Summary
本报告介绍了制备冷冻小鼠视网膜部分用于免疫组织化学(IHC)的综合方法。 所述方法包括眼部后杯的解剖、甲醛固定、嵌入最佳切割温度(OCT)介质和组织定向、切片和免疫染色。
Abstract
为免疫组织化学 (IHC) 制备高质量的小鼠眼部部分对于评估视网膜结构和功能以及确定视网膜疾病背后的机制至关重要。在整个组织制备过程中保持结构完整性对于获得可重复的视网膜 IHC 数据至关重要,但由于视网膜细胞结构的脆弱性和复杂性,这些数据可能具有挑战性。强固定剂,如10%形式蛋白或布恩的溶液,以最佳方式保持视网膜结构,它们通常通过增强背景荧光和/或减少抗体-表位相互作用(称为表位掩蔽的过程)来阻碍IHC分析。另一方面,较温和的固定剂,如4%的甲醛,减少背景荧光和表位遮蔽,必须采用细致的解剖技术来保持视网膜结构。在本文中,我们将介绍一种为 IHC 制备小鼠眼后杯的综合方法,该方法足以保留大多数抗体-表皮相互作用,而不会损失视网膜结构完整性。我们包括具有代表性的IHC与抗体的各种视网膜细胞类型标记,以说明组织保存和方向在最佳和次优条件下。我们的目标是通过提供从眼后杯解剖到IHC的完整方案来优化视网膜的IHC研究。
Introduction
免疫组织化学(IHC)是一种强大的技术,用于在原位1、2、3定位组织的特定蛋白质和细胞结构。不适当的固定方法和复杂组织的次优切片可能会破坏组织结构,产生高背景染色或减少抗体-表皮相互作用,导致染色伪影,进而造成对IHC 数据4.由于脊椎动物视网膜是一种复杂且高度组织的神经器官,由相互连接的光受体、内神经细胞和神经细胞层组成,因此非常脆弱,在解剖和切片过程中很容易被破坏。从小鼠眼部解剖和定向到免疫染色的详细、标准化和经过验证的协议将有助于显著减少 IHC 伪影,从而提高结果的可靠性,并允许获得更准确的比较数据分析。
IHC的组织制备有许多方案,但是,并非所有方案都适合视网膜组织。强固定剂,如10%正式或布因的解决方案保留视网膜结构在解剖和切片5。不幸的是,由于表位6的化学修饰,强固定剂往往导致增强的背景荧光和表位掩蔽。另一方面,温和的固定剂,如4%的甲醛(PFA)可以减轻其中一些伪影,但需要细致的解剖和切片,以保持最佳的视网膜结构。PFA 迅速穿透组织,但交叉链接蛋白质非常缓慢,降低了表位掩蔽的风险。由于短时间的PFA孵育是一种相对温和的固定,组织往往需要快速冷冻,以保持抗原。在组织冻结期间避免冰晶形成是很重要的,因为它们会扭曲和损害细胞和组织的完整性7。
在这里,我们描述了用于小鼠眼后杯解剖、固定和冷冻保护的详细和标准化协议,这些电池杯可生成一致可靠的 IHC 数据。
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Protocol
此处描述的所有方法都是严格按照国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》中的建议进行的,并经宾夕法尼亚大学动物护理和使用机构委员会。
方法的所有工具和设备如图1所示,并列在材料表中。
1 .小鼠眼联、眼杯解剖和嵌入
- 用二氧化碳(CO2)对小鼠实施安乐死,然后斩首(产后小鼠P0 - P11)或宫颈脱位(成人>P11小鼠)。对于P0-P14小鼠,眼睛被皮肤覆盖。确保在后续步骤之前取下皮肤。
- 用尾部烧灼剂轻微灼伤角膜,标记眼睛的时态部分(图2A)。避免在角膜上燃烧一个洞,轻轻触摸角膜,用烧灼器不超过一瞬间。
- 立即用弯曲的杜蒙特#5/45钳子将鼠标眼睛联结在一起。在1.5 mL冷冻管中孵育15分钟,在冰上的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中孵育1mL至4%的甲醛(PFA)。
- 在 4% PFA 中 15 分钟后,使用弯曲的钳子 Dumont #5/45 将固定眼转移到经过修改的 35 mm 解剖盘(参见材料表和图 1C)中填充 PBS 并置于解剖显微镜下。
- 在烧伤标记处做一个小切口,垂直于边缘(角膜边界)上方。
- 将弯曲的剪刀插入切口,并在边缘后对角膜进行圆周切割(图2B)。
- 取出角膜,用薄薄的杜蒙特#5钳子(图2B)取出角膜,并小心翼翼地将其从眼睛的后半部分提起。视网膜体,填充镜头和视网膜之间的空间的透明凝胶,将随着透镜(图2B)出现,视网膜将作为覆盖后眼杯内侧的白色表面可见。确保视网膜没有明显损伤,如孔洞或撕裂(图2C)。
- 在室温下,在 1 mL 的 PBS 中洗眼杯两次 10 分钟。
- 在 PBS 中,在 4°C 下过夜 15% 蔗糖溶液中,直到眼杯下沉,从而保护眼杯
- 将眼杯转移到 PBS 中的 30% 蔗糖 2-3 小时,直到眼杯下沉。
