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Neuroscience

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए माउस रेटिना लयाओ-अनुभागों की तैयारी

Published: July 1, 2019 doi: 10.3791/59683

Summary

यह रिपोर्ट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) के लिए जमे हुए माउस रेटिना सेक्शन तैयार करने के लिए व्यापक तरीकों का वर्णन करती है। वर्णित विधियों में नेत्र पश्च कप, पैराफॉर्मेल्डिहाइड निर्धारण, इष्टतम काटन तापमान (ओसीटी) मीडिया और ऊतक अभिविन्यास, अनुभागिंग और इम्यूनोस्टेनिंग में एम्बेड करना शामिल है।

Abstract

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) के लिए उच्च गुणवत्ता वाले माउस नेत्र वर्गों की तैयारी रेटिना संरचना और समारोह का आकलन करने और रेटिना रोगों के अंतर्निहित तंत्र का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है। ऊतक तैयारी के दौरान संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने reproduible रेटिना IHC डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन कमजोरी और रेटिना साइटोआर्किटेक्चर की कमजोरी और जटिलता के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है. 10% formalin या Bouin समाधान की तरह मजबूत fixatives बेहतर रेटिना संरचना की रक्षा, वे अक्सर पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट बढ़ाने के द्वारा IHC विश्लेषण में बाधा और / दूसरी ओर, हल्के fixatives, 4% paraformaldehyde की तरह, पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट और epitope-मास्किंग कम कर देता है, जटिल विच्छेदन तकनीक रेटिना संरचना को बनाए रखने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए. इस लेख में, हम IHC के लिए माउस नेत्र पश्च कप तैयार करने के लिए एक व्यापक विधि प्रस्तुत करते हैं जो रेटिना संरचनात्मक अखंडता के नुकसान के बिना सबसे एंटीबॉडी-एपिटोप बातचीत को संरक्षित करने के लिए पर्याप्त है। हम इष्टतम और उप इष्टतम स्थितियों के तहत ऊतक संरक्षण और अभिविन्यास वर्णन करने के लिए विभिन्न रेटिना सेल प्रकार मार्करों के लिए एंटीबॉडी के साथ प्रतिनिधि IHC शामिल हैं. हमारा लक्ष्य नेत्र पश्च कप विच्छेदन से आईएचसी के लिए एक पूरा प्रोटोकॉल प्रदान करके रेटिना के आईएचसी अध्ययन का अनुकूलन करने के लिए है।

Introduction

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) सीटू1,2,3के ऊतकों में विशिष्ट प्रोटीन और सेलुलर संरचनाओं को स्थानीय बनाने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। अनुचित निर्धारण विधियों और जटिल ऊतकों के उप-अनुकूल अनुभागऊतक संरचना को बाधित कर सकते हैं, उच्च पृष्ठभूमि धुंधला उत्पन्न कर सकते हैं या एंटीबॉडी-एपिटोप बातचीत को कम कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कलाकृतियों को धुंधला कर दिया जाता है और परिणामस्वरूप गलत व्याख्या की जाती है IHC डेटा4| के रूप में कशेरुकी रेटिना एक जटिल और अत्यधिक संगठित तंत्रिका अंग परस्पर photoceptors, interneurons और गुच्छिका कोशिकाओं के स्तर से बना है, यह बहुत नाजुक है और विच्छेदन और विच्छेदन के दौरान आसानी से बाधित किया जा सकता है. एक विस्तृत, मानकीकृत, और प्रतिरक्षा के लिए माउस आँख विच्छेदन और अभिविन्यास से मान्य प्रोटोकॉल काफी IHC कलाकृतियों को कम करने में मदद मिलेगी, जिससे, परिणामों की विश्वसनीयता बढ़ाने और अधिक सटीक तुलनात्मक डेटा के लिए अनुमति विश्लेषण.

