Klargøring af muse retinale Cryo-sektioner til immun histokemi

Summary

Denne rapport beskriver omfattende metoder til at forberede frosne mus nethinden sektioner for Immunhistokemi (IHC). Beskrevne metoder omfatter dissektion af okulær posterior kop, PARAFORMALDEHYD fiksering, indlejring i optimal skæring temperatur (OCT) medier og vævs orientering, skæring og immun farvning.

Abstract

Forberedelse af høj kvalitet muse øje sektioner for Immunhistokemi (IHC) er afgørende for at vurdere den retinale struktur og funktion og til bestemmelse af de mekanismer, der underliggende retinale sygdomme. Opretholdelse af strukturel integritet i hele vævs præparatet er afgørende for at opnå reproducerbare retinale IHC-data, men kan være udfordrende på grund af den skrøbelige og komplekse nethinde cytoarkitektur. Stærke fiktioner som 10% formalin eller Bouin løsning optimalt bevare den retinale struktur, de ofte hæmmer IHC analyse ved at øge baggrunden fluorescens og/eller aftagende antistof-epitop interaktioner, en proces kendt som epitop maskering. Mildere fikser, på den anden side, som 4% PARAFORMALDEHYD, reducerer baggrunds fluorescens og epitope-maskering, omhyggelig dissektions teknikker skal udnyttes til at bevare den retinale struktur. I denne artikel præsenterer vi en omfattende metode til at forberede muse okulære posterior kopper til IHC, der er tilstrækkelig til at bevare de fleste antistof-epitope interaktioner uden tab af retinal strukturel integritet. Vi medtager repræsentative IHC med antistoffer mod forskellige retinale celletype markører for at illustrere vævs konservering og-orientering under optimale og suboptimale forhold. Vores mål er at optimere IHC undersøgelser af nethinden ved at give en komplet protokol fra okulær posterior kop dissektion til IHC.

Introduction

Immunohistochemistry (IHC) er en kraftfuld teknik til lokalisering af specifikke proteiner og cellulære strukturer i væv in situ^1,2,3. Uhensigtsmæssige fikserings metoder og sub-optimale sektionering af komplekst væv kan forstyrre vævs strukturen, generere høj baggrunds farvning eller mindske antistof-epitope interaktioner, hvilket resulterer i farvning artefakter og deraf følgende fejlfortolkning af IHC-data⁴. Som hvirveldyr nethinden er en kompleks og meget organiseret neurale organ bestående af lag af indbyrdes forbundne fotoceller, interneuroner og ganglion cells, det er meget skrøbelig og kan let afbrydes under dissektion og skæring. En detaljeret, standardiseret og valideret protokol fra muse øje dissektion og orientering til immun farvning vil bidrage til at reducere IHC artefakter, derved øge pålideligheden af resultaterne og giver mulighed for mere præcise sammenlignende data Analyse.

Der er mange protokoller for vævs forberedelse til IHC, men ikke alle er egnet til retinale væv. Stærke fixativer som 10% formalin eller Bouin opløsning bevare retinale struktur under dissektion og skæring⁵. Desværre fører stærke fiktioner ofte til den forbedrede baggrunds fluorescens og epitop maskering på grund af den kemiske modifikation af epitoper⁶. På den anden side, mildere fixatives, ligesom 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) kan lindre nogle af disse artefakter, men kræver omhyggelig dissektion og skæring for at bevare den optimale retinale struktur. PFA trænger hurtigt ind i vævet, men cross-links proteiner meget langsomt, hvilket reducerer risikoen for epitop maskering. Da kort tid PFA inkubation er en relativt mild fiksering, væv ofte kræver hurtig frysning for at bevare antigener. Det er vigtigt at undgå iskrystal dannelse under vævs frysning, da de forvrænger og skader integriteten af celler og væv⁷.

Her beskriver vi detaljerede og standardiserede protokoller for dissektion, fiksering, og Cryo-beskyttelse af mus okulære posterior kopper, der giver konsistente og pålidelige IHC data.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i National Institutes of Health guide for pleje og brug af forsøgsdyr fra Instituttet for Laboratoriedyrs ressourcer og blev godkendt af Institutionel dyrepleje og brug udvalg ved University of Pennsylvania.

Alle værktøjer og udstyr til metoderne er vist i figur 1 og opført i tabellen over materialer.

