ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Bu yöntem, standart mikroakışkan bir platformda 40 perfüze 3D mikrokap olarak iPSC kaynaklı endotel hücrelerinin kültürünü açıklar. Bu platform, anastomoz ve anjiyojenik filizlerin ölçeklenebilir ve yüksek iş lenme tarzında stabilizasyonu da dahil olmak üzere, degrade odaklı anjiyojenik filizlenmenin 3Boyutlu olarak incelenmesini sağlar.
Abstract
Vasküler hastalıkların klinik öncesi ilaç araştırması, yüksek iş başı taraması için değiştirilebilir vaskülatür in vitro modelleri gerektirir. Ancak, yeterli iş sahibi olan mevcut in vitro tarama modelleri sadece sınırlı fizyolojik bir alakaya sahiptir, bu da bulguların in vitro'dan in vivo'ya çevrilmesini engeller. Öte yandan, mikroakışkan hücre kültür platformları in vitro benzersiz fizyolojik alaka göstermiştir, ancak genellikle gerekli üretim, ölçeklenebilirlik ve standardizasyon eksikliği. Perfüzyon ve degradeler de dahil olmak üzere fizyolojik olarak ilgili hücresel mikro ortamda insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC-ECs) elde edilen endotel hücrelerinin anjiyogenezi niincelemek için sağlam bir platform gösteriyoruz. iPSC-ECs bir desenli kollajen-1 iskele karşı 40 perfüze 3D mikrokaplar olarak kültürlü. Anjiyojenik faktörlerin bir gradyan uygulaması üzerine, anjiyogenezin önemli özellikleri incelenebilir, uç ve sap hücresine farklılaşma ve perfusable lümen oluşumu da dahil olmak üzere. Floresan tracer boyaları ile perfüzyon anjiyojenik filizlerin anastomoz sırasında ve sonrasında geçirgenliğin araştırılmasını sağlar. Sonuç olarak, bu yöntem, fizyolojik ilgili kültür koşullarını, gerekli sağlamlık ve ölçeklenebilirliğe sahip bir platformda birleştiren standart ve ölçeklenebilir 3D anjiyojenik bir testte iPSC kaynaklı EC'lerin fizibilitesini gösterir. uyuşturucu tarama altyapısı.
Introduction
In vitro modeller vasküler hastalıkların yeni ilaç hedeflerinin keşfi ve doğrulanmasında temel bir rol oynamaktadır. Ancak, yeterli iş düzeyine sahip mevcut in vitro tarama modelleri sadece sınırlı fizyolojik alaka var1, in in vivo bulguların çeviri engeller. Bu nedenle, klinik öncesi vasküler ilaç araştırmalarını ilerletmek için, yüksek iş artışı taramasını fizyolojik olarak uygun bir 3D hücresel mikro ortamla birleştiren in vitro vaskülatür modelleri gereklidir.
Son on yıl içinde, vaskülatür in vitro modellerin fizyolojik alaka artırmak için önemli ilerleme yapılmıştır. Doku kültürü plastikleri gibi düz yüzeylerde endotel hücrelerinin birliş yerine, endotel hücreleri fibrin ve kollajenjeller2 gibi 3D iskelelere yerlenebilir. Bu matrisler içinde, endotel hücreleri matris bozulması ve lümen oluşumu ile ilişkili daha fizyolojik olarak ilgili fenotip göstermektedir. Ancak, bu modeller sadece hücresel mikroortamdan önemli ipuçları hala eksik olarak anjiyojenik filizlenme sırasında meydana gelen birçok süreçlerin bir alt kümesi ni göstermektedir.
Mikroakışkan hücre kültürü platformları, in vitro vaskülatür modellerinin fizyolojik önemini daha da artırmak için benzersiz bir şekilde uygundur. Örneğin, endotel hücreleri kesme stresine maruz kalınabilir, hangi vaskülatür için önemli bir biyomekanik uyarıcıdır. Ayrıca, mikroakışkanlar içinde mekansal kontrol sıvıları olasılığı biyomoleküler gradyanların oluşumunu sağlar3,4,5,6. Bu degradeler anjiyogenez sırasında oluşum ve desenleme sırasında vivo önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, mikroakışkan hücre kültürü platformları geleneksel 2D ve 3D hücre kültürü yöntemleri üzerinde benzersiz fizyolojik alaka göstermiştir iken, genellikle ilaç taraması için gerekli üretim, ölçeklenebilirlik ve standardizasyon eksikliği 7. Ayrıca, bu platformların çoğu ticari olarak mevcut değildir ve8kullanmadan önce son kullanıcıların cihazlarını mikrofabrikasyon gerektirir. Bu sadece üretim cihazları ve teknik bilgi gerektirir, ama aynı zamanda kalite kontrol düzeyini sınırlar ve olumsuz tekrarlanabilirlik etkiler9.
Bugüne kadar, birincil insan endotel hücreleri in vitro10anjiyogenez modeli için en yaygın olarak kullanılan hücre kaynağı kalır. Ancak, birincil insan hücreleri tarama yaklaşımlarında rutin uygulama engelleyen sınırlamalar bir dizi var. İlk olarak, birincil hücre kaynaklı kültürleri ölçeklendirmek ve genişletmek için sınırlı bir olasılık vardır. Bu nedenle, büyük ölçekli deney için, farklı bağışçılardan gelen gruplar, genomik farklılıklar ve toplu-toplu varyasyonlar neden kullanılması gerekir. İkinci olarak, birkaç pasajdan sonra, birincil endotel hücreleri genellikle in vitro11kültürlü zaman ilgili özelliklerini kaybedersiniz12.
