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Bioengineering

研究脑癌和神经退行性疾病的人类神经器官

doi: 10.3791/59682 Published: June 28, 2019
* These authors contributed equally

Summary

本研究介绍并描述了得出两种特定人类神经器官的规程,作为研究人类神经器官内人类胶质细胞瘤发育的相关和准确的模型,2)神经元多巴胺能分化产生三维有机体。

Abstract

缺乏相关的体外神经模型是神经病理学医学进展的重要障碍。建立相关的细胞模型对于更好地了解这些疾病的病理机制和确定新的治疗目标和策略至关重要。为了相关,体外模型必须复制人类疾病的病理特征。然而,在神经退行性疾病的背景下,相关的体外模型应提供神经细胞替代作为宝贵的治疗机会。

这种模型不仅允许筛选治疗性分子,还可用于优化神经协议分化[例如,在帕金森病(PD)的移植环境中]。本研究描述了人类神经器官(NO)和2)神经元多巴胺能(DA)分化内人类胶质细胞瘤发育的两个体外方案,产生三维(3D)有机体。为此,建立了一个标准化良好的协议,允许生产从人类胚胎干细胞(hESC)分化中提取的经过校准的大小的神经球。第一个模型可用于揭示神经器官内胶质母细胞瘤发育过程中发生的分子和细胞事件,而DA有机体不仅代表了帕金森病中细胞治疗的DA神经元的合适来源,而且还可以用于药物测试。

Introduction

世界卫生组织(世卫组织)将星形细胞瘤归类为低年级(一至二年级)或高年级(三级和四级)。胶质母细胞瘤多毛病(GBM)是星形细胞瘤IV级,最致命的原发性脑肿瘤,是抵抗所有目前形式的治疗1。尽管包括神经外科、化疗和放疗在内的标准护理治疗,GBM仍然致命,15个月的整体存活率在过去15年中没有显著变化2。要在了解 GBM 发病机制方面取得显著进展,使用相关模型是关键。到目前为止,GBM的研究已经依赖于细胞系,啮齿动物器官切片,和异种移植患者衍生细胞到小鼠或转基因小鼠发展自发肿瘤3,4。虽然这些模型对研究脑转移和肿瘤攻击性非常有用,但它们受到物种间差异的限制,因此得出的结论可能错误地转化为人体组织。此外,现有的人体细胞模型也受到缺乏宿主组织/肿瘤相互作用3,4的限制。实验模型对于从基础科学到治疗靶点的转换至关重要。因此,描述与GBM启动细胞(GIC)共同培养的体外人类神经器官生成方案可以提供一个模拟GBM发育的形态和功能特征的相关系统。该系统再现了GBM发展的一些体内特征,如入侵细胞和坏死区的扩散迁移,突出与肿瘤生物学相关的基因表达。如前文所述,一些关键微RNA在3D神经组织5、6的GIC发育过程中被诱导。

PD是一种主要的神经退行性疾病,与多个神经元亚型退化7相关。即使症状的逐渐出现(例如,血症、不对称的休息震颤、僵硬和姿势不稳定)是该病的特征,其确切病因也没有明确确定。事实上,许多研究都强调了主要风险因素可能由遗传和环境因素共同作用的证据。帕金森症状与亚斯坦西亚尼格拉(SN)中多巴胺能神经元的双边退化有关,导致多巴胺基(DA)的斧状消失,并投射到纹状体8,9。因此,纹状多巴胺水平的降低与PD患者运动功能障碍的进展相关。多巴胺能神经元含有酪氨酸羟基酶(TH),这是一种合成儿茶胺能神经递质的关键酶,可将氨基酸L-酪氨酸转化为L-3,4-二羟基苯甲氨酸(L-DOPA,多巴胺前体)转化为多巴胺10。TH活性的早期丧失,随后TH蛋白表达下降是PD的一个标志。

