Summary
Vi beskriver en human perifert blod mononukleär cell (PBMC)-baserad humaniserad xenograft musmodell för translationell Immuno-onkologi forskning. Detta protokoll kan fungera som en allmän riktlinje för att fastställa och karakterisera liknande modeller för I-O-behandlingsbedömning.
Abstract
Upptäckten och utvecklingen av Immuno-onkologi (I-O) terapi under de senaste åren är en milstolpe i behandlingen av cancer. Behandlings utmaningarna kvarstår dock. Robusta och sjukdomsrelevanta djurmodeller är livsviktiga resurser för fortsatt preklinisk forskning och utveckling för att ta itu med en rad ytterligare immun kontroller. Här beskriver vi ett humant perifert blod mononukleära celler (PBMC)-baserade humaniserad xenograft modell. BGB-A317 (Tislelizumab), ett prövande humaniserat anti-PD-1 antikropp i sena stadiet klinisk utveckling, används som ett exempel för att diskutera plattform set-up, modell karakterisering och läkemedels effekt utvärderingar. Dessa humaniserade möss stödja tillväxten av de flesta mänskliga tumörer testas, vilket möjliggör bedömning av i-O terapier i samband med både mänsklig immunitet och mänskliga cancerformer. När etablerad, vår modell är jämförelsevis tid-och kostnadseffektiva, och vanligtvis ger mycket reproducerbara resultat. Vi föreslår att det protokoll som beskrivs i denna artikel kan fungera som en allmän riktlinje för upprättande av musmodeller som rekonstitueras med mänskliga PBMC och tumörer för I-O-forskning.
Introduction
Immuno-onkologi (I-O) är ett snabbt växande område för cancerbehandling. Forskare har nyligen börjat uppskatta den terapeutiska potentialen av modulerande funktioner i immunförsvaret att attackera tumörer. Immun kontrollpunkt blockader har visat uppmuntrande aktiviteter i en mängd olika cancertyper, inklusive melanom, njurcellscancer, huvud och nacke, lungor, urinblåsa och prostatacancer1,2. I motsats till riktade terapier som direkt dödar cancerceller, I-O terapier potentiera kroppens immunförsvar att attackera tumörer3.
Hittills har många relevanta I-O djurmodeller fastställts. Dessa inkluderar: 1) mus tumör cellinjer eller tumör homograft i uterustransplantat möss; 2) spontana tumörer som härrör från genetiskt modifierade mus (GEM) eller carcinogen-induktion; 3) chimär pärlor med Knock-in av humanläkemedel mål (s) i en funktionell murin immunförsvar; och 4) möss med rekonstituerad mänsklig immunitet som transplanterats med humana cancerceller eller xenograft (pdxs). Var och en av dessa modeller har uppenbara fördelar samt begränsningar, som har beskrivits och granskats utförligt någon annanstans4.
Rekonstituering av mänsklig immunitet hos möss med nedsatt immunförsvar har blivit mycket uppskattad som en kliniskt relevant metod för translationell I-O-forskning. Detta uppnås vanligen genom antingen 1) engrafering av vuxna immunceller (t. ex. perifera mononukleära blodceller (pmbc))5,6, eller 2) engrafering av hematopoietiska stamceller (HSC) från, till exempel, navelsträngsblod eller foster lever7,8. Dessa humaniserade möss kan stödja tillväxten av mänskliga tumörer, vilket möjliggör bedömning av i-O terapier i samband med både mänsklig immunitet och mänskliga cancerformer. Trots fördelarna, tillämpningar av humaniserade möss i i-O forskning var oftast hindras av flera farhågor, såsom lång modell utvecklingstid och betydligt höga kostnader.
Här beskriver vi en human PBMC-baserad modell som kan tillämpas I stor utsträckning för translationella I-O-studier. Denna modell är jämförelsevis tid-och kostnadseffektiv med hög reproducerbarhet i effektstudier. Det har använts i egen verksamhet för utvärderingar av flera I-O-Therapeutics för närvarande under preklinisk och klinisk utveckling. BGB-A317 (Tislelizumab), ett prövande humaniserat anti-PD-1 antikropp9 , används som exempel för att diskutera modellutveckling, karakterisering, och möjliga tillämpningar för anti-tumör effektanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som genomförs i studier som involverar mänskliga deltagare var förenliga med de etiska normerna för BeiGene och/eller den nationella forskningskommittén och med 1964 Helsingforsdeklarationen och dess senare ändringar eller jämförbara etiska normer. Informerat samtycke erhölls från alla enskilda deltagare som ingick i studien. Alla förfaranden som utfördes i djurstudier godkändes av den interna Granskningsnämnden vid BeiGene. Detta protokoll har anpassats specifikt för utvärderingen av BGB-A317 (Tislelizumab) i humaniserad NOD/SCID-möss.