IHC के लिए ऊतक की तैयारी के लिए कई प्रोटोकॉल हैं, तथापि, नहीं सभी रेटिना ऊतक के लिए उपयुक्त हैं. 10% फॉर्मेलिन या बूइन के समाधान जैसे मजबूत फिक्सेटिव विच्छेदनऔर अनुभाग5 के दौरान रेटिना संरचना को संरक्षित करते हैं। दुर्भाग्य से, मजबूत fixatives अक्सर बढ़ाया पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट और epitope के कारण epitopes6के रासायनिक संशोधन के लिए मास्किंग के लिए नेतृत्व. दूसरी ओर, मामूली fixatives, जैसे 4% paraformaldehyde (पीएफए) इन कलाकृतियों में से कुछ को कम कर सकते हैं, लेकिन जटिल विच्छेदन और अनुभाग की आवश्यकता के लिए इष्टतम रेटिना संरचना की रक्षा. पीएफए तेजी से ऊतक प्रवेश, लेकिन पार लिंक प्रोटीन बहुत धीरे धीरे, epitope मास्किंग के जोखिम को कम करने. कम समय पीएफए ऊष्मायन एक अपेक्षाकृत हल्के निर्धारण है के बाद से, ऊतकों अक्सर एंटीजन की रक्षा के लिए तेजी से ठंड की आवश्यकता होती है। ऊतक ठंड के दौरान बर्फ क्रिस्टल के गठन से बचने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि वे कोशिकाओं और ऊतकों की अखंडता को विकृत करते हैं और उन्हें नुकसान पहुंचातेहैं.

यहाँ हम विच्छेदन के लिए विस्तृत और मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन, निर्धारण, और माउस नेत्र पश्यं पीछे कप है कि लगातार और विश्वसनीय IHC डेटा उपज के क्रायो संरक्षण.

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Protocol

यहाँ वर्णित सभी तरीकों प्रयोगशाला पशु संसाधन संस्थान द्वारा प्रदान की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों में सिफारिशों के अनुसार किया गया और द्वारा अनुमोदित किया गया पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति.

विधियों के लिए सभी उपकरण और उपकरण चित्र 1 में दर्शाए गए हैं और सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध हैं।

1 . माउस आँख enucleation, नेत्र कप विच्छेदन, और embedding

  1. कार्बन डाइऑक्साइड के साथ चूहों Euthanize (सीओ2) या तो decapitation द्वारा पीछा किया (पोस्टल चूहों P0 - P11) या गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था (वयस्क और P11 चूहों). P0-P14 चूहों के लिए, आँखें त्वचा से कवर कर रहे हैं. बाद के चरणों से पहले त्वचा को हटाने के लिए सुनिश्चित करें।
  2. नेत्र के लौकिक भाग को चिह्नित करें (चित्र 2क) एक पुच्छ कॉटरइज़र का उपयोग करके कॉर्निया को थोड़ा जलाकर चिह्नित करें। कॉर्निया में एक छेद को बहुत हल्के से छूकर और कॉटरइज़र के साथ एक विभाजन दूसरे से अधिक नहीं के लिए जलने से बचें।