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC) elde edilen endotel hücreleri umut verici bir alternatiftir: birincil hücrelere benzerler, ancak daha kararlı bir genotip ile de kesin genom düzenlemesine olanak sağlar. Ayrıca, iPSC'ler kendini yenilemek ve böylece iPSC türetilmiş hücreleri in vitro tarama modelleri içinde kullanım için birincil hücreleriçin cazip bir alternatif yapmak neredeyse sınırsız miktarlarda genişletilebilir13.
Burada, standartlaştırılmış, yüksek iş yapmalı mikroakışkan hücre kültür platformunda, kültür endotel hücrelerine bir yöntem, perfusable 3D mikrodamarlar olarak tanımlar. Perfüzyon, cihazı sağlam bir çalışma sağlayan ve talın ölçeklenebilirliğini artıran bir kaya platformuna yerleştirerek uygulanır. Mikrodamarlar sürekli olarak perfüzyon ve anjiyojenik faktörlerin bir gradyan maruz olarak, anjiyojenik filizlenme daha fizyolojik ilgili hücresel mikro ortamda çalışılır. Protokol birçok farklı (birincil) endotel hücresi14,15ile uyumlu olsa da, bu testin standardizasyonunu artırmak ve entegrasyonunu kolaylaştırmak için insan iPSC kaynaklı EC'leri kullanmaya odaklandık. vasküler ilaç araştırma içinde.
Protocol
1. Cihaz Hazırlama
- Mikroakışkan 384 kuyulu plakayı steril laminar akışkanına aktarın.
- Kapağı çıkarın ve çok kanallı veya yinelenen bir pipet kullanarak 40 gözlem kuyularının her birine(Şekil 1b, iyi B2) 50 μL su veya fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Oda sıcaklığında (RT) steril kültür dolabında kapağı nı kapalı bırakın.
2. Jel ve Kaplama Hazırlayın
- 2,5 mL 10 g/mL fibronektin (FN) kaplama çözeltisi hazırlayın. Seyreltik 25 μL 1 mg/mL fibronektin stok çözeltisi 2.5 mL Dulbecco PBS (dPBS, kalsiyum ve magnezyum içermez). Çözeltiyi kullanıma kadar 37 °C'de su banyosuna yerleştirin.
- 100 μL kollajen-1 çözeltisi hazırlayın. 10 μL HEPES (1 M) ila 10 μL NaHCO3 (37 g/L) ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Tüpü buzüzerine yerleştirin ve nötralize kollajen-1 konsantrasyonu 4 mg/mL'lik bir kollajen-1 (5 mg/mL) kollajen-1 ekleyin. Dikkatle karıştırmak ve kabarcıklar oluşumunu önlemek için bir pipet kullanın.
- Her mikroakışkan ünitenin jel girişine 1,5 μL kollajen-1 çözeltisi (4 mg/mL) ekleyin(Şekil 1b, iyi B1). Jel damlacık kanala girmek için her kuyunun ortasına yerleştirilir emin olun (Bkz. Şekil 2a).
NOT: Faz kılavuzları bitişik kanalların doldurulmasını önler ve jel desenleme sağlar. Doğru jel yükleme 'gözlem penceresi' (iyi B2) üzerinden menisküs oluşumu gözlemleyerek veya ters plaka çevirerek bir brightfield mikroskop altında teyit edilebilir. Jel kanalı tamamen doldurmadıysa, 1 μL'lik ek bir damlacık eklenebilir. - Kollajen-1'i polimerize etmek için mikroakışkan plakayı 10 dakika boyunca bir kuvöze (37 °C, %5 CO2)yerleştirin.
NOT: Polimerizasyonun zamanlaması çok önemlidir; mikroakışkanlarda kullanılan düşük hacimler nedeniyle, buharlaşma zaten jel çökmesi veya büzülme ile sonuçlanan kuluçka 15 dakika sonra görülebilir. - Tabağı kuvözden çıkar ve steril laminar akışlı kaputa aktarın.
- Her mikroakışkan ünitenin üst perfüzyon kanalının çıkış kuyusu(Şekil 1b, iyi A3) çıkışına 50 μL 10 g/mL FN kaplama çözeltisi ekleyin. Hava kabarcıklarını yakalamadan kuyunun doğru doldurulması için pipet ucunu kuyunun kenarına bastırın (Bkz. Şekil 2b). Kanal doldurmalı ve sıvı prizde (kuyu C1) priz doldurmadan sabitlemelidir.
- Plakayı en az 2 gün boyunca kuvöze (37 °C, %5 CO2)yerleştirin.
NOT: Kollajen-1 jel kaplama karışımı ile birlikte en az 5 gün kuvözde stabil olduğu için protokol burada duraklatılabilir. Kaplama karışımı yenilenirse, daha uzun süreler mümkün olabilir, ancak bu test edilmemiştir. Bu kollajen-1 jel dehidratasyon önler gibi önemli FN kaplama düzeyidir.
3. Hücre Tohumlama/Mikrogemi Kültürü
- 5 mL fetal buzağı serumu ve 2,5 mL kalem/strep ile 500 mL bazal endotel hücre kültürü ortamını ekleyin ve 0,22 m gözenek boyutunda bir şişe üst filtre kullanarak filtre sterilize edin. Bu ortam artık bazal orta olarak adlandırılır.
- Vasküler büyüme ortamını hazırlayın: 3 μL 50 g/mL vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve 2 μL 20 g/mL temel fibroblast büyüme faktörleri (bFGF) ila 5 mL bazal orta ekleyin.
