Summary
אנו מתארים היקפית אנושית תא היקפי (pbmc)-מבוסס הומניזציה מודל העכבר מבע שתלת עבור מחקר translational-אונקולוגיה. פרוטוקול זה יכול לשמש כמנחה כללי להקמת ולאפיון מודלים דומים להערכת הטיפול של I-O.
Abstract
הגילוי וההתפתחות של הטיפול האימונואונקולוגיה (I-O) בשנים האחרונות מייצג אבן דרך בטיפול בסרטן. עם זאת, אתגרי הטיפול ממשיכות להתקיים. מודלים של בעלי חיים רלוונטיים ועמידים בפני מחלות הם משאבים חיוניים להמשך המחקר והפיתוח הקדם-קליני כדי לטפל במגוון של מחסומים חיסוניים נוספים. כאן, אנו מתארים את הדם ההיקפי היקפי תא מונאנרור (PBMC)-מבוסס על מודל הומניזציה האנושית. BGB-A317 (טילאסיאמאב), נוגדן נגד PD-1 הומניסט בפיתוח קליני בשלב מאוחר, משמש כדוגמה לדון פלטפורמת הגדרת פלטפורמה, אפיון מודל והערכות יעילות הסמים. אלה עכברים הומניזציה לתמוך בצמיחה של הגידולים האנושיים ביותר נבדק, ובכך מאפשר הערכה של הטיפולים I-O בהקשר של החסינות האנושית וסרטן אנושי. ברגע שהוקמה, המודל שלנו הוא יחסית זמן וחסכוני, ובדרך כלל להניב תוצאות מאוד מתועלות. אנו מציעים כי הפרוטוקול המתואר במאמר זה יכול לשמש כמנחה כללי להקמת דגמי העכבר מחדש עם PBMC האדם וגידולים עבור מחקר I-O.
Introduction
אימונואונקולוגיה (I-O) הוא שדה מתרחב במהירות של טיפול בסרטן. חוקרים החלו לאחרונה להעריך את הפוטנציאל התרפויטי של פונקציות מודלדירוג של המערכת החיסונית לתקוף גידולים. המערכת החיסונית מחסום בלואדס הפגינו פעילויות עידוד במגוון סוגי סרטן, כולל מלנומה, קרצינומה של תאי הכליה, ראש וצוואר, ריאות, שלפוחית השתן וסרטן הערמונית1,2. בניגוד לטיפולים ממוקדים כי ישירות להרוג תאים סרטניים, אני-O טיפולים הפוטנציאל המערכת החיסונית של הגוף לתקוף גידולים3.
עד היום, הוקמו מודלים רבים של חיות I-O. אלה כוללים: 1) עכבר הגידול קווי תאים או הומושתל הגידול בעכברים syngeneic; 2) גידולים ספונטנית נגזר מעכבר מהונדסים גנטית (פנינה) או מסרטנים-אינדוקציה; 3) כלאריק אבני חן עם דפיקה-in של היעד סמים האדם (s) במערכת החיסון מורטין פונקציונלי; ו 4) עכברים עם מחדש חסינות אנושית מושתלים עם תאים סרטניים אנושיים או המטופל נגזר xenografts תלי (PDXs). לכל אחד מדגמים אלה יש יתרונות ברורים, כמו גם מגבלות, אשר תוארו ונבדקו באופן נרחב במקומות אחרים4.
החוקה של החסינות האנושית בעכברים לקויה העריכו בצורה מוערכת כגישה קלינית למחקר של מחקר I-O של טרנסלtional. הדבר מושג בדרך כלל באמצעות אחד משני הצדדים של תאים חיסוניים מבוגרים (למשל, דם היקפי תאים ברורים (pmbc)5,6, או 2) חרט תאי גזע המטבטיים (hsc) מ, למשל, דם טבורי או עוברי כבד7,8. עכברים אלה הומניזציה יכול לתמוך בצמיחה של גידולים אנושיים, ובכך לאפשר הערכה של הטיפולים I-O בהקשר של החסינות האנושית וסרטן האדם. למרות היתרונות, יישומים של עכברים הומניזציה במחקר I-O היו בדרך כלל הפריע מספר חששות, כגון זמן פיתוח מודל ארוך ועלות גבוהה במידה ניכרת.
