Standardiserad och skalbar analys för att studera Parfymiserad 3D angiogen Sprouting av iPSC-härledda endotelceller in vitro

Summary

Denna metod beskriver kulturen av IPSC-härledda endotelceller som 40 perfunderade 3D microkärl i en standardiserad mikroflödessystem plattform. Denna plattform gör det möjligt att studera gradientdriven angiogen groning i 3D, inklusive anastomos och stabilisering av angiogena groddar i ett skalbart och högt dataflöde sätt.

Abstract

Preklinisk läkemedelsforskning av vaskulära sjukdomar kräver in vitro-modeller av kärl som är omprövnings bara för hög genomströmning screening. Aktuella in vitro-screening modeller som har tillräcklig genomströmning har dock endast begränsad fysiologisk relevans, vilket hindrar översättningen av fynd från in vitro till in vivo. Å andra sidan, mikroflödessystem cellkultur plattformar har visat oöverträffad fysiologiska relevans in vitro, men ofta saknar den nödvändiga genomströmning, skalbarhet och standardisering. Vi visar en robust plattform för att studera angiogenes av endotelceller härledda från humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSC-ECs) i en fysiologisk relevant cellulär mikromiljö, inklusive perfusion och gradienter. IPSC-ECs odlas som 40 perfunderade 3D microfartyg mot en mönstrad kollagen-1 byggnadsställning. Vid applicering av en gradient av angiogena faktorer, kan viktiga kännetecken för angiogenes studeras, inklusive differentiering i spets-och stjälk cell och bildandet av perfusable lumen. Perfusion med fluorescerande Tracer färgämnen gör det möjligt att studera permeabilitet under och efter anastomos av angiogena groddar. Sammanfattningsvis visar denna metod genomförbarheten av iPSC-härledda ECs i en standardiserad och skalbar 3D angiogen analys som kombinerar fysiologiska relevanta odlingsförhållanden i en plattform som har erforderlig robusthet och skalbarhet som ska integreras i infrastrukturen för läkemedels screening.

Introduction

In vitro-modeller spelar en grundläggande roll i upptäckten och validering av nya läkemedel mål av vaskulära sjukdomar. Aktuella in vitro-screening modeller som har tillräcklig genomströmning har dock endast begränsad fysiologisk relevans¹, vilket hindrar översättningen av fynd från in vitro till in vivo. Således, för att främja prekliniska vaskulär läkemedelsforskning, förbättrade in vitro-modeller av kärl är nödvändiga som kombinerar hög genomströmning screening med en fysiologiskt relevant 3D cellulära mikro-miljö.

Inom det senaste decenniet har betydande framsteg gjorts för att öka den fysiologiska relevansen av in vitro-modeller av kärl. Istället för att odla endotelceller på plana ytor som vävnadsodling kan endotelceller bäddas in i 3D-ställningar, såsom fibrin och kollagen Gels². Inom dessa matriser, endotelcellerna visar en mer fysiologiskt relevant fenotyp i samband med matris nedbrytning och lumen bildas. Dessa modeller visar dock bara en delmängd av de många processer som uppstår under angiogen groning som viktiga ledtrådar från den cellulära mikromiljön saknas fortfarande.

Mikrofluidiska cellkulturplattformar är unikt lämpade för att ytterligare öka den fysiologiska relevansen av in vitro-modeller av kärl. Till exempel, endotelceller kan utsättas för skjuvning stress, vilket är en viktig biomekanisk stimulans för kärl. Även möjligheten att rumsligt kontrollera vätskor inom mikrofluidik tillåter bildandet av biomolekylära gradienter^3,4,5,6. Sådana gradienter spelar en viktig roll in vivo under bildandet och mönstringen under angiogenes. Men medan mikroflödessystem cellkultur plattformar har visat oöverträffad fysiologiska relevans över traditionella 2D-och 3D-cellkultur metoder, de saknar ofta den nödvändiga genomströmning, skalbarhet och standardisering som krävs för Drug screening ⁷. Dessutom är många av dessa plattformar inte kommersiellt tillgängliga och kräver slutanvändare att microfabricate sina enheter före användning⁸. Detta kräver inte bara tillverkande apparatur och teknisk kunskap, utan begränsar också kvalitetskontrollens nivå och inverkar negativt på reproducerbarheten⁹.

