Denne undersøgelse introducerer og beskriver protokoller til at udlede to specifikke humane neurale organoider som en relevant og præcis model til at studere 1) menneskelig glioblastoma udvikling inden for humane neurale organoider udelukkende hos mennesker og 2) neuron dopaminerge differentiering genererer en tredimensionel organoid.
Manglen på relevante in vitro neurale modeller er en vigtig hindring for medicinske fremskridt for neuropatiologier. Etablering af relevante cellulære modeller er afgørende både for bedre at forstå de patologiske mekanismer af disse sygdomme og identificere nye terapeutiske mål og strategier. For at være relevant skal en in vitro-model gengive de patologiske egenskaber ved en menneskelig sygdom. I forbindelse med neurodegenerative sygdomme bør en relevant in vitro-model imidlertid give neurale celle udskiftning som en værdifuld terapeutisk mulighed.
En sådan model ville ikke kun tillade screening af terapeutiske molekyler, men kan også anvendes til at optimere neurale protokol differentiering [for eksempel i forbindelse med transplantation i Parkinsons sygdom (PD)]. Denne undersøgelse beskriver to in vitro-protokoller af 1) Human glioblastoma udvikling inden for en menneskelig neurale organoider (NO) og 2) neuron dopaminerge (DA) differentiering genererer en tredimensionel (3D) organoid. Til dette formål blev der etableret en standardiseret protokol, som giver mulighed for at fremstille størrelses kalibrerede Neuro kugler afledt af humane embryonale stamceller (hESC)-differentiering. Den første model kan bruges til at afsløre molekylære og cellulære hændelser i løbet af glioblastoma udvikling inden for neurale organoid, mens DA organoid ikke kun repræsenterer en passende kilde til DA neuroner for Celleterapi i Parkinsons sygdom, men også kan anvendes til lægemiddel testning.
Verdenssundhedsorganisationen (WHO) klassificerer astrocytomer som lav kvalitet (grad I til II) eller høj kvalitet (grad III og IV). Glioblastoma multiforme (GBM) er en astrocytoma grade IV, den mest dødbringende af primære hjernetumorer, der er modstandsdygtig over for alle nuværende former for behandlinger1. Trods standardbehandling, herunder neurosurgery, kemoterapi og strålebehandling, er GBM fortsat dødelig, og den samlede overlevelsesrate på 15 måneder har ikke ændret sig dramatisk i løbet af de sidste 15 år2. For at gøre betydelige fremskridt med hensyn til at forstå GBM patogenesen er brugen af relevante modeller nøglen. Indtil videre har studiet af GBM påberåbt sig cellelinjer, gnaver organotypiske skiver og xenotransplantation af patient afledte celler til mus eller Transgene mus, som udvikler spontane tumorer3,4. Selv om disse modeller har været nyttige til at studere hjernemetastaser og tumor aggressivitet, de er begrænset af forskelle mellem arter, og resulterende konklusioner kan være forkert oversat til humane væv. Desuden er eksisterende modeller med humane celler også begrænset af fravær af vært væv/tumor interaktioner3,4. Eksperimentelle modeller er afgørende for oversættelsen fra grundforskning til terapeutiske mål. Derfor, at beskrive en protokol til at producere in vitro humane neurale organoider Co-kultiveret med GBM-initierende celler (GICs) kan give et relevant system, der efterligner morfologiske og funktionelle funktioner i GBM udvikling. Dette system gengiver nogle in vivo funktioner i GBM developmentsåsom diffus migration af invaderende celler og nekrose områder, og det fremhæver genekspression relevant for tumor biologi. Som tidligere afsløret, nogle kritiske micrornas er induceret under GIC udvikling inden for 3D nerve væv5,6.
PD er en stor neurodegenerative lidelse og forbundet med degeneration af flere neuronal undertyper7. Selv om en progressiv indtræden af symptomer (f. eks bradykinesia, asymmetrisk hvile tremor, stivhed og holdning ustabilitet) karakteriserer sygdommen, dens nøjagtige ætiologi er ikke klart fastslået. Faktisk har mange undersøgelser fremhævet beviser for, at store risikofaktorer kan skyldes en kombination af genetiske og miljømæssige faktorer. Parkinson symptomer er forbundet med den bilaterale degeneration af dopaminerge neuroner i stoffer nigra (SN), hvilket fører til forsvinden af dopaminerge (da) axoner projicering til striatum8,9. Derfor er reduktionen af striatal dopamin niveauer korreleret med progression af motorisk dysfunktion hos PD patienter. Dopaminerge neuroner indeholder tyrosin hydroxylase (TH), et vigtigt enzym i syntesen af catecholaminerge neurotransmittere, der omdanner aminosyren L-tyrosin til L-3, 4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA, en dopamin forløber) til dopamin10. Tidlig tab af TH aktivitet efterfulgt af et fald i TH protein udtryk er et kendetegn for PD.
