Summary
Dit rapport beschrijft uitgebreide methoden voor de voorbereiding van bevroren muis Retina secties voor Immunohistochemistry (IHC). Beschreven methoden omvatten dissectie van de oculaire posterior Cup, Paraformaldehyde fixatie, inbedding in optimale snij-temperatuur (OCT) media en weefsel oriëntatie, sectioneren en immunokleuring.
Abstract
De voorbereiding van hoge-kwaliteit muis oog secties voor Immunohistochemistry (IHC) is van cruciaal belang voor de beoordeling van de netvlies structuur en functie en voor het bepalen van de mechanismen ten grondslag liggen aan het netvlies ziekten. Het handhaven van structurele integriteit in het weefsel preparaat is van vitaal belang voor het verkrijgen van reproduceerbare retinale IHC gegevens, maar kan uitdagend zijn als gevolg van de kwetsbaarheid en complexiteit van het netvlies cytoarchitecture. Sterke Fixatieven zoals 10% formaline of de oplossing van Bouin de retinale structuur optimaal te bewaren, belemmeren zij vaak IHC analyse door de achtergrond fluorescentie en/of afnemende antilichaam-epitope interacties, een proces te verbeteren dat als epitope masking wordt bekend. Milder Fixatieven, aan de andere kant, zoals 4% Paraformaldehyde, vermindert de achtergrond fluorescentie en epitope-masking, nauwgezette dissectie technieken moeten worden gebruikt om het netvlies structuur te behouden. In dit artikel presenteren we een uitgebreide methode om muis oculaire achterste cups voor IHC die voldoende is om de meeste antilichaam-epitope interacties te behouden zonder verlies van retinale structurele integriteit te bereiden. Wij omvatten vertegenwoordiger IHC met antilichamen aan diverse retinale cel type tellers om weefsel behoud en richtlijn onder optimale en sub-optimale voorwaarden te illustreren. Ons doel is het optimaliseren van IHC studies van het netvlies door het verstrekken van een compleet Protocol van oculaire posterior Cup dissectie IHC.
Introduction
Immunohistochemistry (IHC) is een krachtige techniek voor het lokaliseren van specifieke eiwitten en cellulaire structuren in weefsels in situ1,2,3. Ongepaste fixatie methoden en sub-optimale afdeling van complexe weefsels kan verstoren weefselstructuur, het genereren van hoge achtergrond vlekken of te verminderen antilichaam-epitope interacties, wat resulteert in vlekken artefacten en daaruit voortvloeiende verkeerde interpretatie van IHC gegevens4. Als de gewervelde Retina is een complex en zeer georganiseerd neuraal orgaan bestaat uit lagen van onderling verbonden fotoreceptoren, interneuronen en ganglioncellen, het is zeer kwetsbaar en kan gemakkelijk worden verstoord tijdens de dissectie en de sectie. Een gedetailleerd, gestandaardiseerd, en gevalideerd Protocol van muis oog dissectie en oriëntatie naar immunokleuring zal helpen aanzienlijk verminderen IHC artefacten, waardoor de betrouwbaarheid van de resultaten en waardoor meer accurate vergelijkende gegevens Analyse.
Er zijn vele protocollen voor weefsel voorbereiding voor IHC, echter, niet zijn allen geschikt voor netvlies weefsel. Sterke Fixatieven zoals 10% formaline of de oplossing van Bouin behouden de netvlies structuur tijdens dissectie en sectioning5. Helaas, sterke Fixatieven vaak leiden tot de versterkte achtergrond fluorescentie en epitope masking als gevolg van de chemische modificatie van epitopes6. Aan de andere kant, mildere Fixatieven, net als 4% Paraformaldehyde (toppunt) kan verlichten sommige van deze artefacten, maar vereisen nauwgezette dissectie en het delen van de optimale retinale structuur te behouden. Het snel doordringen van het gaasweefsel, maar dwars-verbindingen proteïnen zeer langzaam, verminderend het risico van epitope masking. Sinds korte tijd is de incubatie van het middel een vrij milde fixatie, vereisen de weefsels vaak het snelle bevriezen om antigenen te bewaren. Het is belangrijk om te voorkomen dat ijs kristalvorming tijdens het bevriezen van weefsels als ze vervormen en beschadiging van de integriteit van cellen en weefsels7.