- Dondurulmuş iPSC-EC'leri 37 °C'lik bir su banyosunda hızla (<1 dk) eritin ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 10 mL bazal ortamda seyreltin.
- Hücreleri say.
NOT: Tek bir şişe 0,5 mL içinde 1 milyon hücre içerir ve %gt;90 canlılık sağlar. - Tüpü 100 x g'de 5 dk. Aspire süpernatant hücre peletini bozmadan santrifüj edin ve bazal ortamda 2 x 107 hücre/mL konsantrasyonu elde etmek için yeniden askıya alın.
- Mikroakışkan 384 kuyulu plakayı kuvözden steril laminar akışkanına aktarın.
- Perfüzyon girişi (iyi A1) aspirat FN kaplama çözeltisi. Giriş kuyularına (iyi A1) 25 μL bazal ortam ekleyin.
- Her üst perfüzyon girişine 1 μL'lik bir hücre süspansiyonu damlatın(Şekil 1b, iyi A1). Damlacık birkaç saniye içinde düzleşir (bu 'pasif pompalama' yönteminin bir örneği için Şekil 3a,b'ye bakınız).
NOT: Tohumlamanın homojen olup olmadığını mikroskop altında kontrol edin. Değilse, çıkışa 1 μL daha ekleyin ve damlacık düzlene kadar bekleyin. - Mikroakışkan iyi plakayı 37 °C'de 1 saat, %5 CO2'dekuluçkaya yatırın. Bundan sonra, hücreler yapışmış olmalıdır. Değilse, başka bir 30 dakika bekleyin.
- Bazal ortamı üst perfüzyon çıkış kuyularından çıkarın(Şekil 1b, iyi A3). Üst perfüzyon giriş ve çıkış sıcak damar kültür orta ekleyin(Şekil 1b, kuyular A1 ve A3). Plakayı kayaplatformuna yerleştirin (7° açı, 8 dk sallanan aralık) kuvözde (37 °C, %5 CO2).
- Hücre canlılığını doğrulamak için 1 ve 2 numaralı tohumlama sonrası otomatik sahne ile parlak alan mikroskobu kullanarak plakayı görüntüleyin. 2 gün sonra kollajen-1 iskelesine karşı bir konflufluent monolayer oluşmuş olmalıdır.
NOT: Kanallar eşit derecede etkili görünmüyorsa, mikrokaplar ek bir 24 saat için kültürlenebilir.
4. İpucu ve Sap Hücre Oluşumu Dahil Anjiyojenik Filizlenme Çalışması
- 4,5 mL anjiyojenik filizlenme ortamını 4,5 μL VEGF (50 μg/mL stok), 4,5 μL phorbol 12-myristate-13-asetat (PMA) (2 g/mL stok) ve 2,25 μL sfingosin-1-fosfat (S1P) (1 mm) ile takviye ederek anjiojenik filizlenme ortamı hazırlayın.
- 8.5 mL damar büyüme ortamı (30 ng/mL VEGF ve 20 ng/mL bFGF ile desteklenen bazal ortam) hazırlayın.
- Kuyulardan aspirasyon ortamı ve üst perfüzyon giriş ve çıkış kuyuları ve jel giriş ve çıkış kuyuları(Şekil 1b, kuyular A1, A3, B1 ve B3) taze damar kültürü orta 50 μL ekleyin.
- Alt perfüzyon kanalı girişi ve çıkış kuyularının her birine 50 μL anjiyojenik filiz karışımı ekleyin(Şekil 1b, Kuyular C1 ve C3).
- Anjiyojenik büyüme faktörlerinin bir gradyanı oluşturmak için cihazı kaya platformundaki kuvöze (37 °C, %5 CO2)geri yerleştirin.
- Otomatik sahne ile bir brightfield mikroskop kullanarak anjiyojenik büyüme faktörlerinin eklenmesinden sonra resim 1 gün ve 2 gün.
NOT: Anastomoz çalışması için mikrodamarları karıştırmaya devam edin (bölüm 5'e gidin) veya 2.
5. Çalışma Anastomoz ve Filiz Stabilizasyonu
- Otomatik sahne ile parlak alan mikroskobu kullanarak görüntü.
- Üst perfüzyon girişine(Şekil 1b, iyi A1) floresan etiketli albumin (0.5 mg/mL) ekleyin ve 50 μL pipet kullanarak karıştırın.
- Plakayı 37 °C'de otomatik sahne ve kuluçka makinesi ile floresan mikroskoba aktarın. Mikroskobu 10x objektif ve doğru pozlama ayarlarına (örn. tetrametethylrhodamine [TRITC]-kanal, 20 ms maruz ilerler). 10 dakika boyunca her dakika hızlandırılmış görüntüler edinin.
- Plakayı mikroskoptan çıkarın ve tabağı steril laminar akışkanına aktarın.
- Kuyulardan tüm ortamı çıkarın ve ilgili kuyularda hem damar kültürü ortamını hem de anjiyojenik filizlenme ortamını değiştirin (bkz. 4.3 ve 4.4. basamaklar).
- Anjiyojenik filizlenmedevam etmek için cihazı tekrar kuvöze (37 °C, %5 CO2)yerleştirin.
- 6. günde geçirgenliği incelemek için 5.1−5.6 adımlarını tekrarlayın.
6. Fiksasyon, Boyama ve Görüntüleme
- Tüm kuyulardan tüm kültür medyaaspire.
