Summary
Nós descrevemos uma pilha mononucleares do sangue periférico humano (PBMC)-modelo humanizado baseado do rato do xenograft para a pesquisa translacional do immuno-Oncology. Este protocolo poderia servir como diretriz geral para O estabelecimento e caracterização de modelos similares para a avaliação da terapia de I-O.
Abstract
A descoberta e desenvolvimento da terapia de imuno-Oncologia (I-O) nos últimos anos representa um marco no tratamento do câncer. No entanto, persistem desafios de tratamento. Modelos animais robustos e relevantes para a doença são recursos vitais para a continuação da investigação pré-clínica e do desenvolvimento, a fim de abordar uma série de pontos de verificação imunológicos adicionais. Aqui, nós descrevemos uma pilha mononucleares humana do sangue periférico (PBMC)-modelo humanizado baseado do xenograft. BGB-A317 (Tislelizumab), um anticorpo anti-PD-1 humanizado investigacional no desenvolvimento clínico em estágio tardio, é usado como exemplo para discutir a criação da plataforma, a caracterização do modelo e as avaliações da eficácia do fármaco. Estes ratos humanizados apoiam o crescimento da maioria dos tumores humanos testados, permitindo assim a avaliação de terapias de I-O no contexto da imunidade humana e dos cânceres humanos. Uma vez estabelecido, nosso modelo é comparativamente tempo-e custo-eficaz, e geralmente produzem resultados altamente reprodutíveis. Nós sugerimos que o protocolo esboçado neste artigo pudesse servir como uma diretriz geral para estabelecer os modelos do rato reconstituídos com O PBMC humano e os tumores para a pesquisa do I-O.
Introduction
A imuno-Oncologia (I-O) é um campo de tratamento de câncer em rápida expansão. Os pesquisadores começaram recentemente a apreciar o potencial terapêutico das funções moduladoras do sistema imunológico para atacar tumores. Bloqueios de ponto de verificação imunológico demonstraram atividades encorajadoras em uma variedade de tipos de câncer, incluindo melanoma, Carcinoma de células renais, cabeça e pescoço, pulmão, câncer de bexiga e próstata1,2. Ao contrário das terapias direcionadas que matam diretamente as células cancerosas, as terapias I-O potenciam o sistema imunológico do corpo para atacar os tumores3.
Até à data, foram estabelecidos numerosos modelos de animais de I-O relevantes. Estes incluem: 1) linhas de pilha do tumor do rato ou homoenxerto do tumor em ratos syngeneic; 2) tumores espontâneos derivados do rato geneticamente projetado (GEM) ou da indução carcinogênica; 3) gemas quiméricas com o knock-in de alvo de droga humana (s) em um sistema imunológico funcional murino; e 4) camundongos com imunidade humana reconstituída transplantados com células cancerosas humanas ou xenoenxertos derivados do paciente (PDXs). Cada um destes modelos têm vantagens óbvias, bem como limitações, que foram descritos e revistos extensivamente em outros lugares4.
A reconstituição da imunidade humana em camundongos imunodeficientes tem sido valorizada como uma abordagem clinicamente relevante para a pesquisa de I-O translacional. Isto é conseguido geralmente com o 1) Engraftment de pilhas imunes adultas (por exemplo, pilhas mononucleares do sangue periférico (pmbc))5,6, ou 2) Engraftment de pilhas de haste hematopoietic (HSC) de, por exemplo, sangue do cordão umbilical ou fetal fígado7,8. Estes ratos humanizados poderiam apoiar o crescimento de tumores humanos, permitindo assim a avaliação de terapias do I-O no contexto da imunidade humana e dos cancros humanos. Apesar das vantagens, as aplicações de camundongos humanizados na pesquisa I-O foram geralmente prejudicadas por diversas preocupações, como o tempo de desenvolvimento do modelo longo e o custo consideravelmente elevado.
Aqui, nós descrevemos um modelo PBMC-baseado humano que poderia extensamente ser aplicado para estudos translacional do I-O. Este modelo é comparativamente tempo-e custo-eficaz com reprodutibilidade elevada em estudos da eficácia. Tem sido utilizado em casa para as avaliações de várias terapêuticas I-O atualmente desenvolvimento pré-clínico e clínico. BGB-A317 (Tislelizumab), um anticorpo anti-PD-1 humanizado investigacional9 , é utilizado como exemplo para discutir o desenvolvimento do modelo, caracterização e possíveis aplicações para análises de eficácia antitumoral.