Hier beschrijven we gedetailleerde en gestandaardiseerde protocollen voor dissectie, fixatie, en Cryo-bescherming van de muis oculaire achterste cups die consistente en betrouwbare IHC gegevens opleveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de nationale instituten van de gezondheidsgids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren die door het Instituut voor laboratorium dierlijke hulpbronnen en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en het gebruik Comite van de Universiteit van Pennsylvania.
Alle gereedschappen en apparatuur voor de methoden worden weergegeven in Figuur 1 en vermeld in de tabel van materialen.
1. Muis Eye enucleation, Eye Cup dissectie, en inbedding
- Euthanaseren muizen met kooldioxide (CO2), gevolgd door een onthoofding (postnatale muizen P0-P11) of cervicale dislocatie (Adult > P11 muizen). Voor P0-P14 muizen, zijn de ogen bedekt door de huid. Zorg ervoor dat de huid te verwijderen voordat de volgende stappen.
- Markeer de temporele deel van het oog (Figuur 2a) door een beetje branden het hoornvlies met behulp van een staart cauterizer. Vermijd het branden van een gat in het hoornvlies door het aanraken van het hoornvlies zeer licht en voor niet meer dan een fractie van een seconde met de cauterizer.
- Onmiddellijk enucleate muis ogen met behulp van gebogen Dumont #5/45 Tang. Incubeer gedurende 15 min in een 1,5 mL cryotube buis met 1 mL van 4% Paraformaldehyde (speels) in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) op het ijs.
- Na 15 min in 4%-punt, breng het vaste oog met behulp van de gebogen Tang Dumont #5/45 naar een aangepaste 35 mm dissectie schotel (Zie tabel van materialen en figuur 1c) gevuld met PBS en plaats onder ontleden Microscoop.
- Maak een kleine incisie op het brandmerk, loodrecht op en net boven de limbus (grens van het hoornvlies) met behulp van de micro-mes.
- Steek de gebogen schaar in de incisie en voer een omtrek snede van het hoornvlies na de limbus (Figuur 2b).
- Verwijder het hoornvlies en pak de lens met een dunne Dumont #5 Tang, (Figuur 2b) en til het delicaat weg van het achterste gedeelte van het oog. Het glaslichaam, de heldere gel die de ruimte tussen de lens en het netvlies vult, zal komen met de lens (Figuur 2b) en het netvlies zal zichtbaar zijn als een wit oppervlak dat de binnenkant van de achterste Eye Cup. Zorg ervoor dat er geen zichtbare schade aan het netvlies, zoals gaten of tranen (figuur 2c).
- Was het oog cups tweemaal in 1 mL PBS voor 10 min bij kamertemperatuur.
- Cryoprotect het oog cups door equilibrating ze in een oplossing van 15% sacharose in PBS overnachting bij 4 ° c tot de Eye Cup zinkt
- Breng de Eye cups naar 30% sacharose in PBS voor 2-3 h tot de Eye Cup daalt.
- Embed de Eye cups in OCT in 10 x 10 mm cryomolds (Figuur 3a). Met behulp van een ontleden Microscoop, oriënteren het oog in de cryomold langs de dorsale-buik-as (figuur 2D, Figuur 3a) door het roteren van het oog tot het branden merk is op de top, de oogzenuw is aan de linkerkant en de cut-out deel van de mal gezichten het recht ( Figuur 2D). Zorg ervoor dat bubbels in de buurt van het weefsel te vermijden.