  3. तुरंत घुमावदार Dumont #5 का उपयोग कर माउस आँखें enucleate / बर्फ पर फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के 1 एमएल के साथ 1.5 एमएल क्रायोट्यूब ट्यूब में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  4. 4% पीएफए में 15 मिनट के बाद, घुमावदार बल्स Dumont #5/45 का उपयोग कर एक संशोधित 35 मिमी विच्छेदन पकवान (सामग्री और चित्र 1C की तालिका देखें ) PBS और विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत जगह से भरा का उपयोग कर निश्चित आँख हस्तांतरण।
  5. जलने के निशान पर एक छोटा सा चीरा बनाओ, सीधा करने के लिए और बस limbus के ऊपर (कॉर्निया की सीमा) सूक्ष्म चाकू का उपयोग कर.
  6. चीरा में घुमावदार कैंची डालें और लिम्बस के बाद कॉर्निया का परिधीय कट करें (चित्र 2ख) .
  7. कॉर्निया निकालें और एक पतली Dumont #5 संदंश के साथ लेंस निकालने, (चित्र 2B) और यह नाजुक आंख के पीछे के हिस्से से दूर उठा. काचाभ शरीर, स्पष्ट जेल जो लेंस और रेटिना के बीच की जगह को भर देता है, लेंस के साथ बाहर आ जाएगा (चित्र 2ख) और रेटिना पीछे की आंख कप के अंदर कवर एक सफेद सतह के रूप में दिखाई देगा। सुनिश्चित करें कि रेटिना को कोई दृश्य क्षति नहीं है, जैसे छेद या आँसू (चित्र 2C) .
  8. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के 1 एमएल में दो बार आंखों के कप धो लें।
  9. आंखों के कप के डूबने तक रात भर पीबीएस में 15% सुक्रोज के समाधान में उन्हें बराबर करके आंखों के कप की रक्षा करें
  10. आंखों के कप को पीबीएस में 30% सुक्रोज को 2-3 एच के लिए स्थानांतरित करें जब तक कि आंख कप सिंक न हो जाए।
  11. ओसीटी में आंखों के कपों को 10 x 10 मिमी क्रायोमोल्ड्स में एम्बेड करें (चित्र 3क) ) विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करके, अपने पृष्ठीय-अवतरण अक्ष के साथ क्रायोमोल्ड में नेत्र को उन्मुख करें (चित्र 2D, चित्र 3क) आंख को तब तक घुमाकर जब तक कि बर्न मार्क शीर्ष पर न हो जाए, ऑप्टिक तंत्रिका बाईं ओर है और मोल्ड का कट-आउट भाग दायीं ओर है ( चित्र 2D) ऊतक के पास बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखना।
    नोट: आंख कप में हेरफेर करने के लिए, एक टाइटेनियम एक पिपेट टिप से जुड़े तार से बना एक टाइटेनियम जांच का उपयोग करें।
  12. स्नैप-फ्रीज़ रेटिना ऊतक के लिए, एक धातु बीकर में कम से कम 5 मिनट के लिए क्रायोमोल्ड को विसर्जित करें जिसमें आइसोपेनेट न युक्त होते हैं और बीकर को तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ/100% इथेनॉल स्नान में रखें (धातु बीकर की ऊंचाई के 1/
    नोट: क्रायोमोल्ड को अपनी ऊंचाई के आधे से अधिक के लिए isopenten में डूब जाना चाहिए, लेकिन पूरी तरह से जलमग्न होने की जरूरत नहीं है।
  13. जमे हुए ब्लॉक निकालें और एल्यूमीनियम पन्नी में लपेट.
  14. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  15. ब्लॉक के अभिविन्यास को अभिलिखित करने के लिए पेन या शार्पी का उपयोग करके जमे हुए ब्लॉक को चिह्नित करें (चित्र 3ख) ।