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Protocol
Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo participantes humanos estavam de acordo com os padrões éticos do BeiGene e/ou Comitê Nacional de pesquisa e com a declaração de Helsínquia 1964 e suas emendas posteriores ou padrões éticos comparáveis. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes individuais incluídos no estudo. Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de revisão interna do BeiGene. Este protocolo foi ajustado especificamente para a avaliação de BGB-A317 (Tislelizumab) em camundongos humanizados NOD/SCID.
1. estabelecimento do modelo humano baseado em PBMC
-
Mieloablação de camundongos NOD/SCID usando ciclofosfamida: determinação de doses ideais
- Compre camundongos NOD/SCID femininos (6-8 semanas).
Nota: Todos os camundongos envolvidos neste estudo eram do sexo feminino. - Prepare a ciclofosfamida (PC) em doses diferentes (50, 100 e 150 mg/kg) em soro fisiológico. Preparar dissulfiram (DS) em 0,8% Tween-80 em soro fisiológico a 125 mg/kg.
Nota: diferentes concentrações de PC foram preparadas para permitir a administração de volumes iguais de solução de medicamentos para camundongos recebendo diferentes doses de PC. - Trate os animais com CP (i.p.) e DS (p.o.) uma vez por dia durante 2 dias. Dar DS (p.o.) 2 h após cada dose de PC.
Nota: O DS diminui a urotoxicidade da PC em camundongos, e a CP combinada com DS tem sido sugerida para ter neutropenia de maior duração do que os animais tratados apenas com PC10 o regime posológico de PC pode necessitar de ser pré-determinado antes dos estudos reais e foi encontrado para variar ligeiramente entre diferentes estirpes de rato imunodeficientes. - Colete amostras de sangue do seio venoso orbital e transfira para tubos revestidos de EDTA-K no gelo no dia 0 (1 h antes da dose de 1St ), dia 2 (24 h após a 2ª dose) e dia 4 (72 h após a 2ª dose).
- Examine o efeito da mieloablação após o tratamento com PC e DS por FACS. Use Rat anti-mouse CD11b (M1/70), Rat anti-mouse Ly6C (HK 1.4,) e Rat anti-mouse Ly6G (1a8) para gating CD11b+ Ly6Galta como neutrófilos, CD11b+Ly6Calta como monócitos11,12.
- Grave o peso corporal e as condições de saúde dos ratos diariamente durante uma semana. A dose óptima de PC e de DS é determinada como o regime que conduz ao esgotamento máximo dos neutrófilos e dos monócitos sem causar a toxicidade severa aos ratos.
- Compre camundongos NOD/SCID femininos (6-8 semanas).
-
Transplantação humana do PBMC e Engraftment do tumor: ajuste do modelo
- Isole PBMCs humanos de doadores saudáveis por centrifugação de gradiente de densidade de acordo com as instruções do fabricante.
- Pré-trate os ratos com CP e DS como indicado pela etapa 1.1.2 e 1.1.3 para aumentar a eficiência da transplantação.
- 20 a 24 h após a segunda dose de PB e DS, injetar linha celular tumoral humana, como células A431 (ATCC, 2,5 x 106) e 5 x 106 PBMCs isolados (misturado em um total de 200 μL de soro tampão fosfato (PBS) contendo 50% de matrigel) , ou fragmentos tumorais (3 x 3 x 3 mm3, em um volume total de 200 ΜL de PBS contendo 50% de Matrigel) e 200 μL de 5 x 106 PBMCs (100 μl cada um para o lado esquerdo e direito do fragmento de tumor enenxertado) (s.c.) subcutaneamente no flanco direito dos animais.
- Meça o volume preliminar do tumor e recorde duas vezes por semana por 4-6 semanas.