Opmerking: om de Eye Cup te manipuleren, gebruik dan een titanium sonde gemaakt van een titanium draad bevestigd aan een pipet tip. - Om het netvlies te breken, dompel de cryomold gedurende ten minste 5 min in een metalen beker met isopentane en plaats het bekerglas in vloeibare stikstof of droog ijs/100% ethanol bad (tot 1/3 van de hoogte van de metalen beker).
Let op: de cryomold moet worden ondergedompeld in isopentane tot meer dan de helft van de hoogte, maar hoeft niet volledig onder te dompelen. - Verwijder het bevroren blok en wikkel het in aluminiumfolie.
- Opslag bij-80 °C.
- Markeer de bevroren blok met behulp van een pen of Sharpie om de oriëntatie van het blok (Figuur 3b) vast te leggen.
2. Secties met een cryostat
- Na het aanpassen van de cryostat temperatuur (tussen-20 en-25 ° c), laat de mallen met de embedded Eye cups equilibrate aan de cryostat temperatuur voor 1 uur.
- Installeer het blok met dorso-buik oriëntatie (figuur 3c) en snijd 10 µm dikke seriële secties. Plaats voorzichtig de netvlies secties op geannoteerde en genummerde Microscoop dia's.
- De dia's van de opslag in schuif dozen bij-20 °C of-80 °C tot IHC procedures.
3. Fluorescentie immunokleuring met het schuif rek
Opmerking: de dia rack systeem (bijv. Sequenza) houdt de glazen Microscoop dia's met een afdekplaat, het creëren van een ~ 100 µ L capillaire kloof tussen de dia en de plaat.
- Ontdooi de Cryo-secties bij kamertemperatuur (RT) voor 2 h tot 4 uur om ze te laten drogen en hechten aan Microscoop dia's.
Let op: het is ook mogelijk om ze te drogen bij 30-37 °C voor 30 min tot 1 uur. - Plaats dia's in dia rek en was de retinale secties tweemaal in 100-200 µ L PBS voor 2 min.
- Permeabilize de netvlies secties door incubatie hen in 0,25% Triton-X/0,05% NaN3in PBS voor 5 min bij RT.
- Voeg 100 µ L van het blokkeren van oplossing voor de dia's.
- Voeg 100 µ L van primair antilichaam verdund in het blokkeren van oplossing voor de dia's.
- Incubeer retinale secties overnachting op 4 ˚ C.
Opmerking: gedurende deze tijd, bedek de dia rek om uitdroging van de secties te voorkomen. - Was de retinale secties 3 keer, elk voor 15 min, gebruikend 200 µ L PBS.
Nota: de toevoeging van 0,001-0,002% Triton-X100 aan PBS (PBS-T) staat een strengere was toe maar kan sommige membranen en cellulaire structuren verstoren. - Incubeer retinale secties in fluorescerende-gelabelde secundaire antilichamen voor 1 h bij RT. Van nu af aan te beschermen tegen licht.
- Was de retinale secties 3 keer, elk voor 15 min.
- Incubeer de netvlies secties op RT voor 5 min met een nucleaire marker zoals Hoechst 33342 of DAPI oplossing.
- Was de netvlies secties 1 keer voor 15 minuten.
- Plaats een dekglaasje op de top van een papieren handdoek op het lab bankje.
- Voeg 2 druppels anti-fading montage media naar het midden van de dekglaasje.
- Draai de schuif om de retinale Cryo-sectie naar beneden te hebben.
- Voorzichtig Monteer de dekglaasje langzaam, op een ~ 45 ˚ hoek, tip de dia op de montage media.
Opmerking: het vermijden van het vormen van bubbels als je de dia op zijn plaats lager. - Breng zelfs druk, met behulp van een zware boek of catalogus (zie hieronder), om de dia-dekglaasje combinatie om overtollige montage media te elimineren.
