Summary
Wir beschreiben eine menschliche periphere Mononuklezelle (PBMC) – basierendes humanisiertes Xenograft-Mausmodell für translationale Immunonkologieforschung. Dieses Protokoll könnte als allgemeine Leitlinie für die Erstellung und Charakterisierung ähnlicher Modelle für die Bewertung von I-O-Therapien dienen.
Abstract
Die Entdeckung und Entwicklung der Immunonkologie (I-O) in den letzten Jahren stellt einen Meilenstein in der Krebsbehandlung dar. Die Behandlungsherausforderungen bestehen jedoch nach wie vor. Robuste und krankheitsrelevante Tiermodelle sind wichtige Ressourcen für die weitere präklinische Forschung und Entwicklung, um eine Reihe zusätzlicher Immun-Checkpoints anzugehen. Hier beschreiben wir eine menschliche periphere mononukleäre Blutzelle (PBMC) – basierend auf humanisiertem Xenograft-Modell. BGB-A317 (Tislelizumab), ein humanisierter Anti-PD-1-Antikörper in der späten klinischen Entwicklung, wird als Beispiel verwendet, um Plattform-Setup, Modellcharakterisierung und Bewertungen der Arzneimittelwirksamkeit zu diskutieren. Diese humanisierten Mäuse unterstützen das Wachstum der meisten getesteten menschlichen Tumoren und ermöglichen so die Beurteilung von I-O-Therapien im Kontext sowohl der menschlichen Immunität als auch menschlicher Krebsarten. Einmal etabliert, ist unser Modell vergleichsweise zeit- und kostengünstig und liefert in der Regel sehr reproduzierbare Ergebnisse. Wir schlagen vor, dass das in diesem Artikel beschriebene Protokoll als allgemeine Richtlinie für die Erstellung von Mausmodellen dienen könnte, die mit humanem PBMC und Tumoren für die I-O-Forschung rekonstituiert wurden.
Introduction
Die Immunonkologie (I-O) ist ein schnell wachsendes Feld der Krebsbehandlung. Forscher haben vor kurzem begonnen, das therapeutische Potenzial der modulationsfähigen Funktionen des Immunsystems zu schätzen, um Tumore anzugreifen. Immun-Checkpoint-Blockaden haben ermutigende Aktivitäten bei einer Vielzahl von Krebsarten gezeigt, einschließlich Melanom, Nierenzellkarzinom, Kopf und Hals, Lunge, Blase und Prostatakrebs1,2. Im Gegensatz zu gezielten Therapien, die Krebszellen direkt abtöten, potenzieren I-O-Therapien das Immunsystem des Körpers, um Tumore anzugreifen3.
Bis heute wurden zahlreiche relevante I-O-Tiermodelle etabliert. Dazu gehören: 1) Maustumorzelllinien oder Tumorhomograft bei syngenischen Mäusen; 2) spontane Tumoren, die aus gentechnisch veränderter Maus (GEM) oder karzinogener Induktion stammen; 3) chimäre GEMs mit dem Knock-in von humanen Drogenzielen in einem funktionellen murinen Immunsystem; und 4) Mäuse mit rekonstituierter menschlicher Immunität, transplantiert mit menschlichen Krebszellen oder vom Patienten abgeleiteten Xenografts (PDXs). Jedes dieser Modelle hat offensichtliche Vorteile sowie Einschränkungen, die an anderer Stelle ausführlich beschrieben und überprüft wurden4.
Die Rekonstitution der menschlichen Immunität bei immundefizienten Mäusen wurde zunehmend als klinisch relevanter Ansatz für translationale I-O-Forschung geschätzt. Dies wird in der Regel entweder durch 1) Transplantation von adulten Immunzellen (z. B. periphere mononukleäre Blutzellen (PMBC))5,6oder 2) Transplantation hämatopoetischer Stammzellen (HSC) aus z. B. Nabelschnurblut oder fetalem Leber7,8. Diese humanisierten Mäuse könnten das Wachstum menschlicher Tumoren unterstützen und so die Beurteilung von I-O-Therapien im Kontext sowohl der menschlichen Immunität als auch menschlicher Krebsarten ermöglichen. Trotz der Vorteile wurden Anwendungen von humanisierten Mäusen in der I-O-Forschung in der Regel durch mehrere Bedenken behindert, wie lange Modellentwicklungszeit und erheblich hohe Kosten.