כאן, אנו מתארים מודל אנושי מבוסס-BMC שניתן ליישם באופן נרחב עבור מחקרי I-O טרנסלtional. מודל זה הוא יחסית זמן-וחסכוני עם השגות גבוהה במחקרי יעילות. זה כבר בשימוש ב-house עבור ההערכות של מספר I-O therapeutics כרגע תחת פיתוח טרום קליני וקליני. BGB-A317 (טילאסיאמאב), נוגדן הומניסטית anti-PD-1 נוגדנים9 , משמש כדוגמה לדון פיתוח מודל, אפיון, ויישומים אפשריים עבור ניתוח יעילות אנטי הגידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים שבוצעו במחקרים הכרוכים במשתתפים אנושיים היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של בייג'ין ו/או ועדת מחקר לאומית ועם הצהרת הלסינקי 1964 והתיקונים המאוחרים או הסטנדרטים האתיים הדומים. הסכמה מושכלת הושגה מכל המשתתפים הבודדים הכלולים במחקר. כל ההליכים שבוצעו במחקרים הכרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי מועצת הביקורת הפנימית בבייג'ין. פרוטוקול זה הותאם במיוחד עבור הערכה של BGB-A317 (טיליגיאמאב) בעכברים הומניזציה/SCID.
1. הקמת המודל האנושי המבוסס על PBMC
-
Myeloablation של עכברים הנהון/SCID באמצעות ציקלופוספדידה: קביעת מינונים אופטימלית
- רכישת עכברים בנוד/SCID נקבה (6-8 שבועות).
הערה: כל העכברים המעורבים במחקר הזה היו נקבות. - הכינו ציקלופוספמידה (CP) במינונים שונים (50, 100 ו 150 מ"ג/ק"ג) ב תמיסת מלח. להכין disulfiram (DS) ב 0.8% רצף-80 ב מלוחים ב 125 מ"ג/ק"ג.
הערה: ריכוזים שונים של CP היו מוכנים לאפשר ניהול של כמויות שוות של פתרון התרופה לעכברים מקבל מינונים שונים של CP. - לטפל בחיות עם CP (כיתה) ו-DS (p.o.) פעם ביום עבור 2 ימים. תן DS (p.o.) 2 h לאחר כל מנה של CP.
הערה: DS מקטין את הרעילות של CP בעכברים, ו CP בשילוב עם DS כבר הציע נויטרופילים לאורך זמן יותר מאשר בעלי חיים מטופלים עם CP לבד10 המינון משטר של CP עשוי להיות מראש נחוש לפני מחקרים בפועל נמצא להשתנות מעט בין זנים שונים של העכבר החיסוני. - איסוף דגימות דם מן הסינוס ורידים מסלולית ולהעביר לצינורות EDTA-K מצופה קרח על היום 0 (1 h לפני מינון1) , יום 2 (24 שעות לאחר מינון2) ויום 4 (72 h לאחר מינון2) .
- לבחון את האפקט myeloablation אחרי CP ו DS טיפול על ידי FACS. השתמש עכברוש נגד עכבר CD11b (M1/70), עכברוש נגד העכבר Ly6C (hk 1.4,) ועכבר נגד עכברים Ly6G (1a8) עבור לאחר CD11b+ Ly6Gגבוה כמו נויטרופילים, CD11b+Ly6Cגבוה כמו מונוציטים11,12.
- הקלט את משקל הגוף ואת המצב הבריאותי של העכברים מדי יום למשך שבוע אחד. המינון האופטימלי של CP ו-DS נקבע כמשטר כי תוצאות דלדול מקסימלית של נויטרופילים מונוציטים מבלי לגרום לרעילות חמורה לעכברים.
- רכישת עכברים בנוד/SCID נקבה (6-8 שבועות).
-
השתלת PBMC האדם בתאום הגידול: מודל הגדרת
- בודד PBMCs אנושי מתורמים בריאים על ידי צפיפות הדרגתי צנטריפוגה על פי הוראות היצרן.
- טרום לטפל עכברים עם CP ו-DS כפי שמצוין על ידי צעד 1.1.2 ו 1.1.3 כדי להגביר את יעילות ההשתלה.
- 20 עד 24 שעות לאחר המינון השני של CP ו-DS, להזריק האדם קו הגידול האנושי כגון A431 תאים (ATCC, 2.5 x 106) ו 5 x 106 pbmcs מבודדים (מעורב סך של 200 μl-פוספט באגירה מלוחים (PBS) המכיל 50% מטריצות) , או שברי הגידול (3 x 3 x3 מ"מ 3, בנפח כולל של 200 ΜL PBS המכיל 50% מטריצות) ו 200 μl של 5 x 106 pbmcs (100 μl כל אחד בצד שמאל וימין של רסיס הגידול מנופה) (ספורטינג ראגה) תת-עורי באגף הימני של החיות.