Nota: Os ratos serão eutanasiados uma vez que seus pesos corporais perdem mais de 20% ou seu volume tumoral atinge 2.000 mm3 ou o tumor é Ulcerado. - Eutanizar os camundongos em câmaras de gás com dióxido de carbono. Colete todos os tecidos tumorais em camundongos sacrificados com tesoura oftálmicas e processe-os para análise histológica e imuno-histoquímica (IHC). Examine as expressões humanas CD8, PD-1 e PD-L1 nestes tecidos. Consulte o protocolo passo 4.
2. tela de doador PBMC
- Tela de um painel de doadores PBMC devido às variações antecipadas resultantes de PBMCs coletados de indivíduos. Use células A431 coinjetando com PBMCs de diferentes doadores de acordo com os procedimentos, conforme indicado pela etapa 1,2.
Nota: Mais de 50 doadores saudáveis de PBMC foram rastreados no estudo, a fim de obter número suficiente de doadores adequados. Pesquisadores que gostariam de adotar esse protocolo podem decidir por conta própria quantos doadores saudáveis de PBMC devem ser rastreados, com base no projeto dos estudos planejados. - Monitore o volume tumoral duas vezes por semana medindo com um paquímetro.
Nota: A taxa de crescimento tumoral pode variar com PBMC de diferentes doadores. - Colete os tecidos tumorais em um volume médio de 200-500 mm3 e processe-os para análise histológica e imuno-histoquímica (IHC). Examine as expressões humanas CD8, PD-1 e PD-L1. Consulte a etapa 4 para obter um protocolo detalhado.
- Selecione doadores de PBMC que resultam em crescimento moderado do tumor (volume tumoral > 200 mm3 14 dias após a inoculação) e relativamente altas expressões PD-1, PD-L1 e CD8 (escores médios do ihc > 2). Consulte a etapa 4 para obter um protocolo detalhado de Pontuação do IHC.
3. linha celular do cancro humano e tela de PDX
- Linhas de células de tela e PDXs de acordo com os procedimentos indicados na etapa 1,2, para avaliar a taxa de crescimento tumoral, a expressão de PD-L1 humana dos tumores e infiltrações de células imunes.
Nota: Mais de 30 linhagens de células cancerosas humanas e mais de 20 PDXs de diferentes tipos de câncer foram rastreadas pelos autores. Os dados dos modelos de tumores selecionados foram mostrados na seção de resultados.
4. imunoistoquímica (IHC)
- Colheita como indicado pela etapa 1.2.5 e fixar tecidos tumorais por imersão em formalina. Deshidratar e incorporar tecidos fixos em parafina. Corte os tecidos fixos a 3 μm e coloque-os em lâminas revestidas com polylysine.
- Desparaffinize em xilenos três vezes 7 min cada. Hidratar as secções através de álcoois classificados: 100% etanol duas vezes por 3 min cada, seguido por 90%, 80% e 70% etanol por turno por 3 min cada. Enxágüe por H2o desionizado três vezes e remova o excesso de líquido das lâminas.
- Realize a recuperação do antígeno colocando as lâminas em um recipiente e cubra com tampão do citrato de sódio de 10 mM (pH 6,0), ou Tris-EDTA (pH 9,0). Aqueça o recipiente de slides por microondas por 3 min. Ferva em um banho de água a 95 ° c por 30 min e depois esfrie até a temperatura ambiente. Enxágüe por H2O desionizado três vezes e aspirar o excesso de líquido das lâminas.
- Bloquear as secções em 3% de albumina sérica bovina em PBS durante 1 h e 0,3% H2O2 solução em PBS durante 10 min. mancha por anticorpos contra o CD8 humano (EP334), PD-1 (NAT105,) e PD-L1 (E1L3N) a 4 ° c durante a noite, e HRP conjugado 2ND anticorpos na RT para 1 h. soltar o substrato DAB (3, 3 '-diaminobenzidina) sobre as lâminas e controlar o tempo de reação (segundos a minutos), monitorando a cor marrom do microscópio.
- Cubra as lâminas com bálsamo neutro depois de mergulhar as lâminas em 0,5% álcool ácido clorídrico e 0,5% de água de amônia por sua vez para 5 s cada, em seguida, em 80%, 90% e 100% etanol em seqüência por 3 min cada, e, finalmente, em xilenos usando três mudanças para 5 min cada. Detecte os anticorpos observando a cor marrom do DAB usando o microscópio.
