Summary
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)-翻訳免疫腫瘍学研究のためのヒトヒト異種移植片マウスモデルについて説明する。このプロトコルは、I-O療法評価のための同様のモデルを確立し、特徴付けるための一般的なガイドラインとして役立つ可能性があります。
Abstract
近年の免疫腫瘍学(I-O)療法の発見と開発は、がん治療における画期的な出来事です。しかし、治療の課題は続きます。堅牢で疾患に関連する動物モデルは、追加の免疫チェックポイントの範囲に対処するために、継続的な前臨床研究開発のための重要なリソースです。ここでは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)-ヒト化異種移植片モデルについて説明する。BGB-A317(Tislelizumab)は、後期臨床開発におけるヒト化抗PD-1抗体の研究例として、プラットフォームのセットアップ、モデル特性評価および薬剤有効性評価を議論する例として用いられる。これらのヒト化マウスは、試験されたほとんどのヒト腫瘍の増殖を支持し、したがって、ヒト免疫とヒト癌の両方の文脈におけるI-O療法の評価を可能にする。確立されると、当社のモデルは比較的時間と費用対効果が高く、通常は非常に再現性の高い結果をもたらします。我々は、この記事で概説するプロトコルが、ヒトPBMCおよび腫瘍で再構成されたマウスモデルを確立するための一般的なガイドラインとして役立つことを示唆する。
Introduction
免疫腫瘍学(I-O)は、がん治療の急速に拡大する分野です。研究者は最近、腫瘍を攻撃するために免疫系の機能を調節する治療の可能性を理解し始めています。免疫チェックポイント遮断は、黒色腫、腎細胞癌、頭頸部、肺、膀胱および前立腺癌1、2を含む様々な癌タイプにおける励ましの活動を実証している。がん細胞を直接殺す標的治療とは対照的に、I-O療法は腫瘍3を攻撃するために身体の免疫系を増強する。
現在までに、関連するI-O動物モデルが数多く確立されています。これらには、1)マウス腫瘍細胞株または同種マウスにおける腫瘍ホモグラフトが含まれる。2)遺伝子組み換えマウス(GEM)または発癌性誘導に由来する自発性腫瘍;3)機能的なマウス免疫系におけるヒト薬物標的のノックインを有するキメラGEM;そして4)ヒト癌細胞または患者由来異種移植片(PDX)で移植された再構成ヒト免疫を有するマウス。これらの各モデルには明らかな利点と制限があり、他の場所で広く説明され、見直されています4.
免疫不備マウスにおけるヒト免疫の再構成は、翻訳I-O研究の臨床的に関連するアプローチとして高く評価されている。これは通常、成人免疫細胞の1)捕等(例えば、末梢血単核細胞(PMBC))5、6、または2)造血幹細胞(HSC)の生着、例えば臍帯血または胎児から達成される。肝臓7,8.これらのヒト化マウスはヒト腫瘍の増殖を支持し、ヒト免疫とヒト癌の両方の文脈におけるI-O療法の評価を可能にする。利点にもかかわらず、I-O研究におけるヒト化マウスの応用は、通常、モデル開発時間が長く、コストがかなり高いなど、いくつかの懸念によって妨げられた。
ここでは、翻訳I-O研究に広く応用できるヒトPBMCベースのモデルについて述べた。このモデルは有効性の研究の高い再現性と比較的時間および費用効果が大きい。それは現在前臨床および臨床開発の間のいくつかのI-Oの治療の評価のために社内で使用されている。BGB-A317(Tislelizumab)は、ヒト化された抗PD-1抗体9を、モデル開発、特性評価、および抗腫瘍有効性分析への応用を議論する例として用いられる。
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Protocol
人間の参加者を含む研究で行われたすべての手順は、BeiGeneおよび/または国家研究委員会の倫理基準に従い、1964年のヘルシンキ宣言とその後の修正または同等の倫理基準に従っていました。インフォームド・コンセントは、研究に含まれるすべての個々の参加者から得られました。動物に関する研究で行われたすべての手順は、BeiGeneの内部審査委員会によって承認されました。このプロトコルは、ヒト化されたNOD/SCIDマウスにおけるBGB-A317(Tislelizumab)の評価のために特に調整された。