1. upprättande av Human PBMC-baserad modell
-
Myeloablation av nicka/SCID-möss som använder Cyclophosphamide: bestämning av optimala doser
- Köpa kvinnliga NOD/SCID möss (6-8 veckor).
Anmärkning: Alla möss involverade i denna studie var kvinnor. - Bered cyklofosfamid (CP) vid olika doser (50, 100 och 150 mg/kg) i saltlösning. Bered disulfiram (DS) i 0,8% Tween-80 i saltlösning vid 125 mg/kg.
Obs: olika koncentrationer av CP var beredda att möjliggöra administrering av lika volymer av läkemedelslösning till möss få olika doser av CP. - Behandla djuren med CP (i.p.) och DS (p.o.) en gång om dagen för 2 dagar. Ge DS (p.o.) 2 h efter varje dos av CP.
Anmärkning: DS minskar den urotoxicitet av CP hos möss, och CP kombinerat med DS har föreslagits för att ha längre livslängd neutropeni än djur som behandlats med enbart CP10 dosregimen av CP kan behöva förutbestämmas före de faktiska studierna och konstaterades variera något mellan olika immunobristfälliga mus stammar. - Samla blodprov från orbital venös sinus och överföring till EDTA-K belagda rören på isen på dag 0 (1 h före 1St dos), dag 2 (24 h efter 2nd dos) och dag 4 (72 h efter 2nd dos).
- Undersöka myeloablation effekt efter CP och DS behandling av FACS. Använda råtta mot-mus CD11b (M1/70), råtta mot-mus Ly6C (hk 1.4,) och råtta mot-mus Ly6G (1A8) för gating CD11b+ Ly6Ghög så neutrofiler, CD11b+Ly6Chög så monocyter11,12.
- Registrera kroppsvikt och hälsotillstånd av möss dagligen under en vecka. Den optimala dosen av CP och DS bestäms som den regim som resulterar i maximal utarmning av neutrofiler och monocyter utan att orsaka svår toxicitet för möss.
- Köpa kvinnliga NOD/SCID möss (6-8 veckor).
-
Mänsklig PBMC transplantation och tumör engrafation: modell set-up
- Isolera humana PBMCs från friska donatorer genom densitetsgradientcentrifugering enligt tillverkarens anvisningar.
- Förbehandla möss med CP och DS som anges i steg 1.1.2 och 1.1.3 för att öka transplantations effektiviteten.
- 20 till 24 timmar efter den andra dosen av CP och DS, injicera Human tumör cellinjer såsom A431 celler (ATCC, 2,5 x 106) och 5 x 106 isolerade pbmcs (blandat i totalt 200 μl fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller 50% matrigel) , eller tumörfragment (3 x 3 x 3 mm3, i en total volym på 200 μl PBS innehållande 50% matrigel) och 200 μl 5 x 106 Pbmcs (100 μl vardera till vänster och höger sida av inympade tumörfragment) (s.c.) subkutant i den högra flanken av djuren.
- Mät primär tumör volym och spela in två gånger i veckan för 4-6 veckor.
Anmärkning: Mössen kommer att euthanized när deras kroppsvikter förlora över 20% eller deras tumör volym når 2 000 mm3 eller tumören är ulcerated. - Euthanize möss i gaskamrarna med koldioxid. Samla in hela tumör vävnader i offrade möss med oftalmisk sax och bearbeta dem för histologi och immunohistokemi (IHC) analys. Undersök de humana CD8-, PD-1-och PD-L1-uttrycken i dessa vävnader. Se protokoll steg 4.
2. PBMC donator skärm
- Screen en panel av PBMC givare på grund av de förväntade variationerna resulterade från PBMCs samlats in från individer. Använd A431 celler som tillsammans injicerar med PBMCs från olika givare enligt de procedurer som anges i steg 1,2.