Hittills är primära humana endotelceller fortfarande den mest använda cell källan för att modellera angiogenes in vitro¹⁰. Emellertid, primära mänskliga celler har ett antal begränsningar som hindrar deras rutinmässig tillämpning i screeningmetoder. För det första finns det en begränsad möjlighet att skala upp och expandera primära cell-härledda kulturer. För storskaliga experiment måste därför partier från olika givare användas, vilket leder till genomiska skillnader och variationer i parti-till-sats. För det andra, efter några passager, primära endotelceller förlorar i allmänhet relevanta egenskaper när odlade in vitro-^11,12.

Endotelceller som härrör från humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) är ett lovande alternativ: de liknar primära celler, men med en stabilare genotyp som också är mottagliga för exakt genom redigering. Dessutom kan iPSCs självförnya och därmed utökas i nästan obegränsade kvantiteter, vilket gör iPSC-härledda celler till ett attraktivt alternativ till primära celler för användning inom in vitro-screening modeller¹³.

Här beskriver vi en metod för att odla endotelceller som perfusable 3D microfartyg i en standardiserad, hög genomströmning mikroflödessystem cellkultur plattform. Perfusion appliceras genom att placera enheten på en rocker plattform, vilket garanterar robust drift och ökar skalbarheten i analysen. Eftersom mikrokärlen kontinuerligt är parfymiserade och utsätts för en gradient av angiogena faktorer studeras angiogen groning i en mer fysiologisk relevant cellulär mikromiljö. Medan protokollet är förenligt med många olika källor av (primära) endotelceller^14,15, fokuserade vi på att använda humant IPSC-härledda ECs för att öka standardiseringen av denna analys och för att underlätta dess integration inom vaskulär läkemedelsforskning.

Protocol

1. förberedelse av enheten

1. Överför mikroflödessystem 384-well-plattan till ett sterilt laminärt-Flow-huv.
2. Ta bort locket och tillsätt 50 μL vatten eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till var och en av de 40 observationsbrunnarna (figur 1b, brunn B2) med en flerkanals eller upprepad pipett.
   Anmärkning: Protokollet kan pausas här. Lämna plattan med locket på i det sterila odlings skåpet i rumstemperatur (RT).

2. Förbered gel och beläggning

1. Bered 2,5 ml av 10 μg/ml Fibronektin (FN) beläggnings lösning. Späd 25 μl av 1 mg/ml Fibronektin stamlösning i 2,5 ml av Dulbecco ' s PBS (dpbs, kalcium och magnesium fri). Placera lösningen i vattenbadet vid 37 ° c till användning.
2. Bered 100 μL kollagen-1-lösning. Tillsätt 10 μL av HEPES (1 M) till 10 μL NaHCO₃ (37 g/L) och blanda genom pipettering. Placera röret på is och tillsätt 80 μL kollagen-1 (5 mg/mL) för att ge en neutraliserad kollagen-1 koncentration av 4 mg/mL. Använd en pipett för att blanda försiktigt och undvika bildandet av bubblor.
3. Tillsätt 1,5 μL kollagen-1-lösning (4 mg/mL) till gel inloppet på varje mikrofluidisk enhet (figur 1b, brunn B1). Se till att droppet av gelen placeras i mitten av varje brunn för att gelen ska komma in i kanalen (se figur 2A).
   Anmärkning: Phaseguides förhindrar fyllning av intilliggande kanaler och möjliggör gel-mönkning. Korrekt gel lastning kan bekräftas under ett brightfield Mikroskop genom att observera menisken bildas genom "observation fönstret" (väl B2) eller genom att vända plattan upp och ner. Om gelen inte helt fyller kanalen, kan ytterligare en droppe av 1 μL tillsättas.
4. Placera mikroflödessystem plattan i en inkubator (37 ° c, 5% Co₂) för 10 min att polymerisera kollagen-1.
   Anmärkning: Timing av polymerisation är avgörande; på grund av de låga volymer som används i mikrofluidik, avdunstning kan redan observeras efter 15 min av inkubation, vilket resulterar i gel kollaps eller krympning.
5. Ta ut plattan ur inkubatorn och överför till ett sterilt laminärt-flödesskydd.
6. Tillsätt 50 μL av 10 μg/mL FN-beläggnings lösning till utloppet väl av den översta per fusions kanalen för varje mikrofluidisk enhet (figur 1b, väl a3). Tryck pipettspetsen mot sidan av brunnen för korrekt fyllning av brunnen utan att fånga upp luftbubblor (se figur 2b). Kanalen ska fyllas, och vätskan bör stift på utloppet (väl C1) utan att fylla utloppet väl.
7. Placera plattan i inkubatorn (37 ° c, 5% CO₂) i minst 2 dagar.
   Anmärkning: Protokollet kan pausas här, eftersom kollagen-1-gelen tillsammans med beläggnings blandningen är stabil i minst 5 dagar i inkubatorn. Om beläggnings blandningen uppdateras kan längre perioder vara möjliga, men detta har inte testats. Avgörande är nivån av FN-beläggning, eftersom detta förhindrar uttorkning av kollagen-1 gel.