NOT: Mikroakışkan kanallardaki artık ortam veya sıvılar, 1−2 μL'lik düşük hacmi nedeniyle fiksasyonu etkilemez. - PBS'deki %4 paraformaldehitin (PFA) 25 μL'sini tüm perfüzyon girişine(Şekil 1b,A1 ve C1) ve çıkış kuyularına(Şekil 1b, A3 ve C3) ekleyin. RT'de 10 dakika kuluçka ya da hafif bir açının altına (±5°) yerleştirin ve bir tarafını bir kapak üzerine koyarak akışı (örn.
- Kuyulardan PfA'yı aspire edin. Hank'in dengeli tuz çözeltisinin (HBSS) 50°L'si ile tüm perfüzyon girişlerini ve prizlerini iki kez yıkayın. Wells'ten HBSS'yi aspire edin.
- Tüm perfüzyon giriş ve çıkışlarına %0,2 noniyonik yüzey aktif madde nin 50 μL'si ekleyerek 10 dakika boyunca RT'de permeabilize edin.
- Wells gelen nononionic yüzey aktif aspire. Tüm perfüzyon giriş ve çıkış kuyularına 50°L HBSS ekleyerek perfüzyon kanallarını iki kez yıkayın. Wells'ten HBSS'yi aspire edin.
- HBSS'de Phalloidin (1:200) kullanarak Hoechst (1:2,000) ve F-aktin kullanarak çekirdekleri lekele. 40 ünite için 2,2 mL hazırlayın ve her perfüzyon girişine ve çıkışa 25 l ekleyin. Plakayı hafif bir açının altına yerleştirin ve en az 30 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
- Tüm perfüzyon girişlerinde ve çıkışlarında 50°L HBSS ile iki kez yıkayın.
- Otomatik sahne ile floresan mikroskop kullanarak doğrudan görüntü veya daha sonra kullanmak için 4 °C ışıktan korunan plaka saklayın.
Representative Results
Mikroakışkan 3D hücre kültür platformu, desenli kollajen-1 jel(Şekil 1c)ile perfüzyon mikrodamarların anjiyojenik filizlenmesini incelemek için kullanılan 40 perfüzyon mikroakışkan birimden(Şekil 1a,b)oluşur. Bu mikrodamarlar sürekli olarak perfüzyonve anjiyojenik büyüme faktörlerinin bir gradyan maruz(Şekil 3a-d). Anjiyojenik filizler degrade maruziyetinden 2 gün sonra incelenebilir veya anastomoz ve filiz stabilizasyonu için degrade maruziyetten sonra 5 günden fazla kültürlenebilir (bkz. zaman çizelgesi, Şekil 1d).
pasif pompalama yöntemi kullanılarak iPSC-EC'lerin tohumlanması homojen tohumlama yoğunluklarına neden olmalıdır (Şekil 4a,b). Sürekli perfüzyon altında kültür 2 gün içinde konfluent mikrodamarlar sonuçlandı, hücreler tamamen mikroakışkan kanalın çevresi astar ve desenli kollajen-1 jel karşı bir konfluent monolayer oluşumu ile.
Anjiyojenik faktörlerin bir gradyan maruz ilerlüz bünyeklü kollajen-1 jel içinde mikrodamarların yönlü anjiyojenik filizlenme ile sonuçlandı (Şekil 5a-g). Berrak uç hücre oluşumu ve kollajen-1 jel içine invazyonu anjiyojenik gradyan eklenmesinden sonra 24 saat görünür iken lümen oluşumu içeren sap hücreleri 48 h sonra görülebilir(Şekil 5a).
Fiksasyon ve boyama dan sonra, kılcal ağ F-aktin lekepoidin kullanılarak ve çekirdek leke Hoechst 33342 kullanılarak görselleştirilmiş olabilir(Şekil 5b,c). Bu filizler sayısallaştırılabilir (örneğin, şekil ve uzunluk14). Büyüme faktörleri eklenmeden kollajen-1 jeliniçine invazyon gözlenmemelidir (Şekil 5d). Filiz çapını belirlemek ve lümen oluşumunu doğrulamak için konfokal görüntüleme kullanılmıştır (Şekil 5e-g).
Filizler degrade yönüne doğru büyümeye devam eder ve anjiyojenik büyüme faktörlerinin eklenmesinden sonra 3−4 gün içinde zıt perfüzyon kanalına ulaşırlar. Bu da vasküler ağın yeniden şekillendirilmesiyle sonuçlanır ve anjiyojenik filiz sayısında belirgin bir azalma sağlar (Şekil 6a). Lümen oluşumu floresan olarak etiketlenmiş makromoleküller (örn. albümin veya dekstrans) ile vasküler ağın perfüzyonu ile değerlendirildi. Anastomoz öncesi ve sonrası 0.5 mg/mL etiketli albumin ile mikrodamarlarıperfüzyon, 10 dakika(Şekil 6b-e)sonrası filiz geçirgenliğinde belirgin bir fark ortaya çıkararak, kılcal damarların anastomoz dan sonra stabilize ve olgunlaştığını düşündürmektedir.