- מדידת נפח הגידול העיקרי ולהקליט פעמיים בשבוע עבור 4-6 שבועות.
הערה: העכברים יהיה מורדמים ברגע משקולות הגוף שלהם לאבד מעל 20% או נפח הגידול שלהם מגיע 2,000 mm3 או הגידול הוא כיבית. - המתת חסד העכברים בתאי גזים עם פחמן דו חמצני. לאסוף את רקמות הגידול כולו בעכברים הוקרב עם מספריים אופטלמולוגי ולעבד אותם היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה (IHC) ניתוח. בדקו את הביטויים הCD8 האנושיים, ה-PD-1 ו-PD-L1 ברקמות האלה. ראה את הפרוטוקול שלב 4.
2. מסך תורם PBMC
- מסך פאנל של תורמים PBMC בשל הווריאציות הצפויות הביא PBMCs שנאספו מיחידים. השתמש בתאי A431 מזריקים עם PBMCs מתורמים שונים על פי ההליכים כפי שצוין בשלב 1.2.
הערה: במשך 50 תורמים PBMC בריאים הוקרן במחקר על מנת להשיג מספר מספיק של תורמים מתאימים. חוקרים אשר רוצים לאמץ את הפרוטוקול הזה עשוי להחליט על עצמם כמה תורמים PBMC בריאים כדי להיות מוקרן, בהתבסס על העיצוב של המחקרים המתוכננים. - נטר נפח גידול פעמיים בשבוע על ידי מדידת עם caliper.
הערה: שיעור גידול הגידול עשוי להשתנות עם PBMC מתורמים שונים. - לאסוף את רקמות הגידול בנפח ממוצע של 200-500 מ"מ3 ולעבד אותם עבור היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה (ihc) ניתוח. לבחון CD8 אנושיים, PD-1 ו-PD-L1 ביטויים. ראה שלב 4 עבור פרוטוקול מפורט.
- בחר התורמים PBMC כי התוצאה בצמיחה גידול מתון (נפח הגידול > 200 מ"מ3 14 ימים לפוסט חיסון) ו גבוהה יחסית pd-1, Pd-L1 ו CD8 ביטויים (מתכוון הציונים ihc > 2). ראה שלב 4 עבור פרוטוקול הבקיע IHC מפורט.
3. שורת התאים של סרטן האדם ומסך PDX
- שורות תא מסך ו-PDXs בהתאם להליכים שצוינו בשלב 1.2, כדי להעריך את קצב גידול הגידול, ביטוי L1 PD האנושי של הגידולים וחדירות התא החיסונית.
הערה: מעל 30 תאים סרטניים האנושי ומעל 20 PDXs של סוגי סרטן שונים הוקרן על ידי המחברים. נתונים של דגמי הגידולים שנבחרו הוצגו בסעיף התוצאות.
4. אימונוהיסטוכימיה (IHC)
- קציר כפי שמצוין על ידי שלב 1.2.5 ולתקן רקמות הגידול על ידי האישר בפורמאלין. מייבשים ומטביעים רקמות קבועות בפרפין. מדור את רקמות קבוע ב 3 יקרומטר ולמקם אותם על שקופיות מצופה פולייזין.
- . שלוש כפול 7 דקות כל אחד מימה את הסעיפים דרך אלכוהול מדורגים: 100% אתנול פעמיים עבור 3 דקות כל אחד, ואחריו 90%, 80% ו 70% אתנול בתורו עבור 3 דקות כל אחד. לשטוף על ידי מונו H2O שלוש פעמים ולהסיר נוזל עודף מהשקופיות.
- לבצע אחזור אנטיגן על ידי הצבת שקופיות במיכל ולכסות עם 10 מ"מ נתרן ציטראט מאגר (pH 6.0), או טריס-EDTA (pH 9.0). מחממים את המיכל במיקרוגל למשך 3 דקות. מרתיחים באמבט מים ב 95 ° c עבור 30 דקות ואז להתקרר לטמפרטורת החדר. לשטוף על ידי מונו H2O שלוש פעמים ומכה נוזל עודף מהשקופיות.