本研究描述了使用人类神经器官的两种方案,其中一种专门针对富含TH阳性细胞的中脑样表型。

Protocol

本议定书遵循日内瓦大学人类研究伦理委员会的指导方针。

1. 未分化人类胚胎干细胞的维持和培养

  1. 在无进纸器条件下,通过预涂带特定细胞外基质的洗碗,对 hSEC 进行维护和扩展。
    1. 在 4°C(典型范围浓度 18-22 mg/mL,保持冰上)下解冻 300 μL 的细胞外基质,并轻轻与 15 mL 的冷 DMEM 介质混合,以避免细胞外基质过早凝固。在两个T150烧瓶中加入7.5 mL的细胞外母体。
    2. 在37°C下孵育涂有细胞外基质的菜肴至少1小时(最多过夜)。
    3. 取出中种和种子hESC的密度为6.5 x 104细胞/厘米2。
  2. 在hESC培养基和1%青霉素/链霉素中保持H1(hESC细胞系)。
  3. 通过酶程序的细胞:在37°C下将7.5 mL的酶溶液加入T75 cm2烧瓶1-2分钟。一旦细胞完全分离,加入7.5 mL的DMEM-F12,然后离心机5分钟,在300 x g。为了更好的生存,将所需密度的细胞重新盘到细胞外基质涂层的培养皿上,在同一介质中含有Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂(10μM)24小时。

2. 用于 GBM 研究的 hESC 衍生神经器官

  1. 在开始3D培养之前24小时,用无血清培养基取代hESC培养基,辅以10μM ROCK抑制剂(这两种成分都是支持微孔聚集阶段细胞生存和自发神经球形成所必需的)板)。细胞应处于60%的汇合度。第二天(第0天),分离hESC菌落作为单个细胞:去除培养基,然后用PBS冲洗没有Ca2+/Mg2+,加入5 mL的酶溶解溶液,并在37°C孵育1-2分钟。
  2. 用10μM的ROCK抑制剂收集无血清培养基中的细胞,并在300 x g下将细胞离心5分钟。去除上清液,在10mL的无血清培养基中计数,并辅以10μM的ROCK抑制剂。
  3. 同时,用每孔2 mL无血清介质冲洗微孔板,并在1200 x g下离心5分钟,去除所有气泡,防止神经球形成。
  4. 在12.5 mL的无血清培养基中制备28.2 x 106个细胞,辅以10μM ROCK抑制剂。分配1000个细胞/微井。在300 x g下将细胞离心5分钟,并将板置于37°C的培养箱中过夜(最大36小时)。例如:要获得30个人类神经器官,在汇合70%-80%(约3000万个细胞)处使用一个T150烧瓶。
  5. 第二天(第 1 天),收集球体(带 P1000),并将其放入 6 孔板中。在每口井中,加入2 mL的B27介质和DMEM-F12谷氨酸和神经碱基(混合在1:1),辅以1%B27补充剂和1%非必需氨基酸(NEAA)。为了促进快速神经诱导,补充介质双SMAD抑制鸡尾酒,由10μM TGF®/Activin/诺达尔抑制剂和0.5μM骨形态蛋白(BMP)抑制剂组成。从这一步开始,球体以旋转方式培养(60 rpm,轨道摇床)。旋转对于防止球体粘在一起或粘在板上至关重要。
  6. 每2-3天更换一次介质:弯曲板,让球体下降5分钟,去除一半的介质(2 mL),并加入2 mL的新鲜B27介质,补充生长因子和抑制剂。不要使球体离心。
  7. 根据以下时间课程执行神经感应:
    1. 从第1-4天起,培养B27介质中的球体,辅以双SMAD。双SMAD抑制鸡尾酒(10μM TGF®/Activin/诺达尔抑制剂和0.5μM BMP抑制剂)促进神经诱导。
    2. 从第4-11天起,通过在B27介质中加入10纳克/mL表皮生长因子(EGF)和10纳克/mL基本成纤维细胞因子(bFGF),促进hESC衍生神经玫瑰花环(进入球体)的增殖。
      注:在第11天,大多数细胞对Nestin应该是阳性的。
    3. 从第11-13天起,培养B27介质中的球体,辅以0.5μM BMP抑制剂。
    4. 从第13-21天起,培养B27介质中的球体辅以10纳克/mL胶质衍生神经营养因子(GDNF)、10纳克/mL脑衍生神经营养因子(BDNF)和1μMβ-分酶抑制剂。GDNF和BDNF促进神经元和胶质分化。β-分泌酶抑制剂允许更大的神经成熟。
    5. 第 21 天,将球体(约 1,000 个球体)放在沉积在专为 6 孔板设计的培养板插入件上的亲水聚四氟乙烯 (PTFE) 膜(直径 6 mm,0.4 μm)上。停止此步骤中的任何旋转。用明亮的场显微镜观察的玫瑰花环的存在表明神经分化的开始。在PTFE膜上电镀球体2-3天后,可以观察到神经玫瑰花。
    6. 每2-3天(通常在周一、周三和周五)向膜插入下的每口井添加1mL的B27介质,并辅以生长因子和抑制剂(如下),进行随后3周的分化。
    7. 从第21-25天起,在同一神经成熟培养基培养人类神经器官(参见步骤2.7.4)。
    8. 从第25-28天起,只需用1μMβ-分泌酶抑制剂补充B27介质。
    9. 从第28-39天起,停止添加β-分酶抑制剂,仅在B27培养基中继续人体神经器官培养。
      注:3周后,神经器官可用于GIC植入。在神经成熟时,观察到神经不成熟标记Nestin的减少和成熟神经标记+3-tubulin和GFAP的增加。