Nota: A expressão humana de CD8 e de PD-1 em leucócito tumor-infiltrando (TIL) foi avaliada atribuindo uma contagem da expressão em uma escala de 5 pontos (contagem de IHC, escala 0-4) na ampliação objetiva elevada (20x, 40x). 0, ausente; 1, fraca intensidade/menos de 20% células; 2, intensidade fraca a moderada/20%-50% células; 3, moderada a forte intensidade/50%-80% células; 4, intensidade forte/mais de 80% células. A mancha PD-L1 humana dentro das pilhas do tumor foi anotada usando um sistema de Pontuação ajustado em uma escala de 5 pontos (contagem de IHC, escala 0-4) por causa de seu sinal relativamente difuso. 0, ausente; 1, fraca intensidade/menos de 10% células; 2, fraca-a-moderada intensidade/10%-30% células; 3, moderada/30%-50% células; 4, intensidade forte/mais de 50% células.
5. estudos de eficácia e farmacodinâmica in vivo em modelos de PBMC-NOD/SCID xenograft humanizados
- Pré-trate camundongos NOD/SCID como indicado pela etapa 1.1.3. Em suma, trate os camundongos com 100 mg/kg CP (i.p.) e 125 mg/kg DS (p.o.) uma vez por dia durante 2 dias.
- 20 a 24 h após a segunda dose, injete por via subcutânea (s.c.) com número indicado de células cancerosas humanas e 2,5-5 x 106 PBMCs (um total de 200 μL de mistura de células em 50% de Matrigel) no flanco dianteiro direito dos animais.
Nota: O número de PBMC usado para qualquer mouse individual em um único estudo deve ser o mesmo. No entanto, devido a variações na disponibilidade de PBMC isolados totais no momento de cada estudo, os autores optaram por usar 2,5 x 106, 4 x 106ou 5 x 106 PBMC em diferentes estudos. Embora essa diferença de 2 vezes na quantidade administrada de PBMCs possa afetar o grau de humanização, os autores não observam diferenças significativas na avaliação de eficácias antitumorais das imunoterapias testadas. - Para o Engraftment de pdxs, injete fragmentos por via subcutânea do tumor (3 x 3 x 3 milímetros3) no flanco dianteiro direito dos animais. Injete por via subcutânea 200 μL de 5 x 106 PBMCs (100 μl cada lado) à esquerda e à direita do fragmento enxertado do tumor.
Nota: Os tecidos do tumor de PDX foram administrados em uma solução de Matrigel, mesmo que descrito para os modelos da linha celular. - No dia da inoculação celular, agrupe aleatoriamente os animais e trate-o como o protocolo de estudo planejado. Avalie a atividade antitumoral de drogas candidatas, BGB-A317 (QW, i.p.) neste caso, nas doses indicadas em vários modelos tumorais.
Nota: As três linhagens de células cancerosas humanas (i.e., A431 (Carcinoma epidemoide), SKOV3 (cancro do ovário) e SK-MES-1 (cancro do pulmão)), bem como dois modelos PDX (i.e., BCLU-054 (cancro do pulmão) e BCCO-028 (cancro do cólon)), são considerados bons modelos tumorais para avaliação neste modelo humanizado do rato. - Meça o volume preliminar do tumor duas vezes cada semana, usando um compasso de calibre.
Nota: A perda de pesos corporais de Gand foi observada em torno de 4-6 semanas após o Engraftment de PBMC em nossos estudos, permitindo uma janela de 1-2 meses para avaliações terapêuticas da eficácia. - Para a análise da farmacodinâmica de células imunes infiltradas tumorais, corte os tecidos tumorais em pequenos pedaços e digerir-os com colagenase tipo i (1 mg/ml) e DNase i (100 μg/ml) em RPMI1640 mais 5% soro fetal bovino (FBS) por 30 min a 37 ° c. Passe os tecidos digeridos através de filtros de células de 40 μm para obter suspensões de células únicas.