- 将眼杯嵌入 OCT 中,以 10 x 10 mm 的低温(图 3A)。使用解剖显微镜,通过旋转眼睛,直到烧伤标记位于顶部,视神经位于左侧,模具的切口部分朝右(右侧),将眼睛定向到低温中(图 2D,图 3A)图 2D。小心避免组织附近的气泡。
注:要操纵眼罩,请使用由连接到移液器尖端的钛线制成的钛探头。 - 要快速冷冻视网膜组织,将冷冻液浸泡在含有丙烯的金属烧杯中至少 5 分钟,并将烧杯放入液氮或干冰/100% 乙醇浴中(高达金属烧杯高度的 1/3)。
注:低温应浸入丙烯中,使其高度大于其高度的一半,但不必完全浸没。 - 取出冷冻块,将其包裹在铝箔中。
- 储存在-80°C。
- 使用笔或锐化标记冻结块以记录块的方向(图 3B)。
2 .使用低温分段
- 调整低温温度(-20至-25°C)后,让含有嵌入式眼杯的模具与低温温度平衡1小时。
- 安装带双体方向的块(图3C),并切割10μm厚的串行部分。小心地将视网膜部分放在带分号和编号的显微镜幻灯片上。
- 将幻灯片存放在 -20 °C 或 -80 °C 的滑动盒中,直到 IHC 程序。
3 .使用滑动机架进行荧光免疫染色
注: 滑动机架系统(例如,Sequenza)用盖板固定玻璃显微镜滑块,在滑轨和板之间形成 ±100 μL 毛细管间隙。
- 在室温 (RT) 下将冷冻部分解冻 2 小时至 4 小时,使其干燥并附着在显微镜玻片上。
注:也可在30-37°C干燥30分钟至1小时。 - 将幻灯片放在滑动架中,在 100-200 μL PBS 中清洗视网膜部分两次,2 分钟。
- 通过在 PBS 中孵育视网膜部分 0.25% Triton-X / 0.05% NaN 3,在 RT 中孵育 5 分钟,从而渗透视网膜部分。
- 向幻灯片添加 100 μL 的阻止溶液。
- 在阻滞溶液中加入100μL的原抗体,以阻隔溶液加入幻灯片。
- 在4°C下孵育视网膜部分过夜。
注: 在此期间,请盖上滑轨机架,以避免部分干燥。 - 使用 200 μL PBS 洗涤视网膜部分 3 次,每次 15 分钟。
注: 在 PBS (PBS-T) 中加入 0.001- 0.002% Triton-X100 允许更严格的洗涤,但可能会破坏某些膜和细胞结构。 - 在荧光标记的二级抗体中孵育视网膜部分1小时,在RT。从现在开始,保护免受光。
- 洗视网膜部分3次,每次15分钟。
- 使用热标(如 Hoechst 33342 或 DAPI 溶液)在 RT 孵育视网膜部分 5 分钟。
- 洗视网膜部分1次15分钟。
- 在实验室工作台上放置纸巾盖玻片。
- 将 2 滴防褪色安装介质添加到盖玻片的中心。
- 将滑轨翻过来,使视网膜低温部分朝下。
- 小心地以 [45°]角缓慢地将盖玻片安装到安装介质上。
注:在将幻灯片降至位时,请避免形成气泡。 - 使用重书或目录(见下文)对滑盖滑片组合施加均匀压力,以消除过多的安装介质。
注:为确保样品制备的一致性,始终使用相同的对象(即同一书籍或目录)在滑动安装过程中对盖玻片施加均匀压力。 - 保持平放,让在黑暗中在RT处硬化过夜。无限期地将幻灯片平放在 4°C 下。
- 通过宽场或共聚焦荧光显微镜成像(图4)。
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Representative Results
为了说明这些协议如何,确保IHC的最佳视网膜保存,我们用对红斑素(光受体标记物)8、谷氨酸酸脱碳酶65(Gad65,一种丙烯细胞)的抗体对P28 WT小鼠(C57BL/6N)的视网膜部分进行了调查标记)9, 谷氨酰胺合成酶 (GS, Müller 细胞标记)10,和钙化素 (水平细胞标记)11 (图 4)。IHC 表明我们的协议始终能产生高质量和保存完好的视网膜部分。值得注意的是,富含红素的内段和外段保持垂直和完整,与覆盖视网膜色素上皮(RPE)几乎没有分离(图4A)。此外,Müller 细胞保存完好,从结节细胞层 (GCL) 到外部核层 (ONL) 的细胞母体正确对齐和细胞质过程(图 4B)。
内侧体,如Gad65阳性阿马辛细胞,也保持在INL和内丛形式层(IPL)(图4 B)内,而定义良好的水平细胞在INL和外丛形式可检测到层 (OPL) 边框 (图 4C) 。总体而言,这些数据表明,我们的方法保留了视网膜细胞和组织的完整性,从光受体到结子细胞
为了便于横向切片,在冷冻前,在低温模具中精心定位光学杯非常重要。方向不当的视网膜、不良的切片技术或使用钝化或损坏的微管刀进行切片可能会导致视网膜组织撕裂、扭曲和细胞位移等伪影,如图4所示。截面工件的示例如图4D-F所示。在图 4D中,由于切片和对齐不良,会导致光感受器内段和外段失真(图 4D)和小组织撕裂(图 4E,箭头)。在另一个例子中,节前组织方向不良导致穆勒细胞索马和细胞质过程的次优排列图4E。图 4F显示了钝化微细胞刀可能导致水平细胞从 OPL 到 GCL 异常涂抹的不良切片。因此,必须精确注意协议中概述的每个步骤的执行,以确保 IHC 数据的最高质量和可重复性。
