Summary
我们描述了人类外周血单核细胞(PBMC)–基于人体的异种移植小鼠模型,用于转化免疫肿瘤学研究。该协议可作为建立和描述类似I-O治疗评估模型的一般准则。
Abstract
近年来免疫肿瘤学(I-O)疗法的发现和发展是癌症治疗的一个里程碑。然而,治疗挑战依然存在。健壮且与疾病相关的动物模型是继续临床前研究和开发的重要资源,以解决一系列额外的免疫检查点。在这里,我们描述了人类外周血单核细胞(PBMC)-基于人性化异种移植模型。BGB-A317(Tislelizumab)是一种在晚期临床开发中研究性的人性化抗PD-1抗体,作为讨论平台设置、模型特征和药物疗效评估的例子。这些人性化的小鼠支持大多数经过测试的人类肿瘤的生长,从而允许在人类免疫和人类癌症的背景下评估I-O疗法。一旦建立,我们的模型是比较时间和成本效益,通常产生高度可重复的结果。我们建议本文中概述的协议可以作为建立小鼠模型的一般指南,该模型与人类PBMC和肿瘤重组为I-O研究。
Introduction
免疫肿瘤学(I-O)是一个迅速扩大的癌症治疗领域。研究人员最近开始意识到调节免疫系统作用对肿瘤的攻击作用。免疫检查点封锁已经证明了各种癌症类型的令人鼓舞的活动,包括黑色素瘤,肾细胞癌,头和颈部,肺,膀胱和前列腺癌1,2。与直接杀死癌细胞的目标疗法相反,I-O疗法能增强人体免疫系统攻击肿瘤3。
迄今为止,已经建立了许多相关的I-O动物模型。这些包括:1)小鼠肿瘤细胞系或肿瘤同源性小鼠;2)来自基因工程小鼠(GEM)或致癌物的自发性肿瘤;3) 功能性鼠免疫系统中与人类药物靶点敲的嵌合的GEM;4)用人类癌细胞或患者衍生异种移植物(PDXs)移植的具有重组人体免疫力的小鼠。每种模型都有明显的优势和局限性,这些优点和局限性已在其他地方广泛描述和审查。
复生人类免疫免疫缺陷小鼠作为转化I-O研究的临床相关方法,已日益受到重视。这通常是通过成人免疫细胞(例如,外周血单核细胞 (PMBC))5、6 或 2) 从脐带血或胎儿的造血干细胞 (HSC) 的移植来实现的肝脏7,8。这些人性化的小鼠可以支持人类肿瘤的生长,从而允许在人类免疫和人类癌症的背景下评估I-O疗法。尽管这些优点,但人性化小鼠在I-O研究中的应用通常受到一些顾虑的阻碍,例如模型开发时间长,成本相当高。
在这里,我们描述了一个基于人类PBMC的模型,可以广泛应用于翻译I-O研究。该模型在疗效研究中具有较好的时间和成本效益,具有很高的可重复性。它已被内部用于评估目前正在临床前和临床开发中的几种I-O疗法。BGB-A317(Tislelizumab),一种研究性的人性化抗PD-1抗体9,作为例子,讨论模型开发、表征以及抗肿瘤疗效分析的可能应用。
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Protocol
在涉及人类参与者的研究中进行的所有程序都符合BeiGene和/或国家研究委员会的道德标准,以及1964年《赫尔辛基宣言》及其后来的修正或类似的道德标准。研究中的所有个人参与者都得到了知情同意。在涉及动物的研究中执行的所有程序都得到北金内部审查委员会的批准。该协议已针对人体化NOD/SCID小鼠的BGB-A317(Tislelizumab)的评估进行了专门调整。
1. 建立基于人PBMC的模型
-
使用环磷酰胺测定NOD/SCID小鼠的骨髓消融:确定最佳剂量
- 购买雌性NOD/SCID小鼠(6-8周)。
注:参与这项研究的所有小鼠都是雌性。 - 在盐水中制备不同剂量(50、100和150毫克/千克)的环磷酰胺(CP)。在125毫克/千克的盐水中制备0.8%补钙-80的脱硫硫兰(DS)。
注:为获得不同剂量CP的小鼠,准备了不同浓度的CP,使药物溶液的施用量相等。 - 每天用CP(即p.p.)和DS(p.o.)治疗动物,为期2天。每剂量的CP后给予DS(p.o.)2小时。
注:DS降低小鼠中CP的尿毒性,CP与DS结合,比单独使用CP治疗的动物具有更持久的中性粒细胞减少期10 CP的剂量方案可能需要在实际研究之前预先确定,并且发现有变化不同免疫缺陷小鼠菌株之间略有间。 - 从轨道静脉鼻塞收集血液样本,并在第0天(第1次剂量前1小时)、第2天(第二次剂量后24小时)和第4天(第二次剂量后72小时)转移到冰上的EDTA-K涂层管。