Hier beschreiben wir ein menschliches PBMC-basiertes Modell, das für translationale I-O-Studien weit verbreitet sein könnte. Dieses Modell ist vergleichsweise zeit- und kostengünstig mit hoher Reproduzierbarkeit in Wirksamkeitsstudien. Es wurde intern für die Evaluierung mehrerer I-O-Therapeutika verwendet, die sich derzeit in der präklinischen und klinischen Entwicklung befinden. BGB-A317 (Tislelizumab), ein humanisierter Anti-PD-1-Antikörper9 , wird als Beispiel verwendet, um Modellentwicklung, Charakterisierung und mögliche Anwendungen für Anti-Tumor-Wirksamkeitsanalysen zu diskutieren.
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Protocol
Alle Verfahren, die in Studien mit menschlichen Teilnehmern durchgeführt wurden, entsprachen den ethischen Standards von BeiGene und/oder dem nationalen Forschungsausschuß sowie der Erklärung von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen oder vergleichbaren ethischen Standards. Von allen einzelnen Teilnehmern, die an der Studie teilnahmen, wurde die informierte Zustimmung eingeholt. Alle Verfahren, die in Studien mit Tieren durchgeführt wurden, wurden vom Internal Review Board bei BeiGene genehmigt. Dieses Protokoll wurde speziell für die Bewertung von BGB-A317 (Tislelizumab) bei humanisierten NOD/SCID-Mäusen angepasst.
1. Etablierung eines menschlichen PBMC-basierten Modells
-
Myeloablation von NOD/SCID-Mäusen mit Cyclophosphamid: Bestimmung optimaler Dosen
- Kaufen Sie weibliche NOD/SCID-Mäuse (6-8 Wochen).
HINWEIS: Alle an dieser Studie beteiligten Mäuse waren weiblich. - Cyclophosphamid (CP) in verschiedenen Dosen (50, 100 und 150 mg/kg) in Derart zubereiten. Disulfiram (DS) in 0,8% Tween-80 in Saline bei 125 mg/kg vorbereiten.
HINWEIS: Es wurden verschiedene Konzentrationen von CP vorbereitet, um die Verabreichung gleicher Mengen an Arzneimittellösung an Mäuse zu ermöglichen, die unterschiedliche Dosen von CP erhalten. - Behandeln Sie die Tiere einmal täglich für 2 Tage mit CP (i.p.) und DS (p.o.). Geben Sie DS (p.o.) 2 h nach jeder Dosis CP.
HINWEIS: DS verringert die Urotoxizität von CP bei Mäusen, und CP in Kombination mit DS wurde vorgeschlagen, länger anhaltende Neutropenie als Tiere mit CP allein behandelt haben10 Das Dosisschema von CP muss möglicherweise vor den tatsächlichen Studien vorbestimmt werden und wurde festgestellt, dass es variieren würde. leicht zwischen verschiedenen immundefizienten Mausstämmen. - Sammeln Sie Blutproben aus der orbitalen venösen Sinus und übertragen Sie auf EDTA-K beschichtete Röhren auf Eis am Tag 0 (1 h vor der1. Dosis), Tag 2 (24 h nach der 2. Dosis) und Tag 4 (72 h nach der 2. Dosis).
- Untersuchen Sie den Myeloablationseffekt nach CP- und DS-Behandlung durch FACS. Verwenden Sie Ratte Anti-Maus CD11b (M1/70), Ratte Anti-Maus Ly6C (HK1.4, ) und Ratte Anti-Maus Ly6G (1A8) für Gating CD11b+ Ly6Ghoch als Neutrophile, CD11b+Ly6Choch als Monozyten11,12.
- Zeichnen Sie das Körpergewicht und die gesundheitlichen Bedingungen der Mäuse täglich für eine Woche auf. Die optimale Dosis von CP und DS wird als das Regime bestimmt, das zu einer maximalen Erschöpfung von Neutrophilen und Monozyten führt, ohne dass Mäuse schwer toxizitätig sind.
- Kaufen Sie weibliche NOD/SCID-Mäuse (6-8 Wochen).
-
Humane PBMC-Transplantation und Tumortransplantation: Modellaufbau
- Isolieren Sie menschliche PBMCs von gesunden Spendern durch Dichtegradientenzentrifugation gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Vorbehandlung der Mäuse mit CP und DS gemäß Schritt 1.1.2 und 1.1.3 zur Steigerung der Transplantationseffizienz.
- 20 bis 24 h nach der zweiten Dosis von CP und DS, injizieren menschliche Tumorzelllinie wie A431-Zellen (ATCC, 2,5 x 106) und 5 x 106 isolierte PBMCs (gemischt in insgesamt 200 L phosphatgepufferter Salin (PBS) mit 50% Matrigel) , oder Tumorfragmente (3 x 3 x 3 mm3, in einem Gesamtvolumen von 200 L PBS mit 50% Matrigel) und 200 l von 5 x 106 PBMCs (jeweils 100 l links und rechts des transplantierten Tumorfragments) (s.c.) subkutan in der rechten Flanke der Tiere.
- Messen Sie das primäre Tumorvolumen und zeichnen Sie zweimal pro Woche für 4-6 Wochen auf.
HINWEIS: Die Mäuse werden eingeschläfert, sobald ihre Körpergewichte über 20% verlieren oder ihr Tumorvolumen 2.000 mm3 erreicht oder der Tumor ulzeriert wird. - Euthanisieren Sie die Mäuse in Gaskammern mit Kohlendioxid. Sammeln Sie das gesamte Tumorgewebe in geopferten Mäusen mit einer ophthalmologischen Schere und verarbeiten Sie sie für die Histologie und Immunhistochemie (IHC) Analyse. Untersuchen Sie die menschlichen CD8-, PD-1- und PD-L1-Ausdrücke in diesen Geweben. Siehe Protokollschritt 4.
2. PBMC-Spender-Bildschirm
- Screen eine Gruppe von PBMC-Spender aufgrund der erwarteten Variationen resultiert aus PBMCs von Einzelpersonen gesammelt. Verwenden Sie A431-Zellen, die mit PBMCs verschiedener Spender nach den in Schritt 1.2 angegebenen Verfahren koinjiziert werden.
HINWEIS: Über 50 gesunde PBMC-Spender wurden in der Studie untersucht, um genügend geeignete Spender zu erhalten. Forscher, die dieses Protokoll übernehmen möchten, könnten auf der Grundlage des Entwurfs der geplanten Studien selbst entscheiden, wie viele gesunde PBMC-Spender gescreent werden sollen. - Überwachen Sie das Tumorvolumen zweimal pro Woche, indem Sie mit einem Bremssattel messen.
HINWEIS: Tumorwachstumsrate kann mit PBMC von verschiedenen Spendern variieren. - Sammeln Sie das Tumorgewebe mit einem durchschnittlichen Volumen von 200-500 mm3 und verarbeiten Sie es für die Histologie und Immunhistochemie (IHC) Analyse. Untersuchen Sie menschliche CD8-, PD-1- und PD-L1-Ausdrücke. Ausführliches Protokoll finden Sie in Schritt 4.
- Wählen Sie PBMC-Spender aus, die zu einem moderaten Tumorwachstum (Tumorvolumen > 200 mm3 14 Tage nach der Impfung) und relativ hohen PD-1-, PD-L1- und CD8-Ausdrücken (mittlere IHC-Scores > 2) führen. Siehe Schritt 4 für detaillierte IHC-Scoring-Protokoll.
3. Menschliche Krebs-Zell-Linie und PDX-Bildschirm
- Screen-Zelllinien und PDXs nach den in Schritt 1.2 genannten Verfahren zur Bewertung der Tumorwachstumsrate, der menschlichen PD-L1-Expression der Tumoren und der Infiltrationen von Immunzellen.
HINWEIS: Über 30 menschliche Krebszelllinien und über 20 PDX verschiedener Krebsarten wurden von den Autoren untersucht. Die Daten ausgewählter Tumormodelle wurden im Ergebnisbereich angezeigt.
4. Immunhistochemie (IHC)
- Ernte, wie durch Schritt 1.2.5 angegeben und Tumorgewebe durch Eintauchen in Formalin fixieren. Dehydrieren und einbetten Sie festes Gewebe in Paraffin. Die festen Gewebe auf 3 m abteilen und auf polylysinbeschichtete Dias legen.
