Summary
يصف هذا التقرير الطرق الشاملة لإعداد أقسام شبكية العين المجمدة للكيمياء المناعية (IHC). وتشمل الأساليب الموصوفة تشريح كوب العين الخلفي، تثبيت البارافورمالديهايد، وتضمينها في درجة الحرارة القطع الأمثل (OCT) وسائل الإعلام واتجاه الأنسجة، وتقسيم ومناعة.
Abstract
يعد إعداد أقسام عين الفأر عالية الجودة للكيمياء المناعية (IHC) أمرًا بالغ الأهمية لتقييم بنية شبكية العين ووظيفتها وتحديد الآليات الكامنة وراء أمراض الشبكية. الحفاظ على السلامة الهيكلية في جميع أنحاء إعداد الأنسجة أمر حيوي للحصول على بيانات IHC الشبكية القابلة للاستنساخ ولكن يمكن أن يكون تحديا بسبب هشاشة وتعقيد الهندسة الشبكية السيتوالية. المثبتات قوية مثل 10% formalin أو محلول Bouin الحفاظ على الأمثل بنية الشبكية, أنها غالباً ما تعوق تحليل IHC عن طريق تعزيز الفلورسنت الخلفية و / أو تقليل التفاعلات الأجسام المضادة-epitope, عملية تعرف باسم تجسيد اخفاء. المثبتات أكثر اعتدالا، من ناحية أخرى، مثل 4٪ بارافورمالديهايد، ويقلل من الفلورسنت الخلفية ومثال اخفاء، يجب استخدام تقنيات التشريح الدقيق للحفاظ على بنية الشبكية. في هذه المقالة، نقدم طريقة شاملة لإعداد أكواب خلفية العين الماوس لIHC التي هي كافية للحفاظ على معظم التفاعلات الأجسام المضادة-الشبه دون فقدان السلامة الهيكلية الشبكية. نحن تشمل IHC تمثيلية مع الأجسام المضادة لمختلف علامات نوع الخلية الشبكية لتوضيح الحفاظ على الأنسجة والتوجه في ظل الظروف المثلى ودون الأمثل. هدفنا هو تحسين الدراسات IHC من شبكية العين من خلال توفير بروتوكول كامل من تشريح الكأس الخلفي العين يالأيه.
Introduction
الكيمياء المناعية (IHC) هي تقنية قوية لتوطين بروتينات محددة والهياكل الخلوية في الأنسجة في الموقع1،2،3. طرق التثبيت غير المناسبة وتقسيم دون الأمثل من الأنسجة المعقدة يمكن أن تعطل بنية الأنسجة، وتوليد تلطيخ الخلفية العالية أو يقلل من التفاعلات الأجسام المضادة- الشبه، مما يؤدي إلى تلطيخ القطع الأثرية وما يترتب على ذلك من سوء تفسير بيانات IHC4. كما شبكية العين الفقارية هو جهاز عصبي معقد ومنظم للغاية تتألف من طبقات من مستقبلات ضوئية مترابطة، interneurons والخلايا العقدية، فهي هشة جدا ويمكن أن تتعطل بسهولة أثناء التشريح والقسم. وهناك بروتوكول مفصل وموحد ومصدق عليه من تشريح العين الماوس والتوجه إلى المناعية سوف تساعد على الحد بشكل كبير من التحف IHC، وبالتالي، زيادة موثوقية النتائج والسماح لبيانات مقارنة أكثر دقة تحليل.
هناك العديد من البروتوكولات لإعداد الأنسجة لIHC، ومع ذلك، ليست كلها مناسبة للأنسجة الشبكية. المثبتات قوية مثل 10٪ الرسمية أو محلول Bouin للحفاظ على بنية الشبكية خلال تشريح وتقسيم5. لسوء الحظ، المثبتات قوية غالبا ما يؤدي إلى الفلورسنت الخلفية المحسنة وتجسد اخفاء بسبب التعديل الكيميائي لepitopes6. من ناحية أخرى، يمكن للمثبتات الأكثر اعتدالا، مثل 4% بارافورمالديهايد (PFA) تخفيف بعض هذه القطع الأثرية ولكن تتطلب تشريح دقيق وتقسيم للحفاظ على بنية شبكية العين الأمثل. PFA يخترق الأنسجة بسرعة، ولكن عبر الروابط البروتينات ببطء شديد، والحد من خطر اخفاء مثال. منذ وقت قصير PFA الحضانة هو تثبيت معتدل نسبيا، والأنسجة غالبا ما تتطلب تجميد سريع للحفاظ على المستضدات. من المهم تجنب تشكيل الكريستال الجليدي أثناء تجميد الأنسجة لأنها تشوه وتضر بسلامة الخلايا والأنسجة7.