Nota: om consistentie in steekproefvoorbereiding te verzekeren, gebruik altijd het zelfde voorwerp, (d.w.z., het zelfde boek of de catalogus) om zelfs druk aan de dekglaasje tijdens dia montage toe te passen. - Houd plat en laat verharden 's nachts op RT in het donker. Op te slaan dia's plat bij 4 °C voor onbepaalde tijd.
- Beeld via breed veld of confocale fluorescentie microscopie (Figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te illustreren hoe deze protocollen, zorgen voor een optimale retinale bewaring voor IHC, we probed netvlies secties van P28 WT muizen (C57BL/6N) met antilichamen tegen rhodopsine (een fotoreceptor marker)8, glutamine acid decarboxylase 65 (Gad65, een amacrine cel marker)9, glutamine SYNTHETASE (GS, een Müller-cel marker)10, en calbindin (een horizontale cel marker)11 (Figuur 4). IHC geeft aan dat onze protocollen consequent hoge kwaliteit en goed bewaarde netvlies secties opleveren. Met name de rhodopsine-rijke binnenste en buitenste segmenten blijven verticaal en intact met weinig tot geen scheiding van bovenliggende het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE) (figuur 4a). Bovendien blijven de cellen van Müller goed-bewaard met Soma behoorlijk gericht en cytoplasma processen die van de ganglion cel laag (GCL) overspant aan de buitenkern laag (de) (figuur 4b).
Interneuronen, zoals Gad65-positieve amacrine cellen, blijven ook goed gelaagde binnen de INL en innerlijke plexiform laag (IPL) (figuur 4B), terwijl goed gedefinieerde horizontale cellen zijn detecteerbaar op de inl en buitenste plexiform laag (OPL) grens (figuur 4C). Collectief, deze gegevens tonen aan dat onze methode retinale cel en weefsel integriteit behoudt, van fotoreceptoren tot ganglioncellen
Om dwarsdoorsnede te vergemakkelijken, is het belangrijk om de optische kop in de Cryo-vorm voorafgaand aan het bevriezen zorgvuldig te oriënteren. Slecht georiënteerd netvlies, slechte sectieing techniek of een sectie met saai of beschadigd microtome messen kan leiden tot artefacten zoals retinale weefsel tranen, vervormingen, en cellulaire verplaatsing, zoals in Figuur 4. Voorbeelden van sectie-artefacten worden weergegeven in figuur 4D-F. In figuur 4D slechte segmentering en uitlijning leiden tot fotoreceptor innerlijke en buitenste segmenten vervorming (figuur 4D) en kleine weefsel tranen (figuur 4e, Arrow). In een ander voorbeeld, slechte weefsel oriëntatie voorafgaand aan de sectie leidt tot sub-optimale uitlijning van Muller Cell Soma en cytoplasma processen figuur 4e. Figuur 4F laat zien hoe slecht segmenteren waarschijnlijk veroorzaakt door een saaie microtome mes veroorzaakt horizontale cellen te afwijkend uitstrijkje van de OPL naar het gcl. Zo moet nauwkeurig aandacht worden besteed aan de uitvoering van elke in het protocol uiteengezette stap om de hoogste kwaliteit en reproduceerbaarheid van IHC-gegevens te waarborgen.