- Deparaffinisieren in Xylolen dreimal 7 min jeder. Hydratisieren Sie die Abschnitte durch abgestufte Alkohole: 100% Ethanol zweimal für je 3 min, gefolgt von 90%, 80% und 70% Ethanol wiederum für 3 min. Spülen Sie durch deionisierte H2O dreimal und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Dias.
- Führen Sie den Antigenabruf durch, indem Sie die Dias in einen Behälter legen und mit 10 mM Natriumcitratpuffer (pH 6.0) oder Tris-EDTA (pH 9.0) abdecken. Den Diabehälter mit der Mikrowelle für 3 min erhitzen. In einem Wasserbad bei 95 °C 30 min kochen und dann auf Raumtemperatur abkühlen. Spülen Sie durch deionisierte H2O dreimal und aspirieren überschüssige Flüssigkeit aus den Dias.
- Blockieren Sie die Abschnitte durch 3% Rinderserumalbumin in PBS für 1 h und 0,3% H2O2 Lösung in PBS für 10 min. Stain durch Antikörper gegen humane CD8 (EP334), PD-1 (NAT105,) und PD-L1 (E1L3N) bei 4 °C über Nacht, und HRP konjugierte 2nd Antikörper bei RT 1 h. Lassen Sie das Substrat DAB (3,3'-Diaminobenzidin) auf die Dias und steuern Sie die Reaktionszeit (Sekunden bis Minuten), indem Sie die braune Farbe vom Mikroskop aus überwachen.
- Bedecken Sie die Dias mit neutralem Balsam nach dem Eintauchen der Dias in 0,5% Salzsäurealkohol und 0,5% Ammoniakwasser wiederum für je 5 s, dann in 80%, 90% und 100% Ethanol in der Reihenfolge für jeweils 3 min und schließlich in Xylole mit drei Änderungen für je 5 min. Erkennen Sie die Antikörper, indem Sie die braune Farbe von DAB mit Hilfe eines Mikroskops beobachten.
HINWEIS: Die menschliche CD8- und PD-1-Expression auf tumorinfiltrierenden Leukozyten (TIL) wurde bewertet, indem ein Expressionswert auf einer 5-Punkte-Skala (IHC-Score, Bereich 0-4) bei hoher objektiver Vergrößerung (20x, 40x) zugewiesen wurde. 0, abwesend; 1, schwache Intensität / weniger als 20% Zellen; 2, schwache bis mäßige Intensität / 20%-50% Zellen; 3, moderate bis starke Intensität / 50%-80% Zellen; 4, starke Intensität / mehr als 80% Zellen. Die menschliche PD-L1-Färbung in Tumorzellen wurde aufgrund ihres relativ diffusen Signals mit einem angepassten Bewertungssystem auf einer 5-Punkte-Skala (IHC-Score, Bereich 0-4) bewertet. 0, abwesend; 1, schwache Intensität / weniger als 10% Zellen; 2, schwache bis moderate Intensität/10%-30% Zellen; 3, moderate/ 30%-50% Zellen; 4, starke Intensität / mehr als 50% Zellen.
5. In Vivo Wirksamkeits- und Pharmakodynamikstudien an humanisierten PBMC-NOD/SCID Xenograft-Modellen
- Vorbehandlung von NOD/SCID-Mäusen gemäß Schritt 1.1.3. Kurz gesagt, behandeln Sie die Mäuse mit 100 mg/kg CP (i.p.) und 125 mg/kg DS (p.o.) einmal täglich für 2 Tage.
- 20 bis 24 h nach der zweiten Dosis subkutan (s.c.) mit der angegebenen Anzahl menschlicher Krebszellen und 2,5-5 x 106 PBMCs (insgesamt 200 L Zellmischung in 50% Matrigel) in der rechten vorderen Flanke von Tieren injizieren.
