Summary
نحن نصف خلية الدم الطرفية البشرية أحادية النووية (PBMC) - على أساس أنسنة نموذج الماوس xenograft لبحوث الأورام المناعية الترجمة. ويمكن أن يكون هذا البروتوكول بمثابة مبدأ توجيهي عام لوضع نماذج مماثلة وتوصيفها لتقييم العلاج بالمعالجة I-O.
Abstract
اكتشاف وتطوير العلاج المناعي الأورام (I-O) في السنوات الأخيرة يمثل معلما في علاج السرطان. ومع ذلك، لا تزال تحديات العلاج قائمة. وتشكل النماذج الحيوانية القوية والمتصلة بالأمراض موارد حيوية لمواصلة البحث والتطوير قبل السريرية من أجل معالجة مجموعة من نقاط التفتيش المناعية الإضافية. هنا، نقوم بوصف خلية أحادية نوناأحادية للدم المحيطي البشري (PBMC) - نموذج xenograft ذو الطابع الإنساني. يستخدم BGB-A317 (Tislelizumab)، وهو جسم مضاد مضاد PD-1 في مرحلة متأخرة من التحقيق، كمثال لمناقشة إنشاء منصة، وتوصيف النموذج وتقييمات فعالية المخدرات. تدعم هذه الفئران الأنسنة نمو معظم الأورام البشرية التي تم اختبارها، مما يسمح بتقييم علاجات I-O في سياق كل من المناعة البشرية والسرطانات البشرية. وبمجرد إنشائها، يكون نموذجنا فعالاً من حيث الوقت والتكلفة نسبياً، وعادة ما يسفر عن نتائج قابلة للاستنساخ إلى حد كبير. نقترح أن البروتوكول المبين في هذه المادة يمكن أن تكون بمثابة مبدأ توجيهي عام لإنشاء نماذج الماوس المعاد تشكيلها مع PBMC الإنسان والأورام للبحوث I-O.
Introduction
الأورام المناعية (I-O) هو مجال سريع التوسع لعلاج السرطان. وقد بدأ الباحثون مؤخرا لتقدير الإمكانات العلاجية لتعديل وظائف الجهاز المناعي لمهاجمة الأورام. وقد أظهرت حواجز المناعة الحصار أنشطة مشجعة في مجموعة متنوعة من أنواع السرطان، بما فيذلك سرطان الجلد، سرطان الخلايا الكلوية، الرأس والرقبة، الرئة، المثانة وسرطان البروستاتا 1،2. على عكس العلاجات المستهدفة التي تقتل الخلايا السرطانية مباشرة، تقوي علاجات I-O الجهاز المناعي في الجسم لمهاجمة الأورام3.
وحتى الآن، تم وضع العديد من النماذج الحيوانية ذات الصلة I-O. وتشمل هذه: 1) خطوط الخلايا ورم الماوس أو homograft الورم في الفئران syngeneic; 2) الأورام العفوية المستمدة من الماوس المهندسة وراثيا (GEM) أو الحث المسرطن؛ 3) GEMs chimeric مع ضرب في هدف (أهداف) المخدرات البشرية في جهاز المناعة murine وظيفية؛ و4) الفئران مع المناعة البشرية المعاد تشكيلها المزروعة مع الخلايا السرطانية البشرية أو xenografts المستمدة من المريض (PDXs). كل من هذه النماذج لها مزايا واضحة، فضلا عن القيود، والتي تم وصفها واستعراضها على نطاق واسع في أماكن أخرى4.
إعادة تشكيل المناعة البشرية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة قد تم تقديرها بشكل متزايد كنهج ذات الصلة سريريا للبحوث I-O الترجمة. وعادة ما يتحقق ذلك إما من خلال 1) تطعيم الخلايا المناعية للبالغين (على سبيل المثال، الخلايا أحادية النووية أحادية اللانووية في الدم المحيطي (PMBC))5أو6أو 2) تطعيم الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) من، على سبيل المثال، دم الحبل السري أو الجنين الكبد7,8. هذه الفئران أنسنة يمكن أن تدعم نمو الأورام البشرية، مما يسمح بتقييم العلاجات I-O في سياق كل من المناعة البشرية والسرطانات البشرية. وعلى الرغم من المزايا، فإن تطبيقات الفئران الأنسنة في أبحاث I-O عادة ما تعوقها عدة شواغل، مثل وقت تطوير النموذج الطويل والتكلفة المرتفعة إلى حد كبير.