هنا نحن نوصف بروتوكولات مفصلة وموحدة للتشريح، والتثبيت، والحماية من البرد من الكؤوس الخلفية العين الماوس التي تسفر عن بيانات IHC متسقة وموثوق بها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم تنفيذ جميع الأساليب الموصوفة هنا وفقا ً صارماً للتوصيات الواردة في دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي قدمها معهد الموارد الحيوانية المختبرية، وقد تمت الموافقة عليها من قبل معهد لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للرعاية الحيوانية في جامعة بنسلفانيا.
جميع الأدوات والمعدات للأساليب مبينة في الشكل 1 ومدرجة في جدولالمواد.
1 . إزالة الكُمَّة بالعين بالماوس، وتشريح كوب العين، وتضمينها
- الإنقى بالفئران بثانيأكسيد الكربون (CO 2) متبوعاً إما بقطع الرأس (الفئران P0 - P11 بعد الولادة) أو خلع عنق الرحم (الفئران البالغة P11). بالنسبة للفئران P0-P14، يتم تغطية العينين بالجلد. تأكد من إزالة الجلد قبل الخطوات اللاحقة.
- قم بوضع علامة على الجزء الزمني للعين (الشكل2A)بحرق القرنية قليلاً باستخدام الكي الذيل. تجنب حرق ثقب في القرنية عن طريق لمس القرنية بخفة جدا ً ولا لأكثر من ثانية مع الكي.
- على الفور عيون الماوس enucleate باستخدام منحني ة دومونت #5/45 ملقط. احتضان لمدة 15 دقيقة في أنبوب cryotube 1.5 مل مع 1 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) على الجليد.
- بعد 15 دقيقة في 4٪ PFA، نقل العين الثابتة باستخدام ملقط منحني ة دومونت #5/45 إلى تعديل 35 ملم طبق تشريح (انظر جدول المواد والشكل 1C)مليئة PBS ومكان تحت المجهر تشريح.
- إجراء شق صغير في علامة الحرق، عموديا على وفوق مباشرة (حدود القرنية) باستخدام السكين الصغيرة.
- أدخل المقص المنحني في الشق ونفذ قطعاً من القرنية بعد أطرافه (الشكل2B).
- إزالة القرنية واستخراج العدسة مع ملقط #5 دومونت رقيقة، (الشكل 2B)ورفعه بدقة بعيدا عن الجزء الخلفي من العين. الجسم الزجاجي، هلام واضح أن يملأ الفضاء بين العدسة وشبكية العين، وسوف يخرج مع العدسة (الشكل2B)وشبكية العين سوف تكون مرئية كسطح أبيض يغطي داخل كأس العين الخلفي. التأكد من عدم وجود أي ضرر واضح على الشبكية، مثل الثقوب أو الدموع (الشكل2C).
- اغسل يُغسل أكواب العين مرتين في 1 مل من PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- كريوحماية أكواب العين عن طريق التميّز بها في محلول السكروز 15% في PBS بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية حتى يغرق كوب العين
- نقل أكواب العين إلى 30٪ السكروز في PBS لمدة 2-3 ح حتى يغرق كوب العين.
- تضمين أكواب العين في OCT في 10 × 10 مم cryomolds (الشكل 3A). باستخدام المجهر تشريح، وتوجيه العين في cryomold على طول محورها البطيني (الشكل2D، الشكل 3A)عن طريق تدوير العين حتى علامة حرق على رأس، والعصب البصري على اليسار والجزء قطع التدريجي من القالب يواجه الحق ( الشكل 2دال). الحرص على تجنب فقاعات بالقرب من الأنسجة.
ملاحظة: لمعالجة كوب العين، استخدم مسبار تيتانيوم مصنوع من سلك تيتانيوم موصول بطرف ماصة. - لتجميد النسيج الشبكي، تزج cryomold لمدة 5 دقيقة على الأقل في كوب معدني يحتوي على isopentane ووضع كوب في النيتروجين السائل أو الثلج الجاف / 100٪ حمام الإيثانول (تصل إلى 1/3 من ارتفاع الكأس المعدنية).