2 . क्रायोस्टैट का उपयोग करके अनुभागीकरण

  1. क्रायोस्टैट तापमान (20 और -25 डिग्री सेल्सियस के बीच) को समायोजित करने के बाद, एम्बेडेड नेत्र कप वाले मोल्डों को 1 ज के लिए क्रायोस्टैट तापमान के बराबर करने की अनुमति दें।
  2. दोरसो-वेन्ट्रिल अभिविन्यास के साथ ब्लॉक स्थापित करें (चित्र 3C) और 10 डिग्री मीटर मोटी सीरियल वर्गों में कटौती। ध्यान से एनोटेट और गिने माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रेटिना वर्गों जगह है।
  3. IHC प्रक्रियाओं तक -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड बॉक्स में स्लाइड स्टोर करें।

3 . स्लाइड रैक का उपयोग करके फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग

नोट: स्लाइड रैक प्रणाली (उदा., सेक्वेंजा) स्लाइड और प्लेट के बीच एक $ 100 $L केशिका अंतर बनाने, एक कवर प्लेट के साथ कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड रखती है।

  1. कमरे के तापमान पर क्रायो-सेक्शन (आरटी) 2 ज से 4 एच के लिए उन्हें सूखने और माइक्रोस्कोप स्लाइड से संलग्न करने की अनुमति देने के लिए था।
    नोट: 30 मिनट से 1 ज के लिए 30-37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सुखाने के लिए भी संभव है।
  2. स्लाइड रैक में स्लाइड प्लेस और दो मिनट के लिए 100-200 डिग्री पीबीएस में दो बार रेटिना वर्गों धो।
  3. आरटी में 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.25% ट्राइटन-एक्स / 0.05% NaN3में इनक्यूबेट करके रेटिना वर्गों को प्रभावित करें।
  4. स्लाइड के लिए समाधान अवरुद्ध करने के 100 $L जोड़ें।
  5. स्लाइड के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
  6. इनक्यूबेट रेटिना वर्गों रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: इस समय के दौरान, वर्गों के शुष्कीकरण से बचने के लिए स्लाइड रैक को कवर करें।
  7. रेटिना वर्गों को धो लें 3 बार, प्रत्येक के लिए 15 मिनट, 200 डिग्री एल पीबीएस का उपयोग कर.
    नोट: पीबीएस (पीबीएस-टी) के लिए 0.001- 0.002% Triton-X100 के अलावा एक और अधिक कड़े धोने की अनुमति है, लेकिन कुछ झिल्ली और सेलुलर संरचनाओं को बाधित कर सकते हैं.
  8. आरटी में 1 एच के लिए फ्लोरोसेंट लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी में रेटिना वर्गों को इनक्यूबेट करें। अब से प्रकाश से बचाने के लिए.
  9. रेटिना वर्गों 3 बार धो लें, 15 मिनट के लिए प्रत्येक.
  10. इस तरह के Hoechst 33342 या DAPI समाधान के रूप में एक परमाणु मार्कर के साथ 5 मिनट के लिए आरटी पर रेटिना वर्गों इनक्यूबेट।
  11. रेटिना वर्गों 15 मिनट के लिए 1 समय धो लें.
  12. प्रयोगशाला बेंच पर एक कागज तौलिया के शीर्ष पर एक coverslip रखें.
  13. कवरस्लिप के केंद्र में विरोधी fading बढ़ते मीडिया के 2 बूँदें जोड़ें.
  14. रेटिना क्रायो-सेक्शन को नीचे की ओर ले जाने के लिए स्लाइड को चालू करें।
  15. ध्यान से कवरस्लिप को धीरे-धीरे माउंट करें, $45 डिग्री कोण पर, बढ़ते मीडिया पर स्लाइड को टिप करें।
    नोट: बुलबुले बनाने से बचने के रूप में आप जगह में स्लाइड कम.
  16. अतिरिक्त बढ़ते मीडिया को खत्म करने के लिए स्लाइड-कवरस्लिप संयोजन के लिए एक भारी पुस्तक या कैटलॉग (नीचे देखें) का उपयोग करके भी दबाव लागू करें।
    नोट: नमूना तैयारी में स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, हमेशा एक ही वस्तु का उपयोग करें, (यानी, एक ही किताब या कैटलॉग) स्लाइड बढ़ते के दौरान coverslip पर भी दबाव लागू करने के लिए.
  17. फ्लैट रखें और अंधेरे में आरटी पर रात भर कठोर करने के लिए अनुमति देते हैं। स्टोर स्लाइड 4 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए फ्लैट।
  18. व्यापक क्षेत्र या confocal फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से छवि (चित्र 4) .

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Representative Results

कैसे इन प्रोटोकॉल वर्णन करने के लिए, IHC के लिए इष्टतम रेटिना संरक्षण सुनिश्चित करने के लिए, हम P28 WT चूहों से रेटिना वर्गों की जांच (C57BL/6N) रोडोप्सिन के लिए एंटीबॉडी के साथ (एक photoceptor मार्कर)8, glutamic एसिड decarboxylase 65 (Gad65, एक amacrine सेल )9, ग्लूटामाइन सिन्थेटास (जी एस, एक मेलर सेल मार्कर)10, और कैल्बिडिन (एक क्षैतिज सेल मार्कर)11 (चित्र 4)। IHC संकेत मिलता है कि हमारे प्रोटोकॉल लगातार उच्च गुणवत्ता और अच्छी तरह से संरक्षित रेटिना वर्गों उपज. विशेष रूप से, रोडोप्सिन समृद्ध आंतरिक और बाहरी खंड ऊर्ध्वाधर और बरकरार रहते हैं, जिसमें रेटिना वर्णकित उपकला (आरपीई) (चित्र4क)को अधिक से अधिक अलग नहीं किया जाता है। इसके अतिरिक्त, मेलर कोशिकाएं सोमा के साथ अच्छी तरह से संरक्षित रहती हैं और कोशिकाद्रव्यी प्रक्रियाएं जो गुच्छिका कोशिका परत (जीसीएल) से बाहरी नाभिकीय परत (ओएनएल) तक फैली हुई हैं (चित्र 4ख)।

इंटरन्यूरॉन्स, जैसे Gad65-सकारात्मक amacrine कोशिकाओं, भी ठीक से INL और आंतरिक plexform परत के भीतर स्तरित रहते हैं (आईपीएल) (चित्र 4बी) जबकि अच्छी तरह से परिभाषित क्षैतिज कोशिकाओं INL और बाहरी plexiform में पता लगाने योग्य हैं परत (OPL) बॉर्डर (चित्र 4) सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों से पता चलता है कि हमारी विधि रेटिना सेल और ऊतक अखंडता को बरकरार रखता है, photoceptors से गुच्छिका कोशिकाओं के लिए