图1:用于小鼠眼睛解剖、嵌入和 IHC 的工具。(A) 烧土机;(B) 从左到右的解剖工具:杜蒙特#5/45弯曲钳子、弯曲剪刀和杜蒙特#5薄钳;(C) 35 毫米解剖盘(箭头指向解剖室);(D) 解剖显微镜;(E) 从左到右的冷冻工具:绝缘冷却器、不锈钢烧杯、露天浴、不锈钢液体N2浴; (F) 钛探头;(G) 用于 IHC 的滑动机架和盖板。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:鼠标眼杯方向和描述。(A) 时态烧伤标记位置(红色箭头),以方便眼睛定向(陀道 = D,腹腔 = V,时态 = T,鼻鸣 = N)。(B) 小鼠眼解剖的原理图。在烧伤标记处做一个小切口,垂直于角膜,正上方使用细手术刀(微型刀)。切角膜周围,以分离眼睛的前部和后部。(C) 具有完整视网膜的眼杯。(D) 用视神经(ON)、透镜(L)、角膜(C)眼向的眼向(OS)。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:鼠标眼嵌入。(A) 多索-文体定向小鼠眼杯中装满了OCT,(B)冷冻小鼠视网膜杯在带注的低温中。(C) 冷冻。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:小鼠视网膜免疫性化学。(A-C) P 28 WT 的优质和(D-F) 劣质视网膜部分标有对红斑素 (A、 C) 阿霉素标记 GAD65 (B、 E) 和 Müller 细胞标记谷氨酰胺合成酶 (GS;B、E)和水平细胞标记卡宾丁(C,F)。白色箭头指向组织撕裂和组织异常涂抹。刻度条,20 μm.核标有Hoechst 33342(蓝色)。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
由于小鼠眼睛的体积和形状小,视网膜易碎,小鼠视网膜解剖是一个微妙的过程。尽管进行高质量的解剖是一个实践问题,但拥有详细的协议,提供有效的方法和提示是获得视网膜部分和IHC的必要条件。除了此处介绍的协议外,还有几个提示允许一致的高质量视网膜部分,适用于可重复的 IHC。
在开始解剖之前,重要的是要舒适,放松,并设置房间照明,以在小鼠眼睛微解剖的最佳视力。为了在解剖眼睛时保持鼠标眼杯形状,我们建议在定制的蜡涂层解剖皿中将眼睛浸入 PBS 中。我们建议用浅粉色牙蜡涂上35mm解剖盘(图1C)。事实上,牙科蜡的浅粉色提供足够的对比度,在解剖范围内很容易看到眼睛结构,在蜡中,通过将微熔管的底座压入蜡,使眼罩在原位,同时保持眼杯的位置允许在解剖过程中将工具在眼杯周围进行适当的旋转。此外,在去除镜片时,从眼杯中取出尽可能多的葡萄球液非常重要,因为残留的葡萄球体在组织块冻结步骤中容易形成组织破坏冰晶。我们通常使用纸巾并将其放在解剖眼罩的边界处,通过毛细管小心地去除所有剩余的胎儿液体,而不会干扰视网膜组织。在眼杯中仍然存在少量残留的葡萄液的不幸情况下,应在-20°C下进行切片,以减少冰中葡萄干的转化,从而保持刀片的锐度和切片的质量.
固定和嵌入方法也会对各部分和 IHC 的质量产生重大影响。虽然形式固定石蜡嵌入部分可产生眼组织的最佳结构完整性,但形式IN含有甲醇,可增强背景荧光。为了避免这些伪影,我们建议使用新鲜的EM级甲醛(PFA)来限制由甲醇或氧化PFA4、5、6引起的背景和自荧光。我们建议在我们的协议中描述的轻度固定条件,用4%的甲醛在冰上固定眼睛15分钟。由于PFA迅速渗透到组织,但交叉链接蛋白非常缓慢,这些条件足以在解剖过程中保持视网膜结构的完整性,并保持普通视网膜抗原的抗原抗原,而无需抗原检索方法4.如果视网膜结构保存不完好,PFA 固定的持续时间可以延长,但重要的是要注意,过度固定组织会增强非特异性背景荧光,并可能导致表位掩蔽,同时修复不足组织可能损害组织的结构完整性,并导致一些容易蛋白解降解的抗原的丧失。由于短时间的PFA孵育是一种相对温和的固定,我们也建议通过浸渍在浸浸于液氮的异丙烷浴中,将含有的冷冻眼(10毫米x10毫米x5毫米)中的OCT嵌入的眼睛浸入,以捕捉冷冻视网膜。捕捉冷冻组织将保存抗原,而蔗糖溶液和OCT则起到冷冻保护作用。这种方法将减少由于冰晶的形成而使组织的变形,从而造成所谓的瑞士奶酪类型的组织损伤。冷冻液不应直接浸入液氮中,否则会开始沸腾,形成蒸汽屏障,从而减缓冻结过程,导致异质固定和保存。此外,组织和OCT接触液氮会破裂,从而影响眼睛的完整性7。因此,我们建议使用小型不锈钢烧杯(100 mm 宽最小)浸入不超过 5 mm 深的丙烯中,本身浸入含有液氮的较大不锈钢烧杯(最小 100 毫米宽)。为了避免液氮在制备多个样品时迅速蒸发,我们将两个浴位保存在绝缘冷却器中。应该指出,OCT中的冷冻保存组织不是一种长期的保存方法,因为随着时间的推移,冰晶在组织中形成,可以改变亚细胞形态和/或变性一些抗原。因此,组织块和冷冻部分应储存在-20°C,用于短期储存和-80°C长期储存。