3. 胶质细胞瘤启动细胞的分离和培养

  1. 通过分割高等级人体 GBM 活检来分离 GIC。将肿瘤在含有0.25%胰蛋白酶的烧杯中转移到0.1 mM EDTA (4:1)中,并在37°C下缓慢搅拌30-60分钟(取决于肿瘤大小)。
  2. 在GIC培养基中,在2cm 2cm2中,在75 cm2组织培养瓶中镀上分离的细胞:DMEM/F-12介质(1:1),含有1%的N2、1%B27和1%的G5补充剂(以利于GIC生存),辅以bFGF和EGF(均为10分)ng/Ml,促进茎)和1%的青霉素/链霉素。
  3. 一旦GIC建立良好和增长, 从GIC介质中删除N2和G5补充剂.
  4. 在将细胞添加到有机体上的一天前,分离GI并计数它们。
  5. 用 2 mL 的 GIC 介质冲洗微孔板,以最大速度离心板以去除气泡 (1000 x g)。将GIC放置在1,000个细胞中,以获得每个微井一个胶质球。在37°C(图1C)孵育过夜。此步骤是关键,允许经过良好校准的 GIC(坏死和超大 GIC 的示例如图2A,C所示)。
  6. 要启动 GBM 入侵,在神经组织顶部添加一个胶质球,其孔部移液头较大(图 1F)。小心地将 6 个孔板放回培养箱中。