ملاحظة: يجب أن تكون مغمورة في cryomold isopentane إلى أكبر من نصف ارتفاعه ولكن ليس من الضروري أن تكون مغمورة تماما. - إزالة كتلة المجمدة والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم.
- يخزن في -80 درجة مئوية.
- وضع علامة على كتلة المجمدة باستخدام قلم أو sharpie لتسجيل اتجاه كتلة (الشكل 3B).
2 . القسمباستخدام كريوستات
- بعد ضبط درجة حرارة كريوستات (بين -20 و -25 درجة مئوية)، والسماح للقوالب التي تحتوي على أكواب العين جزءا لا يتجزأ لتوازن إلى درجة حرارة كريوستات لمدة 1 ساعة.
- تثبيت كتلة مع التوجه دورسو-البطيني (الشكل3C)وقطع 10 المقاطع التسلسلية سميكة ميكروم. ضع أقسام الشبكية بعناية على شرائح المجهر المشروحة وذات الأرقام.
- تخزين الشرائح في مربعات الشرائح في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية حتى إجراءات IHC.
3 . الإنعكاين المناعي باستخدام حامل الشرائح
ملاحظة: نظام حامل الشرائح (مثل سيكوينزا) يحمل الشرائح المجهر الزجاجي مع لوحة غطاء، وخلق فجوة الشعرية 100 μL ~ بين الشريحة ولوحة.
- قم بذوبان المقاطع المبردة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 2 ساعة إلى 4 ح للسماح لهم بالجفاف وإرفاق الشرائح المجهر.
ملاحظة: من الممكن أيضا ً تجفيفها عند درجة حرارة 30-37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة. - ضع الشرائح في حامل الشرائح واغسل أقسام الشبكية مرتين في 100-200 ميكرولتر PBS لمدة 2 دقيقة.
- Permeabilize أقسام الشبكية عن طريق احتضان لهم في 0.25٪ تريتون-X / 0.05٪ NaN3في PBS لمدة 5 دقيقة في RT.
- إضافة 100 μL من حظر الحل إلى الشرائح.
- إضافة 100 μL من الأجسام المضادة الأولية المخفف في حظر الحل إلى الشرائح.
- تحضن أقسام الشبكية بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: خلال هذا الوقت، تغطية "حامل الشرائح" لتجنب إزالة المقاطع. - غسل أقسام الشبكية 3 مرات، كل لمدة 15 دقيقة، وذلك باستخدام 200 ميكرولتر PBS.
ملاحظة: إضافة 0.001- 0.002٪ تريتون-X100 إلى PBS (PBS-T) تسمح غسل أكثر صرامة ولكن يمكن أن تعطل بعض الأغشية والهياكل الخلوية. - احتضان أقسام الشبكية في الأجسام المضادة الثانوية التي تحمل علامة الفلورسنت لمدة ساعة في RT. من الآن فصاعداً الحماية من الضوء
- اغسل أقسام الشبكية 3 مرات، كل منها لمدة 15 دقيقة.
- احتضان أقسام الشبكية في RT لمدة 5 دقائق مع علامة نووية مثل Hoechst 33342 أو حل DAPI.
- اغسل يُغسل أجزاء شبكية العين 1 مرة لمدة 15 دقيقة.
- ضع غطاء على رأس منشفة ورقية على مقعد المختبر.
- إضافة 2 قطرات من وسائل الإعلام المضادة للتلاشي تصاعد إلى وسط coverslip.
- أدر الشريحة لتواجه قسم التبريد الشبكي لأسفل.
- قم بتركيب الغطاء ببطء، بزاوية 45 درجة تقريبًا، قم بقلب الشريحة على الوسائط المتصاعدة.
ملاحظة: تجنب تشكيل فقاعات كما يمكنك خفض الشريحة في مكان. - تطبيق الضغط حتى، وذلك باستخدام كتاب ثقيل أو الكتالوج (انظر أدناه)، إلى مزيج الشرائح coverslip للقضاء على وسائل الإعلام تصاعد الزائدة.