هنا، نقوم بوصف نموذج الإنسان القائم على PBMC التي يمكن تطبيقها على نطاق واسع لدراسات I-O الترجمة. هذا النموذج هو نسبيا الوقت وفعالة من حيث التكلفة مع استنساخ عالية في دراسات الفعالية. وقد تم استخدامه في المنزل لتقييم العديد من العلاجات I-O حاليا تحت التنمية قبل السريرية والسريرية. BGB-A317 (Tislelizumab)، وهوجسم مضاد مضاد PD-1 9، يستخدم كمثال لمناقشة تطوير النموذج، والتوصيف، والتطبيقات الممكنة لتحليل فعالية مكافحة الورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وكانت جميع الإجراءات التي أجريت في الدراسات التي شملت مشاركين من البشر متفقة مع المعايير الأخلاقية لـ BeiGene و/أو لجنة البحوث الوطنية ومع إعلان هلسنكي لعام 1964 وتعديلاته اللاحقة أو المعايير الأخلاقية المماثلة. وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المشاركين المشاركين المشاركين في الدراسة. وقد وافق مجلس المراجعة الداخلية في بيجين على جميع الإجراءات التي أجريت في الدراسات المتعلقة بالحيوانات. وقد تم تعديل هذا البروتوكول على وجه التحديد لتقييم BGB-A317 (Tislelizumab) في الفئران NOD/SCID أنسنة.
1 - وضع نموذج قائم على برنامج الإيثر الثنائي الفينيل المتعدد البروم
-
الاستئصال النخاعي للفئران NOD/SCID باستخدام سيكلوفوسفاميد: تحديد الجرعات المثلى
- شراء الإناث NOD / SCID الفئران (6-8 أسابيع).
ملاحظة: جميع الفئران المشاركة في هذه الدراسة كانت أنثى. - إعداد سيكلوفوسفاميد (CP) بجرعات مختلفة (50 و100 و150 ملغم/كغم) في المالحة. إعداد disulfiram (DS) في 0.8٪ توين-80 في المالحة في 125 ملغ / كغ.
ملاحظة: تم إعداد تركيزات مختلفة من CP لتمكين إدارة كميات متساوية من محلول المخدرات للفئران الحصول على جرعات مختلفة من CP. - علاج الحيوانات مع CP (i.p.) وDS (p.o.) مرة واحدة في اليوم لمدة 2 أيام. إعطاء DS (p.o.) 2 ساعة بعد كل جرعة من CP.
ملاحظة: DS يقلل من السمية البولية من CP في الفئران، وقد اقترح CP جنبا إلى جنب مع DS أن يكون العدلات أطول أمدا من الحيوانات المعالجة مع CP وحدها10 نظام الجرعة من CP قد تحتاج إلى أن تكون محددة مسبقا قبل الدراسات الفعلية ووجد أن تختلف قليلا بين سلالات الماوس المناعية المختلفة. - جمع عينات الدم من الجيوب الوريدية المدارية ونقلها إلى أنابيب EDTA-K المغلفة على الجليد في اليوم 0 (1 ح قبل الجرعة 1)، اليوم 2 (24 ساعة بعد الجرعةالثانية) واليوم 4 (72 ساعة بعد الجرعةالثانية).
- فحص تأثير الاستئصال النقوي بعد العلاج CP و DS من قبل FACS. استخدام الفئران المضادة للماوس CD11b (M1/70)، الفئران المضادة للماوس Ly6C (HK1.4، ) والفئران المضادة للماوس Ly6G (1A8) لgating CD11b+ Ly6Gعالية كما العدلات، CD11b+Ly6Cعالية كما monocytes11،12.
- تسجيل وزن الجسم والظروف الصحية للفئران يوميا لمدة أسبوع واحد. يتم تحديد الجرعة المثلى من CP و DS كنظام يؤدي إلى استنفاد أقصى قدر من العدلات والخلايا الأحادية دون التسبب في سمية شديدة للفئران.
- شراء الإناث NOD / SCID الفئران (6-8 أسابيع).
-
زرع PBMC البشري وتطعيم الورم: إعداد نموذج
- عزل مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم البشرية عن الجهات المانحة السليمة عن طريق تدرج الكثافة في الطرد المركزي وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.
- علاج مسبق للفئران مع CP و DS كما هو مبين في الخطوة 1.1.2 و 1.1.3 لزيادة كفاءة زرع.
- 20 إلى 24 ساعة بعد الجرعة الثانية من CP و DS، حقن خط الخلايا السرطانية البشريةمثل خلايا A431 (ATCC، 2.5 × 10 6) و 5 × 106 مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم معزولة (مختلطة في ما مجموعه 200 ميكرولتر من ملح الفوسفات المخزنة (PBS) التي تحتوي على 50٪ Matrigel) ، أو شظايا الورم (3 × 3 × 3 مم3، في حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر PBS تحتوي على 50٪ Matrigel) و 200 ميكرولتر من 5 × 106 PBMCs (100 ميكرولتر لكل منهما إلى الجانب الأيسر والأيمن من جزء الورم غير المطعم) (s.c.) تحت الجلد في الجناح الأيمن للالحيوانات.