1. Mus øje enucleation, Eye kop Dissection, og indlejring

1. Euthanize-mus med kuldioxid (CO₂) efterfulgt af enten halshugning (postnatale mus p0-P11) eller cervikal dislokation (voksne > P11-mus). For p0-P14-mus er øjnene dækket af huden. Sørg for at fjerne huden før efterfølgende trin.
2. Marker den tidsmæssige del af øjet (figur 2a) ved let at brænde cornea ved hjælp af en hale cauterizer. Undgå at brænde et hul i hornhinden ved at røre hornhinden meget let og for ikke mere end en splitsekund med cauterizer.
3. Straks enucleate muse øjne ved hjælp af buede Dumont #5/45 pincet. Der inkuieres i 15 min i et 1,5 mL kryotube-rør med 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfat-Buffered saltvand (PBS) på is.
4. Efter 15 min i 4% PFA, overføre det faste øje ved hjælp af den buede pincet Dumont #5/45 til en modificeret 35 mm dissektion skål (Se tabel over materialer og figur 1c) fyldt med PBS og sted under dissekting mikroskop.
5. Lav et lille snit ved brændemærket, vinkelret på og lige over limbussen (cornea-grænsen) ved hjælp af mikro-kniven.
6. Indsæt den buede saks i indsnittet, og Udfør en omskæring af hornhinden efter limbussen (figur 2b).
7. Fjern hornhinden, og udtræk linsen med en tynd Dumont #5 pincet, (figur 2b), og løft den forsigtigt væk fra den bageste del af øjet. Den glasholdige krop, den klare gel, der fylder rummet mellem linsen og nethinden, vil komme ud med linsen (figur 2b) og nethinden vil være synlig som en hvid overflade, der dækker indersiden af posterior øjet kop. Sørg for, at der ikke er synlige skader på nethinden, såsom huller eller tårer (figur 2c).
8. Øjen Kopperne vaskes to gange i 1 mL PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
9. Kryoprobeskyt øjen Kopperne ved at ækvilibrere dem i en opløsning på 15% saccharose i PBS natten over ved 4 °C, indtil øjet kop synker
10. Øjen Kopperne overføres til 30% saccharose i PBS for 2-3 h, indtil øjekoppen synker.
11. Integrer øjen bægre i OLT i 10 x 10 mm kryomårige (figur 3a). Ved hjælp af et dissekterende mikroskop, orientere øjet i kryomold langs sin rygsøjle-ventral akse (figur 2D, figur 3a) ved at rotere øjet, indtil brændemærket er på toppen, synsnerven er på venstre og cut-out del af formen vender mod højre ( Figur 2D). Vær omhyggelig med at undgå bobler i nærheden af vævet.
    Bemærk: Brug en titanium-sonde lavet af en titanium ledning, der er fastgjort til en pipettespids, til at manipulere øjen koppen.
12. For at fastfryse nethinde vævet, nedsænkes kryomold i mindst 5 min i et bægerglas indeholdende isopentan og Anbring bægerglasset i flydende kvælstof eller tøris/100% ethanol (op til 1/3 i højden af metal bægerglasset).
    Bemærk: den kryomold skal nedsænkes i isopentan til mere end halvdelen af sin højde, men behøver ikke at være helt nedsænket.
13. Fjern den frosne blok og Pak den i aluminiumsfolie.
14. Opbevares ved-80 °C.
15. Marker den frosne blok ved hjælp af en pen eller Sharpie for at registrere retningen af blokken (figur 3b).

2. Skæring ved hjælp af en kryostat

1. Efter justering af kryostat temperaturen (mellem-20 og-25 °C), skal de forme, der indeholder de indlejrede øjen kopper, kunne ækvilibrere til kryostat temperaturen i 1 time.
2. Installer blokken med dorso-ventral orientering (figur 3c) og skær 10 μm tykke serielle sektioner. Placer forsigtigt de nethinde sektioner på annoterede og nummererede mikroskop-slides.
3. Opbevar slides i glide kasser ved-20 °C eller-80 °C indtil IHC-procedurer.

3. Fluorescens-immunofarvning ved hjælp af slide stativet

Bemærk: slide rack systemet (f. eks. Sequenza) holder glas mikroskopet med en dækplade, hvilket skaber en ~ 100 μL kapillar kløft mellem sliden og pladen.