ملاحظة: لضمان الاتساق في إعداد العينة، استخدم دائماً نفس الكائن (أي نفس الكتاب أو الكتالوج) لتطبيق الضغط حتى على coverslip أثناء تصاعد الشريحة. - حافظ على الشقة واسمح للتصلب بين عشية وضحاها في RT في الظلام. الشرائح تخزين شقة في 4 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
- صورة عبر حقل واسع أو المجهر الفلورسنتالبؤري (الشكل 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتوضيح كيفية هذه البروتوكولات، وضمان الحفاظ على الشبكية الأمثل لIHC، ونحن التحقيق أقسام الشبكية من الفئران P28 WT (C57BL/6N) مع الأجسام المضادة لرودوبسين (علامة مستقبلات ضوئية) 8، حمض الجلوتاميك decarboxylase 65 (Gad65، خلية amacrine علامة)9، غلوتامين سينثتاز (GS، علامة خلية مولر)10،والكالبيندين (علامة خلية أفقية)11 (الشكل4). IHC تشير إلى أن بروتوكولاتنا تنتج باستمرار عالية الجودة وأقسام شبكية العين المحفوظة جيدا. وتجدر الإشارة إلى أن الأجزاء الداخلية والخارجية الغنية بالرهوبسين تظل رأسية وسليمة مع القليل من الانفصال أو عدم الفصل عن الظهارة المصطبغة الشبكية (RPE) (الشكل4A). بالإضافة إلى ذلك، تبقى خلايا مولر محفوظة بشكل جيد مع عمليات الخلايا الخلوية المتناسقة والسيتوبلازما التي تمتد من طبقة الخلايا العقدية (GCL) إلى الطبقة النووية الخارجية (ONL) (الشكل4B).
كما أن الخلايا المتداخلة، مثل خلايا الأماكرين الإيجابية غاد65، تظل أيضاً مطبقة بشكل صحيح داخل طبقة الـ INL وطبقة البليكيفورم الداخلية (IPL) (الشكل 4B)في حين أن الخلايا الأفقية المحددة جيداً قابلة للكشف في INL وplexiform الخارجي الحدود (OPL)(الشكل 4C). بشكل جماعي، تثبت هذه البيانات أن أسلوبنا يحافظ على سلامة خلايا الشبكية والأنسجة، من مستقبلات ضوئية إلى خلايا العقدة
لتسهيل تقسيم عرضية، من المهم أن توجه بدقة كوب البصرية في العفن كريو قبل تجميد. يمكن أن تسبب شبكية العين الموجهة بشكل خاطئ، وسوء تقنية تقسيم أو تقسيم مع السكاكين ميكروتومي مملة أو التالفة التحف مثل دموع أنسجة الشبكية، والتشوهات، والتشريد الخلوي، كما هو الحال في الشكل 4. تظهر أمثلة على القطع الأثرية للقسم في الشكل 4D-F. في الشكل 4D تقسيم الفقراء والمحاذاة يؤدي إلى تشويه الشرائح الداخلية والخارجية مستقبلات ضوئية (الشكل4D)ودموع الأنسجة الصغيرة (الشكل4E،والسهم). في مثال آخر، يؤدي ضعف اتجاه الأنسجة قبل القسم إلى محاذاة دون المستوى الأمثل من خلية مولر سوما وعمليات السيتوبلازمي الشكل 4E. ويبين الشكل 4واو كيف أن ضعف التقسيم الذي يحتمل أن يسببه سكين ميكروتومي ممل تسبب في تشويه الخلايا الأفقية من الـ OPL إلى GCL. وبالتالي، يجب إيلاء اهتمام دقيق لتنفيذ كل خطوة من الخطوات المبينة في البروتوكول لضمان أعلى جودة وإمكانية استنساخ بيانات IHC.