Şekil 1: iPSC kaynaklı mikrokaplar için mikroakışkan hücre kültürü protokolü. (a) Mikroakışkan hücre kültür cihazının alt kısmında, 384 kuyulu plakanın altına entegre edilmiş 40 mikroakışkan ünite gösterilir. Daha büyük görünüm, 40 mikroakışkan üniteden birini görüntüler. (b) Her mikroakışkan ünite, 3 giriş kuyusu ve 3 çıkış kuyusu ile 9 kuyunun altına yerleştirilmiştir. Mikroakışkan kanallar, komşu kanallarla ('perfüzyon kanalları') hala temas halindeyken merkezi kanaldaki ('gel kanalı') hidrojellerin desenlemesini sağlayan sırtlarla ('phaseguides') ayrılır. (c) Desenli kollajen-1 matrisi ile gradyan tahrikli anjiyojenik filizlenmeyi incelemek için kullanılan mikroakışkan cihaz içinde perfüzyonlu bir mikrodamarı kültüre alma yöntemi. (d) Anjiyojenik filizlenme ve/veya anastomoz çalışma zaman çizelgesi. Bu rakam van Duinen ve ark.14'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Jel ve orta için yükleme prosedürleri. (a) Doğru ve yanlış jel birikimi örnekleri. Daha sonra polimerize orta kanalda bir desenli kollajen-1 jel doğru dosyalama sonuçları. (b) Kuyuların doğru ve yanlış doldurulması örnekleri. Kuyular, mikroakışkan kanallar içinde hava kabarcığı bindirmesini önlemek için 1−4 sırasına göre doldurulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sürekli hidrostatik basınç tahrikli akış ve gradyan stabilizasyon. (a) Kuyular arasındaki hidrostatik basınç farkları, mikroakışkan kanallar içinde pasif tesviye ve akışla sonuçlanır. (b)Cihazı 7° ve 8 dk çevrim süresi olarak belirlenen bir kaya platformuna yerleştirmek, mikroakışkan kanallar içinde sürekli, çift yönlü perfüzyon sağlar. (c) Degradeler, kuyuların içinde pasif tesviye ile sürekli olarak yenilenen iki farklı konsantrasyonun ortaya konarak oluşur. (d) Floresan isoktiyosiyanat (FITC)-dekstran kullanılarak gradyan görüntüleme. Çift yönlü akış degradeyi 3 güne kadar sabitler. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakam van Duinen ve ark.14'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hücre tohumlama için pasif pompalama yöntemi. (a) Pasif pompalama, yüzey gerilimindeki farklılıklardan kaynaklanan basınç farklılıkları ile yönlendirilir. Bu da damlacıktan (yüksek iç basınç) rezervuara (düşük iç basınç) doğru bir akışla sonuçlanır. (b)Mikroakışkan kanalın girişinin (beyaz anahat) üzerine yerleştirilen bir damlacık (gri anahat) zaman atlamalı. Eklemeden hemen sonra (Şekil 4b, i), girişin üstündeki damlacık küçülür (Şekil 4b, ii: 1 s ilaveden sonra; iv: 2 s ekten sonra), çıkışa doğru bir akış ile sonuçlanır. Bu damlacık menisküs girişi tarafından sabitlenmiş kadar devam eder(Şekil 4b, iv). Ölçek çubuğu = 400 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: iPSC-EC mikrodamarlarının sağlam 3D filizlenme. (a) Zaman içinde iPSC-EC filizlenme. Mikrodamarlar 48 saat (sağda) için yetiştirildi ve 50 ng/mL VEGF, 500 nM S1P ve 2 ng/mL PMA içeren anjiyojenik kokteyl ile uyarıldı. Kollajen-1 iskelesini (orta) istila eden ilk uç hücreleri maruz kaldıktan 24 saat sonra görülebilir. İlk lümenler pozlamadan sonra görünür (oklar) 48 saat (sağda) ve uç hücreleri degrade yönünde daha fazla göç etmiş olur. (b) VEGF, S1P ve PMA ile 2 gün süreyle uyarılan ve F-aktin (sarı) ve çekirdekler (mavi) için boyanmış 15 mikrodamardan oluşan dizi. Ölçek çubuğu = 200 μm. (c) Uyarılmış mikrodamar (pozitif kontrol). (d) Uyarılmamış mikrodamar (negatif kontrol). (e) Jel içinde tek bir kılcal maksimum projeksiyon. (f) (g) ile aynıdır ama ortaya odaklanmıştır. Noktalı çizgi panel g. Ölçek çubuklarında ortogonal görünümün konumunu gösterir (a-d: 200 μm; e-g: 20 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Anjiyojenik filiz geçirgenliğinin anastomoz öncesi ve sonrası görüntülenmesi. (a) Bazal kanallı anastomoz, anjiyojenik filizlerin budama ve olgunlaşmasını tetikler. Anjiyojenik büyüme faktörleri ile uyarılmasından 2, 4, 6 ve 7 gün sonra kılcal yatağın kapatılması. (b) Anjiyojenik büyüme faktörlerinin eklenmesinden 2 gün sonra anjiyojenik filizler. Anjiyojenik filizler jel içinde oluşur, ancak henüz alt perfüzyon kanalına bağlı değildir. (c) Mikrodamarın 0.5 mg/mL albumin-Alexa 555 çözeltisi ile perfüzyonu. Floresan görüntüler 0 ve 10 dk. (d,e) Paneller b ve c aynı, ancak stimülasyon 7 gün sonra elde edilir. Filizler diğer tarafa bağlanır ve bazal perfüzyon kanalında bir konfluent mikrodamar oluşur. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Sorun | Neden | Çözüm |
| Kollajen-1 kanala tam olarak girmiyor veya doldurmuyor | Kollajen-1 damlacık girişin üstüne yerleştirilir değil | Damlacıkları jel kanaldan girişin üstüne dikkatlice yerleştirin |