- 检查FACSCP和DS治疗后的骨髓消融效果。使用大鼠抗小鼠CD11b(M1/70)、大鼠抗小鼠Ly6C(HK1.4,)和大鼠抗小鼠Ly6G(1A8)进行注控CD11b+Ly6G高如中性粒细胞,CD11b+Ly6C高为单核细胞11,12。
- 记录小鼠的体重和健康状况,每天一周。CP 和 DS 的最佳剂量被确定为在不对小鼠造成严重毒性的情况下导致嗜中性粒细胞和单核细胞最大消耗的方案。
- 购买雌性NOD/SCID小鼠(6-8周)。
-
人体PBMC移植与肿瘤移植:模型设置
- 根据制造商的说明,通过密度梯度离心将人体PBMC与健康捐赠者隔离。
- 按照步骤1.1.2和1.13所示,用CP和DS预处理小鼠,以提高移植效率。
- 第二次剂量CP和DS后20至24小时,注射人体肿瘤细胞系,如A431细胞(ATCC,2.5 x10 6)和5 x 106分离的PBMC(混合在共200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,含有50%母体凝胶)或肿瘤片段(3 x 3 x3 mm 3,总体积为 200 μL PBS,包含 50% Matrigel)和 200 μL 5 x 106 PBMC(100 μL 各到移植肿瘤片段的左侧和右侧)(s.c.)在动物的右侧皮下。
- 测量原发性肿瘤体积,每周记录两次,持续4-6周。
注:一旦小鼠的体量下降超过20%,或者肿瘤体积达到2,000 mm3或肿瘤溃疡,它们将被安乐死。 - 用二氧化碳在气室中使老鼠安乐死。用眼科剪刀收集牺牲小鼠的整个肿瘤组织,并对其进行组织学和免疫组织化学(IHC)分析。检查这些组织中的人类CD8、PD-1和PD-L1表达。请参阅协议步骤 4。
2. PBMC 捐助者屏幕
- 筛选一组PBMC捐助者,因为从个人收集的PBMC的预期变化。根据步骤1.2所示的程序,使用A431细胞与不同捐赠者的PBMC共同注射。
注:在研究中筛选了50多名健康的PBMC捐赠者,以便获得足够的适当捐助者。希望采用此协议的研究人员可能会根据计划研究的设计,自行决定筛查多少健康的PBMC捐赠者。 - 用卡钳测量,每周监测肿瘤体积两次。
注:肿瘤生长率可能因不同捐赠者的PBMC而异。 - 以平均体积 200-500 mm3收集肿瘤组织,并对其进行组织学和免疫组织化学 (IHC) 分析。检查人类 CD8、PD-1 和 PD-L1 表达式。有关详细协议,请参阅步骤 4。
- 选择导致中度肿瘤生长的PBMC捐赠者(肿瘤体积 > 200 mm3接种后 14 天)和相对较高的 PD-1、PD-L1 和 CD8 表达(平均 IHC 分数 > 2)。有关详细的 IHC 评分协议,请参阅步骤 4。
3. 人类癌细胞系和PDX屏幕
- 屏幕细胞系和PDX按照步骤1.2所述的程序,评估肿瘤生长速率、人体PD-L1肿瘤表达和免疫细胞渗透。
注:作者对30多个人类癌细胞系和20多种不同癌症类型的PDX进行了筛查。所选肿瘤模型的数据显示在结果部分。
4. 免疫组织化学(IHC)
- 按步骤1.2.5指示收获,通过浸入形式化来修复肿瘤组织。脱水,将固定组织嵌入石蜡中。将固定组织分割在3μm处,并把它们放在多酶涂层的幻灯片上。
- 在二甲苯中脱胶三次,每次7分钟。通过分级酒精将部分水化:100%乙醇两次,每次3分钟,然后是90%、80%和70%乙醇,各3分钟。用去离子H2O冲洗三次,从滑道中取出多余的液体。
- 通过将滑轨放入容器中,并盖上 10 mM 柠子酸钠缓冲液 (pH 6.0) 或 Tris-EDTA (pH 9.0), 执行抗原检索。用微波炉加热滑水容器3分钟,在95°C的水浴中煮沸30分钟,然后冷却至室温。用去离子H2O冲洗三次,并从幻灯片中吸出多余的液体。
- 在PBS中用3%的牛血清白蛋白在PBS中阻断1小时和0.3%H2O2溶液10分钟。 在4°C过夜时,通过抗体对人体CD8(EP334)、PD-1(NAT105)和PD-L1(E1L3N)进行抗体染色,HRP在RT时结合第2个抗体将基板 DAB(3,3'-二氨基苯甲酸)滴到幻灯片上,并通过从显微镜监测棕色来控制反应时间(秒到分钟)。