1. Kryo-afsnittene optøs ved stuetemperatur (RT) i 2 timer til 4 h, så de kan tørre og fastgøres til mikroskop-slides.
   Bemærk: det er også muligt at tørre dem ved 30-37 °C i 30 min til 1 time.
2. Anbring slides i slide rack, og vask retinal sektionerne to gange i 100-200 μL PBS i 2 min.
3. Permeabiliserer de nethinde sektioner ved at inkumme dem i 0,25% Triton-X/0,05% NaN₃i PBS i 5 min ved rt.
4. Der tilsættes 100 μL blokerende opløsning til lysbillederne.
5. Der tilsættes 100 μL primær antistof fortyndet i blokerende opløsning til lysbillederne.
6. Inkubeter retinal sektioner natten over ved 4 °C.
   Bemærk: i løbet af denne periode skal du dække slide stativet for at undgå udtørring af sektionerne.
7. De nethinde sektioner vaskes 3 gange, hver i 15 min., med 200 μL PBS.
   Bemærk: tilføjelsen af 0,001-0,002% Triton-X100 til PBS (PBS-T) tillader en mere stringent vask, men kan forstyrre nogle membraner og cellulære strukturer.
8. Inkubeter retinal sektioner i fluorescerende-mærkede sekundære antistoffer i 1 time ved RT. Fra nu af beskytte mod lys.
9. Vask retinal sektioner 3 gange, hver i 15 min.
10. De retinale sektioner inkuperes ved RT i 5 minutter med en nuklear markør som Hoechst 33342 eller DAPI-opløsning.
11. Vask retinal sektioner 1 gang i 15 min.
12. Anbring en dækglas oven på et papirhåndklæde på laboratorie bænken.
13. Tilsæt 2 dråber anti-fading monterings medier til midten af coverslip.
14. Drej sliden over for at få retinal kryo-sektion nedad.
15. Monter forsigtigt coverglien langsomt ved en vinkel på ~ 45 °, og skub sliden på monterings mediet.
    Bemærk: undgå at danne bobler, når du sænker sliden på plads.
16. Anvend et jævnt tryk, ved hjælp af en tung bog eller katalog (se nedenfor), til slide-coverslip kombination for at eliminere overskydende monterings medier.
    Bemærk: for at sikre konsistens i prøveforberedelsen skal du altid bruge det samme objekt (dvs. den samme bog eller det samme katalog) til at anvende jævnt Tryk på dækglas under slide montering.
17. Opbevares fladt og gør det muligt at hærde natten over ved RT i mørket. Opbevar slides fladt ved 4 °C på ubestemt tid.
18. Billede via bredt felt eller Konfokal Fluorescens mikroskopi (figur 4).

Representative Results

For at illustrere, hvordan disse protokoller, sikre optimal retinal konservering for IHC, vi probed nethinde sektioner fra P28 WT mus (C57BL/6N) med antistoffer til rhodopsin (en fotocelle markør)⁸, glutaminsyre decarboxylase 65 (Gad65, en amacrine celler markør)⁹, Glutamin SYNTETASE (GS, en Müller cellemarkør)¹⁰, og calbindin (en vandret cellemarkør)¹¹ (figur 4). IHC indikerer, at vores protokoller konsekvent giver høj kvalitet og velbevarede retinal sektioner. Især de rhodopsin-rige indre og ydre segmenter forbliver lodrette og intakt med lidt at ingen adskillelse fra overliggende nethinde pigmenteret epitel (RPE) (figur 4a). Desuden forbliver Müller-cellerne velbevarede med Soma korrekt justerede og cytoplasmatiske processer, der strækker sig fra ganglion cellelag (GCL) til det ydre nukleare lag (ONL) (figur 4b).

Interneuroner, såsom Gad65-positive amacrine celler, også forblive korrekt stratificeret i INL og indre plexiform lag (IPL) (figur 4B), mens veldefinerede horisontale celler kan påvises ved inl og ydre plexiform lag (OPL) (figur 4C). Tilsammen viser disse data, at vores metode bevarer retinal celle-og vævs integritet, fra cirkadiske til ganglion celler

For at lette tværgående skæring, er det vigtigt at omhyggeligt orientere den optiske kop i kryo-skimmel før frysning. Misorienterede retinaer, dårlig skæring teknik eller skæring med kedelige eller beskadigede mikrotomknive kan forårsage artefakter såsom retinale væv tårer, forvridninger, og cellulære forskydning, som i figur 4. Eksempler på sektions artefakter er vist i figur 4d-F. I figur 4d dårlig skæring og justering føre til foto receptor indre og ydre segmenter forvrængning (figur 4d) og små væv tårer (figur 4e, pil). I et andet eksempel, dårlig vævs orientering før afsnit fører til sub-optimal justering af Muller celle Soma og cytoplasmatiske processer figur 4E. Figur 4F viser, hvor dårlig skæring, der sandsynligvis forårsages af en kedelig mikrotom kniv, forårsagede, at vandrette celler udsmøre fra opl til GCL. Der skal således lægges præcis vægt på gennemførelsen af hvert enkelt trin, der er skitseret i protokollen, for at sikre, at IHC-data er af højeste kvalitet og reproducerbar.