- לחסום את הסעיפים על ידי 3% בסרום שור בערוץ PBS עבור 1 h ו 0.3% H2O2 פתרון ב-pbs עבור 10 דקות. כתם על ידי נוגדנים נגד האדם CD8 (EP334), PD-1 (NAT105,) ו-PD-L1 (E1L3N) ב 4 ° c לילה, ו HRP מובח השנינוגדנים ב RT עבור 1 h. Drop את המצע (3, 3-diaminobenzidine) אל השקופיות ולשלוט על זמן התגובה (שניות לדקות) על ידי ניטור צבע חום ממיקרוסקופ.
- לכסות את השקופיות עם בלזם נייטרלי לאחר לאשר את השקופיות ב 0.5% המלח חומצה הידרוכלורית ו 0.5% מים אמוניה בתורו 5 s כל אחד, אז ב 80%, 90% ו 100% אתנול ברצף עבור 3 דקות כל אחד, ולבסוף באמצעות שלושה שינויים עבור 5 דקות כל אחד. לזהות את הנוגדנים על ידי התבוננות צבע חום של מיקרוסקופ באמצעות.
הערה: האדם CD8 ו PD-1 ביטוי על סרטן החדירה leucocytes (TIL) העריכו על ידי הקצאת ציון ביטוי על סולם 5 נקודות (הציון IHC, טווח 0-4) בהגדלה אובייקטיבית (20x, 40x). 0, נעדר; 1, עוצמה חלשה/פחות מ -20% תאים; 2, עוצמה חלשה בינונית/20%-50% תאים; 3, בינוני עד חזק עוצמה/50%-80% תאים; 4, עוצמה חזקה/יותר מ 80% תאים. האדם PD-L1 מכתים בתוך תאים סרטניים הבקיע באמצעות מערכת הבקיע מותאם על סולם 5 נקודה (הציון IHC, טווח 0-4) בגלל האות הפיזור שלה יחסית. 0, נעדר; 1, עוצמה חלשה/פחות מ-10% תאים; 2, עוצמה חלשה בינונית/10%-30% תאים; 3, בינוני/30%-50% תאים; 4, עוצמה חזקה/יותר מ 50% תאים.
5. ביעילות Vivo ולימודי פרמקודינמיקה הומניזציה PBMC-הנהון/SCID Xenograft מודלים
- התייחס מראש לעכברי הנהון/SCID כפי שמצוין בשלב 1.1.3. בקצרה, לטפל בעכברים עם 100 מ"ג/ק"ג CP (כיתה) ו 125 מ"ג/ק"ג DS (p.o.) פעם ביום עבור 2 ימים.
- 20 כדי 24 שעות לאחר המינון השני, להזריק תת-עורי (ספורטינג ראגה) עם מספר מצוין של תאים סרטניים אנושיים 2.5-5 x 106 pbmcs (סך של 200 μl התערובת התא ב 50% מטריצות) באגף הקדמי הימני של בעלי חיים.
הערה: מספר ה-PBMC המשמש עבור כל עכבר בודד במחקר אחד בודד צריך להיות זהה. עם זאת, בשל וריאציות של הזמינות של PBMC מבודדים סך בזמן של כל מחקר, המחברים בחרו להשתמש 2.5 x 106, 4 x 106, או 5 x 106 pbmc במחקרים שונים. למרות שזה הבדל 2-קיפול בכמות מנוהלת של PBMCs עשוי להשפיע על מידת הומניזציה, המחברים לא להתבונן הבדלים משמעותיים בהערכת אנטי סרטניים efficacies של טיפולים חיסוני נבדק. - עבור העפיל PDXs, הכנס תת-עורי שברי הגידול (3 x 3 x 3 מ"מ3) באגף הקדמי הימני של בעלי חיים. הכנס תת-עורי 200 μL של 5 x 106 pbmcs (100 μl כל צד) משמאל ומימין של רסיס גידול מנופה.
הערה: PDX רקמות הגידול היו מנוהלים בתמיסה מטריצות, זהה לתיאור עבור דגמי קו התא. - מקבץ באופן אקראי את החיות. ומתייחס לפרוטוקול הלמידה המתוכנן להעריך את הפעילות נגד הגידול של תרופות מועמד, BGB-A317 (QW, כש) במקרה זה, על מינונים שצוין במודלים סרטניים שונים.