- Lave as células e ajuste o número da célula para uma concentração de 1 x 107 células/ml em gelo frio FACS buffer (PBS, 1% FBS) em 96-bem fundo redondo placas. Lave as células por centrifugação e bloqueá-las adicionando 20 μg/mL de IgG humana por 30 min, seguida de coloração com anticorpos anti-humanos CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) e PD-1 (MIH4) a 4 ° c durante 30 min. Em seguida, sujeitar as amostras manchadas a citometria de fluxo e analisar usando guavaSoft 3.1.1.
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Representative Results
Seguindo os procedimentos aqui apresentados, foi estabelecido com sucesso um modelo humanizado de Xenoenxerto com base em PBMC. Em síntese, os efeitos da mieloablação de PB nos camundongos NOD/SCID foram determinados pela análise de citometria de fluxo de populações de neutrófilos e monócitos pós-tratamento de CP e DS (Figura 1). 100 mg/kg CP mais 125 mg/kg DS foi determinada como a dose óptima e utilizada em estudos posteriores, uma como o regime resulta na depleção máxima de neutrófilos e monócitos sem causar toxicidade grave para camundongos. Em seguida, o PBMC humano e o transplante tumoral foram realizados. A presença de células imunes humanas infiltrados no microambiente tumoral foi verificada pelo IHC (Figura 2).
Um painel de doadores de PBMC foi selecionado in vivo para assegurar infiltrações imunes relativamente elevadas da pilha no microambiente do tumor e na taxa aceitável do crescimento do tumor (seção 2, Figura 3a). Enquanto isso, mais de 30 linhagens de células cancerosas humanas, bem como mais de 20 PDXs de diferentes tipos de câncer foram rastreados para avaliar a taxa de crescimento tumoral, expressão de PD-L1 tumoral e infiltrações de células imunes (seção 3). Os resultados representativos foram mostrados na Figura 3B.
Estes ratos humanizados PBMC-engrafted foram usados então para examinar a atividade do antitumoral de BGB-A317. Os PBMCs humanos de doadores saudáveis selecionados foram coinjetados com células tumorais humanas (A431, SKOV3 e SK-MES-1) ou fragmentos primários de tecido tumoral derivados de pacientes oncológicos (BCCO-028 e BCLU-054) por via subcutânea. Os camundongos foram tratados, como indicado na Figura 4, com BGB-A317 ou PBS intraperitonealmente uma vez por semana a partir do dia da implantação do tumor. Em todos os modelos supracitados, o BGB-A317 demonstrou atividades antitumorais significativas (Figura 4).
Figura 1 : Mieloablação de camundongos Nod/SCID usando ciclofosfamida (PC) e dissulfiram (DS). (A) estratégia de gating utilizada para identificar subconjuntos de células mielóides, incluindo neutrófilos e monócitos. (B) os resultados representativos de células mielóides (CD11b+), neutrófilos (CD11b +Ly6G+) e monócitos (CD11b+LY6C+) números sobre diferentes dosagens de tratamento de CP. As caixas representam o percentil 75, 50 e 25 dos valores. As linhas superior e inferior representam pontos de dados máximos e mínimos dentro do intervalo de 1,5 x QI (inter trimestre), respectivamente. n = 3 para o grupo de veículos e n = 6 para grupos tratados com PC e/ou DS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Transplantação humana do PBMC e Engraftment do tumor. (A) diagrama esquemático mostrando o fluxo de trabalho geral do modelo de Xenoenxerto humanizado baseado em PBMC. (B) crescimento tumoral de células A431 após a coinjeção subcutânea com PBMC doador com as condições indicadas (os dados representam o volume tumoral médio ± sem, n = 6). (C) análise do IHC de tumores desenvolvidos em camundongos tratados com ou sem PC + DS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : PBMC doador e tela de linha celular de câncer humano. A) dados sumários representativos da tela de doadores PBMC. Os PBMC foram misturados com células A431 e inoculados por via subcutânea em camundongos de NOD/SCID humanizados (ver etapa 2). Cada ponto representa o valor médio de dados de 3 camundongos enenxertados com PBMCs de 1 doador. (B) resultados representativos