| Kollajen-1 hacmi çok düşük | Kanalı tamamen doldurmak için jelin 1,5 μL'sini kullanın | |
| Kollajen-1 çok viskoz | Kollajen-1 başka bir toplu kullanın | |
| Kollajen-1 perfüzyon kanallarına akar | Kollajen-1 jel kanalının girişine doğrudan pipetli | Damlacıkları jel kanaldan girişin üstüne dikkatlice yerleştirin |
| Kollajen-1 açık/lif oluşumu değildir | Kollajen-1 düzgün depolanmaz | Kollajen-1'i 4 °C'de saklayın, donmayın |
| NaHCO3 ve HEPES kollajen-1 eklemeden önce iyi karıştırılmamaktadır | Kollajen-1 eklemeden önce NaHCO3 ve HEPES'i pipetleme yaparak dikkatlice karıştırın | |
| Damlacık pasif pompalama yöntemi kullanılarak küçülmez | Damlacık kuyunun yan tarafına yapışır | Aspire damlacık ve girişin üstüne yeni damlacık ekleyin |
| Çıkış kuyusu en az 20 μL orta ile dolu olduğundan emin olun | ||
| Filizlenme gözlenmez | Büyüme faktörleri eklenmez veya aliquots düzgün depolanmaz | Taze anjiyojenik filizlenme ortamı hazırlayın |
| Hava kabarcığı blokları perfüzyon / gradyan oluşumu | P20 veya P200 pipetkullanarak hava kabarcıklarını çıkarın | |
| Kuyular arasındaki hacim farkları | Doğrusal bir degrade oluşturmak için tüm kuyularda hacimlerin eşit olması gerekir | |
| Hücreler canlı değil | Kaya platformu/rocker platformuna yerleştirilmeyen plaka kapalı | Rocker platformunun açık olduğundan ve doğru çevrim süresine/açısına (8 dk/7°) sahip olduğundan emin olun |
| Hava kabarcıklarının varlığı nedeniyle perfüzyon mümkün değildir | P20 veya P200 pipetkullanarak hava kabarcıklarını çıkarın | |
| Lümen oluşmaz, hücreler tek hücre olarak göç eder | Tek kat oluşmadan önce anjiyojenik filizlenme karışımı eklendi | Anjiyojenik büyüme faktörlerini eklemeden önce ek bir 24 saat bekleyin |
| Filizlenme yoğunluğunda büyük farklılıklar | Tohumlama sonrası hücre yoğunluklarında farklılıklar | Hücre yoğunluğunun homojen olup olmadığını ve mikroakışkan birimler arasında karşılaştırılabilir olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse başka bir hücre süspansiyon damlacıkları ekleyin |
Tablo 1: Sık karşılaşılan hataları giderme.
Discussion
Bu yöntem, sağlam ve ölçeklenebilir mikroakışkan hücre kültürü platformu içinde 40 perfusable endotel mikrodamarların kültürünü açıklar. Geleneksel 2D ve 3D hücre kültürü yöntemleriile karşılaştırıldığında, bu yöntem degradeler ve sürekli perfüzyon içeren fizyolojik ilgili hücresel mikroortamın tarama için yeterli üretim emisi ile 3D hücre kültürüyle nasıl birleştirilebildiğini göstermektedir. Amaçlı.
Karşılaştırılabilir mikroakışkan tahliller üzerinde önemli avantajlarından biri, bu yöntem perfüzyon için pompalar güvenmez ama aynı anda tüm mikroakışkan birimlerinde sürekli perfüzyon ikna etmek için bir rocker platformu kullanır. Bu, talın sağlam ve ölçeklenebilir olmasını sağlar: plakalar daha kayalık bir platformda istiflenebilir. Daha da önemlisi, tüm mikroakışkan birimler ayrı ayrı ele alınabilir kalır, hangi bu yöntem bir doz-yanıt eğrisi üretimi de dahil olmak üzere ilaç tarama içinde uygulanmasına olanak sağlar. Ayrıca, bir pompa olmadan, görüntüleme ve orta replasman (çapraz)-kontaminasyon riski ile çok daha basittir.
Bu yöntemin bir diğer avantajı da standartlaştırılmış, önceden üretilmiş bir platformun kullanımı, karşılaştırılabilir mikroakışkan hücre kültürü platformlarının ise son kullanıcılar tarafından üretilmesi gerekmektedir. Bu kullanılabilirlik, bu testin diğer akademik ve farmasötik araştırma grupları arasında benimsenmesini kolaylaştırarak standardizasyona yol açtı. Ayrıca, mikroakışkan prototiplerin aksine, 384 kuyulu plaka arayüzü mevcut laboratuvar ekipmanlarıyla (örneğin, aspiratörler, plaka işleyicileri ve çok kanallı pipetler) uyumluluğu sağlar ve mevcut tarama altyapısıyla entegrasyonu kolaylaştırır .
Bu titreyi gerçekleştirmenin birkaç kritik adımı vardır. Kollajen-1 jel tamamen jel kanal doldurmak gerekir. Jel yüklemesi sırasında bu dolgu, mikroakışkan kanalların gözlem penceresinden(Şekil 2a)incelenmesi veya plakanın ters çevrilerek (Şekil 1a'dagösterildiği gibi) gözlemlenebilir. Doldururken, kollajen jel merkezi kanalda kalmalıdır, bitişik perfüzyon kanallarıiçine akan olmadan. Biz kollajen-1 jel kalitesi uygun bir asay performansı için çok önemli olduğunu fark ettim. Çok yüksek viskoziteli kollajen-1 toplu jel kanalının eksik dolum yol açacaktır. 37 °C'de 10 dk polimerizasyondan sonra jel homojen ve berrak olmalıdır. Kollajen-1 düzgün depolanmazise (örneğin, buzdolabındaki dalgalı sıcaklıklar nedeniyle), kollajen açıkça görülebilen lif oluşumuna sahip kanallar içinde polimerleşir. Bu anjiyojenik faktörlerin eklenmesi olmadan jel içine ECs işgaline neden olabilir, ancak uygun lümen gelişimi olmadan.