הערה: שלושה תאים סרטניים האנושי (כלומר, A431 (אפידמואיד קרצינומה), SKOV3 (סרטן השחלות) ו-SK-MES-1 (סרטן ריאות)), כמו גם שני דגמי PDX (כלומר, BCLU-054 (סרטן ריאות) ו BCCO-028 (סרטן המעי הגס)), נחשבים מודלים הגידול טוב עבור טיפול I-O הערכה במודל העכבר ההומניציוני הזה. - מדידת נפח הגידול העיקרי פעמיים בכל שבוע, באמצעות caliper.
הערה: הפסד משקולות גוף gand נצפו סביב 4-6 שבועות פוסט PBMC חרט בלימודים שלנו, המאפשר 1-2 חודשים חלון עבור הערכות יעילות טיפולית. - עבור ניתוח פרמקודינמיקה של הגידול מחדר התאים החיסונית, לחתוך את רקמות הגידול לחתיכות קטנות לעכל אותם עם קולגן סוג I (1 מ"ג/mL) ו DNase I (100 μg/mL) ב RPMI1640 ועוד 5% סרום העוברי (FBS) עבור 30 דקות ב 37 ° c. להעביר את הרקמות מתעכל באמצעות מ40 יקרומטר תא בתאי להשיג השעיות תא בודד.
- לשטוף את התאים ולהתאים את מספר התא לריכוז של 1 x 107 תאים/mL ב-facs קירור קר מאגר (PBS, 1% fbs) ב 96-לוחיות התחתונה עגול היטב. לשטוף את התאים על ידי תפרידו ולחסום אותם על ידי הוספת 20 μg/mL האדם IgG עבור 30 דקות, ואחריו כתמים עם אנטי אדם CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) ו PD-1 (MIH4) נוגדנים ב 4 ° c עבור 30 דקות. ואז הנושא דגימות ויטראז לזרום cy, לנתח באמצעות guavaSoft 3.1.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות ההליכים המוצגים כאן, מודל מבוסס PBMC מבוססי הומניזציה האדם הוקמה בהצלחה. בקצרה, ההשפעות של CP myeloablation ב בנוד/SCID עכברים נקבע על ידי הזרימה cy, לנסות ניתוח של נויטרופילים ואוכלוסיות מונוציט הטיפול בפוסט CP ו DS (איור 1). 100 מ"ג/ק"ג CP בתוספת 125 mg/ק"ג DS נקבע כמינון אופטימלי משמש מחקרים מאוחרים יותר כמו תוצאות משטר דלדול מקסימלית של נויטרופילים ומונוציטים מבלי לגרום לרעילות חמורה לעכברים. הבא, האדם PBMC ו השתלת הגידול בוצעה. נוכחות של תא החיסון האנושי מחלחל בסביבה מיקרוסביבתית הגידול אומת על ידי IHC (איור 2).
פאנל של תורמים PBMC הוקרן ב-vivo כדי להבטיח חדירות גבוהות יחסית של תאים חיסוניים של מיקרואקולוגיה הגידול שיעור הגידול המקובל (סעיף 2, איור 3א). בינתיים, מעל 30 סרטן האדם קווי תאים כמו גם מעל 20 PDXs של סוגי סרטן שונים הוקרן כדי להעריך את קצב גידול הגידול, הביטוי PD-L1 ביטוי וחדירות התא החיסונית (סעיף 3). תוצאות הנציגים הוצגו באיור 3ב.
מדובר בעכברים ההומניסטיים האלה שימשו לבדיקת הפעילות נגד הגידול של BGB-A317. האדם PBMCs מתורמים בריאים שנבחרו היו מוזרק עם תאים סרטניים האדם (A431, SKOV3 ו SK-MES-1) או שברי רקמות הגידול העיקרי נגזר מחולי סרטן (BCCO-028 ו BCLU-054) תת-עורי. העכברים טופלו, כפי שצוין באיור 4, עם bgb-A317 או PBS intraperitoneally פעם בשבוע מיום השתלת הגידול. בכל הדגמים הנ ל, BGB-A317 הפגינו פעילויות אנטי סרטניים משמעותי (איור 4).