da tela de linha celular de câncer humano. PBMC de doadores selecionados foram coinjetados com células A431, SK-MES-1 ou SKOV3. Os dados representam o volume tumoral médio ± SEM coletado de 3 camundongos, 14 dias após a inoculação das linhagens celulares indicadas. O escore médio de IHC ± MEV representa a expressão média dos humanos CD8, PD-1 e PD-L1 de todos os 3 camundongos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Atividades do anti-tumor e análise da farmacodinâmica de BGB-A317 no modelo humanizado PBMC-baseado do xenograft. A atividade antitumoral de BGB-A317 em doses indicadas (i.p., QW) foi avaliada por meio de linhagens de células cancerosas humanas (a) A431 (com 5 x 106 PBMC), (C) SKOV3 (com 5 x 106 PBMC), (D) SK-mes-1 (com 5 x 106 PBMC) e xenoenxertos derivados do paciente (PDXs) (e) bclu-054 (com 5 x 106 PBMC) e (F) bcco-028 (com 5 x 106 PBMC). PBMC dos doadores saudáveis selecionados e das pilhas correspondentes do tumor foram coinjetados por via subcutânea em ratos humanizados de Nod/scid (n = 8 a 10). (B) quantificação de células hCD8 + e HCD8 + HPD-1 + de tumor-infiltrantes em tumores A431 tratados com BGB-A317. n = 8-10 animais por grupo em A, e C a F, n = 4-6 animais por grupo em B; dados representam média ± SEM. A significância foi avaliada por meio de teste t de Student bicaudal não pareado, a suposição de Variância desigual. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nosso conhecimento do desenvolvimento e da progressão do cancro avançou significativamente nos últimos anos, com foco em uma compreensão detalhada das pilhas do tumor e de seu estroma associado. Aproveitar os mecanismos imunes do hospedeiro poderia induzir um maior impacto contra as células cancerosas, representando uma estratégia de tratamento promissora. Os modelos murinos com sistemas imunológicos de rato intacto, como os modelos syngeneic e GEM, têm sido amplamente utilizados para estudar a imunidade mediada por ponto de verificação. As avaliações de eficácia que utilizam estes modelos dependem em grande parte dos anticorpos substitutos do alvo anti-rato13,14. No entanto, as diferenças inerentes entre os sistemas imunológico humano e murino e a falta de alguns alvos humanos em modelos murinos limitam os estudos pré-clínicos dos efeitos antitumorais do I-O15,16. Conseqüentemente, os modelos robustos do rato que incluem pilhas imunes humanas e os tumores humanos são desejados urgente, que melhorarão significativamente a tradução e o desenvolvimento da terapêutica nova do I-O.
Aqui, nós descrevemos um modelo PBMC-baseado humano do rato do xenograft que poderia potencial ser amplamente utilizado para estudos translacional do I-O. O doador PBMC, bem como as telas de linha/PDX de células cancerosas, são essenciais para garantir a robustez e a reprodutibilidade dos estudos de eficácia in vivo. Os doadores de PBMC foram selecionados in vivo para assegurar o tumor humano bem sucedido e o Engraftment imune da pilha. Enquanto isso, mais de 50 linhas celulares e PDXs de várias origens de câncer humano foram rastreados para avaliar a taxa de crescimento tumoral, a expressão humana PD-L1 e as infiltrações de células imunes. Nossas análises sugerem que cerca de 20% das linhagens de células cancerosas e PDXs examinados demonstram taxa de crescimento tumoral aceitável e, ao mesmo tempo, com TILs relativamente altos e coloração PD-L1, que são considerados bons modelos para avaliações de eficácia de I-O.
A correspondência de HLA é usada rotineiramente na clínica para combinar pacientes e doadores para transplantes de órgãos ou de medula17. Os autores, no entanto, só realizaram uma caracterização limitada sobre a tipagem de HLA, e este continua sendo um tópico interessante a ser investigado em estudos futuros. Os autores gostariam de notar que um doador PBMC pode ser adequado para uma linha de células cancerosas/PDX, mas não é ideal para outros. Portanto, os doadores de PBMC podem precisar ser rastreados para cada modelo de câncer para garantir resultados ideais.