哺乳动物视网膜是一种不对称器官,其细胞在时间-鼻和地管轴上具有特定的空间分布。例如,M-和S-opin锥体排列在特定的地管梯度12中。因此,为了执行比较IHC,必须确保眼睛在整个组织制备和切片过程中的正确方向。我们使用烧孔器在解剖前在眼睛上放置一个参考标记(图2A,D),以便我们能够在嵌入阶段沿眼杯的背-腹轴定向,从而获得完美的横向截面。我们将烧伤标记放在眼睛的左右部,用烧灼剂触摸角膜一瞬间。这将允许轻微烧伤角膜,同时避免穿孔到它。在眼杯解剖过程中,我们使用微刀(图2B)在烧伤标记处,垂直于角膜边界处进行一个小切口。为了便于块的背向方向,并尽量减少切片过程中的方向调整,我们建议在低温中定位后眼杯,烧伤标记面向低温底部,角膜开口完全与低温的右侧平行(图3A,B)。冻结块将安装在块的底部朝向刀片在低温,眼杯垂直于刀片,在一个地头朝状(图3c)。
可靠的视网膜 IHC 从最佳、适应和可重复的解剖和组织处理开始。此处概述的方法可最佳地保持视网膜结构和完整性,同时最大限度地减少可能危及荧光 IHC 的自荧光和表位掩蔽。遵循此协议将确保您拥有可重现的高质量数据。
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Disclosures
没有披露。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH(RO1-GMO97327)和大学研究基金会(UPenn)的资金支持。我们特别感谢斯韦特兰娜·萨维娜在开发免疫组织化学方案方面给予的帮助,戈登·鲁塞尔(宾夕法尼亚大学)和宾夕法尼亚大学Vet成像核心中心为显微镜和莱斯利·金博士提供了显微镜和莱斯利·金博士的辅助,帮助她阅读了这份手稿.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | For liquid nitrogen (Figure 1E) |
| Aluminum foil | |||
| Cauterizer | Bovie | #AA01 | To mark eye orientation (Figure 1A) |
| Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A) |
| Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | #15002-08 | To circumferentially cut the cornea (Figure 1B) |
| Dental wax-coated 35mm dissection dish | For eye cup dissection (Figure 1C) | ||
| Dissecting microscope | Leica, Houston, USA | MZ12.5 High-performance stereomicroscope | |
| Micro Knives - Plastic Handle | Fine Science Tools | #10315-12 | To make a small incision at the burn mark (Figure 1A) |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | #72660 | For coating dissection dish |
| Slide Rack and Coverplate | Ted Pella | #36107 | For retinal IHC (Figure 1G) |
| Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | For isopentane bath (Figure 1E) |
| Styrofoam box | For insulated cooler | ||
| Thin forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Electron Miscroscopy Sciences | #62534-10 | Mold for OCT embedding |
| Buffers and Reagents | Company | Catalog Number | Comments |
| Blocking solution | 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer. | ||
| Gelvatol (anti-fading mounting media) | Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops). Store in amber drop bottle at 4°C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh at 1 ug/mL (1x) |
| Isopentane, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| Paraformaldehyde (PFA) in PBS | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. |
| Permeabilization solution | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3. Prepare fresh. | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. Prepared from 10x stock |
| Sucrose solutions | Fisher Scientific | #S-5-500 | Dissolve the appropriate amount of sucrose in 37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. |
| Tissue-Tek OCT-compound | Sakura | #4583 | |
| Antibodies | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | To label horinzotal cells |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | To label GABAergic amacrine cells |
| anti-GS | BD Transduction | 610517 | To label Müller cells |
| anti-rhodopsin | Millipore | MAB5316 | To label rods |
References
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Hartz, P. H. Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology. Stain Technology. 20, 113 (1945).
- Benerini Gatta, L., et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology. European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).
- Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).
- Imai, H., et al. Molecular properties of rhodopsin and rod function. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).
- Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry. Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).
- Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).
- Nakhai, H., et al. Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina. Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