- قياس حجم الورم الأساسي وسجل مرتين في الأسبوع لمدة 4-6 أسابيع.
ملاحظة: سيتم قتل الفئران بمجرد أن تفقد أوزان الجسم أكثر من 20٪ أو يصل حجم الورم إلى 2000 مم3 أو الورم تقرح. - قتل الفئران في غرف الغاز مع ثاني أكسيد الكربون. جمع أنسجة الورم كله في الفئران ضحى مع مقص العيون ومعالجتها لتحليل الأنسجة والكيمياء المناعية (IHC). فحص تعبيرات CD8 و PD-1 و PD-L1 البشرية في هذه الأنسجة. راجع الخطوة البروتوكولية 4.
2. PBMC شاشة المانحين
- عرض فريق من الجهات المانحة للPBMC بسبب الاختلافات المتوقعة الناتجة عن مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم التي تم جمعها من الأفراد. استخدام خلايا A431 التي تحقن بصورة مشتركة مع مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم من مختلف الجهات المانحة وفقاً للإجراءات المبينة في الخطوة 1-2.
ملاحظة: وقد تم فحص أكثر من 50 من المتبرعين الأصحاء في هذا البرنامج في الدراسة من أجل الحصول على عدد كاف من المانحين المناسبين. وقد يقرر الباحثون الذين يرغبون في اعتماد هذا البروتوكول بأنفسهم عدد المتبرعين الصحيين في برنامج PBMC الذين سيتم فحصهم، استناداً إلى تصميم الدراسات المخطط لها. - مراقبة حجم الورم مرتين في الأسبوع عن طريق قياس مع الفرجار.
ملاحظة: قد يختلف معدل نمو الورم مع PBMC من مختلف الجهات المانحة. - جمع أنسجة الورم في حجم متوسط من 200-500 مم3 ومعالجتها لتحليل الأنسجة والكيمياء المناعية (IHC). فحص تعبيرات CD8 و PD-1 و PD-L1 البشرية. راجع الخطوة 4 للحصول على بروتوكول مفصل.
- حدد المتبرعين PBMC التي تؤدي إلى نمو الورم المعتدل (حجم الورم > 200 مم3 14 يوما بعد التلقيح) وعالية نسبيا PD-1، PD-L1 و CD8 التعبيرات (يعني درجات IHC > 2). راجع الخطوة 4 للحصول على بروتوكول تسجيل IHC مفصل.
3. خط الخلايا السرطانية البشرية وشاشة PDX
- خطوط الخلايا الشاشة وPDXs وفقا للإجراءات المذكورة في الخطوة 1.2، لتقييم معدل نمو الورم، والتعبير PD-L1 الإنسان من الأورام وتسلل الخلايا المناعية.
ملاحظة: تم فحص أكثر من 30 خط خلايا سرطان الإنسان وأكثر من 20 PDXs من أنواع السرطان المختلفة من قبل المؤلفين. تم عرض بيانات نماذج الورم المختارة في قسم النتائج.
4. الكيمياء المناعية (IHC)
- الحصاد كما هو مبين في الخطوة 1.2.5 وإصلاح أنسجة الورم عن طريق غمر في formalin. تجفيف وتضمين الأنسجة الثابتة في البارافين. قسم الأنسجة الثابتة في 3 ميكرومتر ووضعها على الشرائح المغلفة بوليليسين.
- إزالة البارافينيز في الزيلين ثلاث مرات 7 دقائق لكل منهما. يرطب الأقسام من خلال الكحول المتدرج: 100٪ الإيثانول مرتين لمدة 3 دقائق لكل منهما، تليها 90٪، 80٪ و 70٪ الإيثانول في المقابل لمدة 3 دقائق لكل منهما. شطف بواسطة منزوع الأيونات H2O ثلاث مرات وإزالة السائل الزائد من الشرائح.
- إجراء استرداد مستضد عن طريق وضع الشرائح في حاوية وتغطية مع 10 مل الصوديوم سيترات العازلة (درجة الحموضة 6.0)، أو Tris-EDTA (درجة الحموضة 9.0). يُسخّن وعاء الشرائح بواسطة الميكروويف لمدّة 3 دقائق. شطف بواسطة منزوع الأيونات H2O ثلاث مرات واستنشاق السائل الزائد من الشرائح.