1. ヒトPBMCベースモデルの確立
-
シクロホスファミドを用いたNOD/SCIDマウスの骨髄アブレーション:最適用量の決定
- 女性のNOD/SCIDマウス(6-8週間)を購入します。
注:この研究に関与するすべてのマウスは雌であった。 - 生理生理で異なる用量(50、100および150 mg/kg)でシクロホスファミド(CP)を調調します。125 mg/kg で生理生理生理で 0.8% トゥエン-80 でディスルフィラム (DS) を調製します。
注:異なる濃度のCPは、異なる用量のCPを得るマウスに対して同量の薬物溶液の投与を可能にするために調製された。 - CP(i.p.)とDS(p.o.)を1日1回2日間治療する。CPの各用量の後にDS(p.o.)2hを与える。
注:DSはマウスにおけるCPの尿毒性を減少させ、およびDSと組み合わせたCPは、CP単独で治療された動物よりも長持ちする好中球減少症を有することが示唆された10 CPの用量レジメンは、実際の研究の前に事前に決定する必要があり、変化することが見出された異なる免疫不全マウス株の間でわずかに。 - 眼窩静脈静脈静脈から血液サンプルを採取し、0日目(1回目の用量の前に1時間)、2日目(2回目の用量の後24時間)、および4日目(2回目の用量後72時間)に氷上のEDTA-Kコーティングチューブに移す。
- FACSによるCPおよびDS処理後の骨髄切除効果を調べる。ラット抗マウスCD11b(M1/70)、ラットアンチマウスLy6C(HK1.4、)およびラットアンチマウスLy6G(1A8)を使用して、好中球としてCD11b +Ly6G高いガッティングを行い、CD11b +Ly6Cは単球11、12として高い。
- 1週間のマウスの体重と健康状態を毎日記録する。CPおよびDSの最適な用量は、マウスに重度の毒性を引き起こすことなく好中球および単球の最大枯渇をもたらすレジメンとして決定される。
- 女性のNOD/SCIDマウス(6-8週間)を購入します。
-
ヒトPBMC移植と腫瘍移植:モデルセットアップ
- 製造元の指示に従って密度勾配遠心分離によって健康なドナーからヒトPBMCを分離します。
- 移植効率を高めるために、ステップ1.1.2および1.1.3で示すように、CPおよびDSでマウスを前処理する。
- CPおよびDSの2回目の投与後20〜24時間、A431細胞(ATCC、2.5 x 106)および5 x 106単離されたPBMC(合計200μLリン酸緩衝生理食べ物(PBS)を50%マトリゲルを含む混合)などのヒト腫瘍細胞株を注入する。、または腫瘍断片(3 x 3 x3 mm 3、50%マトリゲルを含む200 μL PBSの総体積)および200 μLの5 x 106 PBMC(各々、生着腫瘍断片の左右に100μL)(s.c.)を動物の右側に皮下する。
- 原発性腫瘍の体積を測定し、週2回4-6週間記録する。
注:マウスは、体重が20%以上失うか、腫瘍体積が2,000mm3に達するか、腫瘍が潰瘍化すると安楽死させる。 - ガス室でマウスを二酸化炭素で安楽死させる。眼科はさみで犠牲マウスの腫瘍組織全体を収集し、組織学および免疫組織化学(IHC)分析のためにそれらを処理する。これらの組織におけるヒトCD8、PD-1およびPD-L1式を調べる。プロトコル・ステップ4を参照してください。
2. PBMCドナー画面
- 個人から収集されたPBMCから生じる予想される変動に起因するPBMCドナーのパネルをスクリーニングします。ステップ1.2で示す手順に従って、異なるドナーからのPBMCと共注入するA431細胞を使用してください。
注:50人以上の健康なPBMCドナーをスクリーニングし、適切なドナーの数を十分に得た。このプロトコルを採用したい研究者は、計画された研究の設計に基づいて、スクリーニングされる健康なPBMCドナーの数を自分で決定するかもしれません。 - キャリパーで測定することにより、週に2回腫瘍量を監視します。
注:腫瘍増殖速度は、異なるドナーからのPBMCによって異なる場合がある。 - 200-500 mm3の平均体積で腫瘍組織を収集し、組織学および免疫組織化学(IHC)分析のためにそれらを処理する。ヒトCD8、PD-1およびPD-L1式を調べる。詳細なプロトコルについては、手順 4 を参照してください。