HINWEIS: Die Anzahl der PBMC, die für jede einzelne Maus in einer einzigen Studie verwendet wird, sollte gleich sein. Aufgrund von Schwankungen in der Verfügbarkeit von vollständig isoliertem PBMC zum Zeitpunkt jeder Studie haben sich die Autoren jedoch dafür entschieden, 2,5 x 106, 4 x 106oder 5 x 106 PBMC in verschiedenen Studien zu verwenden. Obwohl dieser zweifache Unterschied in der verabreichten Menge an PBMCs den Grad der Humanisierung beeinflussen könnte, beobachten die Autoren keine signifikanten Unterschiede bei der Bewertung der Anti-Tumor-Effizienz der getesteten Immuntherapien. - Für PDXs-Einpfropftierung subkutan Tumorfragmente (3 x 3 x 3 mm3) in die rechte vordere Flanke von Tieren injizieren. Subkutan 200 l von 5 x 106 PBMCs (100 l pro Seite) nach links und rechts des transplantierten Tumorfragments injizieren.
HINWEIS: PDX-Tumorgewebe wurden in einer Matrigel-Lösung verabreicht, wie für die Zelllinienmodelle beschrieben. - Am Tag der Zellimpfung die Tiere nach dem Zufallsprinzip gruppieren und als geplantes Studienprotokoll behandeln. Bewerten Sie die Anti-Tumor-Aktivität von Kandidatenmedikamenten, BGB-A317 (QW, i.p.) in diesem Fall bei den angegebenen Dosen in verschiedenen Tumormodellen.
HINWEIS: Die drei menschlichen Krebszelllinien (d.h. A431 (Epidemoidkarzinom), SKOV3 (Eierstockkrebs) und SK-MES-1 (Lungenkrebs)) sowie zwei PDX-Modelle (d.h. BCLU-054 (Lungenkrebs) und BCCO-028 (Darmkrebs)) gelten als gute Tumormodelle für die I-O-Therapie Auswertung in diesem humanisierten Mausmodell. - Messen Sie das primäre Tumorvolumen zweimal pro Woche mit einem Bremssattel.
HINWEIS: Gand Körpergewichte Verlust wurden etwa 4-6 Wochen nach PBMC-Engraftment in unseren Studien beobachtet, so dass ein 1-2 Monate Zeit für therapeutische Wirksamkeit Bewertungen. - Für die pharmakodynamische Analyse von tumorinfiltrierten Immunzellen schneiden Sie das Tumorgewebe in kleine Stücke und verdauen Sie sie mit Kollagenase Typ I (1 mg/ml) und DNase I (100 g/ml) in RPMI1640 plus 5% fetalem Rinderserum (FBS) für 30 min bei 37 °C. Übergeben Sie das verdaute Gewebe durch 40 m Zellsiebe, um einzellige Suspensionen zu erhalten.
- Waschen Sie die Zellen und passen Sie die Zellzahl auf eine Konzentration von 1 x 107 Zellen/ml in eiskaltem FACS-Puffer (PBS, 1% FBS) in 96-gut runden Bodenplatten an. Waschen Sie die Zellen durch Zentrifugieren und blockieren Sie sie, indem Sie 30 min humanes IgG mit 20 g/ml humanem IgG hinzufügen, gefolgt von einer Färbung mit antihumanen CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) und PD-1 (MIH4) Antikörpern bei 4 °C für 30 min. Dann die gefärbten Proben zytometrie nieren und mit guavaSoft 3.1.1 analysieren.
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Representative Results
Nach den hier vorgestellten Verfahren wurde erfolgreich ein PBMC-basiertes humanisiertes Xenograft-Modell etabliert. Kurz gesagt, die CP-Myeloablationseffekte bei NOD/SCID-Mäusen wurden durch die Durchflusszytometrieanalyse von Neutrophilen- und Monozytenpopulationen nach der CP- und DS-Behandlung bestimmt (Abbildung 1). 100 mg/kg CP plus 125 mg/kg DS wurde als optimale Dosis bestimmt und in späteren Studien verwendet, da das Regime zu einer maximalen Erschöpfung von Neutrophilen und Monozyten führt, ohne mäusen eine schwere Toxizität zu verursachen. Als nächstes wurde eine humane PBMC- und Tumortransplantation durchgeführt. Das Vorhandensein von menschlichen Immunzellinfiltraten in der Tumormikroumgebung wurde von IHC überprüft (Abbildung 2).
Ein Panel von PBMC-Spendern wurde in vivo untersucht, um eine relativ hohe Immunzellinfiltration in der Tumormikroumgebung und eine akzeptable Tumorwachstumsrate zu gewährleisten (Abschnitt 2, Abbildung 3A). In der Zwischenzeit wurden über 30 menschliche Krebszelllinien sowie über 20 PDX verschiedener Krebsarten untersucht, um die Tumorwachstumsrate, die Tumor-PD-L1-Expression und die Infiltrationen von Immunzellen zu bewerten (Abschnitt 3). Repräsentative Ergebnisse wurden in Abbildung 3Bdargestellt.
Diese PBMC-transplantierten humanisierten Mäuse wurden dann verwendet, um die Anti-Tumor-Aktivität von BGB-A317 zu untersuchen. Humane PBMCs von ausgewählten gesunden Spendern wurden mit menschlichen Tumorzellen (A431, SKOV3 und SK-MES-1) oder primären Tumorgewebefragmenten von Krebspatienten (BCCO-028 und BCLU-054) subkutan injiziert. Die Mäuse wurden, wie in Abbildung 4angegeben, mit BGB-A317 oder PBS intraperitoneal einmal pro Woche ab dem Tag der Tumorimplantation behandelt. In allen oben genannten Modellen zeigte BGB-A317 signifikante Anti-Tumor-Aktivitäten (Abbildung 4).
Abbildung 1 : Myeloablation von NOD/SCID-Mäusen mit Cyclophosphamid (CP) und Disulfiram (DS). (A) Gating-Strategie zur Identifizierung myeloischer Zellteilmengen einschließlich Neutrophilen und Monozyten. (B) Repräsentative Ergebnisse der myeloischen Zell (CD11b+), neutrophilen (CD11b+Ly6G+) und Monozyten (CD11b+Ly6C+) Zahlen auf verschiedenen Dosierungen der CP-Behandlung. Die Boxen stellen das 75., 50. und 25. Perzentil der Werte dar. Die oberen und unteren Linien stellen maximale und minimale Datenpunkte innerhalb des 1,5-fachen IQ-Bereichs (Inter-Quarter) dar. n = 3 für die Fahrzeuggruppe und n = 6 für CP- und/oder DS-behandelte Gruppen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Humane PBMC-Transplantation und Tumortransplantation. (A) Schematisches Diagramm, das den allgemeinen Workflow des PBMC-basierten humanisierten Xenograft-Modells zeigt. (B) Tumorwachstum von A431-Zellen bei subkutaner Co-Injektion mit Spender PBMC mit den angegebenen Bedingungen (Daten stellen mittleres Tumorvolumen dar, SEM, n = 6). (C) IHC-Analyse von Tumoren, die bei Mäusen entwickelt wurden, die mit oder ohne CP+DS behandelt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : PBMC-Spender und menschlicher Krebszelllinien-Bildschirm. (A) Repräsentative Zusammenfassungsdaten aus dem PBMC-Spenderbildschirm. PBMC wurden mit A431-Zellen gemischt und subkutan bei humanisierten NOD/SCID-Mäusen geimpft (siehe Schritt 2). Jeder Punkt stellt den mittleren Datenwert von 3 Mäusen dar, die mit PBMCs von 1 Spender eingerückt sind. (B) Repräsentative Ergebnisse des menschlichen Krebszelllinienbilds. PBMC von ausgewählten Spendern wurde mit A431, SK-MES-1 oder SKOV3 Zellen injiziert. Die Daten stellen das mittlere Tumorvolumen dar, das von 3 Mäusen, 14 Tage nach der Inokulation der angegebenen Zelllinien, gesammelt wurde. Der mittlere IHC-Score - SEM stellt die durchschnittliche Expression von Human CD8, PD-1 und PD-L1 aller 3 Mäuse dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Anti-Tumor-Aktivitäten und Pharmakodynamik-Analyse von BGB-A317 in PBMC-basierte humanisierte Xenograft Modell. Die Anti-Tumor-Aktivität von BGB-A317 in indizierten Dosen (i.p., QW) wurde anhand menschlicher Krebszelllinien (A) A431 (mit 