- منع المقاطع بنسبة 3٪ الزلال المصل البقري في PBS لمدة ساعة و 0.3٪ H2O2 الحل في PBS لمدة 10 دقيقة. وصمة عار من قبل الأجسام المضادة ضد CD8 الإنسان (EP334)، PD-1 (NAT105،) وPD-L1 (E1L3N) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها، وHRP مترافق 2الأجسام المضادة في RT لمدة 1 ح. إسقاط الركيزة DAB (3,3'-diaminobenzidine) على الشرائح والسيطرة على وقت رد الفعل (ثانية إلى دقيقة) عن طريق رصد اللون البني من المجهر.
- تغطية الشرائح مع بلسم محايد بعد غمر الشرائح في 0.5٪ حمض الهيدروكلوريك الكحول و 0.5٪ مياه الأمونيا في المقابل لمدة 5 ثوان لكل منهما، ثم في 80٪، 90٪ و 100٪ الإيثانول في تسلسل لمدة 3 دقائق لكل منهما، وأخيرا في xylenes باستخدام ثلاثة تغييرات لمدة 5 دقائق لكل منهما. الكشف عن الأجسام المضادة عن طريق مراقبة اللون البني من DAB باستخدام المجهر.
ملاحظة: تم تقييم تعبير CD8 وPD-1 البشري على الخلايا اللوسية التي تتسرب إلى الأورام (TIL) عن طريق تعيين درجة تعبير على مقياس من 5 نقاط (درجة IHC، نطاق 0-4) في التكبير الموضوعي العالي (20x، 40x). 0, غائبة; 1، وضعف كثافة / أقل من 20٪ الخلايا؛ 2، ضعيفة إلى معتدلة كثافة / 20٪ -50٪ الخلايا؛ 3، معتدلة إلى قوية كثافة / 50٪ -80٪ الخلايا؛ 4، كثافة قوية / أكثر من 80٪ الخلايا. تم تسجيل تلطيخ PD-L1 البشرية داخل الخلايا السرطانية باستخدام نظام تسجيل معدل على مقياس 5 نقاط (درجة IHC، مجموعة 0-4) بسبب إشارة منتشرة نسبيا. 0, غائبة; 1، وضعف كثافة / أقل من 10٪ الخلايا؛ 2، ضعيفة إلى معتدلة كثافة / 10٪ -30٪ الخلايا؛ 3، معتدلة / 30٪ -50٪ الخلايا؛ 4، كثافة قوية / أكثر من 50٪ من الخلايا.
5. في فيفو فعالية ودراسات الدوائية في نماذج أنسنة PBMC-NOD/ SCID Xenograft
- علاج الفئران NOD/SCID مسبقاً كما هو مبين في الخطوة 1-1-3. وباختصار، عالج الفئران بـ 100 ملغم/كغم من الإنتاج الأنظف (i.p.) و125 ملغم/كغم من الـ DS (p.o.) مرة واحدة في اليوم لمدة يومين.
- 20 إلى 24 ساعة بعد الجرعة الثانية، حقن تحت الجلد (s.c.) مع عدد المشار إليه من الخلايا السرطانية البشرية و 2.5-5 × 106 PBMCs (ما مجموعه 200 خليط الخلايا اللتر في 50٪ Matrigel) في الجناح الأمامي الأيمن من الحيوانات.
ملاحظة: وينبغي أن يكون عدد PBMC المستخدم لأي فأر فردي في دراسة واحدة هو نفسه. ومع ذلك، ونظراً للاختلافات في توافر مجموع مركبات متعددة البروم ثنائية الفينيل المعزولة وقت إجراء كل دراسة، اختار المؤلفون استخدام 2.5 x 106أو 4 x 106أو 5 x 106 PBMC في دراسات مختلفة. على الرغم من أن هذا الفرق 2 أضعاف في الكمية التي تدار من PBMCs قد تؤثر على درجة الأنسنة، والمؤلفين لا تلاحظ اختلافات كبيرة في تقييم فعالية المضادة للورم من العلاجات المناعية اختبارها. - لـ PDXs engraftment، حقن شظايا الورم تحت الجلد (3× 3 × 3 مم 3) في الجناح الأمامي الأيمن من الحيوانات. حقن تحت الجلد 200 درجة مئوية من 5 × 106 PBMCs (100 درجة مئوية لكل جانب) إلى اليسار واليمين من جزء الورم engrafted.
ملاحظة: تم إعطاء أنسجة الورم PDX في محلول Matrigel، نفس ما هو موضح لنماذج خط الخلية. - في يوم تلقيح الخلايا، تجمع الحيوانات بشكل عشوائي وتعامل كبروتوكول الدراسة المخطط له. تقييم النشاط المضاد للورم من الأدوية المرشحة, BGB-A317 (QW, i.p.) في هذه الحالة, في الجرعات المشار إليها في نماذج الورم المختلفة.