Anmärkning: Över 50 friska PBMC-donatorer screenades i studien för att få tillräckligt många lämpliga donatorer. Forskare som vill anta detta protokoll kan själv besluta hur många friska PBMC-donatorer som ska screenas, baserat på utformningen av de planerade studierna. - Övervaka tumör volym två gånger i veckan genom att mäta med en bromsfaktor.
Anmärkning: Tumörtillväxt hastighet kan variera med PBMC från olika givare. - Samla tumör vävnader med en genomsnittlig volym av 200-500 mm3 och bearbeta dem för histologi och immunohistokemi (IHC) analys. Undersöka humana CD8-, PD-1-och PD-L1-uttryck. Se steg 4 för detaljerat protokoll.
- Välj PBMC givare som resulterar i måttlig tumörtillväxt (tumör volym > 200 mm3 14 dagar efter inympning) och relativt höga PD-1, PD-L1 och CD8 uttryck (medelvärde ihc betyg > 2). Se steg 4 för detaljerad IHC scoring protokoll.
3. Human cancer cell linje och PDX skärm
- Screen cellinjer och PDXs enligt de förfaranden som anges i steg 1,2, att utvärdera tumörtillväxt hastighet, humant PD-L1 uttryck för tumörer och immunceller infiltrationer.
Anmärkning: Över 30 humana cancer cellinjer och över 20 PDXs av olika cancertyper screenades av författarna. Data från utvalda tumörmodeller visades i resultat sektionen.
4. immunohistokemi (IHC)
- Skörd som indikeras av steg 1.2.5 och fixa tumör vävnader genom att doppa i formalin. Torka och bädda in fasta vävnader i paraffin. Avsnitt de fasta vävnaderna på 3 μm och placera dem på polylysine-belagda diabilder.
- Deparaffinize i xylener tre gånger 7 min vardera. Återfukta sektionerna genom graderade alkoholer: 100% etanol två gånger för 3 min vardera, följt av 90%, 80% och 70% etanol i sin tur för 3 min vardera. Skölj av avjoniserat H2O tre gånger och ta bort överflödig vätska från diabilderna.
- Utför antigen hämtning genom att placera bilderna i en behållare och täck med 10 mM natriumcitratbuffert (pH 6,0), eller Tris-EDTA (pH 9,0). Värm upp glasbehållaren med mikrovågor i 3 min. koka i ett vattenbad vid 95 ° c i 30 min och sedan svalna till rumstemperatur. Skölj av avjoniserat H2O tre gånger och aspirera överflödig vätska från bilderna.
- Blockera avsnitten med 3% bovint serum albumin i PBS för 1 h och 0,3% H2O2 lösning i PBS för 10 min. fläcken av antikroppar mot humant CD8 (EP334), PD-1 (NAT105,) och PD-L1 (E1L3N) vid 4 ° c över natten, och HRP konjugerade 2nd antikroppar vid RT för 1 h. släpp substratet DAB (3, 3 '-diaminobenzidine) på glidbanorna och kontrollera reaktionstiden (sekunder till minuter) genom att övervaka den bruna färgen från Mikroskop.
- Täck glasen med neutral balsam efter att doppa bilderna i 0,5% saltsyra alkohol och 0,5% ammoniak vatten i sin tur för 5 s vardera, sedan i 80%, 90% och 100% etanol i sekvens för 3 min vardera, och slutligen i xylener med tre förändringar för 5 min vardera. Detektera antikropparna genom att observera den bruna färgen på DAB med Mikroskop.
Anmärkning: Humant CD8 och PD-1 uttryck på tumör-infiltrerande leucocyter (TIL) bedömdes genom att tilldela ett uttryck poäng på en 5-punkts skala (IHC-poäng, intervall 0-4) vid hög objektiv förstoring (20x, 40x). 0, frånvarande; 1, svag intensitet/mindre än 20% celler; 2, svag till måttlig intensitet/20%-50% celler; 3, måttlig till stark intensitet/50%-80% celler; 4, stark intensitet/mer än 80% celler. Human PD-L1 färgning inom tumörceller gjordes med hjälp av ett justerat poängsystem på en 5-punkts skala (IHC score, Range 0-4) på grund av dess relativt diffus signal. 0, frånvarande; 1, svag intensitet/mindre än 10% celler; 2, svag till måttlig intensitet/10%-30% celler; 3, måttlig/30%-50% celler; 4, stark intensitet/mer än 50% celler.