איור 1 : Myeloablation של עכבר בנוד/SCID באמצעות ציקלופוספמיד (CP) ו disulfiram (DS). (א) מאתר אסטרטגיה המשמשת לזיהוי תת-ערכות של תאים מיאלואידים, כולל נויטרופילים ומונוציטים. (ב) תוצאות מייצגות של תא מיאלואיד (CD11b+), נויטרופילים (CD11b+Ly6G+) ו מונוציט (CD11b+Ly6C+) מספרים על במינונים שונים של טיפול CP. התיבות מייצגות את האחוזון ה-75, ה-50 ואת ה -25 של הערכים. הקווים העליונים והתחתונים מייצגים נקודות נתונים מרביות ומינימליות בטווח ה-IQ של 1.5 x (בין הרבעים), בהתאמה. n = 3 עבור קבוצת הרכב ו-n = 6 לקבוצות שטופלו ב-CP ו/או DS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : השתלת האדם PBMC ו הגידול התאום. (א) דיאגרמת סכמטית המציגה את זרימת העבודה הכללית של מודל הומניזציה מבוסס pbmc. (ב) גידול של תאים A431 על הזרקה תת עורית עם התורם pbmc עם התנאים המצוינים (הנתונים מייצג נפח גידול ממוצע ± SEM, n = 6). (ג) ihc ניתוח של גידולים שפותחו עכברים שטופלו עם או ללא CP + DS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : תורם Pbmc והאדם התאים בסרטן קו המסך. (א) נתוני סיכום מייצגים ממסך התורם של pbmc. PBMC היו מעורבים עם תאים A431 וחוסנו תת-עורי בעכברים הומניזציה/SCID עכבר (ראה שלב 2). כל נקודה מייצגת את ערך הנתונים הממוצע של 3 עכברים הנחרתים באמצעות PBMCs מתורם אחד. (ב) תוצאות הנציג של סרטן התאים האנושיים קו. PBMC מן התורמים שנבחרו הוזרק עם A431, SK-MES-1 או SKOV3 תאים. הנתונים מייצגים נפח גידול ממוצע ± SEM שנאסף מ 3 עכברים, 14 היום הודעה החיסון של קווי התאים שצוין. מתכוון לציון IHC ± SEM מייצג את הביטוי הממוצע של האדם CD8, PD-1 ו-PD-L1 של כל 3 עכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : פעילות אנטי סרטניים וניתוח פרמקודינמיקה של bgb-A317 ב-pbmc מבוססי הומניסטית מודל מבע. הפעילות נגד הגידול של BGB-A317 במינונים מצוין (כש, QW) הוערך באמצעות קווי סרטן האדם תאים (א) A431 (עם 5 x 106 pbmc), (ג) SKOV3 (עם 5 x 106 PBMC), (ד) SK-MES-1 (עם 5 x 106 pbmc), ו המטופל נגזר xenografts תלי (PDXs) (E) bclu-054 (עם 5 x 106 Pbmc) ו (F) bcco-028 (עם 5 x 106 pbmc). PBMC מן תורמים בריאים שנבחרו תאים סרטניים המקביל היו שיתוף מוזרק תת-עורי לתוך הומניזציה/SCID עכברים (n = 8 כדי 10). (ב) הקוונפיקציה של הגידול החדירה hCD8 + ו hCD8 + הונולולו-1 + תאים ב Bgb-A317 טופלו A431 גידולים. n = 8-10 בעלי חיים לכל קבוצה ב-A, ו-C עד F, n = 4-6 בעלי חיים לכל קבוצה ב B; נתונים מייצגים את הממוצע ± SEM. המשמעות הוערכו באמצעות מבחן t דו-זנבי של סטודנט שאינו משויך, תחת ההנחה של שונות שוויונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הידע שלנו על התפתחות הסרטן וההתקדמות התקדמה באופן משמעותי בשנים האחרונות, עם דגש על הבנה מקיפה של תאי הגידול ומשתית הקשורים שלה. רתימת מנגנוני החיסון המארחים יכול לגרום להשפעה גדולה יותר נגד תאים סרטניים, המייצג אסטרטגיית טיפול מבטיח. מודלים murine עם מערכות חיסונית ללא שינוי של העכבר, כגון מודלים syngeneic ואבני חן, השתמשו באופן נרחב כדי לחקור חסינות מחסום מתווכת. הערכות היעילות המשתמשות במודלים אלה תלויות בעיקר במטרה נגד העכבר הפונדקאית נגד נוגדנים13,14. עם זאת, הבדלים הטבועה בין מערכות החיסון של בני אדם ומורנה והעדר מטרות אנושיות מסוימים במודלים murine להגביל מחקרים קליניים של I-O אנטי סרטניים אפקטים15,16. לכן, מודלים של עכבר חזק הכוללים הן תאים חיסוניים אנושיים וגידולים אנושיים הרצוי בדחיפות, אשר ישפרו באופן משמעותי את התרגום והפיתוח של הרומן I-O therapeutics.