ملاحظة: تعتبر خطوط الخلايا السرطانية البشرية الثلاثة (أي A431 (سرطان الاستئصال) وSKOV3 (سرطان المبيض) وSK-MES-1 (سرطان الرئة))، بالإضافة إلى نموذجين من PDX (أي BCLU-054 (سرطان الرئة) وBCCO-028 (سرطان القولون))، نماذج أورام جيدة للعلاج I-O التقييم في هذا النموذج الماوس أنسنة. - قياس حجم الورم الأساسي مرتين كل أسبوع، وذلك باستخدام الفرجار.
ملاحظة: وقد لوحظ فقدان أوزان الجسم Gand حوالي 4-6 أسابيع بعد الطعوم PBMC في دراساتنا, السماح ل1-2 أشهر نافذة لتقييمات الفعالية العلاجية. - لتحليل الدوائية للخلايا المناعية التسلل الورم، وقطع أنسجة الورم إلى قطع صغيرة وهضمها مع الكولاجين النوع الأول (1 ملغ / مل) وDNase الأول (100 ميكروغرام / مل) في RPMI1640 بالإضافة إلى 5٪ مصل البقر الجنيني (FBS) لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. تمرير الأنسجة المهضومة من خلال 40 ميكرومتر مصفاة الخلية للحصول على تعليق خلية واحدة.
- غسل الخلايا وضبط رقم الخلية إلى تركيز 1 × 107 خلايا / مل في الجليد الباردFACS العازلة (PBS، 1٪ FBS) في 96 جيدا لوحات أسفل جولة. غسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي ومنعها عن طريق إضافة 20 ميكروغرام / مل IgG الإنسان لمدة 30 دقيقة، تليها تلطيخ مع CD3 المضادة للإنسان (HIT3a)، CD8 (OKT8) وPD-1 (MIH4) الأجسام المضادة في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم تخضع العينات الملونة لتدفق قياس الخلايا وتحليل باستخدام guavaSoft 3.1.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد الإجراءات المعروضة هنا، تم بنجاح إنشاء نموذج xenograft أنسنة المستندة إلى PBMC. وباختصار، تم تحديد آثار الاستئصال النخاعي CP في الفئران NOD / SCID عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي من العدلات والسكان monocyte بعد CP وDS العلاج (الشكل 1). تم تحديد 100 ملغم/كغم من الكل CP بالإضافة إلى 125 ملغم/كغم من DS كجرعة مثلى واستخدم في دراسات لاحقة حيث أن النظام يؤدي إلى استنفاد أقصى قدر من العدلات والخلايا الأحادية دون التسبب في سمية شديدة للفئران. بعد ذلك، تم إجراء PBMC البشرية وزرع الورم. تم التحقق من وجود الخلايا المناعية البشرية يتسلل فيالبيئة الدقيقة الورم من قبل IHC (الشكل 2).
وقد تم فحص فريق من المتبرعين PBMC في الجسم الحي لضمان عمليات تسلل عالية نسبيا للخلايا المناعية في البيئة الدقيقة الورم ومعدل نمو الورم المقبول (القسم 2، الشكل 3ألف). وفي الوقت نفسه، تم فحص أكثر من 30 خطوط الخلايا السرطانية البشرية، فضلا عن أكثر من 20 PDXs من أنواع السرطان المختلفة لتقييم معدل نمو الورم، والورم PD-L1 التعبير وتسلل الخلايا المناعية (القسم 3). وترد النتائج التمثيلية في الشكل 3باء.
ثم استخدمت هذه الفئران الأنسنة التي يتم تطعيمها PBMC لفحص النشاط المضاد للورم من BGB-A317. تم حقن مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم البشرية من متبرعين أصحاء مختارين بخلايا الورم البشري (A431 وSKOV3 وSK-MES-1) أو شظايا أنسجة الورم الأولية المستمدة من مرضى السرطان (BCCO-028 وBCLU-054) تحت الجلد. تم التعامل مع الفئران، كما هو مبين في الشكل 4، مع BGB-A317 أو PBS intraperitoneally مرة واحدة في الأسبوع من يوم زرع الورم. في جميع النماذج المذكورة أعلاه، أظهرت BGB-A317 أنشطة كبيرة لمكافحة الورم (الشكل4).