Denne undersøgelse beskriver to protokoller ved hjælp af humane neurale organoider, med en specifikt orienteret mod en midbrain-lignende fænotype beriget med TH-positive celler.
En af de mest kritiske aspekter af denne protokol omfatter vedligeholdelse af hESC pluripotens under celledyrkning og tæt overvågning af sfærer og neurale organoid morfologi. hESCs er meget følsomme, og enhver manipulation kan føre til tidlig ukontrolleret differentiering samt celledød. For at øge eksperimentel reproducerbarhed og undgå forekomsten af unormale karyotype hændelser, anbefales det at kryopreservere flere partier af hESCs ved den laveste passage efter validering af deres kromosom stabilitet. Desuden anbefales det at tø et nyt hætteglas for hvert eksperiment og kontrollere funktionsmåden af cellerne hver dag. Hvis sfærerne er mindre refraktive med unormal højere størrelse, vil de sandsynligvis begynde at aggregere og dø.
En forbedring på dette system er enten perfusion eller gennemførelse af et vaskulariseret system (ved at tilføje endotelceller eller inden for en 3D Fluidic mikrochip)12,13. Men kontrol af tykkelsen af neurale organoid (≤ 300 μm) giver effektiv passiv perfusion af ilt og næringsstoffer og forebygger nekrose. En anden forbedring er indførelsen af immunceller (microglia). Med disse begrænsninger i tankerne, neurale organoider plus et GIC system kan være et relevant værktøj af flere grunde. Første, dette system tillader Drug screening for at overvåge, hvordan en terapeutisk sammensatte kan påvirke en organoid eller tumor celle. For det andet kan celle-til-celle-interaktioner undersøges, og mikro-miljømæssige determinanter underliggende individuelle og kollektive invasioner kan visualiseres og udforskes5,6,13.
I forbindelse med Parkinsons sygdom, en neurale organoid beriget i DA neuroner kan repræsentere en relevant og nøjagtig 3D-model til at studere sygdomsudvikling. I tidligere undersøgelser, Parkinsons patient-afledte induceret pluripotente stamceller differentieret over for DA neuroner er blevet brugt til at studere de berørte neuronal undertyper. Bemærk, at nogle sygdomsrelaterede fænotyper såsom akkumulering af α-synuclein og følsomhed over for oxidativt stress er blevet observeret14,15. Desuden, den neurale organoid kan bruges som et værktøj til at screene terapeutiske molekyler. Der bør dog fastsættes specifikke og relevante udlæsninger for at evaluere DA neuron overlevelse og funktionalitet, såsom dopamin produktion og elektrofysiologisk aktivitet. I alt, denne protokol giver to standardiserede og nøjagtige stamcelle-baserede tilgange til at generere neurale organoider.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker La Ligue genevoise contre Le cancer (Genève, Schweiz), ISREC Foundation (Lausanne, Schweiz) og Clayton Foundation for Research (Houston, TX, USA) for økonomisk støtte. Desuden forfatterne tak HES-HO og Wyss Center for økonomisk støtte. Vi takker krau’s Lab for nyttige diskussioner og støtte og Dr. Halah Kutaish til korrekturlæsning.