כאן, אנו מתארים מודל העכבר מבוססי-השתל של האדם המבוסס על ה-PBMC העלול לשמש באופן נרחב עבור מחקרי I-O טרנסלtional. תורם PBMC, כמו גם סרטן תאים קו/מסכי PDX הם קריטיים כדי להבטיח את החוסן ואת השגות של במחקרים vivo יעילות. תורמים PBMC הוקרן ב-vivo כדי להבטיח גידול אנושי מוצלח והמערכת החיסונית של תא החיסון. בינתיים, מעל 50 קווי התאים PDXs של מקורות סרטן שונים האנושי הוקרן כדי להעריך את קצב צמיחת הגידול, הביטוי האנושי PD-L1, ואת חדירות התא החיסונית. הניתוחים שלנו מראים כי כ 20% של תאי סרטן התאים ו-PDXs בדק להפגין הגידול המקובל שיעור בעוד באותו זמן בעל TILs גבוהה יחסית ו-PD-L1 כתמים, אשר נחשבים מודלים טובים עבור הערכות יעילות I-O.
HLA התאמת משמש באופן שגרתי במרפאה כדי להתאים לחולים ותורמים עבור איבר או השתלות מח17. המחברים, עם זאת, ביצעו רק אפיון מוגבל על הקלדת HLA, וזה נשאר נושא מעניין להיחקר במחקרים עתידיים. המחברים מעוניין לציין כי תורם PBMC עשוי להיות מתאים לקו אחד התאים הסרטניים/PDX אבל לא אידיאלי עבור אחרים. לכן, תורמים PBMC אולי צריך להיות מוקרן עבור כל מודל סרטן כדי להבטיח תוצאות אופטימליות.
חרט של האדם pbmc לתוך הנהון/scid או העכברים nsg תמיד מוביל השתלת xenoic השתל-vs-מארח (xgvhd), הפרעה לאחר השתלת כי התוצאה של התקפה מתווכת החיסונית של רקמת הנמען על ידי התורם תאי T18,19. תצפיות קליניות הקשורות בדרך כלל עם xGVHD נצפו במודל ההומניזציה שלנו, כגון אריתמה, תנוחה כפופות, אובדן משקל ותמותה (נתונים לא מוצגים). פנוטיפים אלה נצפו בדרך כלל לקראת סוף הלימודים שלנו, בדרך כלל ב 1-2 חודשים הודעה לאחר, המציין את התפשטות וחדירה של תאי T האדם באברי היעד xGVHD. הדבר מאפשר חלון של 1-2 חודשים להערכות טיפוליות לטיפול ב-I-O. מספר גישות השתמשו כדי להקטין את החסינות העכבר מולדת ולשפר את התא האנושי החיסונית התאום20,21. לדוגמה, עכברי NSG פגומים בביטוי MHC מחלקה I ו-Class II תומכים בקבלת הפנים של תאי T האנושיים הפונקציונליים בהעדר של xGvHD חריפה לאחר ההזרקה של PBMC22.
בפרוטוקול זה נעשה שימוש בעכברי הנהון/SCID. עכברים homozygous עבור מוטציה SCID יש לקויי T ו B לימפוציטים התפתחות התא ואת הרקע הנהון בנוסף תוצאות הרוצח טבעי לקויה (NK) תאים20. אחרים העכברים לקויה יותר, כמו NSG (המעבדה ג'קסון), NCG (צ ' ארלס הנהר) ו חעוגה (CIEA) זנים, הוקמו. כאשר מוקרן עם pbmcs, עכברים אלה הוכחו לפתח תאים חיסוניים אנושיים וליצור סביבה הדומה למערכת החיסונית האנושית23,24. לחילופין, עכברים אלה יכול להיות מנופה עם CD34+ האדם בתאי מחולל קדמון (hpcs) ולהציג מתמשכת יותר תא T בידול והתבגרות25. בנוסף, הדור הבא מודלים העכבר החיסוני עם שינויים גנטיים נוספים הוקמו כדי לתמוך בפיתוח השושלת האנושית מיאלואידית טובה יותר ולהגדיל את היעילות מוגברת (עיין באתר האינטרנט של התיק משתנים של ה ג'קסון מעבדה ומדעי הביויוני.
פרטים נוספים של שימוש אלה זנים חדשים עבור החיסון החסינות האנושית ממתינים חקירות נוספות. עם זאת, הפרוטוקול המתואר במאמר זה יכול לשמש כמנחה כללי של הקמת ואפיון מודלים העכבר החיסוני מחדש עם PBMC אנושי. שלושה תאים בני סרטן האדם ושני החולה האנושי נגזר xenografts, כיסוי מגוון של סוגי סרטן, הם הפגינו במאמר זה, מציע את היישומים רחב הפוטנציאל של הפרוטוקול שלנו במחקרים I-O טרנסלtional. רוב מודלים pbmc הומניזציה, לידע שלנו, בחרו IV או IP כתוואי הזריקה26,27. המודלים שלנו במקום לספק את החסינות האנושית מחדש באופן חלקי בעכברים הנושאת הגידול האנושי באמצעות תת-עורי מוספים של PBMC אנושי עם סרטן xenografts. גישה זו מספקת חלופה מהירה וחסכונית, אך עדיין מאוד מאפשר להפוך תא גזע מלא החוקה (g., CD34+ תא גזע המטפאות מנופה עכברים הומניזציה). המודל שלנו הוכח להיות שימושי עבור הערכת T העוסקים חיסוני סרטן, במיוחד כאשר עובדים על צירי זמן קצרים או לבחור סוכנים לפני המעבר למודל החסינות רב היוחסין מורכבים יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לכל המחברים יש עניין בעלות על בייג'ין. טונג ג'אנג וקאנג לי הם ממציאים על כיסוי פטנט BGB-A317 תיאר במחקר זה.
Acknowledgments
אנו מודים לחברי המעבדות שלנו לדיונים מועילים. עבודה זו הייתה נתמכת באופן חלקי על ידי התוכנית לחדשנות ולמדעי החיים בביו-רפואית ולטיפוח המחקר של הנציבות העירונית של בייג והטכנולוגיה תחת הסכם גרנט. Z151100003915070 (פרויקט "המחקר הקדם קליני על הרומן אונקולוגיה החיסון נגד הגידול BGB-A317"), וזה היה גם נתמך באופן חלקי על ידי מימון החברה הפנימית למחקר טרום קליני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14 G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
References
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. Journal of Clinical Oncology. 33 (17), 1974-1982 (2015).
- Li, Z., Kang, Y. Emerging therapeutic targets in metastatic progression: A focus on breast cancer. Pharmacology & Therapeutics. 161, 79-96 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Fisher, T. S., et al. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (10), 1721-1733 (2012).
- McCormack, E., et al. Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (4), 773-785 (2013).
- Rongvaux, A., et al. Human hemato-lymphoid system mice: current use and future potential for medicine. Annual Review of Immunology. 31, 635-674 (2013).
- Matsumura, T., et al. Functional CD5+ B cells develop predominantly in the spleen of NOD/SCID/gammac(null) (NOG) mice transplanted either with human umbilical cord blood, bone marrow, or mobilized peripheral blood CD34+ cells. Experimental Hematology. 31 (9), 789-797 (2003).
- Zhang, T., et al. The binding of an anti-PD-1 antibody to FcgammaRIota has a profound impact on its biological functions. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (7), 1079-1090 (2018).
- Gamelli, R. L., Ershler, W. B., Hacker, M. P., Foster, R. S. The effect of disulfiram on cyclophosphamide-mediated myeloid toxicity. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 16 (2), 153-155 (1986).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and Immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6808-6817 (2015).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Mahdi, B. M. A glow of HLA typing in organ transplantation. Clinical and Translational Medicine. 2 (1), 6 (2013).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews Immunolog. 12 (11), 786-798 (2012).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Luban, J., Greiner, D. L. Overcoming current limitations in humanized mouse research. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 125-130 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunolog. 7 (2), 118-130 (2007).
- Brehm, M. A., et al. NOD-scid IL2rgnull (NSG) mice deficient in murine MHC Class I and Class II expression support engraftment of functional human T cells in the absence of acute xenogeneic GVHD following injection of PBMC. The Journal of Immunology. 200, 1 Supplement 57 (2018).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Sasaki, E., et al. Development of a preclinical humanized mouse model to evaluate acute toxicity of an influenza vaccine. Oncotarget. 9 (40), 25751-25763 (2018).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