الشكل 1 : الاستئصال النخاعي للفئران NOD / SCID باستخدام سيكلوفوسفاميد (CP) وdisulfiram (DS). (أ) استراتيجية التجشّع المستخدمة لتحديد المجموعات الفرعية للخلايا النخاعية بما في ذلك العدلات والخلايا الأحادية. (B) النتائج التمثيلية للخلية النخاعية (CD11b+)، العدلات (CD11b+Ly6G+) وأحادية (CD11b+Ly6C+) أرقام على جرعات مختلفة من العلاج CP. وتمثل الصناديق النسبة المئوية 75 و50 و25 من القيم. تمثل الخطوط العليا والسفلية الحد الأقصى والحد الأدنى من نقاط البيانات ضمن نطاق الذكاء 1.5x (بين الربع)، على التوالي. n = 3 لمجموعة المركبات و n = 6 للمجموعات المعالجة CP و/أو DS. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 زرع PBMC البشري وتطعيمالورم. (أ) رسم تخطيطي يوضح سير العمل العام لنموذج xenograft المستند إلى PBMC. (ب) نمو الورم من الخلايا A431 على الحقن المشترك تحت الجلد مع PBMC المانحة مع الشروط المشار إليها (البيانات تمثل متوسط حجم الورم ± SEM، ن = 6). (C) تحليل IHC للأورام التي وضعت في الفئران تعامل مع أو بدون CP + DS. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 PBMC المانحة والإنسان شاشة خط الخلية السرطان. (أ) بيانات موجزة تمثيلية من شاشة المانحين PBMC. تم خلط PBMC مع خلايا A431 وتطعيم تحت الجلد في الفئران NOD/SCID أنسنة (انظر الخطوة 2). وتمثل كل نقطة متوسط قيمة البيانات لـ 3 فئران مطعومة بمركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم من جهة مانحة واحدة. (ب) النتائج التمثيلية من شاشة خط الخلايا السرطانية البشرية. وقد تم حقن PBMC من مانحين مختارين مع خلايا A431 أو SK-MES-1 أو SKOV3. البيانات تمثل متوسط حجم الورم ± SEM التي تم جمعها من 3 الفئران، 14 يوما بعد تلقيح خطوط الخلايا المشار إليها. يعني IHC درجة ± SEM يمثل التعبير المتوسط من CD8 الإنسان، PD-1، وPD-L1 من جميع الفئران 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 الأنشطة المضادة للورم وتحليل الدوائية من BGB-A317 في نموذج xenograftالمستندة إلى PBMC. تم تقييم النشاط المضاد للورم من BGB-A317 في الجرعات المشار إليها (i.p., QW) باستخدام خطوط خلايا السرطان البشري (A) A431 (مع 5 × 106 PBMC) ، (C) SKOV3 (مع 5 × 106 PBMC) ، (D ) SK-MES-1 (مع 5 × 106 PBMC) ، و الجرافوجرافات المشتقة من المريض(PDXs) (E) BCLU-054 (مع 5 × 106 PBMC) و (F)BCCO-028 (مع 5 × 106 PBMC). تم حقن PBMC من متبرعين أصحاء مختارين وخلايا الورم المقابلة بحقن تحت الجلد في فئران NOD/SCID ذات أنسنة (n = 8 إلى 10). (ب) قياس كمية من الخلايا hCD8+ وhCD8 + hCD-1+ في BGB-A317 علاج أورام A431. n = 8-10 الحيوانات لكل مجموعة في A، ومن C إلى F، n = 4-6 الحيوانات لكل مجموعة في B؛ البيانات تمثل يعني ± SEM. تم تقييم الأهمية باستخدام اختبار t الطالب غير المقترنة بذيلين في ظل افتراض عدم المساواة في التباين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تقدمت معرفتنا بتطور السرطان وتطوره بشكل كبير في السنوات الأخيرة، مع التركيز على فهم شامل لكل من الخلايا السرطانية وستروما المرتبطة بها. ويمكن أن يؤدي تسخير آليات المناعة المضيفة إلى إحداث أثر أكبر على الخلايا السرطانية، مما يمثل استراتيجية علاج واعدة. وقد استخدمت على نطاق واسع نماذج Murine مع أجهزة المناعة الماوس سليمة، مثل نماذج الجرمانية وGEM، لدراسة الحصانة التي تتوسط فيها نقاط التفتيش. تقييمات فعالية باستخدام هذه النماذج تعتمد إلى حد كبير على الأجسام المضادة للماوس البديلة الهدف13،14. ومع ذلك، فإن الاختلافات المتأصلة بين الجهاز المناعي البشري والمورين وعدم وجود بعض الأهداف البشرية في نماذج المورين تحد من الدراسات قبل السريرية للآثار المضادة للورم I-O15،16. ولذلك، فإن نماذج الماوس القوية التي تشمل كل من الخلايا المناعية البشرية والأورام البشرية مرغوب فيها على وجه السرعة، والتي سوف تحسن بشكل كبير من ترجمة وتطوير العلاجات I-O رواية.