Figur 1 af : Værktøjer til muse øje Dissection, indlejring, og IHC. (A) Cauterizer; (B) Dissektions værktøjer fra venstre til højre: Dumont #5/45 buede pincet, buet saks og Dumont #5 tynde tang; (C) 35 mm dissektions skål (pil peger for at dissekere kammeret); (D) dissekere mikroskop; (E) frosne værktøjer fra venstre til højre: isoleret køler, rustfrit stål bæger for isopentan bad, rustfrit stål væske N₂ bad; F) titanium sonde; (G) glide stativ og dækplade til IHC. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 af : Mus øje kop orientering og beskrivelse. (A) tidsbegrænset brændemærke placering (rød pil) for at lette øjen retningen (dorso = D, ventrale = V, Temporal = T, nasal = N). (B) skematisk for muse øje dissektion. Et lille snit foretages ved brændemærket, vinkelret i hornhinden og lige over limbussen ved hjælp af en fin skalpel (Micro kniv). Skær rundt om hornhinden for at adskille den forreste og bageste del af øjet. (C) Eye Cup med en intakt nethinde. (D) dorso-ventral orientering af muse øje med synsnerven (ON), linse (L), cornea (C) limbus (OS). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 af : Integrering af muse øjne. (A) dorso-ventral orienterede mus Eye Cup i kryomold fyldt med OCT, (B) frosne mus retinal kop i kommenteret kryomold. (C) Cryostat. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 af : Mus Retina immun histokemi. (A-C) god kvalitet og (D-F) dårlig kvalitet nethinde sektioner fra P28 WT blev mærket med antistoffer mod rhodopsin (a, C) amacrine markør GAD65 (B, E) og Müller cellemarkør glutamin SYNTETASE (GS; B, E) og vandret cellemarkør calbindin (C, F). Hvide pile peger på væv tårer og afvigende udtværing af vævet. Skala stang, 20 μm. nuclei mærket med Hoechst 33342 (blå). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Mus nethinde dissektion er en delikat proces på grund af den lille størrelse og form af mus øjne og skrøbelighed af retinale væv. Selv om udførelsen af høj kvalitet dissektion er et spørgsmål om praksis, at have en detaljeret protokol, der giver effektive metoder og tips er en nødvendighed for at få nethinde sektioner og IHC. Ud over de protokoller, der er beskrevet her, er der flere tips, der giver mulighed for ensartede retinal sektioner af høj kvalitet, der egner sig til reproducerbare IHC.

Før påbegyndelse med dissektion, er det vigtigt at være komfortabel, afslappet og indstille rummet belysning for optimal vision under muse øjet mikrodissektion. For at opretholde muse øjet kop form mens dissekere øjet, foreslår vi at holde øjnene nedsænket i PBS i specialfremstillede voks belagte dissektions retter. Vi foreslår belægning en 35mm dissektion skål med lyserød farvet dentalvoks (figur 1c). Faktisk, den lyse pink farve af dentalvoks giver tilstrækkelig kontrast til at se let øjet strukturer under en dissektion omfang, de Eye-størrelse indtryk i voks, lavet ved at trykke på bunden af mikrofuge rør i voks, vil holde øjet kop på plads, mens muliggør en passende rotation af værktøjerne omkring øjet kop under dissektion. Desuden er det vigtigt at fjerne så meget glaslegemet væske fra øjet kop som muligt, mens du fjerner linsen, som resterende glasfiber væske er tilbøjelige til at danne væv skadelige iskrystaller under vævs blokken frysning trin. Vi bruger generelt et silkepapir og placere det til kanten af den dissekerede øjet kop, omhyggeligt at fjerne alle resterende glaserede væske ved kapillar uden at forstyrre nethinden væv. I det uheldige tilfælde, hvor der stadig er en lille mængde glasfiber rester til stede i øjet kop, skal skæring foretages ved-20 °C for at reducere omdannelsen af glaslegemet i is og derfor bevare knivskarp heden og kvaliteten af skære .