3. cell sådd/mikrokärl kultur

1. Tillsätt 5 ml fetalt kalv serum och 2,5 ml penna/STREP till 500 ml basal endotelceller cellkulturmedium och filtersterilisera med en Flask topp filter med porstorlek 0,22 μm. Detta medium kallas nu basal medium.
2. Förbered vaskulär tillväxtmedium: Tillsätt 3 μL av 50 μg/mL vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) och 2 μL av 20 μg/mL grundläggande fibroblasttillväxtfaktorer (bFGF) till 5 mL basalt medium.
3. Tina den frusna iPSC-ECs snabbt (< 1 min) i ett 37 ° Cwater bad och överför till en 15 mL tub och späd i 10 mL basala mediet.
4. Räkna cellerna.
   Anmärkning: En enda injektionsflaska innehåller 1 000 000 celler i 0,5 mL med > 90% lönsamhet.
5. Centrifugera röret vid 100 x g i 5 min. Aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten och Omsuspendera i basal medium för att ge en koncentration på 2 x 10⁷ celler/ml.
6. Överför mikroflödessystem 384-well-plattan från inkubatorn till ett sterilt laminärt-Flow Hood.
7. Aspirera FN-beläggnings lösning från per fusions inloppet (brunn a1). Tillsätt 25 μL bas medium i inlopps brunnarna (brunn a1).
8. Tillsätt en 1 μL droppe cellsuspension till varje topp perfusion inlopp väl (figur 1b, brunn a1). DROPP-programmet ska platta sig på några sekunder (se figur 3a, b för en illustration av denna "passiva pumpnings metod").
   Obs: Kontrollera under ett Mikroskop om sådd är homogen. Om inte, tillsätt ytterligare 1 μl i utloppet och vänta tills dropp flackar.
9. Inkubera den mikrofluidiska välplattan i 1 h vid 37 ° c, 5% CO₂. Efter detta bör cellerna ha anslutit sig. Om inte, vänta ytterligare 30 min.
10. Avlägsna det basala mediet från de övre per fusions utlopps brunnarna (figur 1b, väl a3). Tillsätt varmt kärl odlingssubstrat i det övre per fusions intaget och utloppet (figur 1b, brunnarna a1 och a3). Placera plattan på Rocker Platform (inställd på 7 ° vinkel, 8 min Gung intervall) i inkubatorn (37 ° c, 5% CO₂).
11. Bildplattan med hjälp av ett brightfield Mikroskop med automatiserad fas vid dag 1 och 2 efter sådd för att bekräfta cellernas lönsamhet. Efter 2 dagar, en konfluenta enskiktslager bör ha bildats mot kollagen-1 byggnadsställning.
    Anmärkning: Om kanalerna inte verkar vara lika confluent, mikrofartyg kan odlas för en extra 24 h.

4. studie angiogen Sprouting inklusive spets-och Stjälcellsbildning

1. Förbered 4,5 ml av angiogena groning medium genom att komplettera basala medium med 4,5 μl VEGF (50 μg/ml lager), 4,5 μl av phorbol 12-myristate-13-acetat (PMA) (2 μg/ml lager), och 2,25 μl av sphingosine-1-fosfat (S1P) (1 mm lager).
2. Bered 8,5 mL odlingssubstrat för fartyg (basal medium kompletterat med 30 ng/mL VEGF och 20 ng/mL bFGF).
3. Aspirera mediet från brunnarna och tillsätt 50 μL färskt kärl odlingssubstrat i de övre per fusions inloppet och utlopps brunnarna samt gel inlopp och utlopps brunnar (figur 1b, brunnar a1, A3, B1 och B3).
4. Tillsätt 50 μl angiogen GRO-blandning till var och en av de nedersta per fusions kanalens inlopp och utlopps brunnar (figur 1b, brunnar C1 och C3).
5. Sätt tillbaka enheten i inkubatorn (37 ° c, 5% CO₂) på Rocker-plattformen för att bilda en gradient av angiogena tillväxtfaktorer.
6. Bild 1 dag och 2 dagar efter tillsats av angiogena tillväxtfaktorer med hjälp av ett brightfield Mikroskop med automatiserad fas.
   Anmärkning: Fortsätt odling av mikrokärlen för att studera anastomos (gå till avsnitt 5) eller fixera och färga mikrokärlen för att kvantifiera groning längd och morfologi vid dag 2 och dag 6 (gå till avsnitt 6).