- 将滑片浸入0.5%盐酸醇和0.5%氨水中,依次为5s,然后依次在80、90%和100%乙醇中,每次3分钟,最后在二甲苯中,使用三次变化,每次5分钟。使用显微镜观察 DAB 的棕色,检测抗体。
注:人类CD8和PD-1对肿瘤渗透细胞(TIL)的表达是通过在高目标放大倍率(20x,40x)下分配5分尺度(IHC分数,范围0-4)的表达分数来评估的。0,缺席;1、弱强度/小于20%的细胞;2、弱至中强度/20%-50%细胞;3、中强度至强强度/50%-80%细胞;4、强强度/80%以上的细胞。由于肿瘤细胞中相对扩散的信号,使用调整的评分系统在5分尺度(IHC评分,范围0-4)对肿瘤细胞内的人类PD-L1染色进行评分。0,缺席;1、弱强度/小于10%的细胞;2、弱至中度强度/10%-30%细胞;3、中度/30%-50%细胞;4、强强度/超过50%的细胞。
5. 在人性化 PBMC-NOD/SCID 异种移植模型中的 Vivo 功效和药效学研究
- 如步骤 1.1.3 所示,预处理 NOD/SCID 小鼠。简而言之,每天用100毫克/千克CP(即p.p.)和125毫克/千克DS(p.o.)治疗小鼠2天。
- 第二次剂量后20至24小时,在动物的右前侧翼注射指示数量的人类癌细胞和2.5-5 x 106 PBMC(共200μL细胞混合物,以50%Matrigel为单位)
注:单个研究中用于单个小鼠的 PBMC 数量应相同。然而,由于每次研究时总分离的PBMC的可用性不同,作者选择在不同的研究中使用2.5 x 10 6,4 x106或5 x 106 PBMC。虽然PBMC施用量的2倍差异可能会影响人性化程度,但作者在评估经测试的免疫疗法的抗肿瘤效果时并没有观察到显著差异。 - 对于PDX的移植,在动物的右前侧翼注射皮下肿瘤片段(3 x 3x 3 mm 3)。在移植肿瘤片段的左侧和右侧注射皮下200 μL的5 x 106 PBMC(每侧100 μL)。
注:PDX肿瘤组织在Matrigel溶液中施用,与细胞系模型描述相同。 - 在细胞接种当天,随机分组动物,并作为计划的研究方案处理。 评估候选药物BGB-A317(QW,i.p.)的抗肿瘤活性,在本例中,以指示剂量在各种肿瘤模型中。
注:三种人类癌细胞系(即A431(肿瘤肿瘤)、SKOV3(卵巢癌)和SK-MES-1(肺癌))以及两种PDX模型(即BCLU-054(肺癌)和BCCO-028(结肠癌))被认为是I-O治疗的良好肿瘤模型在这个人性化的鼠标模型中进行评估。 - 使用卡钳每周测量原发性肿瘤体积两次。
注:在我们的研究中,在PBMC移植后4-6周左右观察到甘德体重损失,允许1-2个月的时间窗口进行疗效评估。 - 对于肿瘤渗透免疫细胞的药效动力学分析,将肿瘤组织切成小块,在RPMI1640加5%的胎儿牛血清(FBS)中用蛋白胶酶I型(1mg/mL)和DNaseI(100μg/mL)在37°C下消化30分钟。通过40μm细胞过滤器的消化组织获得单细胞悬浮液。
- 在 96 孔圆形底板中,在冰冷的 FACS 缓冲液(PBS,1% FBS)中清洗细胞数,并将细胞数调整到 1 x 107细胞/mL的浓度。通过离心洗涤细胞,并通过加入20μg/mL人IgG30分钟,然后用抗人CD3(HIT3a)、CD8(OKT8)和PD-1(MIH4)抗体在4°C下染色30分钟。"然后对染色样品进行流动细胞测定,并使用 GuavaSoft 3.1.1 进行分析。
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Representative Results
按照此处介绍的程序,成功建立了基于 PBMC 的人性化异种移植模型。总之,在CP和DS治疗后,通过对嗜中性粒细胞和单细胞种群的流细胞测定分析,确定了NOD/SCID小鼠的CP骨髓消融效应(图1)。100毫克/千克CP加125毫克/千克DS被确定为最佳剂量,并在后来的研究中使用,因为该方案可导致嗜中性粒细胞和单核细胞的最大耗竭,而不会对小鼠造成严重毒性。其次,进行了人体PBMC和肿瘤移植。IHC验证了人体免疫细胞在肿瘤微环境中的渗透(图2)。