Figuur 1 : Gereedschap voor muis oog dissectie, inbedding, en IHC. A Cauterizer; (B) de hulpmiddelen van de dissectie van links naar rechts: Dumont #5/45 gebogen Tang, gebogen schaar, en Dumont #5 dunne Tang; (C) 35 mm dissectie schaal (pijl wijst naar het ontleden van de kamer); D ontleden Microscoop; (E) bevroren hulpmiddelen van links naar rechts: geïsoleerde koeler, roestvrijstalen beker voor isopentane bad, roestvrijstaal vloeibare N2 bad; F titanium sonde; (G) Schuif rack en deksel voor IHC. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Mouse Eye Cup oriëntatie en beschrijving. (A) de tijdelijke plaats van het brandwond teken (rode pijl) om oog richtlijn (dorso = D, buik = V, tijdelijk = T, nasale = N) te vergemakkelijken. (B) Schematische voor muis oog dissectie. Een kleine incisie wordt gemaakt op het brandmerk, loodrecht in het hoornvlies en net boven de limbus met behulp van een fijne scalpel (micro mes). Snijd rond het hoornvlies om de voorste en achterste deel van het oog te scheiden. (C) Eye Cup met een intacte retina. (D) dorso-buik oriëntatie van de muis oog met de oogzenuw (ON), lens (L), hoornvlies (C) de limbus (OS). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Muis oog inbedding. (A) dorso-buik georiënteerde muizen Eye Cup in cryomold gevuld met OCT, (B) bevroren muis retinale Cup in geannoteerde cryomold. C cryostat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Muis Retina immunohistochemistry. (A-C) goede kwaliteit en (D-F) slechte kwaliteit netvlies secties van P28 WT werden geëtiketteerd met antilichamen tegen de rhodopsine (A, C) AMACRINE marker GAD65 (B, E) en de Müller Cell marker glutamine SYNTHETASE (GS; B, E), en horizontale cel marker calbindin (C, F). Witte pijlen wijzen op weefsel tranen en afwijkende vegen van het weefsel. Schaal Bar, 20 µm. kernen gelabeld met Hoechst 33342 (blauw). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muis Retina dissectie is een delicaat proces te wijten aan de kleine omvang en de vorm van muis ogen en de kwetsbaarheid van het netvlies weefsel. Hoewel het uitvoeren van kwalitatief hoogwaardige dissectie is een kwestie van de praktijk, met een gedetailleerd protocol, het verstrekken van efficiënte methoden en tips is een noodzaak om het netvlies secties en IHC te verkrijgen. In aanvulling op de hier beschreven protocollen, zijn er verschillende tips die het mogelijk maken voor een consistente hoge kwaliteit netvlies secties die geschikt zijn voor reproduceerbare IHC.
Voorafgaand aan de aanvang met dissectie, is het belangrijk om comfortabel, ontspannen en zet de kamer verlichting voor een optimale visie tijdens de muis oog microdissection. Te handhaven Mouse Eye Cup vorm, terwijl het ontleden van het oog, raden we u aan de ogen ondergedompeld in PBS in op maat gemaakte Wax-gecoate dissectie gerechten. We raden coating een 35mm dissectie schotel met licht roze gekleurde tandheelkundige Wax (figuur 1c). Inderdaad, de lichtroze kleur van de tandheelkundige biedt voldoende contrast om gemakkelijk oog structuren te zien onder een dissectie reikwijdte, de Eye-sized indrukken in de was, gemaakt door het indrukken van de basis van microfuge buizen in de was, zal de Eye Cup te houden op zijn plaats, terwijl waardoor de juiste rotatie van de instrumenten rond de Eye Cup tijdens de dissectie. Daarnaast is het belangrijk om zo veel glasvocht te verwijderen uit de Eye Cup mogelijk tijdens het verwijderen van de lens, zoals residuele glasvocht is vatbaar voor weefselbeschadiging van ijs kristallen te vormen tijdens het weefsel blok bevriezing stap. Wij gebruiken over het algemeen een tissue papier en plaats het aan de grens van de ontleed oog kop, om alle resterende glasvocht zorgvuldig te verwijderen door capillaire zonder het Retina weefsel te storen. In het ongelukkige geval waar een kleine hoeveelheid overblijvend glasvocht is nog steeds aanwezig in de Eye Cup, moet worden gedaan met een sectie-20 ° c om de transformatie van het glas in ijs te verminderen en dus het behoud van de scherpte van het mes en de kwaliteit van de afdeling .