Hücreler tohumlandığında, fibronektin kaplama çözeltisi kuyulardan çıkarılır ve sadece kaplama solüsyonu ile doldurulmuş mikroakışkan kanallar kalır. Kaplama çözeltisinin mikroakışkan kanallardan aspirasyonu jel bozulmasına veya jel aspirasyonuna neden olabilir. Hücre süspansiyonunun bu kaplama çözeltisini değiştirmesi/değiştirmesi gerekir. Hücre süspansiyonu pasif pompalama yöntemi kullanılarak tohumlandığında en iyi şekilde çalışır, çünkü hücre süspansiyonunun doğrudan kanallara borulanması daha az tekrarlanabilir tohumlama yoğunlukları gösterir.
Mikrodamarlar jel karşısında istikrarlı bir monolayer oluşturdukça, bu küçük farklılıklar sadece biraraya ulaşmak için gereken farklı zamanlarda sonuçlanır. Böylece, deneme başlangıç noktası kültür zamanı yerine biraraya gelerek belirlenir. Gerekirse, jel karşı net bir monolayer oluşturulana kadar kültür lenme süresi uzatılabilir.
Kuyuların içinde, hava kabarcıkları kuyuların yanlış doldurulmasıyla kapanabilir (Bkz. Şekil 2b). Bu hava kabarcıkları, cihaz daha kayalık bir platforma yerleştirildiğinde bile ortamın akışını kısıtlar ve mikro geminin çökmesine ve yanlış degrade oluşumuna neden olur. Pipet ucunu kuyunun yan duvarına bastırmak kuyuyu tamamen doldurma başarısını artıracaktır. Bir hava kabarcığı kuyuların içinde sıkışıp kalırsa, cam alt içine steril bir pipet ucu hafifçe takılarak çıkarılabilir. Hava kabarcıkları da mikroakışkan kanallar içinde oluşabilir. Orta kuyulardan çıkarıldığında, 30 dakika sonra mikroakışkan kanallardan (kanallar içindeki mikrolitre hacimleri nedeniyle) ortamın buharlaşması fark edilir. Böylece, orta değişiklikler tercihen mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirilir. Buharlaşan ortama sahip bir kanala ortam eklendiğinde, hava kabarcıkları mikroakışkan kanallar içinde sıkışıp kalır. Mikroakışkan kanallar içindeki bu hava kabarcıkları, p20 pipetini doğrudan giriş veya priz üzerine yerleştirerek ve ortamı karşı kuyudan gelen mikroakışkanlardan geçirerek elle çıkarılabilir. Hava kabarcıklarının başarılı bir şekilde çıkarılması, diğer kuyudaki hacimde küçük ama gözle görülür bir azalmaya neden olur. Tablo 1, sık karşılaşılan hataları ve bunları nasıl gidereceklerini listeler.
Bir pompa eksikliği sürekli görüntüleme gerektiğinde bir sınırlama, rocker platformu sıralı zaman aralıklarında görüntü kullanıcı sınırlar gibi. Ayrıca, bu platformda ortamın perfüzyonu düşük kesme gerilimi seviyelerine sahip çift yönlü akıştan oluşurken, vivo'daki vaskülatür yüksek kesme gerilimi ile tek yönlü akışa maruz kalır. Anjiyojenik filizlenme açısından çift yönlü akışın olumsuz etkilerini gözlemlemesek de, akış önemli bir biyomekanik uyarıcıdır ve tercihen kontrol edilir. Ancak, ticari olarak mevcut pompa kurulumları varken, 384-iyi plaka ile interfacing zorlu kalır ve pompa kurulumları ciddi bu test ölçeklenebilirlik engel.
Anjiyojenik filizlenmeyi incelemek için iPSC-EC kullanma imkanı, hastalık modelleme ve ilaç araştırmalarında yeni fırsatlar yaratmaktadır. Birincil ECs aksine, bu hücreler istikrarlı bir genotip ile neredeyse sınırsız miktarlarda oluşturulabilir ve genom düzenleme teknikleri kullanılarak, hücreler gen nakavt ve knock-ins dahil olmak üzere oluşturulabilir. Ancak, ec'leri iPSC'den ayırt etme protokolleri nispeten yeni olduğundan, birincil EC'leri en iyi yansıtan iPSC-EC'lere neyin yol açtığı ve hangi AK alt türlerinin üretildiği veya oluşturulabileceği hala belirsizdir. Ayrıca, hala onların alaka ile ilgili kalan sorular vardır. Örneğin, iPSC-EC'ler hala endotel hücreleri için tipik olan plastisiteyi sergiliyor lar mı? Ve ne dereceye kadar iPSC kaynaklı hücreler yanıt ve hücresel mikro çevre ile etkileşim? Burada sunulan standartlaştırılmış platform, iPSC kaynaklı EC'lerin in vitro kullanımını daha fazla doğrulamak için bu soruların bazılarını yanıtlamak için kullanılabilir.