5. in vivo effekt och farmakodynamik studier i humaniserade PBMC-NOD/SCID xenograft modeller
- Pre-Treat NOD/SCID möss som anges i steg 1.1.3. I korthet, behandla möss med 100 mg/kg CP (i.p.) och 125 mg/kg DS (p.o.) en gång om dagen för 2 dagar.
- 20 till 24 timmar efter den andra dosen, injicera subkutant (s.c.) med angivet antal humana cancerceller och 2.5-5 x 106 pbmcs (totalt 200 μl cell blandning i 50% matrigel) i den högra främre flanken av djur.
Anmärkning: Antalet PBMC som används för varje enskild mus i en enda studie bör vara densamma. På grund av variationer i tillgången på total isolerad PBMC vid tiden för varje studie har författarna valt att använda 2,5 x 106, 4 x 106eller 5 x 106 PBMC vid olika studier. Även om denna 2-faldig skillnad i den administrerade mängden PBMCs kan påverka graden av humanisering, författarna inte observera betydande skillnader i utvärderingen av anti-tumör effektivitet av de testade immunterapier. - För PDXs-transplantation, injicera subkutant tumörfragment (3 x 3 x 3 mm3) i den högra främre flanken av djur. Injicera subkutant 200 μL av 5 x 106 pbmcs (100 μl vardera sida) till vänster och höger om inympade tumörfragment.
Anmärkning: PDX tumör vävnader administrerades i en Matrigel lösning, samma som beskrivits för cellinjer modeller. - På dagen för cellinympning, slumpmässigt gruppera djuren och behandla som planerat studieprotokoll. Bedöma anti-tumöraktivitet av läkemedelskandidater, BGB-A317 (QW, i.p.) i detta fall, vid de angivna doserna i olika tumörmodeller.
Anmärkning: De tre humana cancer cellinjer (dvs A431 (epidemoid carcinoma), SKOV3 (äggstockscancer) och SK-MES-1 (lungcancer)), samt två PDX-modeller (dvs., BCLU-054 (lungcancer) och BCCO-028 (tjocktarmscancer)), anses vara bra tumörmodeller för I-O-terapi utvärdering i denna humaniserad musmodell. - Mät primär tumör volym två gånger varje vecka, med hjälp av en bromper.
Anmärkning: Gand kroppsvikter förlust observerades runt 4-6 veckor efter PBMC engraftion i våra studier, vilket gör att en 1-2 månader fönster för terapeutisk effekt utvärderingar. - För farmakodynamiken analys av tumör infiltrerade immunceller, klippa tumören vävnader i små bitar och smälta dem med kollagenas typ I (1 mg/mL) och DNase I (100 μg/mL) i RPMI1640 plus 5% foster bovin serum (FBS) för 30 min vid 37 ° c. Passera smält vävnader genom 40 μm cell silar för att få enstaka cellsuspensioner.
- Tvätta cellerna och justera cell nummer till en koncentration av 1 x 107 celler/ml i Ice Cold FACS buffert (PBS, 1% FBS) i 96-väl runda Bottenplattor. Tvätta cellerna genom att centrifugeras och blockera dem genom att tillsätta 20 μg/mL humant IgG i 30 min, följt av färgning med anti-human CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) och PD-1 (MIH4)-antikroppar vid 4 ° c i 30 minuter. Sedan föremål de färgade proverna för att flöda flödescytometrianalys och analysera med guavaSoft 3.1.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter de förfaranden som presenteras här, en PBMC-baserade humaniserad xenograft modell har etablerats framgångsrikt. I korthet, CP myeloablation effekter i nod/scid Möss bestämdes genom flödescytometri analys av neutrofila och monocyt populationer efter CP och DS behandling (figur 1). 100 mg/kg CP Plus 125 mg/kg DS bestämdes som den optimala dosen och användes i senare studier eftersom regimen resulterar i maximal utarmning av neutrofiler och monocyter utan att orsaka svår toxicitet för möss. Nästa, mänskliga PBMC och tumör transplantation utfördes. Förekomst av mänskliga immunceller infiltrat i tumören mikromiljö kontrollerades av IHC (figur 2).