Fixatie en inbedding methoden hebben ook een grote impact op de kwaliteit van de secties en de IHC. Hoewel formaline-vaste paraffine-embedded secties optimale structurele integriteit van het oog weefsel opleveren, bevat formaline methanol die de achtergrond fluorescentie kan verbeteren. Om te voorkomen dat deze artefacten, raden wij u aan verse em grade Paraformaldehyde (middel) om de achtergrond en autofluorescentie veroorzaakt door methanol of geoxideerde geleerde4,5,6te beperken. Wij raden de milde fixatie voorwaarden beschreven in ons protocol tot vaststelling van het oog met 4% Paraformaldehyde voor 15 min op ijs. Aangezien het hulpstuk snel het weefsel doordringt, maar dwars-verbindingen proteïnen zeer langzaam, zijn die voorwaarden voldoende om retinale structurele integriteit tijdens de dissectie te bewaren en de antigenicity van gemeenschappelijke Retina antigenen te bewaren zonder de behoefte aan antigeen de methodes van de terugwinning4. Als het netvlies structuur is niet goed bewaard gebleven, de duur van de fixatie van het GAAS kan worden verhoogd, maar het is belangrijk om te beseffen dat over-fixatie weefsels zal niet-specifieke achtergrond fluorescentie te verbeteren en kan leiden tot epitope masking, terwijl onder-fixatie de weefsels kunnen structurele integriteit van het weefsel compromitteren en het verlies van sommige antigenen veroorzaken vatbaar voor Proteolytische degradatie. Sinds korte tijd is de incubatie van het ogenblik een vrij milde fixatie, adviseren wij ook breuk-bevriezend netvlies door het OCT-ingebedde oog te onderdompelen, dat in een cryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm), in een isopentane bad wordt ondergedompeld dat in vloeibare stikstof wordt ingebed. Snap-bevriezing weefsels zal beschermen antigenen, terwijl sacharoseoplossing en LGO fungeren als Cryo-beschermers. Deze methode zal verminderen de vervorming van het weefsel als gevolg van de vorming van ijs kristallen, die kan leiden tot de zogenaamde Zwitserse kaas type weefselschade. De cryomold mag niet rechtstreeks worden ondergedompeld in vloeibare stikstof of het zal beginnen aan de kook, het vormen van een dampbarrière en dat zal vertragen de bevriezing proces, wat resulteert in een heterogene fixatie en behoud. Bovendien, weefsel en LGO in contact met vloeibare stikstof kan kraken, waardoor de integriteit van het oog7. Daarom raden wij aan om de cryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm) te dompelen in niet meer dan 5 mm diep isopentane met behulp van een kleine roestvrijstalen beker, zelf ondergedompeld in een grotere roestvrijstalen beker (100 mm breed minimum) met vloeibare stikstof. Om de snelle verdamping van de vloeibare stikstof tijdens de bereiding van verschillende monsters te voorkomen, houden we beide baden in een geïsoleerde koeler. Opgemerkt moet worden dat cryopreserving weefsels in oktober is niet een langdurige bewaarmethode, als gevolg van de vorming van ijs kristallen in het weefsel in de tijd die subcellulaire morfologie kan veranderen en/of denatureren sommige antigenen. Bijgevolg moeten weefsel blokken en bevroren delen worden opgeslagen bij-20 °C voor opslag op korte termijn en voor opslag op lange termijn van-80 °C.