Fastgørelses-og indlejrings metoder har også stor indflydelse på kvaliteten af sektionerne og IHC. Selv om formalin-faste paraffin-indlejrede sektioner giver optimal strukturel integritet af øjet væv, formalin indeholder methanol, der kan forbedre baggrunden fluorescens. For at undgå disse artefakter, anbefaler vi at bruge frisk EM grade PARAFORMALDEHYD (PFA) for at begrænse baggrund og autofluorescens forårsaget af methanol eller oxideret PFA^4,5,6. Vi anbefaler de milde fikserings betingelser, der er beskrevet i vores protokol om fastsættelse af øjet med 4% PARAFORMALDEHYD i 15 minutter på is. Da PFA hurtigt trænger ind i vævet, men kryds forbinder proteiner meget langsomt, er disse betingelser tilstrækkelige til at bevare retinal strukturel integritet under dissektion og bevare anti geniciteten af almindelige retinale antigener uden behov for antigen hentning af metoder⁴. Hvis nethinden struktur ikke er velbevaret, varigheden af PFA fiksering kan øges, men det er vigtigt at være opmærksom på, at over-fixerende væv vil øge ikke-specifik baggrunds fluorescens og kan føre til epitop maske, mens under-fixating væv kan kompromittere strukturel integritet af vævet og forårsage tab af nogle antigener tilbøjelige til proteolytisk nedbrydning. Da PFA-inkubation på kort tid er en relativt mild fiksering, anbefaler vi også snap-fryse-nethinder ved at dyppe det OLT-indlejrede øje, der er indeholdt i en kryomgammel (10 mm x 10 mm x 5 mm), i et isopentan-bad, der er nedsænket i flydende kvælstof. Snap-frysning væv vil bevare antigener, mens saccharoseopløsning og OLT fungere som Cryo-protektanter. Denne metode vil reducere forvrængning af vævet på grund af dannelsen af iskrystaller, som kan forårsage den såkaldte schweiziske ost type vævsskade. Den kryomold bør ikke dyppet direkte i flydende kvælstof eller det vil begynde at koge, danner en dampspærre, og som vil bremse fryse processen, resulterer i en heterogen fiksering og konservering. Desuden kan væv og OLT i kontakt med flydende nitrogen knække, hvilket påvirker integriteten af øjet⁷. Vi anbefaler derfor at dyppe kryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm) i højst 5 mm dyb isopentan ved hjælp af et lille bægerglas af rustfrit stål, der selv er dyppet i et større bæger i rustfrit stål (100 mm bredt minimum), der indeholder flydende nitrogen. For at undgå hurtig fordampning af flydende kvælstof under forberedelsen af flere prøver, holder vi begge bade i en isoleret køler. Det skal bemærkes, at cryopreservation væv i OLT er ikke en langsigtet konservering metode, på grund af dannelsen af iskrystaller i vævet over tid, som kan ændre subcellulære morfologi og/eller denaturering nogle antigener. Derfor bør vævs blokke og frosne sektioner opbevares ved-20 °C for kort tids opbevaring og for-80 °C langtidsopbevaring.

Patte nethinden er et asymmetrisk organ med en specifik rumlig fordeling af cellerne på tværs af de tidsmæssige-nasale og dorso-ventral akser. For eksempel er M-og S-opsin kegler arrangeret i en specifik dorso-ventral gradient ¹². Derfor er det vigtigt at sikre korrekt orientering af øjet gennem vævs forberedelse og skæring for at udføre sammenlignende IHC. Vi bruger en cauterizer til at placere et referencemærke på øjet før dissektion (figur 2a, D) så vi kan orientere øjet kop langs sin rygsøjle-ventral akse under indlejrings fasen, og derfor opnå perfekt tværgående sektioner. Vi placerer brændemærket på den dorso-temporale del af øjet, ved at røre hornhinden for en splitsekund med cauterizer. Dette vil gøre det muligt at let brænde hornhinden og samtidig undgå piercing et hul i det. Under øjet kop dissektion, laver vi en lille Incision, ved brændemærke, vinkelret på grænsen af hornhinden, ved hjælp af mikro kniv (figur 2b). For at lette den dorso-ventral orientering af blokken og minimere orientering justeringer under skæring, foreslår vi orientere den bageste øje kop i kryomold, med brændemærke mod bunden af kryomold og åbningen af hornhinden perfekt parallelt med kryomalderens højre side (figur 3a, B). Den frosne blok vil blive installeret med bunden af blokken vendt mod klingen i kryostat, øjet kop vinkelret på klingen, i en dorso-ventral orientering (figur 3c).

Pålidelig Retina IHC starter med optimale, tilpassede og reproducerbare dissektioner og vævs behandling. Den metode, der er skitseret her optimalt bevarer retinale struktur og integritet samtidig minimere autofluorescens og epitop maskering, der kan kompromittere fluorescerende IHC. Efter denne protokol vil sikre, at du har reproducerbare data af høj kvalitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods