Summary
हम एक मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (पीबीएमसी) का वर्णन करते हैं - अनुवादीय इम्यूनो-ऑन्कोलॉजी अनुसंधान के लिए मानवीकृत एक्सोग्रैफ्ट माउस मॉडल पर आधारित है। इस प्रोटोकॉल की स्थापना और आई-ओ चिकित्सा मूल्यांकन के लिए इसी तरह के मॉडल की विशेषता के लिए एक सामान्य दिशानिर्देश के रूप में सेवा कर सकता है.
Abstract
हाल के वर्षों में इम्यूनो-ऑन्कोलॉजी (आई-ओ) थेरेपी की खोज और विकास कैंसर के उपचार में एक मील का पत्थर का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, उपचार की चुनौतियां बनी हुई हैं। मजबूत और रोग से संबंधित पशु मॉडल अतिरिक्त प्रतिरक्षा चौकियों की एक श्रृंखला को संबोधित करने के क्रम में जारी पूर्व नैदानिक अनुसंधान और विकास के लिए महत्वपूर्ण संसाधन हैं। यहाँ, हम एक मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (पीबीएमसी) का वर्णन - आधारित मानवीय exograft मॉडल. BGB-A317 (Tislelizumab), एक investigational मानवीय विरोधी पीडी-1 देर से चरण नैदानिक विकास में एंटीबॉडी, मंच सेट अप, मॉडल विशेषता और दवा प्रभावकारिता मूल्यांकन पर चर्चा करने के लिए एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है. इन मानवीय चूहों परीक्षण सबसे मानव ट्यूमर के विकास का समर्थन, इस प्रकार दोनों मानव प्रतिरक्षा और मानव कैंसर के संदर्भ में आई-ओ चिकित्सा के आकलन की अनुमति. एक बार स्थापित, हमारे मॉडल अपेक्षाकृत समय और लागत प्रभावी है, और आम तौर पर अत्यधिक reprod्य परिणाम उपज. हमारा सुझाव है कि इस लेख में उल्लिखित प्रोटोकॉल मानव PBMC और आई-ओ अनुसंधान के लिए ट्यूमर के साथ पुनर्गठित माउस मॉडल स्थापित करने के लिए एक सामान्य दिशानिर्देश के रूप में सेवा कर सकता है.
Introduction
इम्यूनो-ऑन्कोलॉजी (आई-ओ) कैंसर के उपचार का एक तेजी से विस्तार क्षेत्र है। शोधकर्ताओं ने हाल ही में ट्यूमर पर हमला करने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली के कार्यों modulating की चिकित्सीय क्षमता की सराहना करने के लिए शुरू कर दिया है. प्रतिरक्षा जांच चौकी नाकाबंदी मेलेनोमा, गुर्दे सेल कार्सिनोमा, सिर और गर्दन, फेफड़े, मूत्राशय और प्रोस्टेट कैंसर1,2सहित कैंसर प्रकार की एक किस्म में उत्साहजनक गतिविधियों का प्रदर्शन किया है। लक्षित उपचार है कि सीधे कैंसर की कोशिकाओं को मारने के विपरीत, मैं-ओ चिकित्सा ट्यूमर पर हमला करने के लिए शरीर की प्रतिरक्षा प्रणाली को शक्ति3.
तारीख करने के लिए, कई प्रासंगिक आई-ओ पशु मॉडल स्थापित किया गया है. इन में शामिल हैं: 1) माउस ट्यूमर सेल लाइनों या syngeneic चूहों में ट्यूमर homograft; 2) आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस (जीईएम) या कैंसरजन-प्रेरण से व्युत्पन्न सहज ट्यूमर; 3) एक कार्यात्मक murine प्रतिरक्षा प्रणाली में मानव दवा लक्ष्य (ओं) के दस्तक के साथ झंकार जीईएम; और 4) पुनर्गठित मानव प्रतिरक्षा के साथ चूहों मानव कैंसर कोशिकाओं या रोगी व्युत्पन्न xenografts (PDXs) के साथ प्रतिरोपित. इन मॉडलों में से प्रत्येक स्पष्ट लाभ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सीमाओं, जो वर्णित किया गया है और कहीं और बड़े पैमाने पर समीक्षाकी है 4.
इम्यूनोन्यूफिएंट चूहों में मानव प्रतिरक्षा का पुनर्गठन अनुवाद आई-ओ अनुसंधान के लिए एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक दृष्टिकोण के रूप में बढ़ रहा है। यह आमतौर पर या तो के माध्यम से हासिल की है 1) वयस्क प्रतिरक्षा कोशिकाओं के engraftment (जैसे, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PMBC))5,6,या 2) hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के engraftment (HSC) से, उदाहरण के लिए, गर्भनाल रक्त या भ्रूण जिगर7,8. इन मानवीय चूहों मानव ट्यूमर के विकास का समर्थन कर सकता है, इस प्रकार दोनों मानव प्रतिरक्षा और मानव कैंसर के संदर्भ में आई-ओ चिकित्सा के आकलन की अनुमति. फायदे के बावजूद, आई-ओ अनुसंधान में humanized चूहों के आवेदन आम तौर पर इस तरह के लंबे मॉडल विकास समय और काफी उच्च लागत के रूप में कई चिंताओं, द्वारा बाधित थे.
यहाँ, हम एक मानव PBMC आधारित मॉडल है कि व्यापक रूप से अनुवाद आई-ओ अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है का वर्णन. इस मॉडल अपेक्षाकृत समय है और प्रभावकारिता अध्ययन में उच्च reproducibility के साथ लागत प्रभावी है. यह वर्तमान में पूर्व नैदानिक और नैदानिक विकास के तहत कई आई-ओ चिकित्सकीय के मूल्यांकन के लिए घर में इस्तेमाल किया गया है। BGB-A317 (Tislelizumab), एक जांच मानवीय विरोधी पीडी-1 एंटीबॉडी9, मॉडल विकास पर चर्चा करने के लिए उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है, विशेषता, और विरोधी ट्यूमर प्रभावकारिता विश्लेषण के लिए संभव अनुप्रयोगों.
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Protocol
मानव प्रतिभागियों को शामिल अध्ययन में प्रदर्शन सभी प्रक्रियाओं BeiGene और / या राष्ट्रीय अनुसंधान समिति के नैतिक मानकों के अनुसार और 1964 हेलसिंकी घोषणा और उसके बाद संशोधन या तुलनीय नैतिक मानकों के साथ थे. अध्ययन में शामिल सभी व्यक्तिगत प्रतिभागियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। पशुओं से संबंधित अध्ययनों में की गई सभी प्रक्रियाओं को बीजीन में आंतरिक समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल को विशेष रूप से बीजीबी-ए317 (Tislelizumab) के मानवीय NOD/SCID चूहों में मूल्यांकन के लिए समायोजित किया गया है।
1. मानव पीबीएमसी आधारित मॉडल की स्थापना
-
साइक्लोफॉस्फामाइड का उपयोग करके NOD/SCID चूहों का माइलोबेशन: इष्टतम खुराक का निर्धारण
- खरीद महिला NOD / SCID चूहों (6-8 सप्ताह).
नोट: इस अध्ययन में शामिल सभी चूहे मादा थे। - लवण में विभिन्न खुराक (50, 100 और 150 मिलीग्राम/किलोग्राम) पर साइक्लोफॉस्फेट (सीपी) तैयार करें। 125 मिलीग्राम प्रति किलो पर नमकीन में 0.8% ट्वेन-80 में disulfiram (डी एस) तैयार करें।
नोट: CP के विभिन्न सांद्रता CP की विभिन्न खुराक हो रही चूहों के लिए दवा समाधान के बराबर मात्रा के प्रशासन को सक्षम करने के लिए तैयार थे. - 2 दिनों के लिए दिन में एक बार सीपी (i.p.) और डी एस (p.o.) के साथ जानवरों का इलाज करें। डी एस (p.o.) CP की प्रत्येक खुराक के बाद 2 एच दे.
नोट: डी एस चूहों में सीपी की यूरोटॉक्सिसिटी कम हो जाती है, और डी एस के साथ संयुक्त सीपी को लंबे समय तक चलने वाले न्यूट्रोपेनिया का सुझाव दिया गया है जो अकेले सीपी के साथ इलाज किए गए जानवरों की तुलना में लंबे समय तक चलने वाले न्यूट्रोपेनिया है10 सीपी की खुराक आहार को वास्तविक अध्ययन से पहले पूर्व निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है और यह अलग-अलग पाया गया था विभिन्न इम्यूनोडेसिकमूडेसिवेज़ माउस उपभेदों के बीच थोड़ा। - कक्षीय शिरापरक साइनस से रक्त के नमूने एकत्र करें और दिन 0 पर EDTA-K लेपित ट्यूबों में स्थानांतरित करें (1 एच 1सेंट खुराक से पहले), दिन 2 (24 एच 2nd खुराक के बाद) और दिन 4 (72 एच 2nd खुराक के बाद).।
- FACS द्वारा सीपी और डी एस उपचार के बाद myeloablation प्रभाव की जांच. चूहे विरोधी माउस CD11b (M1/70), चूहे विरोधी माउस Ly6C (HK1.4, ) और चूहे विरोधी माउस Ly6G (1A8) CD11b+ Ly6Gउच्च न्यूट्रोफिल के रूप में gating के लिए का प्रयोग करें, CD11b+Ly6Cउच्च मोनोसाइट्स के रूप में11,12.
- रिकॉर्ड शरीर के वजन और चूहों के स्वास्थ्य की स्थिति एक सप्ताह के लिए दैनिक. CP और डी एस के इष्टतम खुराक चूहों के लिए गंभीर विषाक्तता के कारण के बिना न्यूट्रोफिल और monocytes की अधिकतम कमी में परिणाम है कि आहार के रूप में निर्धारित किया जाता है.
- खरीद महिला NOD / SCID चूहों (6-8 सप्ताह).
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मानव PBMC प्रत्यारोपण और ट्यूमर engraftment: मॉडल सेट अप
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार घनत्व ढाल centrifugation द्वारा स्वस्थ दाताओं से मानव PBMCs अलग करें.
- प्रत्यारोपण दक्षता बढ़ाने के लिए चरण 1.1.2 और 1.1.3 द्वारा इंगित के रूप में CP और डी एस के साथ चूहों पूर्व इलाज.
- 20 से 24 एच CP और डी एस की दूसरी खुराक के बाद, इस तरह के A431 कोशिकाओं के रूप में मानव ट्यूमर सेल लाइन इंजेक्ट (ATCC, 2.5 x 106) और 5 x 106 अलग PBMCs (कुल में मिश्रित 200L फॉस्फेट-बफ़र्ड नमकीन (पीबीएस) युक्त 50% Matrigel) , या ट्यूमर के टुकड़े (3 x 3 x 3 मिमी3, की कुल मात्रा में 200 $L PBS युक्त 50% Matrigel) और 200 $L 5 x 106 PBMCs (100 $L प्रत्येक engrafted ट्यूमर टुकड़ा के बाईं और दाईं ओर) (s.c.) जानवरों के दाईं ओर में subcutanously.
- 4-6 सप्ताह के लिए प्राथमिक ट्यूमर की मात्रा और रिकॉर्ड एक सप्ताह में दो बार उपाय।
नोट: चूहों एक बार उनके शरीर के वजन 20% से अधिक खो या उनके ट्यूमर की मात्रा तक पहुँच जाता है 2,000 मिमी3 या ट्यूमर ulcerated है इच्छामृत्यु हो जाएगा. - कार्बन डाइऑक्साइड के साथ गैस कक्षों में चूहों euthanize. नेत्र कैंची के साथ बलिदान चूहों में पूरे ट्यूमर के ऊतकों को ले लीजिए और उन्हें ऊतक विज्ञान और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) विश्लेषण के लिए प्रक्रिया। इन ऊतकों में मानव CD8, पीडी-1 और पीडी-L1 अभिव्यक्ति की जांच करें। प्रोटोकॉल चरण 4 देखें.
2. PBMC दाता स्क्रीन
- व्यक्तियों से एकत्र PBMCs से हुई प्रत्याशित विविधताओं के कारण PBMC दाताओं के एक पैनल स्क्रीन. चरण 1.2 द्वारा दर्शाई गई प्रक्रियाओं के अनुसार विभिन्न दाताओं से PBMCs के साथ सह-इंजेक्शन A431 कोशिकाओं का उपयोग करें.
नोट: 50 से अधिक स्वस्थ PBMC दाताओं के लिए उपयुक्त दाताओं की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए अध्ययन में जांच की गई. शोधकर्ताओं, जो इस प्रोटोकॉल को अपनाने के लिए चाहते हैं अपने आप पर तय हो सकता है कि कितने स्वस्थ PBMC दाताओं की जांच की जानी है, की योजना बनाई अध्ययन के डिजाइन के आधार पर. - एक कैलिपर के साथ मापने के द्वारा एक सप्ताह में दो बार ट्यूमर की मात्रा की निगरानी करें।
नोट: ट्यूमर विकास दर विभिन्न दाताओं से PBMC के साथ भिन्न हो सकते हैं. - 200-500 मिमी3 की एक औसत मात्रा में ट्यूमर के ऊतकों को इकट्ठा करने और उन्हें ऊतक विज्ञान और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) विश्लेषण के लिए प्रक्रिया। मानव CD8, पीडी-1 और पीडी-L1 अभिव्यक्ति की जांच. विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए चरण 4 देखें.
- PBMC दाताओं है कि मध्यम ट्यूमर विकास में परिणाम का चयन करें (ट्यूमर मात्रा और 200 मिमी3 14 दिन के बाद टीका) और अपेक्षाकृत उच्च पीडी-1, पीडी-L1 और CD8 अभिव्यक्ति (मतलब IHC स्कोर और gt; 2). विस्तृत IHC स्कोरिंग प्रोटोकॉल के लिए चरण 4 देखें।
3. मानव कैंसर सेल लाइन और PDX स्क्रीन
- चरण 1.2 में कहा गया प्रक्रियाओं के अनुसार स्क्रीन सेल लाइनों और PDXs, ट्यूमर विकास दर का मूल्यांकन करने के लिए, ट्यूमर और प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ के मानव पीडी-L1 अभिव्यक्ति.
नोट: 30 से अधिक मानव कैंसर सेल लाइनों और विभिन्न प्रकार के कैंसर के 20 से अधिक PDXs लेखकों द्वारा जांच की गई. चयनित ट्यूमर मॉडल के डेटा परिणाम अनुभाग में दिखाए गए थे.
4. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी)
- फसल के रूप में कदम 1.2.5 द्वारा संकेत दिया और formalin में डूब द्वारा ट्यूमर के ऊतकों को ठीक. निर्जलीकरण और पैराफिन में स्थिर ऊतकों एम्बेड. नियत ऊतकों को 3 डिग्री मीटर पर अनुभाग करें और उन्हें पॉलीलिसिन-कोटेड स्लाइडों पर रखें।
- तीन बार 7 मिनट प्रत्येक xylenes में deparaffinize. वर्गीकृत alcohols के माध्यम से वर्गों हाइड्रेट: 100% इथेनॉल दो बार 3 मिनट प्रत्येक के लिए, 90%, 80% और 70% इथेनॉल के बदले में 3 मिनट प्रत्येक के लिए पीछा किया. deionized एच2हे तीन बार कुल्ला और स्लाइड से अतिरिक्त तरल हटा दें।
- एक कंटेनर में स्लाइड रखकर प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन और 10 एमएम सोडियम साइट्रेट बफर (पीएच 6.0), या Tris-EDTA (पीएच 9.0) के साथ कवर। 30 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में उबालें और फिर कमरे के तापमान को ठंडा करें, 3 मिनट के लिए माइक्रोवेव द्वारा स्लाइड कंटेनर को गरम करें। deionized एच2हे तीन बार और स्लाइड से अतिरिक्त तरल aspirate द्वारा कुल्ला.
- पीबीएस में 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन द्वारा 1 एच और 0.3% एच2ओ2 समाधान के लिए पीबीएस में 10 मिनट के लिए ब्लॉक करें। मानव सीडी 8 (ईपी 334), पीडी-1 (NAT105,) और पीडी-एल1 (E1L3N) के खिलाफ एंटीबॉडी द्वारा आरटी पर 2 एन डी एंटीबॉडी का दाग, और एचआरपी ने आरटी पर 2एन डी एंटीबॉडी को शामिल किया। के लिए 1 ज. स्लाइड पर सब्सट्रेट DAB (3,3'-diaminobenzidine) ड्रॉप और माइक्रोस्कोप से भूरे रंग की निगरानी के द्वारा प्रतिक्रिया समय (मिनट के लिए सेकंड) को नियंत्रित करते हैं।
- स्लाइड में 0.5% हाइड्रोक्लोरिक एसिड अल्कोहल और 0.5% अमोनिया पानी के बदले में 5 एस प्रत्येक के लिए, तो 80%, 90% और 100% इथेनॉल में 3 मिनट प्रत्येक के लिए अनुक्रम में, और अंत में xylenes में डूब के बाद स्लाइड ्स्ड कवर 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन परिवर्तन का उपयोग कर. माइक्रोस्कोप का उपयोग कर DAB के भूरे रंग को देख कर एंटीबॉडी का पता लगाएँ।
नोट: ट्यूमर घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स (टीआईएल) पर मानव CD8 और पीडी-1 अभिव्यक्ति उच्च उद्देश्य आवर्धन (20x, 40x) पर एक 5-बिंदु पैमाने (IHC स्कोर, रेंज 0-4) पर एक अभिव्यक्ति स्कोर निर्दिष्ट करके मूल्यांकन किया गया। 0, अनुपस्थित; 1, कमजोर तीव्रता / कम से कम 20% कोशिकाओं; 2, कमजोर करने के लिए मध्यम तीव्रता / 20%-50% कोशिकाओं; 3, मध्यम करने के लिए मजबूत तीव्रता / 50%-80% कोशिकाओं; 4, मजबूत तीव्रता / 80% से अधिक कोशिकाओं। ट्यूमर कोशिकाओं के भीतर मानव पीडी-L1 धुंधला एक 5-बिंदु पैमाने पर एक समायोजित स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग कर रन बनाए थे (IHC स्कोर, रेंज 0-4) इसकी अपेक्षाकृत फैलाना संकेत की वजह से. 0, अनुपस्थित; 1, कमजोर तीव्रता / कम से कम 10% कोशिकाओं; 2, कमजोर करने के लिए मध्यम तीव्रता / 10%-30% कोशिकाओं; 3, मध्यम/ 30%-50% कोशिकाओं; 4, मजबूत तीव्रता / 50% से अधिक कोशिकाओं।
5. जीवाणो प्रभावकारिता और फार्माकोडायनामिक्स स्टडीज इन ह्यूमनाइज्ड पीबीएमसी-एनओडी/
- पूर्व उपचार NOD/SCID चूहों के रूप में कदम 1.1.3 द्वारा संकेत दिया. संक्षेप में, चूहों के साथ इलाज 100 mg/kg CP (i.p.) और 125 mg/kg डी एस (पी.ओ.) 2 दिनों के लिए एक दिन में एक बार.
- दूसरी खुराक के बाद 20 से 24 एच, मानव कैंसर कोशिकाओं की संकेत संख्या और 2.5-5 x 106 PBMCs (50% Matrigel में 200 डिग्री सेल्सियस सेल मिश्रण की कुल) जानवरों के दाहिने सामने पार्श्व में subcutaneously (s.c.) सुई.
नोट: एक ही अध्ययन में किसी भी व्यक्ति माउस के लिए इस्तेमाल किया PBMC की संख्या एक ही होना चाहिए. हालांकि, प्रत्येक अध्ययन के समय कुल अलग PBMC की उपलब्धता में बदलाव के कारण, लेखकों को विभिन्न अध्ययनों में 2.5 x 106, 4 x 106, या 5 x 106 PBMC का उपयोग करने के लिए चुना है. हालांकि PBMCs के प्रशासित राशि में यह 2 गुना अंतर मानवीकरण की डिग्री को प्रभावित कर सकता है, लेखकों परीक्षण इम्यूनोथेरपी के विरोधी ट्यूमर efficacies के मूल्यांकन में महत्वपूर्ण अंतर का पालन नहीं करते. - PDXs engraftment के लिए, जानवरों के दाहिने सामने पार्श्व में subcutaneously ट्यूमर टुकड़े (3 x 3 x 3 मिमी3) सुई. इंजेक्शन subcutaneously 200 $L के 5 x 106 PBMCs (100 $L प्रत्येक पक्ष) engrafted ट्यूमर टुकड़ा के बाएँ और दाएँ करने के लिए.
नोट: PDX ट्यूमर ऊतकों एक Matrigel समाधान में प्रशासित किया गया, सेल लाइन मॉडल के लिए वर्णित के रूप में ही. - कोशिका टीका के दिन, बेतरतीब ढंग से जानवरों को समूहीकृत करें और नियोजित अध्ययन प्रोटोकॉल के रूप में व्यवहार करें। उम्मीदवार दवाओं के विरोधी ट्यूमर गतिविधि का आकलन, BGB-A317 (QW, i.p.) इस मामले में, विभिन्न ट्यूमर मॉडल में संकेत खुराक पर.
नोट: तीन मानव कैंसर सेल लाइनों (यानी, A431 (epidemoid कार्सिनोमा), SKOV3 (ओवेरियन कैंसर) और एसके-एमईएस-1 (लंग कैंसर)), साथ ही दो PDX मॉडल (यानी, BCLU-054 (लंग कैंसर) और BCCO-028 (कोलन कैंसर)), मैं-ओ चिकित्सा के लिए अच्छा ट्यूमर मॉडल माना जाता है इस मानवीय माउस मॉडल में मूल्यांकन. - प्राथमिक ट्यूमर की मात्रा को हर हफ्ते दो बार उपाय, एक कैलिपर का उपयोग कर.
नोट: Gand शरीर के वजन घटाने के आसपास मनाया गया 4-6 सप्ताह के बाद PBMC हमारे अध्ययन में engraftment, चिकित्सीय प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए एक 1-2 महीने खिड़की की अनुमति. - ट्यूमर के फार्माकोडायनामिक्स विश्लेषण के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं में घुसपैठ की, छोटे टुकड़ों में ट्यूमर के ऊतकों में कटौती और उन्हें collagenase प्रकार के साथ पचा मैं (1 mg/mL) और DNase मैं (100 डिग्री ग्राम /एमएल) RPMI1640 प्लस 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए। एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए पचते हुए ऊतकों को 40 डिग्री कोशिका छन्नियों के माध्यम से पास करें।
- कोशिकाओं को धो लें और 96-अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेटों में बर्फ ठंड FACS बफर (पीबीएस, 1% FBS) में 1 x 107 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के लिए सेल नंबर समायोजित करें। केन्द्रापसारण द्वारा कोशिकाओं को धो लें और 30 मिनट के लिए 20 डिग्री/एमएल मानव आईजीजी जोड़कर उन्हें ब्लॉक करें, इसके बाद मानव विरोधी सीडी 3 (HIT3a), CD8 (OKT8) और पीडी-1 (MIH4) एंटीबॉडी के साथ 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर दाग लगाया गया है। फिर विषय दाग नमूने cytometry प्रवाह और अमरूद का उपयोग कर विश्लेषण 3.1.1.
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Representative Results
यहाँ प्रस्तुत प्रक्रियाओं के बाद, एक PBMC आधारित humanized xenograft मॉडल सफलतापूर्वक स्थापित किया गया था. संक्षेप में, NOD/SCID चूहों में CP myeloablation प्रभाव न्यूट्रोफिल और मोनोसाइट आबादी के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था CP और डी एस उपचार के बाद (चित्र 1)। 100 mg/kg CP प्लस 125 mg/kg डी एस इष्टतम खुराक के रूप में निर्धारित किया गया था और बाद के अध्ययनों में प्रयोग किया जाता है क्योंकि आहार चूहों को गंभीर विषाक्तता के कारण के बिना न्यूट्रोफिल और मोनोसाइट्स की अधिकतम कमी में परिणाम है। इसके बाद, मानव पीबीएमसी और ट्यूमर प्रत्यारोपण किया गया था। मानव प्रतिरक्षा कोशिका की उपस्थिति ट्यूमर microenvironment में घुसपैठ IHC द्वारा सत्यापित किया गया था (चित्र 2) .
पीबीएमसी दाताओं के एक पैनल को विवो में जांच की गई ताकि ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट और स्वीकार्य ट्यूमर विकास दर (खंड 2, चित्र 3ए)में अपेक्षाकृत उच्च प्रतिरक्षा कोशिका की घुसपैठ सुनिश्चित की जा सके। इस बीच, 30 से अधिक मानव कैंसर सेल लाइनों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विभिन्न प्रकार के कैंसर के 20 से अधिक PDXs ट्यूमर विकास दर, ट्यूमर पीडी-L1 अभिव्यक्ति और प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ (अनुभाग 3) का मूल्यांकन करने के लिए जांच की गई. प्रतिनिधि परिणाम चित्र 3खमें दिखाए गए थे।
ये PBMC-engrafted मानवीय चूहों तो BGB-A317 के विरोधी ट्यूमर गतिविधि की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया. चयनित स्वस्थ दाताओं से मानव PBMCs सह मानव ट्यूमर कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन थे (A431, SKOV3 और एसके-एमईएस-1) या प्राथमिक ट्यूमर ऊतक कैंसर रोगियों से व्युत्पन्न टुकड़े (BCCO-028 और BCLU-054) subcutaneously. चूहों का इलाज किया गया, जैसा कि चित्रा 4में दर्शाया गया है, बीजीबी-ए317 या पीबीएस के साथ सप्ताह में एक बार ट्यूमर प्रत्यारोपण के दिन से। उपरोक्त सभी मॉडलों में, BGB-A317 महत्वपूर्ण विरोधी ट्यूमर गतिविधियों का प्रदर्शन किया (चित्र 4).
चित्र 1 : साइक्लोफॉस्फास्मिड (सीपी) और डिस्ल्फीराम (डीएस) का उपयोग करके एनओडी/एससीआईडी चूहों का माइलोबेशन। (ए) गैटिंग रणनीति का उपयोग न्यूट्रोफिल और मोनोसाइट्स सहित माइलॉयड सेल सबसेट की पहचान करने के लिए किया जाता है। (ख) माइलॉयड सेल (CD11b+ ),न्यूट्रोफिल (CD11b+Ly6G+) और मोनोसाइट (CD11b+Ly6C+) के प्रतिनिधि परिणाम सीपी उपचार के विभिन्न खुराकों पर संख्या। बक्से मूल्यों के 75 वें, 50 वीं और 25 वीं शतमक का प्रतिनिधित्व करते हैं. शीर्ष और नीचे लाइनों क्रमशः 1.5x बुद्धि (इंटर तिमाही) रेंज के भीतर अधिकतम और कम से कम डेटा अंक का प्रतिनिधित्व करते हैं। द वाहन समूह के लिए 3 तथा सीपी तथा/अथवा डी एस उपचारित समूहों के लिए द 6। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : मानव PBMC प्रत्यारोपण और ट्यूमर engraftment| (क) पीबीएमसी आधारित मानवीयीकृत एक्सोग्रेफ्ट मॉडल के सामान्य कार्यप्रवाह को दर्शाने वाला स्कीमेटिक आरेख। (बी) संकेत शर्तों के साथ दाता PBMC के साथ subcutaneous सह इंजेक्शन पर A431 कोशिकाओं के ट्यूमर विकास (डेटा मतलब ट्यूमर मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है - SEM, n ] 6). (सी) सी पी + डी एस के साथ या बिना इलाज चूहों में विकसित ट्यूमर के आईएचसी विश्लेषण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : PBMC दाता और मानव कैंसर सेल लाइन स्क्रीन. (A) PBMC दाता स्क्रीन से प्रतिनिधि सारांश डेटा. PBMC A431 कोशिकाओं के साथ मिलाया गया था और मानवीकृत NOD/SCID चूहों में incutaneously in inoculated (चरण 2 देखें). प्रत्येक डॉट 1 दाता से PBMCs के साथ engrafted 3 चूहों का मतलब डेटा मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है. (बी) मानव कैंसर सेल लाइन स्क्रीन से प्रतिनिधि परिणाम. चयनित दाताओं से PBMC सह A431, SK-MES-1 या SKOV3 कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन थे. डेटा मतलब ट्यूमर की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है - SEM 3 चूहों से एकत्र, संकेत सेल लाइनों के 14 दिन के बाद टीका. मतलब IHC स्कोर - SEM मानव CD8, पीडी-1, और सभी 3 चूहों के पीडी-L1 की औसत अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : पीबीएमसी स्थित मानवीकृत जेनोग्रैफ्ट मॉडल में बीजीबी-ए317 के ट्यूमर विरोधी गतिविधियों और फार्माकोडायनामिक्स विश्लेषण। संकेत खुराक पर BGB-A317 के विरोधी ट्यूमर गतिविधि (i.p., QW) मानव कैंसर सेल लाइनों का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था (एक) A431 (के साथ 5 x 106 PBMC), (सी ) SKOV3 (के साथ 5 x 106 PBMC), (डी ) SK-MES-1 (के साथ 5 x 106 PBMC), और रोगी व्युत्पन्न xenografts (PDXs) (ई) BCLU-054 (5 x 106 PBMC के साथ) और (एफ) BCCO-028 (5 x 106 PBMC के साथ). चयनित स्वस्थ दाताओं और इसी ट्यूमर कोशिकाओं से PBMC सह-इंजेक्शन मानवीकृत NOD/SCID चूहों में किया गया (एन $ 8 से 10). (B) BGB-A317 में ट्यूमर घुसपैठ hCD8 + और hCD8 + hPD-1+ कोशिकाओं का परिमाणीकरण A431 ट्यूमर का इलाज किया. द ए में प्रति समूह 8-10 जंतु तथा ब् से च तक, द े 4ण्6 जंतु प्रति समूह भ में; डेटा मतलब का प्रतिनिधित्व करता है - SEM. असमान विचरण की धारणा के तहत एक दो पूंछ unpaired छात्र टी परीक्षण का उपयोग कर महत्व का मूल्यांकन किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
कैंसर के विकास और प्रगति के बारे में हमारा ज्ञान हाल के वर्षों में काफी उन्नत हुआ है, ट्यूमर कोशिकाओं और इसके संबद्ध स्ट्रोमा दोनों की व्यापक समझ पर ध्यान केंद्रित करने के साथ। मेजबान प्रतिरक्षा तंत्र हार्नेसिंग कैंसर की कोशिकाओं के खिलाफ एक बड़ा प्रभाव पैदा कर सकता है, एक आशाजनक उपचार रणनीति का प्रतिनिधित्व. बरकरार माउस प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ Murine मॉडल, ऐसे syngeneic और जीईएम मॉडल के रूप में, व्यापक रूप से जांच की चौकी मध्यस्थता प्रतिरक्षा का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन मॉडलों का उपयोग करने वाले दक्षता मूल्यांकन काफी हद तक सरोगेट एंटी-माउस लक्ष्य एंटीबॉडी13,14पर निर्भर करते हैं। हालांकि, मानव और murine प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच निहित मतभेद और murine मॉडल में कुछ मानव लक्ष्यों की कमी आई-ओ विरोधी ट्यूमर प्रभाव15,16के पूर्व नैदानिक अध्ययन की सीमा . इसलिए, मजबूत माउस मॉडल है कि दोनों मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं और मानव ट्यूमर शामिल तत्काल वांछित हैं, जो काफी अनुवाद और उपन्यास मैं-ओ चिकित्सकीय के विकास में सुधार होगा.
यहाँ, हम एक मानव PBMC आधारित xenograft माउस मॉडल है कि संभवतः व्यापक रूप से अनुवाद आई-ओ अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णन. PBMC दाता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कैंसर सेल लाइन / पीडीएक्स स्क्रीन vivo प्रभावकारिता अध्ययन में की मजबूती और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. सफल मानव ट्यूमर और प्रतिरक्षा सेल engraftment सुनिश्चित करने के लिए पीबीएमसी दाताओं vivo में जांच की गई. इस बीच, 50 से अधिक सेल लाइनों और विभिन्न मानव कैंसर मूल के PDXs ट्यूमर विकास दर, मानव पीडी-L1 अभिव्यक्ति, और प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ का मूल्यांकन करने के लिए जांच की गई. हमारे विश्लेषण का सुझाव है कि कैंसर सेल लाइनों और PDXs के बारे में 20% की जांच की स्वीकार्य ट्यूमर विकास दर का प्रदर्शन करते हुए एक ही समय में अपेक्षाकृत उच्च TILs और पीडी-L1 धुंधला, जो मैं के लिए अच्छा मॉडल माना जाता है-ओ प्रभावकारिता मूल्यांकन.
एचएलए मिलान नियमित रूप से अंग या मज्जा प्रत्यारोपण17के लिए रोगियों और दाताओं मैच के लिए क्लिनिक में प्रयोग किया जाता है । लेखकों, तथापि, केवल HLA टाइपिंग पर सीमित लक्षण प्रदर्शन किया है, और यह एक दिलचस्प विषय के लिए भविष्य के अध्ययन में जांच की बनी हुई है. लेखकध्यान दें कि एक PBMC दाता एक कैंसर सेल लाइन के लिए उपयुक्त हो सकता है / इसलिए, पीबीएमसी दाताओं के लिए प्रत्येक कैंसर मॉडल के लिए जांच की जरूरत हो सकती है इष्टतम परिणाम सुनिश्चित करने के लिए.
मानव पीबीएमसी को NOD/SCID या NSG चूहों में प्रवेश हमेशा एक xenogeneic भ्रष्टाचार-vs-होस्ट रोग (xGvHD), एक पोस्ट ट्रांसप्लांट विकार है कि दाता टी कोशिकाओं द्वारा प्राप्तकर्ता ऊतक के प्रतिरक्षा मध्यस्थता हमले से परिणाम की ओर जाता है18,19. आमतौर पर xGVHD के साथ जुड़े नैदानिक टिप्पणियों हमारे मानवीय मॉडल में मनाया गया है, जैसे एरिथेमा, hunched मुद्रा, वजन घटाने और मृत्यु दर (डेटा नहीं दिखाया). ये phenotypes आमतौर पर हमारे अध्ययन के अंत की ओर मनाया गया, आमतौर पर 1-2 महीने के बाद engraftment, प्रचार और xGVHD लक्ष्य अंगों में मानव टी कोशिकाओं की घुसपैठ का संकेत. यह चिकित्सकीय आई-ओ चिकित्सा मूल्यांकन के लिए एक 1-2 महीने खिड़की की अनुमति देता है. माउस की जन्मजात प्रतिरक्षा को कम करने और मानव प्रतिरक्षाकोशिका को बढ़ाने के लिए अनेक दृष्टिकोणों का उपयोग किया गया है. उदाहरण के लिए, एनएसजी चूहों murine MHC कक्षा मैं और कक्षा द्वितीय अभिव्यक्ति में दोषपूर्ण पीबीएमसी22के इंजेक्शन के बाद तीव्र xGvHD के अभाव में कार्यात्मक मानव टी कोशिकाओं के engraftment समर्थन करते हैं.