一组PBMC的捐赠者在体内进行了筛查,以确保在肿瘤微环境中相对较高的免疫细胞渗透和可接受的肿瘤生长率(第2节,图3A)。同时,筛选了30多个人类癌细胞系和20多种不同癌症类型的PDX,以评估肿瘤生长率、肿瘤PD-L1表达和免疫细胞渗透(第3节)。代表结果如图3B所示。
然后,这些PBMC移植的人性化小鼠用于检查BGB-A317的抗肿瘤活性。从选定的健康捐赠者身上的人类PBMC被联合注射人类肿瘤细胞(A431、SKOV3和SK-MES-1)或从癌症患者(BCCO-028和BCLU-054)衍生的原发性肿瘤组织片段(BCCO-028和BCLU-054)。如图4所示,小鼠从肿瘤植入当天起每周接受一次BGB-A317或PBS内腹治疗。在上述所有模型中,BGB-A317表现出显著的抗肿瘤活性(图4)。
图 1:使用环磷酰胺(CP)和二硫磷胺(DS)的NOD/SCID小鼠的骨髓消融。(A) 用于识别骨髓细胞子集(包括嗜中性粒细胞和单核细胞)的识别策略。(B) 骨髓细胞 (CD11b+)、 中性粒细胞 (CD11b+Ly6G+) 和单核细胞 (CD11b+Ly6C+) 数的代表性结果, 不同剂量的 CP 治疗.框表示值的第 75、50 和 25 百分位数。顶部和底线分别表示 1.5 倍 IQ(季度间)范围内的最大和最小数据点。n = 3 表示车辆组,n = 6 表示 CP 和/或 DS 处理组。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:人体PBMC移植和肿瘤移植。(A) 显示基于 PBMC 的人性化异种移植模型的一般工作流程的原理图.(B) A431细胞在与供体PBMC联合注射时的肿瘤生长,具有指示条件(数据表示平均肿瘤体积= SEM,n = 6)。(C) IHC 分析在使用 CP+DS 或不使用 CP+DS 治疗的小鼠中开发的肿瘤。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:PBMC供体和人体癌细胞系屏幕。(A) 来自 PBMC 捐赠者屏幕的代表性汇总数据.PBMC与A431细胞混合,在人性化NOD/SCID小鼠中接种皮下(参见步骤2)。每个点表示从 1 个供体中移植的 3 个小鼠的平均数据值。(B) 人类癌细胞系屏幕的代表性结果. 从选定的捐赠者的PBMC联合注射A431,SK-MES-1或SKOV3细胞。数据表示从3只小鼠中收集的肿瘤体积=SEM,指示细胞系接种后14天。平均IHC分数 = SEM表示所有3只小鼠中人类CD8、PD-1和PD-L1的平均表达。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:基于PBMC的人性化异种移植模型中BGB-A317的抗肿瘤活性和药效动力学分析。BGB-A317的抗肿瘤活性在指示剂量(即p.p.,QW)评估使用人类癌细胞系(A)A431(5 x 106 PBMC),(C) SKOV3(5 x 106 PBMC),(D ) SK-MES-1(5 x 106 PBMC),以及患者衍生异种移植物 (PDX) (E) BCLU-054 (带 5 x 106 PBMC) 和 (F)BCCO-028 (带 5 x 106 PBMC)。从选定的健康捐赠者和相应的肿瘤细胞的PBMC被共同注射皮下到人性化的NOD/SCID小鼠(n = 8至10)。(B) 在BGB-A317治疗A431肿瘤的BGB-A317中,肿瘤渗透hCD8+和hCD8_hPD-1+细胞的定量化。n = A 组每组 8-10 只动物,B 组中 C 到 F,n = B 组每组 4-6 只动物;数据表示均值 = SEM。在等值方差假设下,使用双尾未配对学生 t 检验来评估显著性。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
近年来,我们对癌症发展和进展的认识有了显著的进步,重点是全面了解肿瘤细胞及其相关频闪。利用宿主免疫机制可以引起对癌细胞的更大影响,这是一种有前途的治疗策略。具有完整小鼠免疫系统的鼠模型,如合成和GEM模型,已被广泛用于研究检查点介导的免疫。使用这些模型的功效评估主要取决于代理抗小鼠靶抗体13,14。然而,人类和鼠的免疫系统之间的固有差异和在鼠模型中缺乏一些人类靶点限制了I-O抗肿瘤效应的临床前研究15、16。因此,迫切需要包括人体免疫细胞和人类肿瘤在内的强健小鼠模型,这将显著改善新型I-O疗法的翻译和发展。