अनुप्रस्थ अनुभागकी सुविधा के लिए, ठंड से पहले क्रायो-मोल्ड में ऑप्टिकल कप को सावधानी से उन्मुख करना महत्वपूर्ण है। Misoriented रेटिना, गरीब अनुभागतकनीक या सुस्त या क्षतिग्रस्त microtome चाकू के साथ अनुभागीकरण इस तरह के रेटिना ऊतक आँसू, विकृति, और सेलुलर विस्थापन के रूप में कलाकृतियों का कारण बन सकता है, चित्रा 4के रूप में. अनुभाग कलाकृतियों के उदाहरण चित्र 4D-Fमें दिखाए गए हैं। चित्र 4D गरीब अनुभागन और संरेखण में प्रकाशग्राही आंतरिक और बाह्य खंड विरूपण का कारण बनते हैं (चित्र 4D) और छोटे ऊतक आँसू (चित्र 4E, तीर)। एक अन्य उदाहरण में, अनुभाग से पहले खराब ऊतक अभिविन्यास मुलर सेल सोमा और साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाओं चित्र 4Eके उप-अनुकूल संरेखण की ओर जाता है। चित्रा 4F से पता चलता है कि कैसे गरीब अनुभागकी संभावना एक सुस्त microtome चाकू की वजह से क्षैतिज कोशिकाओं के कारण OPL से जीसीएल के लिए aberantly धब्बा. इस प्रकार, सटीक ध्यान IHC डेटा की उच्चतम गुणवत्ता और reproducibility सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रत्येक कदम के निष्पादन के लिए लागू किया जाना चाहिए.

Figure 1
चित्रा 1 : माउस आँख विच्छेदन के लिए उपकरण, embedding, और IHC. (ए) काटेराइज़र; (बी) बाएँ से दाएँ: Dumont #5/45 घुमावदार संदंश, घुमावदार कैंची, और Dumont #5 पतली संदंश; (सी) 35 मिमी विच्छेदन डिश (तीर अंक विच्छेदन कक्ष के लिए); (डी) विक्षिंघरदर्शी का विनिविक्षिर करना; (ई) बाएँ से दाएँ जमे हुए उपकरण: अछूता कूलर, स्टेनलेस स्टील बीकर isopentane स्नान के लिए, स्टेनलेस स्टील तरल एन2 स्नान; (एफ) टाइटेनियम जांच; (जी) आईएचसी के लिए स्लाइड रैक और कवरप्लेट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा : माउस नेत्र कप अभिविन्यास और विवरण. (क) नेत्र अभिविन्यास की सुविधा के लिए अस्थायी बर्न मार्क स्थान (लाल तीर) (डॉर्सो जेड डी, अधर ] ट, अस्थायी जेड टी, नाक ] छ)। (बी) माउस नेत्र विच्छेदन के लिए Schematic. कॉर्निया में सीधा और एक ठीक स्केलपेल (माइक्रो चाकू) का उपयोग कर के लिम्बस के ऊपर एक छोटा सा चीरा जला निशान पर किया जाता है। आंख के पूर्वकाल और पीछे के हिस्से को अलग करने के लिए कॉर्निया के चारों ओर कटें। (सी) एक बरकरार रेटिना के साथ नेत्र कप। (डी) ऑप्टिक तंत्रिका (ऑन), लेंस (एल), कॉर्निया (सी) लिम्बस (ओएस) के साथ माउस आंख के डोर्सो-वेन्ट्रिल अभिविन्यास। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3 : माउस आंख embedding. (A) ओसीटीओसीटी से भरे क्रायोमोल्ड में डोर्सो-वेट्रल ओरिएंटेड चूहों की आंख का कप, (बी) जमे हुए माउस रेटिना कप एनोटेट क्रायोमोल्ड में। (सी) क्रायोस्टैट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4 : माउस रेटिना इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। (ए-सी) अच्छी गुणवत्ता और (डी-एफ) पी28 डब्ल्यूटी से खराब गुणवत्ता वाले रेटिना वर्गों को रोडोप्सिन (ए, सी) ऐमाक्रिन मार्कर GAD65 (बी, ई) और एमजेडलर सेल मार्कर ग्लूटामाइन सिंथेटाज़ (जी एस; बी, ई), और क्षैतिज सेल मार्कर कैल्बिडिन (सी, एफ)। सफेद तीर ऊतक आँसू और ऊतक के विदारक स्मीयरिंग की ओर इशारा करते हैं। स्केल बार, 20 m. न्यूक्ली को होचस्ट 33342 (नीला) के साथ लेबल किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