O Engraftment de PBMC humano em camundongos do nod/scid ou do NSG conduz invariàvel a uma doença xenogénica da corrupção-contra-anfitrião (xgvhd), uma desordem borne-transplantação que resulte do ataque imune-negociado do tecido receptor por pilhas de T do doador18,19. Observações clínicas comumente associadas à xgvhd têm sido observadas em nosso modelo humanizado, como eritema, postura curvado, perda de peso e mortalidade (dados não mostrados). Estes fenótipos foram observados geralmente para a extremidade de nossos estudos, geralmente em 1-2 meses do borne do Engraftment, indicando a propagação e a infiltração de pilhas de T humanas em órgãos do alvo do xgvhd. Isto permite uma janela de 1-2 meses para avaliações terapêuticas da terapia do I-O. Diversas aproximações foram utilizadas para diminuir a imunidade inata do rato e para realçar o Engraftment imune humano da pilha20,21. Por exemplo, os ratos de NSG defeituosos na classe I murino de MHC e na expressão da classe II apoiam o Engraftment de pilhas humanas funcionais de T na ausência de xgvhd agudo depois da injeção de PBMC22.
Camundongos NOD/SCID foram utilizados neste protocolo. Camundongos homozygous para a mutação de SCID prejudicaram o desenvolvimento do linfócito da pilha de T e de B e o fundo do assentimento resulta adicionalmente na função de pilha20do assassino natural deficiente (NK). Outros camundongos mais altamente imunodeficientes, como o NSG (o laboratório Jackson), as cepas NCG (Charles River) e NOG (CIEA), foram estabelecidos. Quando enxertado com PBMCs, estes ratos foram mostrados desenvolvem células imunes humanas e formam um ambiente que se assemelha ao sistema imunológico humano23,24. Alternativamente, estes ratos podiam ser enxertado com pilhas hematopoietic humanas do progenitor de CD34+ (HPCS) e para indicar a diferenciação e a maturação mais sustentadas da pilha de T25. Além, os modelos immunodeficientes da geração seguinte do rato com umas modificações genéticas mais adicionais foram estabelecidos para suportar o desenvolvimento humano melhor da linhagem Myeloid e a eficiência aumentada do Engraftment (refira a página da Web do portfolio das variações do Laboratório de Jackson e Biosciences Taconic).
Mais detalhes de usar estas tensões novas para a reconstituição da imunidade humana estão pendentes umas investigações mais adicionais. No entanto, o protocolo delineado neste artigo poderia servir como diretriz geral de estabelecer e caracterizar modelos imunodeficientes de camundongo reconstituídos com PBMC humano. Três linhagens de células cancerosas humanas e duas xenoenxertos derivados de pacientes humanos, abrangendo uma série de tipos de câncer, são demonstradas neste artigo, sugerindo as possíveis aplicações amplas de nosso protocolo em estudos de I-O translacionais. A maioria dos modelos de PBMC humanizados, ao nosso conhecimento, escolheram IV ou IP como via de injeção26,27. Nossos modelos fornecem preferivelmente a imunidade humana parcialmente reconstituída em ratos humanos do rolamento do tumor através da admistura por via subcutânea do PBMC humano com xenoenxertos do cancro. Esta aproximação fornece uma alternativa rápida e rentável, contudo altamente reprodutível à reconstituição cheia da pilha de haste (por exemplo, ratos humanizados engrafted da pilha de haste hematopoietic CD34+ ). Nosso modelo tem sido provado ser útil para avaliar imunoterapias de câncer envolvendo células T, especialmente quando se trabalha em prazos curtos ou para selecionar agentes antes de passar para um modelo de imunidade de múltiplas linhagens mais complexa.
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Disclosures
Todos os autores têm o interesse da posse em BeiGene. Tong Zhang e Kang li são inventores em uma patente cobrindo BGB-A317 descrito neste estudo.
Acknowledgments
Agradecemos aos membros dos nossos laboratórios por discussões úteis. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo programa de pesquisa de inovação e cultivo biomédico e de Ciências da vida da Comissão Municipal de ciência e tecnologia de Pequim, o acordo de subvenção n º. Z151100003915070 (projeto "estudo pré-clínico sobre uma nova droga antitumoral de Oncologia imunológica BGB-A317"), e também foi parcialmente apoiado pelo financiamento interno da empresa para pesquisa pré-clínica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14 G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
References
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