الشكل 1 أدوات لتشريح العين الماوس، وتضمين، وIHC. (أ) الكيّاز؛ (ب) أدوات التشريح من اليسار إلى اليمين: ملقط دومونت #5/45 المنحني، مقص منحني، ودومون #5 ملقط رقيقة؛ (ج) طبق تشريح 35 مم (نقاط السهم إلى غرفة تشريح)؛ (د) تشريح المجهر; (E) الأدوات المجمدة من اليسار إلى اليمين: برودة معزول، كوب من الفولاذ المقاوم للصدأ للحمام isopentane، غير القابل للصدأ السائل الصلب N2 حمام؛ (F) مسبار التيتانيوم; (ز) حامل الشرائح وغطاء لIHC. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 الماوس العين كأس التوجه والوصف. (أ) موقع علامة الحرق المؤقت (السهم الأحمر) لتسهيل اتجاه العين (دورسو = D، البطين = V، الصدغي = T، الأنف = N). (ب) مخططية لتشريح العين الماوس. يتم إجراء شق صغير عند علامة الحرق، عمودي في القرنية وفوق أطرافه مباشرة باستخدام مشرط ناعم (سكين دقيق). قطع حول القرنية لفصل الجزء الأمامي والخلفي من العين. (ج) كوب العين مع شبكية العين سليمة. (د) اتجاه دورسو-البطيني للعين الماوس مع العصب البصري (ON)، عدسة (L)، القرنية (C) والحاقد (OS). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 الماوس العين التضمين.: (أ) دورسو-البطينية الموجهة الفئران العين كوب في cryomold مليئة OCT، (B) المجمدة الماوس كأس الشبكية في cryomold مشروحة. (ج) كريوستات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 كيمياء مناعية شبكية العين.: (A-C) نوعية جيدة و (D-F) أقسام شبكية العين ذات نوعية رديئة من P28 WT وصفت مع الأجسام المضادة إلى رهودوبسين (A, C) amacrine علامة GAD65 (B, E) ومولر خلية علامة الجلوتامين سينثتاز (GS; B، E)، وعلامة الخلية الأفقية كالبيندين (C، F). تشير الأسهم البيضاء إلى دموع الأنسجة وتشويه الأنسجة الشاذة. شريط مقياس، 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إن ّ تَتَحَيَمُل شبكية العين بالفأرة عملية دقيقة بسبب صغر حجم وشكل عيون الفأر وهشاشة نسيج الشبكية. على الرغم من أن إجراء تشريح عالي الجودة هو مسألة ممارسة، وجود بروتوكول مفصل، وتوفير طرق فعالة ونصائح هو ضرورة للحصول على أقسام الشبكية وIHC. بالإضافة إلى البروتوكولات الموصوفة هنا، هناك العديد من النصائح التي تسمح لأقسام شبكية العين متسقة عالية الجودة التي هي مناسبة لIHC استنساخها.
قبل البدء بالتشريح، من المهم أن تكون مريحة ومريحة وتعيين إضاءة الغرفة للرؤية المثلى أثناء الميكروديفيس العين الماوس. للحفاظ على شكل كأس العين الماوس أثناء تشريح العين، نقترح إبقاء عيون مغمورة في PBS في العرف أدلى الشمع المغلفة أطباق التشريح. نقترح طلاء طبق تشريح 35mm مع ضوء وردي ملون الشمع الأسنان (الشكل1C). في الواقع، فإن اللون الوردي الفاتح من شمع الأسنان يوفر تباينا كافيا لرؤية هياكل العين بسهولة تحت نطاق تشريح، والانطباعات العين الحجم في الشمع، التي أدلى بها الضغط على قاعدة أنابيب microfuge في الشمع، والحفاظ على كوب العين في مكان بينما السماح بالتناوب المناسب للأدوات حول كأس العين أثناء التشريح. بالإضافة إلى ذلك، من المهم إزالة أكبر قدر ممكن من السوائل الزجاجية من كوب العين أثناء إزالة العدسة، حيث أن السائل الزجاجي المتبقي عرضة لتشكيل الأنسجة الضارة بلورات الجليد أثناء كتلة الأنسجة خطوة تجميد. نستخدم عادة ورقة نسيجية ونضعها على حدود كوب العين المنقطع، لإزالة جميع السوائل الزجاجية المتبقية بعناية عن طريق الشعرية دون إزعاج أنسجة الشبكية. في حالة مؤسفة حيث كمية صغيرة من السائل الزجاجي المتبقية لا تزال موجودة في كوب العين، يجب أن يتم تقسيم في -20 درجة مئوية للحد من التحول من الجسم الزجاجي في الجليد، وبالتالي الحفاظ على الحدة من شفرة وجودة المقطع .