4. hESC衍生多巴胺类有机物,用于PD研究

  1. 第0天:在2D培养物中放大hESCs高达60%的汇合率(第0天),然后用无血清培养基取代用于维持hESCs多能特征的干细胞培养基。通过补充培养基,使用0.5μM BMP抑制剂和10μM TGF®/Activin/Nodal抑制剂(双SMAD抑制鸡尾酒)开始神经诱导,然后加入10μM ROCK抑制剂24小时,以提高细胞在通过过程中的存活率。
  2. 第1天:用每孔无血清介质2.5 mL制备微孔板,辅以0.5μM BMP抑制剂、10μM TGF+/Activin/诺达尔抑制剂和10μM ROCK抑制剂。要指定细胞朝向神经管的腹腔模式,请添加100纳克/mL声波刺猪(SHH)、100纳克/mL成纤维细胞生长因子8(FGF8)和2μM平滑激动剂。将板(仅带介质和无细胞)在 1200 x g下 5 分钟,以去除微孔中的气泡。
    1. 在 2D 中进行 1 天的神经感应后,取出介质,无需 Ca2+/MgCl2+即可快速用 PBS 清洗。在T75 cm2烧瓶中加入7.5 mL的重组酶溶液,分离单个细胞悬浮液的菌落。在 37°C 下孵育 2 分钟,然后使用 7.5 mL 的 DMEM-F12 完成。
    2. 收集细胞悬浮液,以300 x g离心5分钟。取出上清液,在用于制备微孔板的同一培养基中计算细胞。
    3. 调整介质体积以获得细胞悬浮液,从而形成每个微孔包含1000个细胞的神经球(例如,这里使用的微孔板每孔含有4,700个微孔)。因此,在2.5 mL的介质中制备470万个细胞,并将其添加到先前已放置在板中的2.5 mL介质中。
    4. 为了在每个微孔中正确分配细胞,轻轻摇动板,将微孔板300 x g离心5分钟。在37°C下孵育板24小时以产生球体。
  3. 第2天:用介质轻轻冲洗微孔,然后收集,然后将球体转移到经过组织处理的六孔板中。用1%B27、1x NEAA、2 mM L-谷氨酰胺和1%的青霉素/链霉素补充的神经基础介质替换培养基。此外,添加区域化因子SHH,FGF8,平滑激动剂,和双SMAD抑制小分子。
    1. 将球体在37°C(60rpm,轨道摇床)旋转,每2-3天更换半介质新鲜补充。
  4. 第3天:为了增强神经诱导,并转换为具有中脑身份的神经祖子,用3+M GSK-3+抑制剂补充介质,该抑制剂激活Wnt/β-卡泰宁通路。在第13天前保持GSK-3+抑制剂。分裂成两个新的组织处理6孔板,以减少每孔的球体密度,避免球体聚集。
    注:在第8天,大多数细胞对Nestin应该是阳性的。
  5. 第8天:开始神经成熟:用0.5 mM二叶酸丙类(有利于成熟)取代区域化因子SHH、FGF8、平滑激动剂和双SMAD抑制鸡尾酒(有利于成熟),20 nM抑制剂组蛋白脱乙酰酶(用于细胞周期退出),1μM β-分泌酶抑制剂和生长因子,10纳克/mL GDNF,10纳克/mL BDNF,1纳克/mL转化生长因子+3(TGF+3)和5纳克/mL FGF20(都有利于DA祖细胞生存)。每 2-3 天更换一次介质。
  6. 第21天:生成神经器官:在PTFE膜(直径6毫米)的气液界面条件下,在100个神经球层中播种。将膜转移到培养板插入物(0.4 mm),并添加1.2 mL的神经成熟介质,用于神经球分化,如前所述。
    1. 停止此步骤中的任何旋转。每 2-3 天更换一次介质,直到达到所需的区分时间点。
      注:关于神经成熟,观察到神经不成熟标记Nestin的减少和成熟神经标记+3-tubulin和GFAP的增加。观察到高TH和NURR1表达(图3C),确认神经器官成熟度11。

5. TH和Nurr1基因表达的定量,用于验证多巴胺能分化

  1. RNA提取:在所述分化日,含有350μL的RLT缓冲液(在RNA提取试剂盒中提供)的40个神经球,辅以3.5μL的2-甲酸酯乙醇。按照制造商的说明,使用RNA提取试剂盒从解糖神经球中提取RNA。
  2. 量化总RNA浓度。
  3. 使用反向转录试剂盒对总RNA提取的300纳克进行逆转录,用于定量实时聚合酶链反应(qPCR),并遵循制造商的说明。
  4. 基于非对称氰化物检测,对实时PCR检测系统执行qPCR分析。用内务管理基因使数据正常化:甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和伸长因子1-α(EF1)。引种序列在表1中描述。

6. 高压液相色谱 (HPLC) 检测

  1. 使用高压液相色谱 (HPLC) 与电化学检测检测,以检测多巴胺的存在。多巴胺在4°C下,在100 mL的0.1 N上氯酸(HClO4)中裂解神经有机体,每5分钟一次产生剧烈涡旋。多巴胺被提取15分钟。离心后,收集和储存上清液在-20°C多巴胺剂量。
  2. 使用 C-18 柱(5 μm,4.6 mm x 150 mm)在等分模式下以 1 mL/分钟的流速通过反向相 HPLC 分离分析物。应使用库仑检测仪进行多巴胺检测,其调节单元的电位设定在 ±200 mV。

7. 使用微电位阵列 (MEA) 平台进行原始数据记录

  1. 使用解剖显微镜将神经球转移到多孔 MEA 设备的中心。
  2. 使用放大器和数据采集系统进行电生理记录。在 5 分钟记录期间,使用信号作为相同 5 分钟周期中记录的峰值的平均峰峰值电压,将信噪比 (SNR) 测量为电压的标准偏差。