En panel av PBMC givare screenades in vivo för att säkerställa relativt höga immunceller infiltrationer i tumören mikromiljö och acceptabel tumörtillväxt (avsnitt 2, figur 3A). Under tiden screenades över 30 humana cancer cellinjer samt över 20 PDXs av olika cancertyper för att utvärdera tumörtillväxt, tumör PD-L1-uttryck och immuncellinfiltreringar (avsnitt 3). Representativa resultat visades i figur 3B.
Dessa PBMC-enympade humaniserade möss användes sedan för att undersöka BGB-A317 anti-tumöraktivitet. Humana PBMCs från utvalda friska donatorer var tillsammans injiceras med mänskliga tumörceller (A431, SKOV3 och SK-MES-1) eller primära tumörvävnads fragment härrör från cancerpatienter (BCCO-028 och BCLU-054) subkutant. Mössen behandlades, som anges i figur 4, med BGB-A317 eller PBS intraperitonealt en gång i veckan från dagen för tumör implantation. I alla ovannämnda modeller uppvisade BGB-A317 betydande antitumörverksamhet (figur 4).
Figur 1 : Myeloablation av nicka/SCID-möss som använder cyklofosfamid (CP) och disulfiram (DS). (A) gating strategi används för att identifiera myeloida cell undergrupper inklusive neutrofiler och monocyter. (B) representativa resultat av myeloida cell (CD11b+), neutrofila (CD11b+Ly6G+) och monocyt (CD11b+Ly6C+) nummer vid olika doser av CP-behandling. Rutorna representerar 75, 50 och 25: e percentilen för värdena. De övre och nedre linjerna representerar maximala och minimala datapunkter inom intervallet 1,5 x IQ (Inter Quarter). n = 3 för fordons gruppen och n = 6 för CP-och/eller DS-behandlade grupper. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Mänsklig PBMC-transplantation och tumörengrafation. (A) Schematiskt diagram som visar det allmänna arbetsflödet för PBMC-baserad humaniserad xenograft-modell. (B) tumörtillväxt av A431 celler vid subkutan injektion med donator PBMC med de angivna förhållandena (data representerar medelvärdet av tumör volymen ± SEM, n = 6). C) IHC-analys av tumörer som utvecklats hos möss som behandlats med eller utan CP + DS. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : PBMC givare och Human cancer cell line Screen. A) representativa sammanfattande data från PBMC-donatorskärmen. PBMC blandades med A431 celler och inokulerades subkutant i humaniserade nickar/SCID-möss (se steg 2). Varje prick representerar medelvärdet av data svärdet för 3 möss som inympats med PBMCs från 1 givare. B) representativa resultat från Human cancer cell line Screen. PBMC från utvalda givare injicerades tillsammans med A431, SK-MES-1 eller SKOV3 celler. Data representerar medelvärdet av tumör volymen ± SEM som samlats in från 3 möss, 14 dagars inokulering av de angivna cellinjer. Genomsnittligt IHC-resultat ± SEM representerar det genomsnittliga uttrycket för humant CD8, PD-1 och PD-L1 av alla 3 möss. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Anti-tumör verksamhet och farmakodynamik analys av BGB-A317 i PBMC-baserade humaniserad xenograft modell. Den anti-tumöraktivitet av BGB-A317 vid indikerade doser (i.p., QW) bedömdes med hjälp av humana cancer cellinjer (a) A431 (med 5 x 106 PBMC), (C) SKOV3 (med 5 x 106 PBMC), (D) sk-mes-1 (med 5 x 106 PBMC), och xenograft från patienter (pdxs) (E) bclu-054 (med 5 x 106 PBMC) och (F) bcco-028 (med 5 x 106 PBMC). PBMC från utvalda friska donatorer och motsvarande tumörceller var tillsammans injiceras subkutant i humaniserade NOD/SCID möss (n = 8 till 10). Bkvantifiering av tumörinfiltrerande hCD8 + och HCD8 + HPD-1 +-celler i BGB-A317 behandlade A431 tumörer. n = 8-10 djur per grupp i A, och C till F, n = 4-6 djur per grupp i B; data representerar medelvärdet ± SEM. Signifikansen utvärderades med hjälp av en tvåsidiga unparade Students t-test under antagande av olika varians. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår kunskap om cancerutveckling och progression har framskridit betydligt under de senaste åren, med fokus på en omfattande förståelse av både tumörcellerna och dess associerade stroma. Utnyttja värd immunförsvaret mekanismer kan framkalla en större inverkan mot cancerceller, som representerar en lovande behandlingsstrategi. Murina modeller med intakt mus immunsystem, såsom uterustransplantat och gem modeller, har använts i stor utsträckning för att studera Checkpoint-medierad immunitet. Effektivitets bedömningar med hjälp av dessa modeller beror till stor del på surrogat anti-mus mål antikroppar13,14. Emellertid, inneboende skillnader mellan mänskliga och murina immunsystem och avsaknaden av vissa mänskliga mål i murina modeller begränsa prekliniska studier av i-O anti-tumör effekter15,16. Därför, robusta musmodeller som omfattar både mänskliga immunceller och mänskliga tumörer är brådskande önskas, vilket kommer att avsevärt förbättra översättningen och utvecklingen av nya I-O-Therapeutics.