كما أن لأساليب التثبيت والتضمين أثر كبير على نوعية الأقسام واللجنة الدولية للهك. على الرغم من أن الأجزاء الخالية من البارافين ذات الماشة الخالية من البارافين ذات الشكلين ية تعطي السلامة الهيكلية المثلى لأنسجة العين، فإن الماجينين يحتوي على الميثانول الذي يمكن أن يعزز الفلورية الخلفية. لتجنب هذه القطع الأثرية، نوصي باستخدام جديدة EM الصف بارافورمالدهيد (PFA) للحد من الخلفية وautofluorescence الناجمة عن الميثانول أو المؤكسدPFA4،5،6. نوصي بظروف التثبيت الخفيفة الموصوفة في بروتوكولنا لتحديد العين مع 4% بارافورمالديهايد لمدة 15 دقيقة على الجليد. بما أنّ [بفا] سريعا يخترق النسيج, غير أنّ [كروسّ-لينكس] بروتينات جدّا ببطء, أنّ شروط كاف أن يحفظ نزاهة شبكية بنية أثناء ال [تيسّكل] ويحفظ ال [أنتيجينيوجنيتي] من مستضدات شبكيّة عاديّة دون الحاجة إلى مستضدات طرق الاسترجاع4. إذا لم يتم الحفاظ على بنية شبكية العين بشكل جيد، يمكن زيادة مدة تثبيت PFA، ولكن من المهم أن ندرك أن الأنسجة الإفراط في تحديد المواقع سوف تعزز الفلورسنت الخلفية غير محددة ويمكن أن يؤدي إلى تجسيد اخفاء، في حين أن تحت التثبيت قد تعرض الأنسجة السلامة الهيكلية للأنسجة للخطر وتسبب فقدان بعض المستضدات المعرضة للتحلل البروتيوليك. منذ وقت قصير PFA حضانة هو تثبيت معتدل نسبيا، ونحن نوصي أيضا المفاجئة تجميد شبكية العين عن طريق غمس العين OCT جزءا لا يتجزأ، الواردة في cryomold (10 مم X 10 ملم X 5 ملم)، في حمام isopentane مغمورة في النيتروجين السائل. سوف الأنسجة تجميد المفاجئة الحفاظ على المستضدات، في حين أن محلول السكروز وOCT بمثابة واقية من البرد. هذا الأسلوب سوف يقلل من تشويه الأنسجة بسبب تشكيل بلورات الثلج، والتي يمكن أن تسبب ما يسمى نوع الجبن السويسري من تلف الأنسجة. لا ينبغي أن ينخفض cryomold مباشرة في النيتروجين السائل أو أنها ستبدأ في الغليان، وتشكيل حاجز بخار، وسوف تبطئ عملية التجميد، مما أدى إلى تثبيت غير متجانسة والحفاظ عليها. وعلاوة على ذلك، يمكن للأنسجة وOCT في اتصال مع النيتروجين السائل الكراك، مما يؤثر على سلامة العين7. لذلك، نوصي بغمس الكريومولد (10 مم × 10 مم × 5 مم) في ما لا يزيد عن 5 ملم من الإيأوبنتان العميق باستخدام كوب صغير من الفولاذ المقاوم للصدأ، وينخفض في كوب أكبر من الفولاذ المقاوم للصدأ (100 مم كحد أدنى) يحتوي على النيتروجين السائل. لتجنب التبخر السريع للنتروجين السائل أثناء إعداد عدة عينات، نحافظ على كلا الحمامين في مبرد معزول. تجدر الإشارة إلى أن الأنسجة الباردة في OCT ليست طريقة حفظ طويلة الأجل، وذلك بسبب تشكيل بلورات الثلج في الأنسجة مع مرور الوقت والتي يمكن أن تغير المورفولوجيا تحت الخلية و / أو تشويه بعض المستضدات. وبالتالي، ينبغي تخزين كتل الأنسجة والأجزاء المجمدة عند -20 درجة مئوية للتخزين القصير الأجل وللتخزين الطويل الأجل -80 درجة مئوية.