De retina van zoogdieren is een asymmetrisch orgaan met een specifieke ruimtelijke spreiding van de cellen over de temporele-neus-en dorso-buik assen. Bijvoorbeeld, M-en S-opsin kegels zijn gerangschikt in een specifieke dorso-buik gradiënt 12. Daarom is het essentieel om te zorgen voor een goede oriëntatie van het oog gedurende weefsel voorbereiding en het delen van de vergelijkende IHC uit te voeren. We gebruiken een cauterizer om een referentiemerk te plaatsen op het oog voorafgaand aan dissectie (Figuur 2a, D),zodat we de Eye Cup langs de dorsale-buik as kunnen oriënteren tijdens de inbedding fase, en dus het verkrijgen van perfect transversale secties. We plaatsen het brandmerk op de dorso-temporale deel van het oog, door het aanraken van het hoornvlies voor een fractie van een seconde met de cauterizer. Dit zal toelaten om een beetje branden het hoornvlies, terwijl het vermijden van piercing een gat in. Tijdens de Eye Cup dissectie, maken we een kleine incisie, op het brandmerk, loodrecht op de grens van het hoornvlies, met behulp van de micro-mes (Figuur 2b). Ter vergemakkelijking van de dorso-buik oriëntatie van het blok en het minimaliseren van oriëntatie aanpassingen tijdens het segmenteren, raden we het oriënteren van de achterste Eye Cup in de cryomold, met het branden merk naar de onderkant van de cryomold en de opening van het hoornvlies perfect parallel aan de rechterkant van de cryomold (Figuur 3a, B). De bevroren blok zal worden geïnstalleerd met de onderkant van het blok naar het mes in de cryostat, de Eye Cup loodrecht op het mes, in een dorso-buik oriëntatie (figuur 3c).
Betrouwbare Retina IHC start met optimale, aangepaste en reproduceerbaar dissecties en weefsel verwerking. De hier geschetste methode bewaart optimaal de netvlies structuur en de integriteit terwijl het minimaliseren van autofluorescentie en epitope masking die fluorescente IHC kunnen compromitteren. Na dit protocol zal ervoor zorgen dat u reproduceerbare gegevens van hoge kwaliteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen onthullingen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door fondsen van NIH (RO1-GMO97327) en de Universitaire Stichting van het onderzoek (UPenn). Wij danken Svetlana Savina vooral voor haar hulp bij de ontwikkeling van het Immunohistochemistry protocol, Gordon Ruthel (University of Pennsylvania) en de Penn vet Imaging Core voor hulp bij microscopie en Leslie King, Ph.D. voor kritisch lezen van dit manuscript .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | For liquid nitrogen (Figure 1E) |
| Aluminum foil | |||
| Cauterizer | Bovie | #AA01 | To mark eye orientation (Figure 1A) |
| Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A) |
| Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | #15002-08 | To circumferentially cut the cornea (Figure 1B) |
| Dental wax-coated 35mm dissection dish | For eye cup dissection (Figure 1C) | ||
| Dissecting microscope | Leica, Houston, USA | MZ12.5 High-performance stereomicroscope | |
| Micro Knives - Plastic Handle | Fine Science Tools | #10315-12 | To make a small incision at the burn mark (Figure 1A) |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | #72660 | For coating dissection dish |
| Slide Rack and Coverplate | Ted Pella | #36107 | For retinal IHC (Figure 1G) |
| Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | For isopentane bath (Figure 1E) |
| Styrofoam box | For insulated cooler | ||
| Thin forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Electron Miscroscopy Sciences | #62534-10 | Mold for OCT embedding |
| Buffers and Reagents | Company | Catalog Number | Comments |
| Blocking solution | 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer. | ||
| Gelvatol (anti-fading mounting media) | Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops). Store in amber drop bottle at 4°C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh at 1 ug/mL (1x) |
| Isopentane, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| Paraformaldehyde (PFA) in PBS | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. |
| Permeabilization solution | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3. Prepare fresh. | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. Prepared from 10x stock |
| Sucrose solutions | Fisher Scientific | #S-5-500 | Dissolve the appropriate amount of sucrose in 37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. |
| Tissue-Tek OCT-compound | Sakura | #4583 | |
| Antibodies | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | To label horinzotal cells |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | To label GABAergic amacrine cells |
| anti-GS | BD Transduction | 610517 | To label Müller cells |
| anti-rhodopsin | Millipore | MAB5316 | To label rods |
References
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Hartz, P. H. Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology. Stain Technology. 20, 113 (1945).
- Benerini Gatta, L., et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology. European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).
- Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).
- Imai, H., et al. Molecular properties of rhodopsin and rod function. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).
- Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry. Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).
- Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).
- Nakhai, H., et al. Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina. Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