- 中等度の腫瘍増殖をもたらすPBMCドナー(腫瘍容積> 200 mm3 14日接種後)と比較的高いPD-1、PD-L1およびCD8式(平均IHCスコア>2)を選択します。詳細な IHC スコアリング プロトコルについては、手順 4 を参照してください。
3. ヒトがん細胞株とPDXスクリーン
- ステップ1.2に記載された手順に従ってスクリーン細胞株およびPDXは、腫瘍増殖速度、腫瘍および免疫細胞浸潤のヒトPD-L1発現を評価する。
注:30以上のヒト癌細胞株と20種類以上の異なるがんタイプのPDXをスクリーニングした。選択した腫瘍モデルのデータを結果セクションに示した。
4. 免疫組織化学(IHC)
- ステップ1.2.5で示すように収穫し、ホルマリンに浸漬することにより腫瘍組織を固定する。脱水し、パラフィンに固定組織を埋め込みます.固定組織を3μmで切り取り、ポリリシンコーティングされたスライドに置きます。
- キシレンでデパラフィン化各3回7分。グレードアルコールを通じてセクションを水和する:100%エタノールをそれぞれ3分間に2回、次いで90%、80%、70%のエタノールをそれぞれ3分間順番に使用します。脱イオンH2 Oで3回すすいで、スライドから余分な液体を取り除きます。
- スライドを容器に入れ、10mMクチン酸バッファー(pH 6.0)またはトリスEDTA(pH 9.0)で覆って抗原検索を行います。スライド容器を電子レンジで3分間加熱し、95°Cの水風呂で30分間沸騰させ、室温まで冷やします。脱イオンH2 Oで3回すすいで、スライドから余分な液体を吸引する。
- PBSで3%ウシ血清アルブミンを1時間、0.3%H2 O2溶液を10分間PBSでブロックし、ヒトCD8(EP334)、PD-1(NAT105)、PD-L1(E1L3N)を一晩4°Cで、HRPは2nd抗体を結合した。1時間、基板DAB(3,3'-ジアミノベンジジン)をスライド上に落とし、顕微鏡から茶色をモニタリングして反応時間(秒~数分)を制御します。
- スライドを0.5%塩酸アルコールと0.5%のアンモニア水に順番に5sに浸した後、スライドを中性バルサムで覆い、次に80%、90%、100%エタノールをそれぞれ3分間順番に、最後に3分間3回の変化を用いてxylenesで覆います。顕微鏡を用いてDABの褐色を観察して抗体を検出します。
注:腫瘍浸潤性白細胞(TIL)に対するヒトCD8およびPD-1発現は、高い対次倍率(20倍、40倍)で5点スケール(IHCスコア、範囲0〜4)で発現スコアを割り当てることにより評価した。0、不在。1、弱強度/20%未満の細胞;2、弱から中程度の強度/20%-50%細胞;3、中等度から強い強度/50%-80%細胞;4、強強度/80%以上の細胞。腫瘍細胞内のヒトPD-L1染色は、その比較的拡散したシグナルのために、5点スケール(IHCスコア、範囲0-4)で調整されたスコアリングシステムを用いてスコア付けされた。0、不在。1、弱強度/10%未満の細胞;2、弱から中程度の強度/10%-30%細胞;3、中等度/30%-50%細胞;4、強強度/50%以上の細胞。
5. ヒト化PBMC-NOD/SCID異種移植片モデルにおける生体内有効性と薬理力学研究
- ステップ1.1.3で示すように、NOD/SCIDマウスを前処理する。簡単に言えば、100mg/kg CP(i.p.)および125mg/kg DS(p.o.)で2日間1回マウスを治療する。
- 2回目の投与後20〜24時間、動物の右前側腹にヒト癌細胞の示された数と2.5-5 x 106 PBMC(合計200μL細胞混合物50%マトリゲル)を用いて皮下注射する。
注:1回のスタディで個々のマウスに使用されるPBMCの数は同じでなければなりません。しかし、各研究の時点での総単離PBMCの可用性の変動のために、著者らは異なる研究で2.5 x 106、4 x 106、または5 x 106 PBMCを使用することを選択しました。PBMCの投与量のこの2倍の差はヒト化の程度に影響を与える可能性があるが、著者らは、試験された免疫療法の抗腫瘍有効性を評価する上で有意な差を観察しない。 - PDXの生着の場合は、動物の右前側に皮下腫瘍断片(3 x 3x 3 mm 3)を注入する。生着した腫瘍断片の左右に5 x 106 PBMC(各側100μL)の皮下200 μLを注入する。
注:PDX腫瘍組織は、細胞株モデルについて記載と同様に、Matrigel溶液中に投与した。 - 細胞接種の日に、動物をランダムにグループ化し、計画された研究プロトコルとして扱う。 候補薬の抗腫瘍活性を評価し、この場合、様々な腫瘍モデルにおける示された用量でBGB-A317(QW、i.p.)を評価する。