الشبكية الثديية هي عضو غير متماثل مع توزيع مكاني محدد للخلايا عبر المنفوين الصدغي والظهروي. على سبيل المثال، يتم ترتيب المخاريط M- و S-opsin في تدرج دورسو-البطيني 12 محددة . لذلك، فمن الضروري لضمان التوجه السليم للعين طوال إعداد الأنسجة وتقسيمها من أجل إجراء IHC مقارنة. نحن نستخدم الكي لوضع علامة مرجعية على العين قبل تشريح (الشكل 2A, D) حتى نتمكن من توجيه كأس العين على طول محور الظهرية والبطني خلال مرحلة التضمين ، وبالتالي الحصول على المقاطع مستعرضة تماما. نضع علامة الحرق على الجزء الصدغي من العين، عن طريق لمس القرنية لثانية واحدة مع الكي. وهذا سوف يسمح لحرق طفيف القرنية مع تجنب ثقب ثقب في ذلك. خلال تشريح كأس العين، نقوم بعمل شق صغير، عند علامة الحرق، عمودي على حدود القرنية، باستخدام السكين الصغيرة (الشكل2B). لتسهيل التوجه دورسو-البطيني للكتلة وتقليل تعديلات الاتجاه أثناء تقسيم، نقترح توجيه كأس العين الخلفي في كريومولد، مع علامة حرق التي تواجه الجزء السفلي من كريومولد وفتح القرنية تماما موازية من الجانب الأيمن في cryomold (الشكل 3A، B). سيتم تركيب كتلة المجمدة مع الجزء السفلي من كتلة تواجه نحو شفرة في كريوستات، وكوب العين عمودي على شفرة، في اتجاه دورسو-البطيني (الشكل3ج).
تبدأ IHC الشبكية الموثوقة بتشريح اتّلِب الأمثل والتكيّف والقابل للاستنساخ ومعالجة الأنسجة. الطريقة المبينة هنا تحافظ على النحو الأمثل بنية الشبكية والنزاهة مع التقليل من الفلور التلقائي وتجسيد اخفاء التي يمكن أن تضر IHC الفلورسنت. سوف يضمن اتباع هذا البروتوكول أن يكون لديك بيانات عالية الجودة قابلة للتكرار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا إفصاحات.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من خلال أموال من المعاهد القومية للصحة (RO1-GMO97327) ومؤسسة البحوث الجامعية (UPenn). نشكر سفيتلانا سافينا بشكل خاص على مساعدتها في تطوير بروتوكول الكيمياء المناعية، وغوردون روثل (جامعة بنسلفانيا) وجامعة بن فيت للتصوير الأساسي للمساعدة في الفحص المجهري وليزلي كينغ، دكتوراه للقراءة الحرجة لهذه المخطوطة .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | For liquid nitrogen (Figure 1E) |
| Aluminum foil | |||
| Cauterizer | Bovie | #AA01 | To mark eye orientation (Figure 1A) |
| Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A) |
| Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | #15002-08 | To circumferentially cut the cornea (Figure 1B) |
| Dental wax-coated 35mm dissection dish | For eye cup dissection (Figure 1C) | ||
| Dissecting microscope | Leica, Houston, USA | MZ12.5 High-performance stereomicroscope | |
| Micro Knives - Plastic Handle | Fine Science Tools | #10315-12 | To make a small incision at the burn mark (Figure 1A) |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | #72660 | For coating dissection dish |
| Slide Rack and Coverplate | Ted Pella | #36107 | For retinal IHC (Figure 1G) |
| Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | For isopentane bath (Figure 1E) |
| Styrofoam box | For insulated cooler | ||
| Thin forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Electron Miscroscopy Sciences | #62534-10 | Mold for OCT embedding |
| Buffers and Reagents | Company | Catalog Number | Comments |
| Blocking solution | 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer. | ||
| Gelvatol (anti-fading mounting media) | Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops). Store in amber drop bottle at 4°C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh at 1 ug/mL (1x) |
| Isopentane, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| Paraformaldehyde (PFA) in PBS | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. |
| Permeabilization solution | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3. Prepare fresh. | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. Prepared from 10x stock |
| Sucrose solutions | Fisher Scientific | #S-5-500 | Dissolve the appropriate amount of sucrose in 37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. |
| Tissue-Tek OCT-compound | Sakura | #4583 | |
| Antibodies | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | To label horinzotal cells |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | To label GABAergic amacrine cells |
| anti-GS | BD Transduction | 610517 | To label Müller cells |
| anti-rhodopsin | Millipore | MAB5316 | To label rods |
References
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Hartz, P. H. Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology. Stain Technology. 20, 113 (1945).
- Benerini Gatta, L., et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology. European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).
- Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).
- Imai, H., et al. Molecular properties of rhodopsin and rod function. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).
- Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry. Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).
- Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).
- Nakhai, H., et al. Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina. Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