Representative Results

此协议的关键步骤必须识别并正确处理。因此,分别图1A和图 3A 中说明了指示每个步骤的延时时间推移以及用于分化协议的化合物的培养条件图。图 1A 和图 3A分别说明 NO 加 GBM 和 DA 神经有机体。图1B、C、D、E、F说明了细胞、球体和NO,并显示了每个步骤的典型形态。图1G,H,I用一些神经标记说明了免疫荧光染色。

Figure 1
图 1:人体神经器官(否)差异化协议。(A) 从人类胚胎干细胞 (hESC) 生成 NO 的标准化协议。(B) hESC 在 hESC 介质中保存在细胞外基质上.(C) 微孔板被用来产生校准的神经球.在2周内,神经球被镀在含有PTFE膜的插入物上(刻度杆 = 50 μm)。(D) 在 6 孔板的一个孔中插入 NO 的宏观视图。在最初的日子里,观察到玫瑰花环(黑色箭头) (E)。(F) 顶部的 NO 加 GIC 球体的宏观视图。(G-I)NO加GIC球(EGFR-阳性;刻度柱= 50 μm) ( G)和 NO 的免疫荧光分析,仅显示神经元标记组的免疫反应性 βIII-tubulin,对内窝略为阳性;然而,突生蛋白1显示弱信号(H,I) (刻度柱 = 100 μm 和 50 μm)。请点击此处查看此图的较大版本。 

Figure 2
图 2:坏死球和不成熟的NO的插图。当神经球(A)和 NO (B) 在井中过多或过大 (C) (刻度柱 = 10 μm) 时,它们可能会发生坏死。(D) 一名感染番茄的 GIC 帮助跟踪肿瘤细胞入侵在 NO、 刻度条、 10 μm. 未成熟的 NO 与神经管 (E) 和没有神经管 (F ) (刻度棒 = 50 μm) 的示例。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:DA神经有机体生成标准化协议 电生理和形态分析。(A) 用于生成 DA 神经器官的标准化协议.(B) DA神经有机体的免疫荧光分析;TH免疫反应细胞共同表达Nurr1,一个中脑特异性标记(刻度棒 = 50 μm)。数据表示为平均值 = SEM (n = 3)。(C) 图形表示由 qRT-PCR 评估的 TH 和 Nurr1 基因表达的动力学。(D) 代表HPLC:多巴胺峰(箭头)由HPLC从DA神经有机物裂管中检测到。(E) 使用 MEA 平台记录的原始数据示例。每个尖峰由垂直线(时间戳)显示,而其余跟踪为噪声。(F) 表示沉积在MEA上的神经球的图片.(G) 从原始数据中检测到的典型尖峰(蓝色和红色曲线)的叠加。黑色粗体曲线表示相应红色曲线的平均值。(H) 栅格图显示与检测到的每个尖峰关联的时间戳。不同的颜色突出显示不同的电极。请点击此处查看此图的较大版本。

基因 福沃德 反向
努尔1 GGCTGAGCCTTGT 格加格格特格·GCAATAACA
TH GCACCCGCGCTCT CCCGAACTCCACCGGAA
EEF1 AGAAAATAACCCACAG 海合会加特加特卡加塔
加普德 GCACAAAAGAGAGAGAACC 阿格加加加特格格格格格格格格格格格

表 1:此协议中使用的引性。

Discussion

该协议最重要的方面之一包括维持hESC多能性在细胞培养和密切监测球体和神经器官形态。hESCs非常敏感,每次操作都可能导致早期不受控制的分化以及细胞死亡。为了提高实验的可重复性,避免异常型骨型事件的发生,建议在验证其染色体稳定性后,在最低通道下冷冻保存几批hESCs。此外,建议为每个实验解冻一个新的小瓶,并检查细胞每天的行为。如果球体折射率较低,尺寸异常较大,则它们可能会开始聚集和死亡。