注:3つのヒト癌細胞株(すなわち、A431(エピデモイド癌)、SKOV3(卵巣癌)およびSK-MES-1(肺癌)、ならびに2つのPDXモデル(すなわち、BCLU-054(肺癌)およびBCCO-028(大腸癌))は、I-O療法のための良好な腫瘍モデルと考えられている。この人間化されたマウスモデルの評価。 - キャリパーを使用して、原発性腫瘍の体積を毎週2回測定します。
注:ガンド体重の損失は、我々の研究でPBMCの移植後4〜6週間の周りに観察され、治療有効性評価のための1〜2ヶ月のウィンドウを可能にした。 - 腫瘍浸潤免疫細胞の薬力学解析では、腫瘍組織を小片に切り、37°Cで30分間、RPMI1640のコラゲナーゼI型(1mg/mL)とDNase I(100μg/mL)と5%の胎児ウシ血清(FBS)で消化します。消化された組織を40 μmの細胞ストレーナーを通して渡し、単一細胞懸濁液を得る。
- 細胞を洗浄し、96ウェルの丸い底板で氷冷FACSバッファー(PBS、1%FBS)で1 x 107細胞/mLの濃度に細胞数を調整します。遠心分離によって細胞を洗浄し、30分間20μg/mLヒトIgGを加えてブロックし、続いて抗ヒトCD3(HIT3a)、CD8(OKT8)、PD-1(MIH4)抗体を4°Cで30分間染色します。その後、染色されたサンプルを被験者に浸透させ、guavaSoft 3.1.1を使用して細胞測定を流し、分析します。
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Representative Results
ここで提示された手順に従って、PBMCベースのヒト化異種移植片モデルが正常に確立されました。簡単に言えば、NOD/SCIDマウスにおけるCP骨髄切除効果は、好中球および単球集団の流れ細胞メトリー分析によって決定されたCPおよびDS処理後(図1)。100 mg/kg CP プラス 125 mg/kg DS は最適な用量として決定され、レジメンとして後の研究で使用され、マウスに重度の毒性を引き起こすことなく好中球および単球の最大枯渇をもたらす。次に、ヒトPBMCおよび腫瘍移植を行った。腫瘍微小環境におけるヒト免疫細胞浸潤の存在をIHCにより検証した(図2)。
PBMCドナーのパネルを生体内でスクリーニングし、腫瘍微小環境における比較的高い免疫細胞浸潤および許容可能な腫瘍増殖速度を確保した(セクション2、図3A)。一方、30以上のヒト癌細胞株と20種類以上の異なる癌タイプのPDXをスクリーニングし、腫瘍増殖速度、腫瘍PD-L1発現および免疫細胞浸潤を評価した(セクション3)。代表的な結果を図3Bに示した。
これらのPBMC生着型ヒト移植マウスを用いて、BGB-A317の抗腫瘍活性を調べた。選択された健康なドナーからのヒトPBMCは、ヒト腫瘍細胞(A431、SKOV3およびSK-MES-1)または癌患者由来の原発腫瘍組織断片(BCCO-028およびBCLU-054)と共に注射した。マウスを、図4に示すように、腫瘍移植の日から週1回、BGB-A317またはPBSを経頭腔内で治療した。上記のすべてのモデルにおいて、BGB-A317は有意な抗腫瘍活性を示した(図4)。
図 1: シクロホスファミド(CP)およびジスルフィラム(DS)を用いたNOD/SCIDマウスの骨髄アブレーション。(A) 好中球および単球を含む骨髄細胞サブセットを同定するために使用されるゲーティング戦略。(B)骨髄細胞の代表的な結果(CD11b+)、好中球(CD11b+Ly6G+)および単球(CD11b+Ly6C+)は、CP処理の異なる用量に対する数値である。ボックスは、値の 75 番目、50 番目、および 25 パーセンタイルを表します。上線と一番下の行は、それぞれ 1.5x IQ (四半期間) の範囲内の最大データ ポイントと最小データ ポイントを表します。車両グループの場合は n = 3、CP および/または DS 処理グループの場合は n = 6 です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: ヒトPBMC移植および腫瘍移植(A) PBMCベースのヒト化異種移植片モデルの一般的なワークフローを示す概略図。