6-well plate (6-well plate) | Falcon / Corning | 07-201-588 | |
ABI Prism 7900 HT detection system (Real-Time PCR detection systems) | Applied Biosystems | Discontinued | |
Aggrewell 400 (Microwell culture plates ) | StemCell Technologies | 34421 | |
Amplifier (W2100-HS32) (Amplifier) | Multi Channel Systems | ||
Anti-EGFR (phospho Y1101) antibody | Abcam | ab76195 | 1/100 dilution |
Anti-GFAP Antibody | Dako | Z334 | 1/1000 dilution |
Anti-Nestin, Human Antibody | Millipore | ABD69 | 1/400 dilution |
Anti-Synapsin I Antibody | Chemicon | AB1543P | 1/500 dilution |
B27 supplements (B27) | Life Technologies / Invitrogen | 1238 | For both protocol, stock solution 100x, final solution 1x |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Cell Guidance | GFH1-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
CHIR-99021 (GSK-3β inhibitor ) | Axon Medchem | ct99021 | For Dopaminergic protocol, stock solution 7.5 mM in DMSO, final solution 3 µM |
Compound E a γ–secretase inhibitor (γ–secretase inhibitor) | Calbiochem | CAS 209986-17-4 | For both protocol (gamma-secretase inhibitor XXI), stock solution 5 mM in DMSO, final solution 1 µM |
Coulochem III (Coulometric detector parameters) | Thermo scientific | ||
Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP) | Sigma | D0627 | For Dopaminergic protocol, stock solution 0.5 M in DMSO, final solution 0.5 mM |
Dimethyl Sulfoxide Pure (DMSO) | Sigma-Aldrich | C6164 | Compounds solvent, ready to use |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12491-015 | For cell culture, ready to use |
Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12) | Gibco | 11320033 | For cell culture, ready to use |
EDTA 0.1 mM (EDTA) | Life Technologies | AM9912 | For cell culture, ready to use |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0313 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
Fibroblast Growth Factor 20 (FGF20) | Peprotech | 100-41 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 5 ng/mL |
fibroblast growth factor 8 (FGF8) | Peprotech | GFH176-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
Fibroblast growth factor-basic (bFGF) | Gibco | PHG0024 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
G5 supplements (G5) | Invitrogen | 17503012 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
Glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Cell Guidance | GFH2-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
Hydrophilic polytetrafluoroethylene membrane (PTFE membrane) | BioCell-Interface | Discontinued | |
LDN-193189 (BMP inhibitor) | Axon Medchem /Stemgen | 04-0072-02 /1509 | Dual/Smad, stock solution 5 mM in DMSO, final solution 0.5 µM |
L-glutamine (L-glutamine) | Gibco | 25030081 | L-Glutamine (200 mM), stock solution 200 mM, final solution 2 mM |
Matrigel (extracellular matrix) | BD Biosciences | 354277 | hESC-qualified Matrix, stock solution 18-22 mg/mL, final solution 180-220 µg/mL |
Millicell-CM Culture plate insert (0.4 µm) (Culture plate insert) | Millipore | PICM03050 | |
Monoclonal Anti-β-Tubulin III antibody | Sigma | T8660 | 1/1000 dilution |
MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital shaker) | Major Science | MS-NRC-30 | |
N2 supplements (N2) | Invitrogen | 17502-048 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
Nanodrop (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | Discontinued | |
Neurobasal (Neurobasal) | Life Technologies / Gibco | 21103049 | Maintenance and maturation embryonic neuronal cell populations , ready to use |
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140 | Non-essential Amino Acids 100X, stock solution 100x, final solution 1x |
Nurr1 Antibody (M-196) | Santa Cruz | Sc-5568 | 1/100 dilution |
Nutristem (hESC medium ) | Biological Industries | 05-100-1A | Stem cell media, ready to use |
Penicilin / Streptomycin (Penicilin / Streptomycin ) | Life Technologies / Gibco | 15140122 | For cell culture, stock solution 5 mg/mL, final solution 50 µg/mL |
Perchloric acid 0.1N (HCLO4) | Merck | 100519 | For HPLC, ready to use |
Phosphate Buffered Saline without Ca2+/Mg2+ (PBS without Ca2+/Mg2+ ) | Life Technologies | 14190250 | For cell culture, ready to use |
PrimeScript RT-PCR Kit (Reverse transcription kit) | Takara | RR014A | |
Purmorphamin (smoothened agonist) | Calbiochem | SML0868 | For Dopaminergic protocol, stock solution 10 mM in DMSO, final solution 2 µM |
Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK) | Abcam Biochemicals | ab120129-1 | Rock Inhibitor, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
RNeasy mini kit (RNA extraction kit ) | Qiagen | 74104 | |
SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal inhibitor ) | Ascent | Asc- 163 | Dual-Smad, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
Sonic Hedgehog (SHH) | Cell Guidance | GFH168-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
StemPro Accutase (hESC enzymatic solution) | Gibco | A11105-01 | hESC enzymatic solution, ready to use |
Symmetry C-18,5 mm (4.6 150mm2) (Reversed-phase column) | Waters Corporation | ||
T150 flask (T150 flask) | Falcon | 08-772-1F | |
TH Antibody (F-11) | Santa Cruz | Sc-25269 | 1/200 dilution |
Transforming Growth Factors beta 3 (TGFβ3) | Cell Guidance | GFH109-2 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure ethanol , final solution 1 ng/mL |
Trichostatine A (inhibitor of histone deacetylase ) | Sigma | T8552 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µM in DMSO, final solution 20 nM |
TrypLE (recombinant enzymatic solution) | Invitrogen | 12604021 | recombinant enzymatic solution, ready to use |
Trypsin 0.25% (enzymatic solution) | Life Technologies | 15050065 | enzymatic solution, ready to use |
W2100, Multi Channel Systems (Data acquisition system ) | WAT045905 | ||
X-vivo (serum free medium) | Lonza | BE04-743Q | serum free medium, ready to use |