माउस रेटिना विच्छेदन छोटे आकार और माउस आंखों के आकार और रेटिना ऊतक की कमजोरी के कारण एक नाजुक प्रक्रिया है। हालांकि प्रदर्शन उच्च गुणवत्ता विच्छेदन अभ्यास की बात है, एक विस्तृत प्रोटोकॉल होने, कुशल तरीकों और सुझावों को उपलब्ध कराने के रेटिना वर्गों और IHC प्राप्त करने के लिए एक आवश्यकता है. प्रोटोकॉल के अलावा यहाँ वर्णित, वहाँ कई सुझाव है कि लगातार उच्च गुणवत्ता रेटिना वर्गों है कि reproduible IHC के लिए उपयुक्त हैं के लिए अनुमति देते हैं.

विच्छेदन के साथ शुरू करने से पहले, यह आरामदायक होना महत्वपूर्ण है, आराम और माउस आँख microdissection के दौरान इष्टतम दृष्टि के लिए कमरे प्रकाश व्यवस्था सेट. माउस आँख कप आकार बनाए रखने के लिए, जबकि आंख विच्छेदन विच्छेदन, हम कस्टम बनाया मोम लेपित विच्छेदन व्यंजनों में PBS में जलमग्न आँखें रखने का सुझाव देते हैं. हम हल्के गुलाबी रंग के दंत मोम के साथ एक 35 मिमी विच्छेदन पकवान कोटिंग सुझाव देते हैं (चित्र 1C)। दरअसल, दंत मोम के हल्के गुलाबी रंग एक विच्छेदन गुंजाइश के तहत आसानी से आंख संरचनाओं को देखने के लिए पर्याप्त विपरीत प्रदान करता है, मोम में आंख के आकार के छापों, मोम में microfuge ट्यूबों के आधार दबाकर बनाया, जबकि जगह में आंख कप रखेंगे विच्छेदन के दौरान आंख कप के आसपास उपकरणों के उचित रोटेशन की अनुमति. इसके अलावा, लेंस को हटाने के दौरान जितना संभव हो सके नेत्र कप से अधिक काचाभ तरल पदार्थ को हटाना महत्वपूर्ण है, क्योंकि अवशिष्ट काचाभ तरल पदार्थ ऊतक ब्लॉक ठंड चरण के दौरान बर्फ क्रिस्टल को नुकसान पहुंचाने वाले ऊतक बनाने के लिए प्रवण है। हम आम तौर पर एक ऊतक कागज का उपयोग करें और यह विच्छेदन नेत्र कप की सीमा के लिए जगह है, ध्यान से रेटिना ऊतक परेशान किए बिना केशिका द्वारा सभी शेष vitreous तरल पदार्थ को दूर करने के लिए. दुर्भाग्यपूर्ण मामले में जहां अवशिष्ट काचाभ तरल पदार्थ की एक छोटी राशि अभी भी आंख कप में मौजूद है, अनुभागीकरण -20 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए बर्फ में vitreous के परिवर्तन को कम करने और इसलिए ब्लेड के तीखेपन और अनुभाग की गुणवत्ता की रक्षा .