5 x 106 PBMC), (C) SKOV3 (mit 5 x 106 PBMC), (D) SK-MES-1 (mit 5 x 106 PBMC) und von Patienten abgeleitete Xenografts (PDXs) (E) BCLU-054 (mit 5 x 106 PBMC) und (F) BCCO-028 (mit 5 x 106 PBMC). PBMC von ausgewählten gesunden Spendern und entsprechenden Tumorzellen wurden subkutan in humanisierte NOD/SCID-Mäuse (n = 8 bis 10) mitinjiziert. (B) Quantifizierung von tumorinfiltrierenden hCD8+ und hCD8+hPD-1+ Zellen in BGB-A317 behandelten A431 Tumoren. n = 8-10 Tiere pro Gruppe in A und C bis F, n = 4-6 Tiere pro Gruppe in B; Daten steht für den Mittelwert - SEM. Die Signifikanz wurde anhand eines zweischwanzigen, ungepaarten Schüler-T-Tests unter der Annahme einer ungleichen Varianz bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Unser Wissen über Krebsentwicklung und -progression hat sich in den letzten Jahren deutlich weiterentwickelt, wobei der Schwerpunkt auf einem umfassenden Verständnis sowohl der Tumorzellen als auch der damit verbundenen Stroma liegt. Die Nutzung der Wirtsimmunmechanismen könnte eine größere Wirkung gegen Krebszellen hervorrufen, was eine vielversprechende Behandlungsstrategie darstellt. Murine Modelle mit intakten Maus-Immunsystem, wie syngene und GEM-Modelle, wurden weit verbreitet verwendet, um Checkpoint-vermittelte Immunität zu studieren. Wirksamkeitsbewertungen mit diesen Modellen hängen weitgehend von Ersatz-Anti-Maus-Zielantikörpern13,14ab. Jedoch, inhärente Unterschiede zwischen menschlichen und murinen Immunsystem und das Fehlen einiger menschlicher Ziele in murinen Modellen begrenzen präklinische Studien von I-O Anti-Tumor-Effekte15,16. Daher sind robuste Mausmodelle, die sowohl menschliche Immunzellen als auch menschliche Tumoren umfassen, dringend erwünscht, was die Übersetzung und Entwicklung neuartiger I-O-Therapeutika deutlich verbessern wird.
Hier beschreiben wir ein menschliches PBMC-basiertes Xenograft-Mausmodell, das möglicherweise für translationale I-O-Studien weit verbreitet sein könnte. PBMC-Spender sowie Krebszelllinien-/PDX-Screens sind entscheidend, um die Robustheit und Reproduzierbarkeit von In-vivo-Wirksamkeitsstudien zu gewährleisten. PBMC-Spender wurden in vivo untersucht, um eine erfolgreiche Menschliche Tumor- und Immunzelltransplantation zu gewährleisten. In der Zwischenzeit wurden über 50 Zelllinien und PDXs verschiedener menschlicher Krebsursachen untersucht, um die Tumorwachstumsrate, die menschliche PD-L1-Expression und die Infiltration ender Immunzellen zu bewerten. Unsere Analysen deuten darauf hin, dass etwa 20 % der untersuchten Krebszelllinien und PDXs eine akzeptable Tumorwachstumsrate aufweisen und gleichzeitig relativ hohe TILs und PD-L1-Färbungen aufweisen, die als gute Modelle für I-O-Wirksamkeitsbewertungen gelten.
HLA-Matching wird routinemäßig in der Klinik verwendet, um Patienten und Spender für Organ- oder Marktransplantationen17abzugleichen. Die Autoren haben jedoch nur eine begrenzte Charakterisierung der HLA-Typisierung durchgeführt, und dies bleibt ein interessantes Thema, das in zukünftigen Studien untersucht werden muss. Die Autoren möchten darauf hinweisen, dass ein PBMC-Spender für eine Krebszelllinie/ PDX geeignet sein könnte, aber nicht ideal für andere. Daher müssen PBMC-Spender möglicherweise für jedes Krebsmodell untersucht werden, um optimale Ergebnisse zu gewährleisten.