هنا، نقوم بوصف نموذج الماوس xenograft المستندة إلى PBMC البشرية التي يمكن أن تستخدم على نطاق واسع لدراسات I-O الترجمة. متبرع PBMC وكذلك خطوط الخلايا السرطانية/ شاشات PDX أمر بالغ الأهمية لضمان المتانة واستنساخ دراسات الفعالية في الجسم الحي. تم فحص المتبرعين PBMC في الجسم الحي لضمان نجاح الورم البشري وتطعيم الخلايا المناعية. وفي الوقت نفسه، تم فحص أكثر من 50 خطوط الخلايا وPDXs من أصول السرطان البشري المختلفة لتقييم معدل نمو الورم، والتعبير PD-L1 البشرية، وتسلل الخلايا المناعية. تشير تحليلاتنا إلى أن حوالي 20٪ من خطوط الخلايا السرطانية وPDXs التي تم فحصها تظهر معدل نمو الورم المقبول في حين أن لديها في الوقت نفسه TILs عالية نسبيا وPD-L1 تلطيخ، والتي تعتبر نماذج جيدة لتقييمات فعالية I-O.
يتم استخدام مطابقة HLA بشكل روتيني في العيادة لمطابقة المرضى والمانحين لزرع الأعضاء أو النخاع17. ومع ذلك، لم يقم المؤلفون إلا بتوصيف محدود لكتابة HLA، ولا يزال هذا الموضوع مثيراً للاهتمام يجب التحقيق فيه في الدراسات المستقبلية. يود المؤلفون أن يلاحظوا أن متبرعاً بـ PBMC قد يكون مناسباً لخط خلية سرطان واحد/PDX ولكنه ليس مثالياً للآخرين. ولذلك، قد تحتاج الجهات المانحة PBMC إلى فحص لكل نموذج من نماذج السرطان لضمان تحقيق أفضل النتائج.
تطعيم PBMC البشري في NOD / SCID أو NSG الفئران يؤدي دائما إلى مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف xenogeneic (xGvHD)، وهو اضطراب ما بعد زرع التي تنتج عن هجوم بوساطة المناعة من الأنسجة المتلقية من قبل الخلايا T المانحة18،19. وقد لوحظت الملاحظات السريرية المرتبطة عادة مع xGVHD في نموذجنا أنسنة, مثل حمامي, حدس الموقف, فقدان الوزن والوفيات (البيانات غير مبينة). وعادة ما لوحظت هذه الأنماط الظاهرية قرب نهاية دراساتنا، وعادة ما تكون في 1-2 أشهر بعد الطعوم، مما يشير إلى انتشار وتسلل الخلايا T البشرية في الأجهزة المستهدفة xGVHD. وهذا يسمح بنافذة 1-2 أشهر لتقييمات العلاج العلاجي I-O. وقد استخدمت عدة نهج لتقليل المناعة الفطرية الماوس وتعزيز تطعيم الخلايا المناعية البشرية20،21. على سبيل المثال، الفئران NSG المعيبة في murine MHC الفئة الأولى والفئة الثانية التعبير دعم تطعيم الخلايا T البشرية الوظيفية في غياب xGvHD الحاد بعد حقن PBMC22.
تم استخدام فئران NOD/SCID في هذا البروتوكول. الفئران homozygous لطفرة SCID قد ضعفت T و B نمو الخلايا الليمفاوية الخلية والخلفية NOD بالإضافة إلى ذلك يؤدي إلى نقص القاتل الطبيعي (NK) وظيفة الخلية20. وقد تم إنشاء سلالات أخرى أكثر نقصا في المناعة، مثل NSG (مختبر جاكسون)، NCG (نهر تشارلز) وNOG (CIEA) سلالات. عندما المطعمة مع PBMCs، وقد أظهرت هذه الفئران تطوير الخلايا المناعية البشرية وتشكل بيئة تشبه الجهاز المناعي البشري23،24. بدلا من ذلك، يمكن تطعيم هذه الفئران مع CD34+ خلايا السلف المكونة للدم البشرية (HPCs) وعرض أكثر استدامة T خلية التمايز والنضج25. وبالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء الجيل القادم نماذج الماوس نقص المناعة مع مزيد من التعديلات الوراثية لدعم أفضل تنمية سلالة النخاع البشري وزيادة كفاءة الطعوم (راجع صفحة الويب محفظة المتغيرات من جاكسون مختبر وتاكونيك العلوم الحيوية).