फिक्सेशन और एम्बेडिंग विधियों का भी वर्गों और आईएचसी की गुणवत्ता पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है। हालांकि फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों आंख के ऊतकों की इष्टतम संरचनात्मक अखंडता उपज, फॉर्मेलिन में मेथनॉल होता है जो पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट को बढ़ा सकता है। इन कलाकृतियों से बचने के लिए, हम ताजा EM ग्रेड paraformaldehyde (पीएफए) का उपयोग करने के लिए पृष्ठभूमि और autofluorscence मेथनॉल या ऑक्सीकरण PFA4,5,6की वजह से सीमित करने के लिए सलाह देते हैं. हम अनुशंसा करते हैं हल्के निर्धारण की स्थिति हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित बर्फ पर 15 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ आंख फिक्सिंग. चूंकि पीएफए तेजी से ऊतक प्रवेश, लेकिन पार लिंक प्रोटीन बहुत धीरे धीरे, उन शर्तों विच्छेदन के दौरान रेटिना संरचनात्मक अखंडता की रक्षा और प्रतिजन के लिए आवश्यकता के बिना आम रेटिना प्रतिजन की एंटीजेनिकता की रक्षा करने के लिए पर्याप्त हैं पुनः प्राप्ति के तरीके4| यदि रेटिना संरचना अच्छी तरह से संरक्षित नहीं है, तो पीएफए निर्धारण की अवधि को बढ़ाया जा सकता है, हालांकि यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि अधिक-फिक्सिंग ऊतकों में गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट में वृद्धि होगी और एपिटो मास्किंग का कारण बन सकता है, जबकि कम-फिक्सिंग ऊतक ऊतक की संरचनात्मक अखंडता से समझौता कर सकते हैं और प्रोटीओलिटिक गिरावट से ग्रस्त कुछ एंटीजन के नुकसान का कारण बन सकते हैं। कम समय पीएफए ऊष्मायन एक अपेक्षाकृत हल्के निर्धारण है के बाद से, हम भी OCT-एम्बेडेड आंख सूई द्वारा स्नैप फ्रीजिंग रेटिना की सिफारिश, एक cryomold में निहित (10 मिमी x 10 मिमी x 5 मिमी), एक isopentane स्नान में तरल नाइट्रोजन में डूबे. स्नैप फ्रीजिंग ऊतक एंटीजन की रक्षा करेंगे, जबकि सुक्रोज समाधान और ओसीटी क्रिओ-प्रोटेकेंट के रूप में कार्य करते हैं। इस विधि बर्फ क्रिस्टल के गठन के कारण ऊतक के विरूपण को कम करेगा, जो ऊतक क्षति के तथाकथित स्विस पनीर प्रकार पैदा कर सकता है. cryomold तरल नाइट्रोजन में सीधे डूबा नहीं होना चाहिए या यह फोड़ा शुरू कर देंगे, एक वाष्प बाधा बनाने और है कि ठंड की प्रक्रिया धीमी हो जाएगी, एक विषम निर्धारण और संरक्षण में जिसके परिणामस्वरूप. इसके अलावा, तरल नाइट्रोजन के संपर्क में ऊतक और ओसीटी दरार कर सकते हैं, जिससे आंख की अखंडता को प्रभावितकर सकतेहैं 7 . इसलिए, हम cryomold डुबकी की सिफारिश (10 मिमी x 10 मिमी x 5 मिमी) कोई अधिक से अधिक में 5 मिमी गहरी isopentane एक छोटे से स्टेनलेस स्टील बीकर का उपयोग कर, खुद को एक बड़ा स्टेनलेस स्टील बीकर में डूबा (100 मिमी चौड़ा न्यूनतम) तरल नाइट्रोजन युक्त. कई नमूनों की तैयारी के दौरान तरल नाइट्रोजन के तेजी से वाष्पीकरण से बचने के लिए, हम एक अछूता कूलर में दोनों स्नान रहते हैं. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि OCT में cryopreserving ऊतकों एक दीर्घकालिक संरक्षण विधि नहीं है, समय के साथ ऊतक में बर्फ क्रिस्टल के गठन के कारण जो subcellular आकृति विज्ञान और / नतीजतन, ऊतक ब्लॉक और जमे हुए वर्गों को अल्पकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर और -80 डिग्री सेल्सियस दीर्घकालिक भंडारण के लिए संग्रहीत किया जाना चाहिए।