在这里,我们描述了一个基于PBMC的人类异种小鼠模型,该模型可能广泛用于翻译I-O研究。PBMC 供体以及癌细胞系/PDX 屏幕对于确保体内疗效研究的鲁棒性和可重复性至关重要。PBMC的捐赠者在体内接受筛查,以确保成功的人类肿瘤和免疫细胞移植。同时,筛选了50多种人类癌症来源的细胞系和PDX,以评估肿瘤生长率、人PD-L1表达和免疫细胞渗透。我们的分析表明,约20%的癌细胞系和PDX检查显示可接受的肿瘤生长率,同时具有相对较高的TLL和PD-L1染色,这被认为是I-O疗效评估的良好模型。
HLA匹配在诊所中经常使用,以匹配患者和捐赠者进行器官或骨髓移植17。然而,作者只对HLA类型进行了有限的描述,这仍然是一个有趣的话题,要在未来的研究中加以研究。作者希望指出,PBMC捐赠者可能适合一个癌细胞系/PDX,但不适合其他细胞系。因此,可能需要对PBMC的捐赠者进行每种癌症模型的筛查,以确保取得最佳结果。
将人类PBMC移植到NOD/SCID或NSG小鼠中必然导致异种性移植-宿主疾病(xGvHD),这是一种移植后疾病,由供体T细胞18、19对受体组织的免疫介导攻击而产生。通常与xGVHD相关的临床观察在我们的人性化模型中被观察到,如红斑、驼背姿势、体重减轻和死亡率(未显示数据)。这些表型通常在我们研究结束时观察到,通常在移植后1-2个月,表明人类T细胞在xGVHD靶器官中的繁殖和渗透。这允许1-2个月的窗口治疗I-O治疗评估。已经使用几种方法来降低小鼠先天免疫和增强人类免疫细胞移植20,21。例如,在注射PBMC22后,在缺乏急性xGvHD的情况下,在MHC I类和II类表达中有缺陷的NSG小鼠支持功能性人类T细胞的移植。
该协议使用了NOD/SCID小鼠。SCID突变的小鼠同源性有损T和B细胞淋巴细胞发育,NOD背景又导致自然杀伤者(NK)细胞功能不足20。其他免疫缺陷程度高的小鼠,如NSG(杰克逊实验室)、NCG(查尔斯河)和NOG(CIEA)菌株,已经建立。当与PBMC移植时,这些小鼠被证明发展出人类免疫细胞,并形成一个类似于人类免疫系统23,24的环境。或者,这些小鼠可以移植CD34+人类造血祖细胞(HPCs),并显示更持久的T细胞分化和成熟25。此外,已经建立了下一代免疫缺陷小鼠模型,具有进一步的基因修饰,以支持更好的人类骨髓系发育和提高移植效率(请参阅杰克逊实验室和塔科尼奇生物科学)。
使用这些新菌株进行人体免疫重建的更多细节有待进一步调查。然而,本文中概述的协议可以作为建立和描述用人类PBMC重组的免疫缺陷小鼠模型的一般准则。本文演示了三种人类癌症细胞系和两种人类患者衍生的异种移植物,涵盖多种癌症类型,这表明我们的方案在翻译I-O研究中的潜在广泛应用。据我们所知,大多数人性化的PBMC模型都选择了IV或IP作为注射路线26,27。相反,我们的模型通过将人类PBMC与癌症异种移植物混合在皮下,为人类肿瘤携带小鼠提供部分重组的人类免疫力。这种方法提供了一种快速、经济、但高度可重复的替代完全干细胞重组(例如,CD34–造血干细胞移植的人性化小鼠)。我们的模型已被证明有助于评估T细胞引体癌症免疫疗法,特别是在短时间工作或选择制剂之前转向更复杂的多系免疫模型。
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Disclosures
所有作者都拥有北金的所有权权益。张同和康力是本研究中描述的BGB-A317专利的发明者。
Acknowledgments
我们感谢实验室成员进行有益的讨论。这项工作得到了北京市科委生物医学和生命科学创新与培养研究项目的一部分支持。Z151100003915070(项目"新免疫肿瘤抗肿瘤药物BGB-A317的临床前研究"),也部分得到公司内部临床前研究资金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14 G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
References
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