Bu araştırma için en düz ileri yönde perisitler ve makrofajlar gibi anjiyogenez sırasında önemli bir rol oynayan diğer hücre tiplerinin entegrasyonu olacaktır. Bu, lahanalar arasındaki anastomoz sırasında makrofajların rolünü veya kılcal formasyon sonrası perisitlerin yapışmasını inceleme yeteneğini kolaylaştıracaktır. Ayrıca, bir hücre dışı matris içinde veya karşı çeşitli hücre tipleri kültür mümkündür (örneğin, biz nöronlar ve proksimal tübüller ve ince bağırsak gibi çeşitli epitel yapıları kültürünü göstermiştir), vasküler ile kombine edilebilir yataklar bu yöntem kullanılarak oluşturulmuştur. Son olarak, sentetik hidrojellerde anjiyojenik filizlenmeyi incelemek ilginç olacaktır, çünkü tanımlanmış bileşimleri testin standardizasyonunu daha da arttırır ve hücre-matris etkileşimlerini etkileyen sertlik ve bağlayıcı motiflerin ayarı sağlar.
Sonuç olarak, bu yöntem, fizyolojik ilgili kültür koşullarını, gerekli sağlamlık ve ölçeklenebilirliğe sahip bir platformda birleştiren standart ve ölçeklenebilir 3D anjiyojenik bir testte iPSC kaynaklı EC'lerin fizibilitesini gösterir. uyuşturucu tarama altyapısı.
Disclosures
P. Vulto ve T. Hankemeier Mimetas BV'nin hissedarlarıdır. V. Borgdorff ve A. Reijerkerk Ncardia BV çalışanlarıdır. V. van Duinen, W. Stam, V. V. Orlova ve A.J. van Zonneveld'in herhangi bir açıklaması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Hollanda Sağlık Araştırma ve Geliştirme Örgütü'nün (ZonMw) ve Hollanda Kalp Vakfı CVON konsorsiyumu hibesinin 'Meer Kennis met Minder Dieren' programı (proje numarası 114022501) tarafından desteklenmiştir. Yeniden bağlanma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2-10 μL Electronic repeater pipette | Sigma | Z654566-1EA | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-056 | |
| 3-lane OrganoPlate | Mimetas | 4003-400B | |
| 4% PFA in PBS | Alfa Aesar | J61899 | |
| Basal culture medium | NCardia | ||
| Collagen-1 | Cultrex | 3447-020-01 | |
| Combitips Advanced Biopur 2.5 mL | VWR | 613-2071 | |
| dPBS | Gibco | 14190-094 | |
| Eppendorf Repeater M4 pieptte | VWR | 613-2890 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759-1MG | 1 mg/mL in milliQ water |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | |
| Hoechst | Molecular Probes | H3569 | 10 mg/mL solution in water |
| iPSC-derived endothelial cells | NCardia | ||
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 37 g/L in milliQ water |
| OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | Mimetas | Rocker platform used to provide flow | |
| Pen/Strep | Sigma | P4333 | |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | 1 mg/mL in DMSO |
| PMA | Focus-Biomolecules | 10-2165 | 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO |
| S1P | Ecehelon Biosciences | S-2000 | 1 mM in methanol containing 1% acetic acid |
| TRITC-albumin | Invitrogen | A34786 | |
| VEGF | Peprotech | 450-32-10 | 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA |
References
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods in Molecular Biology. , 17-28 (2013).
- Kim, S., Chung, M., Jeon, N. L. Three-dimensional biomimetic model to reconstitute sprouting lymphangiogenesis in vitro. Biomaterials. 78, 115-128 (2016).
- Kim, C., Kasuya, J., Jeon, J., Chung, S., Kamm, R. D. A quantitative microfluidic angiogenesis screen for studying anti-angiogenic therapeutic drugs. Lab Chip. 15 (1), 301-310 (2015).
- Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), e0133880 (2015).
- Tourovskaia, A., Fauver, M., Kramer, G., Simonson, S., Neumann, T. Tissue-engineered microenvironment systems for modeling human vasculature. Experimental biology and medicine. 239 (9), 1264-1271 (2014).
- Junaid, A., Mashaghi, A., Hankemeier, T., Vulto, P. An end-user perspective on Organ-on-a-Chip: Assays and usability aspects. Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 15-22 (2017).
- Pagano, G., et al. Optimizing design and fabrication of microfluidic devices for cell cultures: An effective approach to control cell microenvironment in three dimensions. Biomicrofluidics. 8 (4), 046503 (2014).
- Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8, 14361 (2017).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Passier, R., Orlova, V., Mummery, C. Complex Tissue and Disease Modeling using hiPSCs. Cell Stem Cell. 18 (3), 309-321 (2016).
- van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
- Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids Barriers CNS. 15 (1), 23 (2018).
Tags
Biyomühendislik Sayı 153 3D hücre kültürü mikroakışkanlar in vitro insan kaynaklı pluripotent kök hücreler endotel hücreleri anjiyogenez gradyanlar yüksek iş gücü taraması elekgelişimiErratum
Formal Correction: Erratum: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro
Posted by JoVE Editors on 01/25/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro. The Protocol section was updated.
Step 2.6 of the Protocol was updated from:
Add 50 µL of 10 µg/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the outlet (well C1) without filling the outlet well.
to:
Add 50 µL of 10 µg/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the inlet (well A1) without filling the inlet well.
Step 3.7 of the Protocol was updated from:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion inlet (well A1). Add 25 µL of basal medium in the inlet wells (well A1).
to:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion outlet well (A3) and replace with 25 µL of basal medium in the outlet well (well A3).