مزيد من التفاصيل لاستخدام هذه الضغوط الجديدة لإعادة تشكيل الحصانة البشرية في انتظار مزيد من التحقيقات. ومع ذلك، فإن البروتوكول المبين في هذه المادة يمكن أن يكون بمثابة مبدأ توجيهي عام لإنشاء وتوصيف نماذج الماوس التي تعاني من نقص المناعة والتي يعاد تشكيلها مع PBMC البشرية. تُظهر هذه المقالة ثلاثة خطوط خلايا سرطانية بشرية واثنين من الخيوط الجلدية التي تُستمد من المرضى البشريين، وتغطي مجموعة من أنواع السرطان، مما يشير إلى التطبيقات الواسعة المحتملة لبروتوكولنا في دراسات I-O المترجمة. معظم نماذج PBMC أنسنة، على حد علمنا، وقد اختارت الرابع أو الملكية الفكرية كطريق للحقن26،27. نماذجنا بدلا من ذلك توفير الحصانة البشرية المعاد تشكيلها جزئيا في الفئران تحمل الورم البشري من خلال admixing subcutaneously من PBMC الإنسان مع xenografts السرطان. ويوفر هذا النهج بديلاً سريعاً وفعالاً من حيث التكلفة، ولكنه قابل للاستنساخ إلى حد كبير لإعادة تشكيل الخلايا الجذعية الكاملة (على سبيل المثال، CD34+ الفئران الأنسنة المطعومة بالخلايا الجذعية المكونة للدم). وقد ثبت أن نموذجنا مفيد لتقييم العلاجات المناعية السرطانية التي تشارك الخلايا T، لا سيما عند العمل على جداول زمنية قصيرة أو لاختيار وكلاء قبل الانتقال إلى نموذج حصانة متعددة السلالات أكثر تعقيدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
جميع المؤلفين لديهم مصلحة في الملكية في BeiGene. تونغ تشانغ وكانغ لي مخترعان على براءة اختراع تغطي BGB-A317 الموصوفة في هذه الدراسة.
Acknowledgments
ونشكر أعضاء مختبراتنا على المناقشات المفيدة. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل برنامج بحوث الابتكار والزراعة في مجال علوم الطب الحيوي والحياة التابع للجنة العلوم والتكنولوجيا لبلدية بكين بموجب اتفاق المنحرقم . Z151100003915070 (مشروع "دراسة ما قبل السريرية على رواية الأورام المناعية المضادة للورم المخدرات BGB-A317")، وكان أيضا بدعم جزئي من قبل تمويل الشركة الداخلية للبحوث ما قبل السريرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14 G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
References
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. Journal of Clinical Oncology. 33 (17), 1974-1982 (2015).
- Li, Z., Kang, Y. Emerging therapeutic targets in metastatic progression: A focus on breast cancer. Pharmacology & Therapeutics. 161, 79-96 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Fisher, T. S., et al. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (10), 1721-1733 (2012).
- McCormack, E., et al. Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (4), 773-785 (2013).
- Rongvaux, A., et al. Human hemato-lymphoid system mice: current use and future potential for medicine. Annual Review of Immunology. 31, 635-674 (2013).
- Matsumura, T., et al. Functional CD5+ B cells develop predominantly in the spleen of NOD/SCID/gammac(null) (NOG) mice transplanted either with human umbilical cord blood, bone marrow, or mobilized peripheral blood CD34+ cells. Experimental Hematology. 31 (9), 789-797 (2003).
- Zhang, T., et al. The binding of an anti-PD-1 antibody to FcgammaRIota has a profound impact on its biological functions. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (7), 1079-1090 (2018).
- Gamelli, R. L., Ershler, W. B., Hacker, M. P., Foster, R. S. The effect of disulfiram on cyclophosphamide-mediated myeloid toxicity. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 16 (2), 153-155 (1986).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and Immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6808-6817 (2015).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Mahdi, B. M. A glow of HLA typing in organ transplantation. Clinical and Translational Medicine. 2 (1), 6 (2013).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews Immunolog. 12 (11), 786-798 (2012).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Luban, J., Greiner, D. L. Overcoming current limitations in humanized mouse research. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 125-130 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunolog. 7 (2), 118-130 (2007).
- Brehm, M. A., et al. NOD-scid IL2rgnull (NSG) mice deficient in murine MHC Class I and Class II expression support engraftment of functional human T cells in the absence of acute xenogeneic GVHD following injection of PBMC. The Journal of Immunology. 200, 1 Supplement 57 (2018).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Sasaki, E., et al. Development of a preclinical humanized mouse model to evaluate acute toxicity of an influenza vaccine. Oncotarget. 9 (40), 25751-25763 (2018).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