Här beskriver vi en mänsklig PBMC-baserad xenograft-musmodell som potentiellt skulle kunna användas I stor utsträckning för translationella I-O-studier. PBMC givare samt cancer cell line/PDX skärmar är avgörande för att säkerställa robusthet och reproducerbarhet av in vivo effektstudier. PBMC-donatorer screenades in vivo för att säkerställa framgångsrik mänsklig tumör och immun cells transplantation. Under tiden, över 50 cellinjer och PDXs av olika mänskliga cancer ursprung screenades för att utvärdera tumörtillväxt hastighet, humant PD-L1 uttryck, och immunceller infiltrationer. Våra analyser tyder på att cirka 20% av cancer cellinjer och PDXs undersökt visar acceptabel tumörtillväxt takt medan samtidigt har relativt höga TILs och PD-L1 färgning, som anses vara bra modeller för I-O effektivitets utvärderingar.
HLA-matchning används rutinmässigt i kliniken för att matcha patienter och givare för organ-eller Benmärgstransplantationer17. Författarna har dock endast utfört en begränsad karakterisering av HLA-typning, och detta är fortfarande ett intressant ämne som ska undersökas i framtida studier. Författarna vill notera att en PBMC-donator kan vara lämplig för en cancer cells linje/PDX men inte idealisk för andra. Därför kan PBMC-donatorer behöva screenas för varje cancer modell för att säkerställa optimala resultat.
Inympning av mänskliga PBMC into nod/scid eller NSG-möss leder alltid till en xenogena graft-vs-host sjukdom (xgvhd), en post-transplantation sjukdom som resulterar från immun-medierad attack av mottagar vävnad av givare T-celler18,19. Kliniska observationer som vanligen förknippas med xGVHD har observerats i vår humaniserade modell, såsom erytem, böjd kroppshållning, viktminskning och dödlighet (data visas inte). Dessa fenotyper observerades vanligtvis mot slutet av våra studier, vanligtvis vid 1-2 månader efter Inympning, indikerar spridning och infiltration av mänskliga T-celler i xGVHD målorgan. Detta tillåter en 1-2 månader fönster för terapeutiska I-O-terapi utvärderingar. Flera metoder har utnyttjats för att minska mus medfödda immunitet och förbättra människans immun cell engraftelse20,21. Till exempel, NSG-möss defekt i murina MHC klass I och klass II uttryck stödja inympning av funktionella mänskliga T-celler i avsaknad av akut xgvhd efter injektion av PBMC22.
Nicka/SCID möss användes i detta protokoll. Möss homozygot för SCID-mutationen har försämrad T-och B-cellernas lymfocytutveckling och NOD-bakgrunden resulterar dessutom i bristfällig Natural Killer (NK) cell funktion20. Andra mer hög immunbrist möss, såsom NSG (The Jackson Laboratory), NCG (Charles River) och NOG (CIEA) stammar, har fastställts. Vid inympade med pbmcs har dessa möss visats utveckla humana immunceller och bilda en miljö som liknar människans immunsystem23,24. Alternativt kan dessa möss inympas med CD34+ mänskliga hematopoietiska progenitorceller (HPCs) och Visa mer ihållande T celldifferentiering och mognad25. Dessutom, nästa generations immunbrist musmodeller med ytterligare genetiska modifieringar har inrättats för att stödja bättre humant myeloida härstamning utveckling och ökad inympning effektivitet (hänvisa till den varianter portfölj hemsida av Jackson Laboratory och Taconic Biosciences).