该系统的一个改进是灌注或实现血管化系统(通过添加内皮细胞或在3D流体微芯片内)12,13。然而,控制神经有机体的厚度(±300 μm)可以有效地被动灌注氧气和营养,并防止坏死。另一个改进是引入免疫细胞(微胶质)。考虑到这些限制,神经器官加上GIC系统可能是一个相关的工具,有几个原因。首先,该系统允许药物筛选,以监测治疗化合物如何影响器官或肿瘤细胞。其次,可以研究细胞与细胞之间的相互作用,可以可视化和探索个体和集体入侵背后的微环境决定因素5、6、13。

在帕金森病的背景下,在DA神经元中富集的神经有机体可以代表一个相关而准确的3D模型来研究疾病的发展。在以前的研究中,帕金森氏症患者衍生的诱导多能干细胞分化为DA神经元已被用来研究受影响的神经元亚型。值得注意的是,一些与疾病有关的表型,如β-核糖核酸的积累和对氧化应激的敏感性已经观察到14,15。此外,神经器官可用作筛选治疗分子的工具。然而,应该建立具体和相关的读出,以评估DA神经元的生存和功能,如多巴胺生产和电生理活动。总之,该协议提供了两种标准化和准确的基于干细胞的方法来生成神经器官。

Disclosures

作者声明没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

作者感谢癌症协会(瑞士日内瓦)、ISREC基金会(瑞士洛桑)和克莱顿研究基金会(美国得克萨斯州休斯敦)的财政支持。此外,作者感谢HES-HO和怀斯中心的财政支持。我们感谢克劳斯实验室的有益讨论和支持,并感谢Halah Kutaish博士的校对。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plate (6-well plate) Falcon / Corning 07-201-588
ABI Prism 7900 HT detection system  (Real-Time PCR detection systems) Applied Biosystems Discontinued
Aggrewell 400 (Microwell culture plates ) StemCell Technologies 34421
Amplifier (W2100-HS32)  (Amplifier) Multi Channel Systems
Anti-EGFR (phospho Y1101) antibody Abcam ab76195 1/100 dilution
Anti-GFAP Antibody Dako  Z334  1/1000 dilution
Anti-Nestin, Human Antibody Millipore  ABD69  1/400 dilution
Anti-Synapsin I Antibody Chemicon  AB1543P  1/500 dilution
B27 supplements (B27) Life Technologies / Invitrogen 1238 For both protocol, stock solution 100x, final solution 1x
Brain-derived neurotrophic factor  (BDNF) Cell Guidance GFH1-2 For both protocol,  stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL
CHIR-99021 (GSK-3β inhibitor ) Axon Medchem ct99021 For Dopaminergic protocol,  stock solution 7.5 mM in DMSO, final solution 3 µM
Compound E a γ–secretase inhibitor (γ–secretase inhibitor) Calbiochem CAS 209986-17-4 For both protocol (gamma-secretase inhibitor XXI),  stock solution 5 mM in DMSO, final solution 1 µM
Coulochem III  (Coulometric detector parameters) Thermo scientific
Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP) Sigma D0627 For Dopaminergic protocol,  stock solution 0.5 M in DMSO, final solution 0.5 mM
Dimethyl Sulfoxide Pure (DMSO) Sigma-Aldrich C6164 Compounds solvent, ready to use
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 12491-015 For cell culture, ready to use
Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12) Gibco 11320033 For cell culture, ready to use
EDTA 0.1 mM (EDTA) Life Technologies AM9912 For cell culture, ready to use
Epidermal Growth Factor (EGF) Gibco PHG0313 For GIC culture,  stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL
Fibroblast Growth Factor 20 (FGF20) Peprotech 100-41 For Dopaminergic protocol,  stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 5 ng/mL
fibroblast growth factor 8  (FGF8) Peprotech GFH176-5 For Dopaminergic protocol,  stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL
Fibroblast growth factor-basic (bFGF) Gibco PHG0024 For GIC culture,  stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL
G5 supplements (G5) Invitrogen 17503012 For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x
Glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) Cell Guidance GFH2-2 For both protocol,  stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL
Hydrophilic polytetrafluoroethylene  membrane (PTFE membrane) BioCell-Interface Discontinued
LDN-193189 (BMP inhibitor) Axon Medchem /Stemgen 04-0072-02 /1509 Dual/Smad,  stock solution 5 mM in DMSO, final solution 0.5 µM
L-glutamine (L-glutamine) Gibco 25030081 L-Glutamine (200 mM), stock solution 200 mM, final solution 2 mM