स्तनधारी रेटिना एक असममित अंग है जिसमें अस्थायी-नासा और दोरसो-वेट्रल अक्षों में कोशिकाओं का एक विशिष्ट स्थानिक वितरण होता है। उदाहरण के लिए, एम- और एस-ऑप्सिन शंकु को एक विशिष्ट दोरसो-वेंट्रिल ग्रेडिएंट 12में व्यवस्थित किया जाता है। इसलिए, यह ऊतक तैयारी और अनुभागके दौरान आंख की उचित अभिविन्यास सुनिश्चित करने के क्रम में तुलनात्मक IHC प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है. हम विच्छेदन से पहले आंख पर एक संदर्भ चिह्न रखने के लिए एक कॉटरकाइज़र का उपयोग करते हैं (चित्र 2क, डी) ताकि हम embedding चरण के दौरान अपने पृष्ठीय-वेंट्रल अक्ष के साथ नेत्र कप उन्मुख कर सकें, और इसलिए पूरी तरह से अनुप्रस्थ अनुभाग प्राप्त कर सकते हैं। हम कॉटरइज़र के साथ एक विभाजन दूसरे के लिए कॉर्निया को छूकर, आंख के डोर्सो-टेम्पोरल भाग पर जला निशान रखते हैं। यह थोड़ा कॉर्निया जला जबकि यह में एक छेद भेदी से बचने की अनुमति देगा. नेत्र कप विच्छेदन के दौरान, हम एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए, जला निशान पर, कॉर्निया की सीमा के सीधा, सूक्ष्म चाकू का उपयोग कर (चित्र 2B). ब्लॉक के डोर्सो-वेंट्रल ओरिएंटेशन को सुविधाजनक बनाने और अनुभाग के दौरान अभिविन्यास समायोजन को कम करने के लिए, हम cryomold में पीछे नेत्र कप उन्मुख सुझाव देते हैं, cryomold के नीचे का सामना करना पड़ जला निशान और कॉर्निया के उद्घाटन के साथ पूरी तरह से क्राइओमल्ड के दाईं ओर के समानांतर (चित्र 3क, बी)। जमे हुए ब्लॉक cryostat में ब्लेड की ओर सामना करना पड़ ब्लॉक के नीचे के साथ स्थापित किया जाएगा, आंख कप ब्लेड के लंबवत, एक दोरसो-वेंट्रिकल अभिविन्यास में (चित्र 3c)।

विश्वसनीय रेटिना IHC इष्टतम, अनुकूलित, और reproduible विच्छेदन और ऊतक प्रसंस्करण के साथ शुरू होता है. यहाँ उल्लिखित विधि बेहतर रेटिना संरचना और अखंडता को बरकरार रखता है, जबकि autofluorscence और epitope मास्किंग कि फ्लोरोसेंट IHC समझौता कर सकते हैं कम से कम. इस प्रोटोकॉल के बाद यह सुनिश्चित करेंगे कि आपके पास पुन: उत्पादन योग्य उच्च-गुणवत्ता वाला डेटा है।

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Disclosures

कोई प्रकटीकरण नहीं.

Acknowledgments

इस काम NIH (RO1-GMO97327) और विश्वविद्यालय अनुसंधान फाउंडेशन (UPenn) से धन द्वारा समर्थित किया गया था. हम विशेष रूप से इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल के विकास में उसकी मदद के लिए स्वेतलाना सविना को धन्यवाद देते हैं, गॉर्डन रुथल (पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय) और माइक्रोस्कोपी और लेस्ली किंग, पीएच.डी. के साथ सहायता के लिए पेन वेट इमेजिंग कोर इस पांडुलिपि को पढ़ने के लिए महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) Gilson  #MA-48 For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil 
Cauterizer  Bovie #AA01 To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent  Electron Microscopy Sciences #72703-D For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge  Fine Science Tools  #15002-08 To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope  Leica, Houston, USA  MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle  Fine Science Tools  #10315-12 To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax  Electron Microscopy Sciences  #72660 For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate Ted Pella #36107 For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) Gilson  #MA-40 For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5   Fine Science Tools  #11254-20 To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm) Electron Miscroscopy Sciences  #62534-10 Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents Company Catalog Number Comments
Blocking solution 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.  
Gelvatol (anti-fading mounting media) Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8). 
Hoechst 33342 1000x Stock Thermo Scientific #62249 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x) 
Isopentane, 99%  GFS Chemicals #2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS Electron Microscopy Sciences  #15710 Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. 
Permeabilization solution PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS) Bioworld  #41620015-20 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock 
Sucrose solutions Fisher Scientific   #S-5-500 Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. 
Tissue-Tek OCT-compound  Sakura  #4583
Antibodies Company Catalog Number Comments
anti-calbindin Sigma-Aldrich C8666 To label horinzotal cells 
anti-GAD65 Chemicon AB5082 To label GABAergic amacrine cells
anti-GS BD Transduction 610517 To label Müller cells
anti-rhodopsin Millipore MAB5316 To label rods

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References

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  2. Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
  3. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  4. Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
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  6. Benerini Gatta, L., et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology. European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).
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  9. Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry. Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).
  10. Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).
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  12. Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).

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Léger, H., Santana, E.,More

Léger, H., Santana, E., Beltran, W. A., Luca, F. C. Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (149), e59683, doi:10.3791/59683 (2019).

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