5. studie anastomosis och spira stabilisering

1. Bild med hjälp av ett brightfield Mikroskop med automatiserad fas.
2. Tillsätt 1 μL Fluorescent märkt albumin (0,5 mg/mL) till det övre per fusions intaget (figur 1b, brunn a1) och blanda med en 50 μl pipett.
3. Överför plattan till ett fluorescerande Mikroskop med automatiserad fas och inkubator inställd på 37 ° c. Ställ in Mikroskop vid 10X mål och korrekta exponeringsinställningar (t. ex. tetrametylrodamin [TRITC]-kanal, 20 MS-exponering). Få tid-lapse bilder varje minut för 10 min.
4. Ta bort plattan från mikroskopet och överför plattan till ett sterilt laminärt flödes skydd.
5. Ta bort allt medium från brunnarna och Byt ut både kärl odlingsmediet och angiogena groning-mediet i motsvarande brunnar (se steg 4,3 och 4,4).
6. Sätt tillbaka enheten i inkubatorn (37 ° c, 5% CO₂) för att fortsätta angiogen Sprouting.
7. Upprepa steg 5.1 − 5.6 för att studera permeabiliteten dag 6.

6. fixering, färgning och avbildning

1. Aspirera alla kultur medier från alla brunnar.
   Anmärkning: Restmedium eller vätskor i mikrofluidiska kanaler påverkar inte fixeringen på grund av dess låga volym på 1 − 2 μL.
2. Tillsätt 25 μL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS till alla per fusions inloppet (figur 1b, a1 och C1) och utlopps brunnar (figur 1b, A3 och C3). Inkubera i 10 minuter vid RT. Placera enheten under en liten vinkel (± 5 °) för inducera flöde (t. ex. genom att placera ena sidan av plattan på ett lock).
3. Aspirera PFA från brunnarna. Tvätta alla perfusion inlopp och utlopp två gånger med 50 μL av Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS). Aspirera HBSS från Wells.
4. Permeabilize vid RT för 10 min genom att tillsätta 50 μl av 0,2% icke-jonaktivt tensid till alla perfusion inlopp och utlopp.
5. Aspirera det nonjoniska ytaktivt ämnet från brunnar. Tvätta perfusion kanalerna två gånger genom att tillsätta 50 μL av HBSS till alla perfusion inlopp och utlopp brunnar. Aspirera HBSS från Wells.
6. Färga kärnor med Hoechst (1:2000) och F-Actin med phalloidin (1:200) i HBSS. Förbered 2,2 mL för 40 enheter, och tillsätt 25 μL till varje perfusion inlopp och utlopp väl. Placera plattan under en liten vinkel och inkubera vid RT i minst 30 min.
7. Tvätta två gånger med 50 μL av HBSS i alla perfusion inlopp och utlopp.
8. Direkt bild med hjälp av ett fluorescerande Mikroskop med automatiserad fas eller förvara plattan skyddad från ljus vid 4 ° c för senare användning.

Representative Results

Den mikroflödessystem 3D cellkultur plattform består av 40 perfunderade mikroflödessystem enheter (figur 1a, b), som används för att studera angiogena groning av parfymiserade mikrofartyg mot en mönstrad kollagen-1 gel (figur 1c). Dessa mikrokärl är kontinuerligt parfymiserade och utsätts för en gradient av angiogena tillväxtfaktorer (figur 3a-d). De angiogena groddar kan antingen studeras 2 dagar efter lutning exponering eller odlas i mer än 5 dagar efter lutning exponering för studie anastomos och spira stabilisering (se tidslinje, figur 1d).

Sådd av iPSC-ECs med hjälp av den passiva pump metoden bör resultera i homogena sådd tätheter (figur 4a, b). Kultur under kontinuerlig perfusion resulterade i konfluenta mikrokärl i 2 dagar, med cellerna helt kantar omkretsen av den mikroflödessystem kanalen och bildandet av en konfluenta enskiktslager mot den mönstrade kollagen-1 gel.

Exponering för en gradient av angiogena faktorer resulterade i riktad angiogen groning av mikrokärlen i den mönstrade kollagen-1-gelen (figur 5a-g). Klar spets cell formation och invasion i kollagen-1 gel var synlig 24 h efter tillsats av angiogena gradienten, medan stjälk celler inklusive lumen bildas var synliga efter 48 h (figur 5a).

Efter fixering och färgning kan kapillärnätet visualiseras med hjälp av phalloidin för att färga F-Actin och använda Hoechst 33342 för att färga kärnan (Figur 5b, c). Dessa groddar kan kvantifieras (t. ex. form och längd¹⁴). Utan tillsats av tillväxtfaktorer, ingen invasion i kollagen-1 gel bör observeras (figur 5D). Konfokal avbildning användes för att bestämma spira diametern och för att bekräfta lumen bildning (figur 5e-g).

Groddar fortsätter att växa mot riktningen av lutningen och nå motsatt perfusion kanal inom 3 − 4 dagar efter tillsats av angiogena tillväxtfaktorer. Detta resulterar i ombyggnad av kärl nätet, med en tydlig minskning av antalet angiogena groddar (figur 6a). Lumen bildningen bedömdes genom perfusion av det vaskulära nätverket med fluorescerande märkta makromolekyler (t. ex. albumin eller dextrans). Parfymera mikrokärlen med 0,5 mg/ml märkt albumin före och efter anastomos visade en klar skillnad i spira permeabilitet efter 10 min (figur 6b-e), vilket tyder på att kapillärerna stabiliseras och mogna efter anastomos.

Figur 1: Microfluidic cell Culture Protocol för iPSC-härledda mikrofartyg. (a) botten av mikroflödessystem cell Culture enheten visas visar 40 mikroflödessystem enheter som är integrerade under den 384-väl plattan. Större vy visar en av 40 mikrofluidiska enheter. (b) varje mikroflödessystem enhet är placerad under 9 brunnar med 3 inlopp brunnar och 3 utlopp brunnar. De microfluidiska kanalerna separeras av åsar (' phaseguides '), som möjliggör mönstringen av hydrogeler i den centrala kanalen (' gel Channel '), medan det fortfarande finns kontakt med de angränsande kanalerna (' perfusion Channels '). (c) metod för att odla ett parfymierat mikrokärl inom mikroflödessystem-enheten, som används för att studera gradientdriven angiogen groning genom en mönstrad kollagen-1-matris. dtidslinje för studier av angiogen groning och/eller anastomosis. Denna siffra har modifierats från van Duinen et al.¹⁴. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: lastnings procedurer för gel och medium. a) exempel på korrekt och felaktig gel deposition. Korrekt arkivering resulterar i en mönstrad kollagen-1 gel i mittkanalen, som därefter polymeriseras. b) exempel på korrekt och felaktig fyllning av brunnarna. Brunnarna fylls i storleksordningen 1 − 4 för att förhindra att luftbubblor svälls i mikrofluidiska kanaler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: kontinuerligt hydrostatiskt tryck drivet flöde och lutning stabilisering. (a) hydrostatiska tryckskillnader mellan brunnar resulterar i passiv utjämning och flöde inom mikrofluidiska kanaler. (b) Placera enheten på en rocker plattform inställd på 7 ° och 8 min cykel tid resulterar i kontinuerlig, dubbelriktad perfusion inom mikrofluidic kanaler. (c) gradienter bildas genom att införa två olika koncentrationer i brunnarna, som kontinuerligt uppdateras genom passiv utjämning. d) gradient visualisering med fluorescein isotiocyanat (FITC)-dextran. Dubbelriktat flöde stabiliserar lutningen upp till 3 dagar. Skalstapel = 200 μm. Denna siffra har modifierats från van Duinen et al.¹⁴. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: passiv pump metod för cell sådd. apassiv pumpning styrs av tryckskillnader som orsakas av skillnader i ytspänningen. Detta resulterar i ett flöde från DROPP (högt internt tryck) mot behållaren (lågt inre tryck). (b) tidsfördröjning för en DROPP (grå kontur) som är placerad ovanpå inloppet (vit kontur) på mikroflödessystem-kanalen (blå kontur). Direkt efter tillsats (figur 4b, i), droppar på toppen av inloppet krymper (figur 4b, II: 1 s efter tillsats; IV: 2 s efter addition), vilket resulterar i ett flöde mot utloppet. Detta fortsätter tills dropp menisken är fäst vid inloppet (figur 4b, IV). Scale bar = 400 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: robust 3D-groning av IPSC-EC-mikrofartyg. a) Sprouting av IPSC-EC över tiden. Mikrofartyg odlades för 48 h (höger) och sedan stimuleras med en angiogen cocktail som innehåller 50 ng/mL VEGF, 500 nM S1P, och 2 ng/mL PMA. De första spets-celler som invaderar kollagen-1 byggnadsställning (mitten) är synliga 24 h efter exponering. De första lumen är synliga (pilar) 48 h efter exponering (höger) medan spetsen-celler har migrerat vidare i riktning mot gradienten. (b) en matris med 15 mikrofartyg som stimulerades med VEGF, S1P och PMA i 2 dagar och färgas för F-Actin (gul) och kärnor (blått). Skalbar = 200 μm.cstimulerad mikrokärl (positiv kontroll). d) ostimulerad mikrokärl (negativ kontroll). e) den maximala projektionen av en enda kapillär i gelen. (f) samma som (g) men fokuserade på mitten. Streckad linje anger positionen för den rätvinkliga vyn i panel g. skalstreck (a-d: 200 μm, e-g: 20 μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: visualisering av angiogen GRO permeabilitet före och efter anastomosis. (a) anastomosis med basal kanal utlöser beskärning och mognad av angiogena groddar. Närbild av kapillärbädd vid 2, 4, 6 och 7 dagar efter stimulering med angiogena tillväxtfaktorer. b) angiogena groddar efter 2 dagar efter tillsats av angiogena tillväxtfaktorer. Angiogena groddar bildas inom gel, men är ännu inte ansluten till botten perfusion kanal. c) perfusion av mikrokärlet med 0,5 mg/ml albumin-Alexa 555 lösning. Fluorescerande bilder erhållna vid 0 och 10 min. (d, e) samma som i panelerna b och c, men efter 7 dagar av stimulering. Groddar är anslutna till den andra sidan och bildade en konfluenta mikrokärl i basal perfusion Channel. Skalstreck = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Problem	Orsaka	Lösning
Kollagen-1 går inte in i eller fyller kanalen helt	Kollagen-1 droppe är inte placerad ovanpå inloppet	Placera försiktigt droppet ovanpå inloppet från gel kanalen
	Volymen av kollagen-1 är för låg	Använd 1,5 μL av gelen för att fylla kanalen helt
	Kollagen-1 är för trögflytande	Använd en annan sats av kollagen-1
Kollagen-1 flödar in i perfusion kanaler	Kollagen-1 pipetteras direkt in i gel kanalens inlopp	Placera försiktigt droppet ovanpå inloppet från gel kanalen
Kollagen-1 är inte klar/fiber formation	Kollagen-1 lagras inte korrekt	Förvara kollagen-1 vid 4 ° c, frys inte
	NaHCO3 och Hepes inte blandas väl innan du lägger kollagen-1	Blanda noga NaHCO3 och Hepes genom att Pipettera innan kollagen-1-
Droplet krymper inte med passiv pump metod	Droplet fäster vid sidan av brunnen	Aspirera dropp och tillsätt ny droppe ovanpå inloppet
		Se till att utloppet väl är fyllt med minst 20 μL medium
Ingen groning observeras	Tillväxtfaktorer läggs inte till eller alikvoter lagras inte korrekt	Förbered färskt angiogent groning medium
	Luftbubbla block perfusion/lutning formation	Ta bort luftbubblor med hjälp av en P20 eller P200 pipett
	Volymskillnader mellan brunnar	Volymerna i alla brunnar måste vara lika för att kunna bilda en linjär gradient
Celler inte livskraftiga	Plattan inte placerad på Rocker plattform/Rocker plattform avstängd	Se till att Rocker Platform är på och har rätt cykeltid/vinkel (8 min/7 °)
	Ingen perfusion möjlig på grund av förekomst av luftbubblor	Ta bort luftbubblor med hjälp av en P20 eller P200 pipett
Inga lumen bildas, celler migrerar som enstaka celler	Angiogen groning-blandning lades till innan en enskiktslager bildades	Vänta ytterligare 24 timmar innan du lägger till de angiogena tillväxtfaktorerna
Större variation i groning densitet	Skillnader i cell tätheter efter sådd	Kontrollera om CELLTÄTHETEN är homogen och jämförbar mellan mikrofluidiska enheter. Lägg till ytterligare en droppe cellsuspension vid behov

Tabell 1: Felsöka vanliga fel.

Discussion

Denna metod beskriver kulturen i 40 perfusable endoteliala mikrofartyg inom en robust och skalbar mikroflödessystem cellkultur plattform. Jämfört med traditionella 2D-och 3D-cellkulturmetoder visar denna metod hur en fysiologisk relevant cellulär mikromiljö som inkluderar gradienter och kontinuerlig perfusion kan kombineras med 3D-cellkultur med adekvat genomströmning för screening Ändamål.

En av de stora fördelarna jämfört med jämförbara mikroflödessystem analyser är att denna metod inte förlitar sig på pumpar för perfusion men använder en rocker plattform för att inducera kontinuerlig perfusion i alla mikroflödessystem enheter samtidigt. Detta säkerställer att analysen är robust och skalbar: plattorna kan staplas på en rocker plattform. Viktigt är att alla mikroflödessystem enheter förblir individuellt adresserbara, vilket gör att denna metod som skall genomföras inom läkemedels screening inklusive generering av en dos-responskurva. Dessutom, utan en pump, avbildning och medelstora ersättare är mycket enklare med mindre risk för (kors)-förorening.

En annan fördel med denna metod är användning av en standardiserad, pre-tillverkad plattform, medan jämförbara mikroflödessystem cellkultur plattformar måste tillverkas av slutanvändarna. Denna tillgänglighet underlättar antagandet av denna analys bland andra akademiska och farmaceutiska forskargrupper, vilket leder till standardisering. Till skillnad från mikrofluidiska prototyper säkerställer 384-well-plattgränssnittet kompatibilitet med den aktuella laboratorieutrustningen (t. ex. aspirare, platthanterare och flerkanalpipetter), vilket underlättar integrationen inom den nuvarande screening infrastrukturen .

Det finns flera kritiska steg för att utföra denna analys. Kollagen-1-gelen ska fylla gel kanalen helt. Vid laddning av gel kan denna fyllning observeras genom att inspektera de mikrofluidiska kanalerna antingen genom observations fönstret (figur 2A) eller genom att vrida plattan upp och ner (som visas i figur 1a). Medan fyllning, kollagen gel bör förbli i centrum kanalen, utan att strömma in i angränsande perfusion kanaler. Vi märkte att kvaliteten på kollagen-1 gel är avgörande för korrekt analys prestanda. Kollagen-1 partier med för hög viskositet kommer att leda till ofullständig fyllning av gel kanalen. Efter 10 min av polymerisation vid 37 ° c, bör gelen vara homogen och klar. Om kollagen-1 inte lagras på rätt sätt (t. ex. på grund av fluktuerande temperaturer i kylskåpet), kommer kollagen polymerisera inom kanalerna med tydligt synlig fiber bildning. Detta kan resultera i invasion av ECs i gelen utan tillsats av angiogena faktorer, men utan ordentlig lumen utveckling.

När cellerna är seedade avlägsnas Fibronektin-beläggningen från brunnarna, vilket innebär att endast de mikrofluidiska kanalerna fylls med beläggnings lösning. Aspiration av beläggnings lösningen från mikrofluidiska kanaler kan orsaka gel avbrott eller gel aspiration. Cellsuspensionen måste ersätta/tränga undan denna beläggnings lösning. Detta fungerar bäst när cellsuspensionen är seedad med hjälp av den passiva pump metoden, som direkt Pipettera cellsuspensionen i kanalerna visar mindre reproducerbara sådd tätheter.

Eftersom mikrokärlen bildar en stabil enskiktslager mot gelen, dessa små skillnader bara resultera i olika tider som behövs för att nå sammanlänkning. Således är analysens startpunkt bestäms av confluency snarare än kultur tid. Vid behov kan odlings tiden förlängas tills en klar enskiktslager har bildats mot gelen.

I brunnarna kan luftbubblor fastna genom felaktig fyllning av brunnarna (se figur 2b). Dessa luftbubblor kommer att begränsa flödet av medium, även när enheten är placerad på en rocker plattform, och resultera i kollaps av mikrokärl och felaktig lutning formation. Genom att trycka pipettspetsen mot sidovägg av brunnar kommer att öka framgången för att helt fylla brunnen. Om en luftbubbla fastnar i brunnarna kan den avlägsnas genom att försiktigt sätta in en steril pipettspets i glas bottnen. Luftbubblor kan också förekomma i mikrofluidiska kanaler. När mediet har tagits bort från brunnarna, är avdunstning av mediet märkbar från mikroflödessystem kanaler efter 30 min (på grund av mikroliter volymer inom kanalerna). Således utförs medelstora förändringar företrädesvis så snabbt som möjligt. När mediet tillsätts i en kanal med evaporerat medium kommer luftbubblor att fastna i de mikrofluidiska kanalerna. Dessa luftbubblor i mikrofluidiska kanaler kan avlägsnas manuellt genom att placera en P20 pipett direkt på antingen inloppet eller utlopp och tvinga medium genom mikrofluidik från motsatt brunn. Framgångsrik avlägsnande av luftbubblor resulterar i en liten men märkbar minskning av volymen i den andra brunnen. Tabell 1 visar vanliga fel och hur du felsöker dem.

Avsaknaden av en pump är en begränsning när kontinuerlig avbildning krävs, eftersom Rocker plattformen begränsar användaren till bild i sekventiella tidsintervall. Vidare, den perfusion av medium i denna plattform består av dubbelriktade flöde med låga nivåer av skjuvning stress, medan kärl in vivo utsätts för enkelriktade flöde med högre nivåer av skjuvning stress. Även om vi inte iakttar negativa effekter av det dubbelriktade flödet när det gäller angiogena Sprouting, är Flow en viktig biomekanisk stimulans och företrädesvis kontrollerad. Men medan det finns kommersiellt tillgängliga pump uppställningar, gränssnitt med 384-väl plattan fortfarande utmanande och pump uppställningar allvarligt hämma skalbarheten i denna analys.

Möjligheten att använda IPSC-ECs för att studera angiogen groning öppnar nya möjligheter inom sjukdomsmodellering och läkemedelsforskning. I motsats till primära ECs, dessa celler kan genereras i nästan obegränsade mängder med en stabil genotyp och genom att använda genomedigering tekniker, celler kan genereras som inklusive genknockouts och knock-ins. Eftersom protokollen för att särskilja ECs från iPSC är relativt nya är det dock fortfarande oklart vad som leder till iPSC-ECs som bäst återspeglar primära ECs och vilka undertyper av EG som är eller kan genereras. Dessutom finns det fortfarande kvarstående frågor om deras relevans. Exempelvis uppvisar iPSC-ECs fortfarande den plasticitet som är typisk för endotelceller? Och i vilken grad gör iPSC-härledda celler svara på och interagera med sina cellulära mikromiljö? Den standardiserade plattform som presenteras här kan användas för att besvara några av dessa frågor för att ytterligare validera användningen av iPSC-härledda ECs in vitro.

Den mest rättframma framtida riktningen för denna analys kommer att vara integrationen av andra celltyper som spelar en viktig roll under angiogenes, såsom pericyter och makrofager. Detta kommer att underlätta möjligheten att studera rollen av makrofager under anastomos mellan groddar eller vidhäftning av pericyter efter kapillärbildning. Också, det är möjligt att odla olika andra celltyper inom eller mot en extracellulär matris (t. ex., vi har visat kulturen av nervceller och olika epitelial strukturer såsom proximala tubuli och tunntarm), som kan kombineras med den vaskulära sängar som genereras med denna metod. Slutligen, det kommer att bli intressant att studera angiogena groning i syntetiska hydrogels, som deras definierade sammansättningen ytterligare ökar standardiseringen av analysen och tillåter trimning av stelhet och bindande motiv som påverkar cell-matris interaktioner.

Sammanfattningsvis visar denna metod genomförbarheten av iPSC-härledda ECs i en standardiserad och skalbar 3D angiogen analys som kombinerar fysiologiska relevanta odlingsförhållanden i en plattform som har erforderlig robusthet och skalbarhet som ska integreras i infrastrukturen för läkemedels screening.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2-10 μL Electronic repeater pipette	Sigma	Z654566-1EA
1 M HEPES	Gibco	15630-056
3-lane OrganoPlate	Mimetas	4003-400B
4% PFA in PBS	Alfa Aesar	J61899
Basal culture medium	NCardia
Collagen-1	Cultrex	3447-020-01
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL	VWR	613-2071
dPBS	Gibco	14190-094
Eppendorf Repeater M4 pieptte	VWR	613-2890
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F4759-1MG	1 mg/mL in milliQ water
HBSS	Gibco	14025-050
Hoechst	Molecular Probes	H3569	10 mg/mL solution in water
iPSC-derived endothelial cells	NCardia
NaHCO3	Sigma	S5761	37 g/L in milliQ water
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini	Mimetas		Rocker platform used to provide flow
Pen/Strep	Sigma	P4333
Phalloidin	Sigma	P1951	1 mg/mL in DMSO
PMA	Focus-Biomolecules	10-2165	2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO
S1P	Ecehelon Biosciences	S-2000	1 mM in methanol containing 1% acetic acid
TRITC-albumin	Invitrogen	A34786
VEGF	Peprotech	450-32-10	50 μg/mL in water containing 0.1% BSA