Matrigel (extracellular matrix) BD Biosciences 354277 hESC-qualified Matrix, stock solution 18-22 mg/mL, final solution 180-220 µg/mL
Millicell-CM Culture plate insert  (0.4 µm) (Culture plate insert) Millipore PICM03050
Monoclonal Anti-β-Tubulin III antibody Sigma  T8660  1/1000 dilution
MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital shaker) Major Science MS-NRC-30
N2 supplements (N2) Invitrogen 17502-048 For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x
Nanodrop (Nanodrop) Thermo Fisher Scientific Discontinued
Neurobasal (Neurobasal) Life Technologies / Gibco 21103049 Maintenance and maturation embryonic neuronal cell populations , ready to use
Non-Essential Amino Acids  (NEAA) Gibco 11140 Non-essential Amino Acids 100X, stock solution 100x, final solution 1x
Nurr1 Antibody (M-196) Santa Cruz Sc-5568 1/100 dilution
Nutristem  (hESC medium ) Biological Industries 05-100-1A Stem cell media, ready to use
Penicilin / Streptomycin  (Penicilin / Streptomycin ) Life Technologies / Gibco 15140122 For cell culture, stock solution 5 mg/mL, final solution 50 µg/mL 
Perchloric acid 0.1N (HCLO4) Merck 100519 For HPLC, ready to use
Phosphate Buffered Saline without Ca2+/Mg2+  (PBS without Ca2+/Mg2+ ) Life Technologies 14190250 For cell culture, ready to use
PrimeScript RT-PCR Kit (Reverse transcription kit) Takara RR014A
Purmorphamin (smoothened agonist) Calbiochem SML0868 For Dopaminergic protocol,  stock solution 10 mM in DMSO, final solution 2 µM
Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK) Abcam Biochemicals ab120129-1 Rock Inhibitor,  stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM
RNeasy mini kit (RNA extraction kit ) Qiagen 74104
SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal inhibitor ) Ascent Asc- 163 Dual-Smad,  stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM
Sonic Hedgehog (SHH) Cell Guidance GFH168-5 For Dopaminergic protocol,  stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL
StemPro Accutase (hESC enzymatic solution) Gibco A11105-01 hESC enzymatic solution, ready to use
Symmetry C-18,5 mm (4.6 150mm2)  (Reversed-phase column) Waters Corporation
T150 flask (T150 flask) Falcon 08-772-1F
TH Antibody (F-11) Santa Cruz Sc-25269 1/200 dilution
Transforming Growth Factors beta 3 (TGFβ3) Cell Guidance GFH109-2 For Dopaminergic protocol,  stock solution 100 µg/mL in pure ethanol , final solution 1 ng/mL
Trichostatine A (inhibitor of histone deacetylase ) Sigma T8552 For Dopaminergic protocol,  stock solution 100 µM in DMSO, final solution 20 nM
TrypLE (recombinant enzymatic solution) Invitrogen 12604021 recombinant enzymatic solution, ready to use
Trypsin 0.25% (enzymatic solution) Life Technologies 15050065 enzymatic solution, ready to use
W2100, Multi Channel Systems (Data acquisition system ) WAT045905
X-vivo (serum free medium) Lonza BE04-743Q serum free medium, ready to use

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References

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研究脑癌和神经退行性疾病的人类神经器官
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Cosset, E., Locatelli, M., Marteyn, A., Lescuyer, P., Dall Antonia, F., Mor, F. M., Preynat-Seauve, O., Stoppini, L., Tieng, V. Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases. J. Vis. Exp. (148), e59682, doi:10.3791/59682 (2019).More

Cosset, E., Locatelli, M., Marteyn, A., Lescuyer, P., Dall Antonia, F., Mor, F. M., Preynat-Seauve, O., Stoppini, L., Tieng, V. Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases. J. Vis. Exp. (148), e59682, doi:10.3791/59682 (2019).

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