इस प्रोटोकॉल में NOD/SCID चूहों का उपयोग किया गया था। एससीआईडी उत्परिवर्तन के लिए चूहे समयुग्मज टी और बी सेल लिम्फोसाइट विकास बिगड़ा हुआ है और NOD पृष्ठभूमि अतिरिक्त कमी प्राकृतिक हत्यारा (एनके) सेल समारोह20में परिणाम है। अन्य अधिक अत्यधिक इम्यूनोडेबिलेटेड चूहों, जैसे एनएसजी (द जैक्सन प्रयोगशाला), एनसीजी (चार्ल्स नदी) और एनओजी (सीआईईए) उपभेदों, स्थापित किए गए हैं। जब PBMCs के साथ engrafted, इन चूहों मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विकास और एक वातावरण है कि मानव प्रतिरक्षा प्रणाली23,24जैसा दिखता है के रूप में दिखाया गया है. वैकल्पिक रूप से, इन चूहों CD34+ मानव hematopoietic जनक कोशिकाओं (HPCs) के साथ engrafted किया जा सकता है और अधिक निरंतर टी सेल भेदभाव और परिपक्वता25प्रदर्शित करते हैं. इसके अलावा, आगे आनुवंशिक संशोधनों के साथ अगली पीढ़ी के इम्यूनोडेफिशिएंट माउस मॉडल बेहतर मानव माइलॉयड वंश विकास और वृद्धि engraftment दक्षता का समर्थन करने के लिए स्थापित किया गया है (के वेरिएंट पोर्टफोलियो वेबपेज को देखें जैक्सन प्रयोगशाला और Taconic बायोसाइंसेज).
मानव प्रतिरक्षा पुनर्गठन के लिए इन नए उपभेदों का उपयोग करने का अधिक विवरण आगे की जांच लंबित है। फिर भी, इस लेख में उल्लिखित प्रोटोकॉल मानव PBMC के साथ पुनर्गठित प्रतिरक्षा की कमी माउस मॉडल की स्थापना और विशेषता के एक सामान्य दिशानिर्देश के रूप में सेवा कर सकता है. तीन मानव कैंसर सेल लाइनों और दो मानव रोगी व्युत्पन्न xenografts, कैंसर प्रकार की एक श्रृंखला को कवर, इस लेख में प्रदर्शन कर रहे हैं, translational आई-ओ अध्ययन में हमारे प्रोटोकॉल के संभावित व्यापक अनुप्रयोगों का सुझाव. अधिकांश मानवीय PBMC मॉडल, हमारे ज्ञान के लिए, इंजेक्शन26,27के मार्ग के रूप में चतुर्थ या आईपी चुना है. हमारे मॉडल के बजाय कैंसर xenografts के साथ मानव PBMC के subcutaneously admixing के माध्यम से मानव ट्यूमर असर चूहों में आंशिक रूप से पुनर्गठित मानव प्रतिरक्षा प्रदान करते हैं. यह दृष्टिकोण पूर्ण स्टेम सेल पुनर्गठन के लिए एक तेजी से और लागत प्रभावी, अभी तक अत्यधिक reproduible विकल्प प्रदान करता है (उदा., CD34+ hematopoietic स्टेम सेल engrafted humanized चूहों). हमारे मॉडल टी सेल संलग्न कैंसर इम्यूनोथेरपी का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी साबित हो गया है, खासकर जब कम समय पर काम कर रहे हैं या एक और अधिक जटिल बहु वंश प्रतिरक्षा मॉडल के लिए जाने से पहले एजेंटों का चयन करने के लिए।
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Disclosures
सभी लेखकों BeiGene में स्वामित्व रुचि है. टोंग झांग और कांग ली इस अध्ययन में वर्णित BGB-A317 को कवर एक पेटेंट पर आविष्कारक हैं.
Acknowledgments
हम सहायक विचार विमर्श के लिए हमारी प्रयोगशालाओं के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। यह काम आंशिक रूप से अनुदान समझौते के तहत बीजिंग नगर विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग के जैव चिकित्सा और जीवन विज्ञान नवाचार और खेती अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था No. $ 151100003915070 (परियोजना "एक उपन्यास प्रतिरक्षा ऑन्कोलॉजी विरोधी ट्यूमर दवा BGB-A317 पर पूर्व नैदानिक अध्ययन"), और यह भी आंशिक रूप से पूर्व नैदानिक अनुसंधान के लिए आंतरिक कंपनी के वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PBMC separation /cell culture | |||
Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
FACS analysis | |||
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
Hypodermic needles (14 G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
IHC | |||
Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
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