Mer information om hur man använder dessa nya stammar för beredning av Human immunitet väntar på ytterligare utredningar. Det protokoll som beskrivs i denna artikel kan dock fungera som en allmän riktlinje för att fastställa och karakterisera immunobristfälliga musmodeller som bereds med mänsklig PBMC. Tre humana cancer cellinjer och två humana patientbaserade xenografter, som täcker en rad cancertyper, visas i denna artikel, vilket tyder på de potentiella breda tillämpningarna av vårt protokoll i translationella I-O-studier. De flesta humaniserade PBMC-modeller, till vår kännedom, har valt IV eller IP som väg för injektion26,27. Våra modeller ger istället delvis rekonstituerad mänsklig immunitet i humana tumör bär ande möss genom subkutant admixing av Human PBMC med cancer xenografts. Denna metod ger ett snabbt och kostnadseffektivt, men ändå mycket reproducerbart alternativ till full stamcells beredning (t. ex. CD34+ hematopoietisk stamcells-enympade humaniserade möss). Vår modell har visat sig vara användbar för att utvärdera T cell-engagerande cancer immunoterapier, särskilt när man arbetar på korta tidslinjer eller att välja agenter innan du flyttar till en mer komplex multi-Lineage immunitet modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare har ägarintresse i BeiGene. Tong Zhang och Kang Li är uppfinnarear på ett patent som täcker BGB-A317 som beskrivs i denna studie.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar i våra laboratorier för hjälpsamma diskussioner. Detta arbete stöddes delvis av biomedicinska och Life science innovation och odling forsknings program av Peking kommunala vetenskaps-och teknik kommissionen under Grant Agreement No. Z151100003915070 (projekt "preklinisk studie om en roman immun onkologi anti-tumör läkemedel BGB-A317"), och det var också delvis stöds av interna företagsfinansiering för preklinisk forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14 G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
References
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. Journal of Clinical Oncology. 33 (17), 1974-1982 (2015).
- Li, Z., Kang, Y. Emerging therapeutic targets in metastatic progression: A focus on breast cancer. Pharmacology & Therapeutics. 161, 79-96 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Fisher, T. S., et al. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (10), 1721-1733 (2012).
- McCormack, E., et al. Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (4), 773-785 (2013).
- Rongvaux, A., et al. Human hemato-lymphoid system mice: current use and future potential for medicine. Annual Review of Immunology. 31, 635-674 (2013).
- Matsumura, T., et al. Functional CD5+ B cells develop predominantly in the spleen of NOD/SCID/gammac(null) (NOG) mice transplanted either with human umbilical cord blood, bone marrow, or mobilized peripheral blood CD34+ cells. Experimental Hematology. 31 (9), 789-797 (2003).
- Zhang, T., et al. The binding of an anti-PD-1 antibody to FcgammaRIota has a profound impact on its biological functions. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (7), 1079-1090 (2018).
- Gamelli, R. L., Ershler, W. B., Hacker, M. P., Foster, R. S. The effect of disulfiram on cyclophosphamide-mediated myeloid toxicity. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 16 (2), 153-155 (1986).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and Immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6808-6817 (2015).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Mahdi, B. M. A glow of HLA typing in organ transplantation. Clinical and Translational Medicine. 2 (1), 6 (2013).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews Immunolog. 12 (11), 786-798 (2012).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Luban, J., Greiner, D. L. Overcoming current limitations in humanized mouse research. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 125-130 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunolog. 7 (2), 118-130 (2007).
- Brehm, M. A., et al. NOD-scid IL2rgnull (NSG) mice deficient in murine MHC Class I and Class II expression support engraftment of functional human T cells in the absence of acute xenogeneic GVHD following injection of PBMC. The Journal of Immunology. 200, 1 Supplement 57 (2018).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Sasaki, E., et al. Development of a preclinical humanized mouse model to evaluate acute toxicity of an influenza vaccine. Oncotarget. 9 (40), 25751-25763 (2018).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