(B)示された条件を有するドナーPBMCとの皮下共注射時のA431細胞の腫瘍増殖(データは、平均腫瘍体積±SEM、n=6を表す)。(C) CP+DSの有無にかかわらず処置したマウスで発症した腫瘍のIHC分析。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: PBMCドナーおよびヒト癌細胞ラインスクリーン。(A) PBMCドナー画面からの代表的な要約データ。PBMCをA431細胞と混合し、ヒト化したNOD/SCIDマウスで皮下に接種した(ステップ2参照)。各ドットは、1ドナーからPBMCで移植された3匹のマウスの平均データ値を表す。(B) ヒト癌細胞株スクリーンからの代表的な結果。 選択したドナーからのPBMCをA431、SK-MES-1またはSKOV3細胞と共噴射した。データは、3匹のマウスから採取された平均腫瘍体積±SEMを表し、示された細胞株の14日目接種後である。平均IHCスコア±SEMは、全3マウスのヒトCD8、PD-1、およびPD-L1の平均発現を表す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: PBMCベースのヒト化異種移植片モデルにおけるBGB-A317の抗腫瘍活性および薬力学分析示された用量でのBGB-A317の抗腫瘍活性(i.p.,QW)は、ヒト癌細胞株(A)A431(5 x 106 PBMC)、(C)SKOV3(5 x 106 PBMC)、(D)SK-MES-1(5 x 106 PBMC)を用いて評価した。患者由来異種移植片(PDX)(E)BCLU-054(5 x 106 PBMC)および(F)BCCO-028(5 x 106 PBMC)。選択された健康なドナーおよび対応する腫瘍細胞からのPBMCを、ヒト化したNOD/SCIDマウス(n=8〜10)に皮下に同時に注入した。(B) BGB-A317における腫瘍浸潤hCD8+およびhCD8+hPD-1+細胞の定量化は、A431腫瘍を治療した。n = Aの群当たり8-10匹、C~F、n=B群当たり4~6匹。データは平均 ± SEM を表します。有意性は、不均等な分散を前提に、両尾のペアでない学生のt検定を用いて評価された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
近年、腫瘍細胞とそれに関連する間質の両方を総合的に理解することに重点を置き、がんの発症と進行に関する我々の知識は著しく進歩しています。宿主の免疫メカニズムを利用することは、がん細胞に対してより大きな影響を与える可能性があります, 有望な治療戦略を表す.同種およびGEMモデルのような無傷のマウス免疫系を有するマウスモデルは、チェックポイント媒介免疫の研究に広く用いられてきた。これらのモデルを用いた有効性評価は、サロゲート抗マウス標的抗体13,14に大きく依存する。しかし、ヒトとマウスの免疫系とマウスモデルにおける一部のヒト標的の欠如との本質的な違いは、I-O抗腫瘍効果15,16の前臨床試験を制限する。従って、ヒト免疫細胞とヒト腫瘍の両方を含む堅牢なマウスモデルが緊急に望まれており、これは新規なI-O治療薬の翻訳および開発を大幅に改善する。
ここでは、翻訳I-O研究に広く使用される可能性のあるヒトPBMCベースの異種移植片マウスモデルについて述べた。PBMCドナーだけでなく、癌細胞株/PDXスクリーンは、生体内有効性研究の堅牢性と再現性を確保するために重要です。PBMCドナーは、ヒト腫瘍および免疫細胞の生着を確実にするために生体内でスクリーニングした。一方、様々なヒト癌起源の50以上の細胞株およびPDXをスクリーニングし、腫瘍増殖速度、ヒトPD-L1発現、および免疫細胞浸潤を評価した。我々の分析は、癌細胞株とPDXの約20%が、I-O有効性評価の良いモデルと考えられている比較的高いTLSとPD-L1染色を有すると同時に、許容可能な腫瘍増殖速度を示していることを示唆している。
HLAマッチングは、臓器または骨髄移植のための患者およびドナーを一致させるために診療所で日常的に使用される17.しかし、著者たちはHLAタイピングに関して限られた特徴付けしか行っていないし、これは今後の研究で調査されるべき興味深いトピックのままである。著者らは、PBMCドナーが1つの癌細胞株/PDXに適しているかもしれないが、他の人には理想的ではないことに留意したいと思います。したがって、最適な結果を確保するために、PBMCドナーは、各癌モデルについてスクリーニングする必要があるかもしれません。