Die Verpflanzung menschlicher PBMC in NOD/SCID- oder NSG-Mäuse führt ausnahmslos zu einer xenogenen Transplantat-vs-Host-Krankheit (xGvHD), einer post-transplantierten Störung, die aus einem immunvermittelten Angriff des Empfängergewebes durch Spender-T-Zellen18,19resultiert. Klinische Beobachtungen, die häufig mit xGVHD in Verbindung gebracht werden, wurden in unserem humanisierten Modell beobachtet, wie Erythem, geknickte Körperhaltung, Gewichtsverlust und Mortalität (Daten nicht gezeigt). Diese Phänotypen wurden in der Regel gegen Ende unserer Studien beobachtet, in der Regel bei 1-2 Monaten nach der Transplantation, was auf die Ausbreitung und Infiltration menschlicher T-Zellen in xGVHD-Zielorganen hindeutet. Dies ermöglicht ein 1-2 Monate Zeit fenster für therapeutische I-O-Therapie-Bewertungen. Mehrere Ansätze wurden verwendet, um Die angeborene Immunität der Maus zu verringern und die menschliche Immunzelltransplantation zu verbessern20,21. Zum Beispiel unterstützen NSG-Mäuse, die in murinem MHC-Klasse I und Klasse II defekt sind, die Transplantation funktioneller menschlicher T-Zellen in Ermangelung akuter xGvHD nach Injektion von PBMC22.
NOD/SCID-Mäuse wurden in diesem Protokoll verwendet. Mäuse homozygot für die SCID-Mutation haben die Entwicklung der T- und B-Zelllymphozyten beeinträchtigt und der NOD-Hintergrund führt zusätzlich zu einer mangelhaften natürlichen Killer-Zellfunktion (NK)20. Andere, stärker immundefizienten Mäuse, wie die NSG (The Jackson Laboratory), NCG (Charles River) und NOG (CIEA) Stämme, wurden etabliert. Bei der Einordnung mit PBMCs haben diese Mäuse gezeigt, dass sie menschliche Immunzellen entwickeln und eine Umgebung bilden, die dem menschlichen Immunsystem ähnelt23,24. Alternativ könnten diese Mäuse mit CD34+ humanen hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPCs) transplantiert werden und einenachhaltigere T-Zelldifferenzierung und Reifung 25 aufweisen. Darüber hinaus wurden immundefizienten Mausmodelle der nächsten Generation mit weiteren genetischen Modifikationen entwickelt, um eine bessere Entwicklung der humanen myeloischen Abstammung und eine höhere Transplantationseffizienz zu unterstützen (siehe Varianten-Portfolio-Webseite von The Jackson Laboratory und Taconic Biosciences).
Weitere Einzelheiten über die Verwendung dieser neuen Stämme für die Rekonstitution der menschlichen Immunität sind noch nicht abgeschlossen. Dennoch könnte das in diesem Artikel beschriebene Protokoll als allgemeine Richtlinie für die Erstellung und Charakterisierung von immundefizienten Mausmodellen dienen, die mit humanem PBMC rekonstruiert wurden. In diesem Artikel werden drei menschliche Krebszelllinien und zwei von menschlichen Patienten abgeleitete Xenografts gezeigt, die eine Reihe von Krebsarten abdecken. Die meisten humanisierten PBMC-Modelle haben nach unserem Wissen IV oder IP als Injektionsweggewählt 26,27. Unsere Modelle bieten stattdessen teilweise rekonstituierte menschliche Immunität bei menschlichen Tumor tragenden Mäusen durch subkutane Beimischung von menschlichem PBMC mit Krebs-Xenografts. Dieser Ansatz bietet eine schnelle und kostengünstige, aber hochreproduzierbare Alternative zur vollständigen Stammzellrekonstitution (z. B. CD34+ hämatopoetische Stammzell-engrafted humanisierte Mäuse). Unser Modell hat sich als nützlich für die Bewertung von T-Zell-engagierenden Krebsimmuntherapien erwiesen, insbesondere bei der Arbeit an kurzen Zeitplänen oder bei der Auswahl von Wirkstoffen, bevor sie zu einem komplexeren Multi-Lineage-Immunitätsmodell übergehen.
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Disclosures
Alle Autoren sind an BeiGene beteiligt. Tong Zhang und Kang Li sind Erfinder eines in dieser Studie beschriebenen Patents für BGB-A317.
Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern unserer Labore für die hilfreichen Diskussionen. Diese Arbeit wurde teilweise durch das Biomedical and Life Science Innovation and Cultivation Research Program der Beijing Municipal Science and Technology Commission im Rahmen des Grant Agreement No unterstützt. Z151100003915070 (Projekt "Präklinische Studie über ein neuartiges immunonkologisches Antitumormedikament BGB-A317" und wurde teilweise durch unternehmensinterne Mittel für die präklinische Forschung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14 G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
References
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