NOD/SCIDまたはNSGマウスへのヒトPBMCの移植は、常に異種移植片対宿主疾患(xGvHD)、ドナーT細胞によるレシピエント組織の免疫媒介攻撃から生じる移植後障害につながる18,19。xGVHDに一般的に関連する臨床観察は、紅斑、予感のある姿勢、体重減少および死亡率(データは示されていない)のような私たちのヒト化モデルで観察されている。これらの型は通常、我々の研究の終わりに向かって観察され、通常、xGVHD標的器官におけるヒトT細胞の伝播および浸潤を示す、通常1〜2ヶ月後に生着した。これは治療I-O療法の評価のための1-2ヶ月の窓を可能にする。いくつかのアプローチは、マウスの自然免疫を減少させ、ヒト免疫細胞生着性を高めるために利用されている20,21.例えば、マウスMHCクラスIおよびクラスII発現に欠損したNSGマウスは、PBMC22の注射後に急性xGvHDが存在しない場合の機能性ヒトT細胞の生着を支持する。
このプロトコルではNOD/SCIDマウスを用いた。SCID変異に対するマウスホモ接合性は、TおよびB細胞リンパ球の発達およびNODバックグラウンドを損なっており、さらに欠損したナチュラルキラー(NK)細胞機能20をもたらす。NSG(ジャクソン研究所)、NCG(チャールズリバー)、NOG(CIEA)株などの他のより高い免疫不全マウスが確立されている。PBMCで移植すると、これらのマウスはヒト免疫細胞を発達させ、ヒト免疫系23,24に似た環境を形成することを示している。あるいは、これらのマウスは、CD34+ヒト血行前駆細胞(HPC)で生着させることができ、より持続的なT細胞分化および成熟25を表示する。さらに、より良いヒト骨髄系統の発達と増入の効率の向上をサポートするために、さらなる遺伝子改変を伴う次世代免疫欠損マウスモデルが確立されている(のバリアントポートフォリオのウェブページを参照)ジャクソン研究所とタコニックバイオサイエンス)。
人間の免疫再構成のためにこれらの新しい株を使用する詳細は、さらなる調査を待っています.それにもかかわらず、この記事で概説するプロトコルは、ヒトPBMCで再構成された免疫不全マウスモデルを確立し、特徴付ける一般的なガイドラインとして役立つ可能性がある。この記事では、3つのヒト癌細胞株と2つのヒト患者由来異種移植片(がんタイプの範囲をカバーする)が実証されており、翻訳I-O研究における当社のプロトコルの潜在的な広範な応用を示唆している。ほとんどの人間化されたPBMCモデルは、私たちの知る限り、注射26、27のルートとしてIVまたはIPを選択しました。我々のモデルは代わりに、ヒトPBMCと癌異種移植片の皮下混合を通じてヒト腫瘍ベアリングマウスにおいて部分的に再構成されたヒト免疫を提供する。このアプローチは、完全な幹細胞再構成(例えば、CD34+造血幹細胞生着マウス)に対する迅速かつ費用対効果の高い、かつ再現性の高い代替を提供する。我々のモデルは、特に短いタイムラインで作業する場合や、より複雑な多系統免疫モデルに移行する前に薬剤を選択する場合に、T細胞に係合するがん免疫療法を評価するのに有用であることが証明されています。
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Disclosures
すべての著者はBeiGeneに所有権を持っています。トン・ザンとカン・リーは、本研究で説明するBGB-A317をカバーする特許の発明者である。
Acknowledgments
私たちは、私たちの研究室のメンバーに有益な議論に感謝します。この研究は、北京市科学技術委員会の生物医学・生命科学イノベーション・栽培研究プログラムの助成金第1号に部分的に支援されました。Z15100003915070(プロジェクト「新規免疫腫瘍学抗腫瘍薬BGB-A317に関する前臨床研究」)、また、前臨床研究のための社内資金によって部分的に支援された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14 G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
References
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