Summary
本報告では、免疫組織化学(IHC)のための凍結マウス網膜切片を準備するための包括的な方法について説明する。 記載された方法は、眼後カップの解剖、パラホルムアルデヒド固定、最適切断温度(OCT)培媒体および組織配向への埋め込み、断断および免疫染色を含む。
Abstract
免疫組織化学(IHC)のための高品質のマウス眼科の準備は、再生体の構造と機能を評価し、および再生疾患の根底にあるメカニズムを決定するために重要です。組織の調製全体を通じて構造的完全性を維持することは、再現可能な再生可能な再生IHCデータを得るために不可欠ですが、再生細胞構造の脆弱性と複雑さのために困難な場合があります。10%ホルマリンまたはBouinの溶液のような強力な固定剤は、尾膜構造を最適に保存し、それらはしばしば背景蛍光および/または減少する抗体エピトープ相互作用を増強することによってIHC分析を妨げる、エピトープマスキングとして知られているプロセスである。一方、穏やかな固定剤は、4%パラホルムアルデヒドのように、背景蛍光およびエピトープマスキングを減少させ、細心の注意を払って解剖技術を利用して、尾膜構造を維持しなければならない。本稿では、網膜構造完全性を損なうことなく、ほとんどの抗体エピトープ相互作用を維持するのに十分なIHC用マウス眼後カップを調製する包括的な方法を提示する。我々は、最適かつ最適でない条件下で組織の保存と向きを示すために、様々な再生細胞型マーカーに対する抗体を有する代表的なIHCを含む。私たちの目標は、眼後カップ解剖からIHCへの完全なプロトコルを提供することにより、網膜のIHC研究を最適化することです。
Introduction
免疫組織化学(IHC)は、その中の組織における特定のタンパク質および細胞構造を局所化するための強力な技術である1,2,3.複雑な組織の不適切な固定方法と最適でない断面は、組織構造を破壊し、高いバックグラウンド染色を生成したり、抗体エピトープ相互作用を減少させたり、染色アーティファクトおよび結果的に誤解を招く可能性があります。IHC データ4.脊椎動物網膜は、相互接続された光受容体、インターニューロンおよび神経節細胞の層から構成される複雑で高度に組織化された神経器官であり、非常に壊れやすく、解剖および切断中に容易に破壊されうる。マウスの眼の解剖とオリエンテーションから免疫染色までの詳細で標準化された検証済みのプロトコルは、IHCアーティファクトを大幅に削減し、結果の信頼性を高め、より正確な比較データを可能にします。分析。
IHCの組織調製のための多くのプロトコルがありますが、すべてがリニア組織に適しているわけではありません。10%ホルマリンやBouinの溶液のような強力な固定剤は、解剖および断面5の間に尾膜構造を保持する。残念ながら、強力な固定剤は、多くの場合、エピトープ6の化学修飾による強化された背景蛍光およびエピトープマスキングにつながる。一方、4%パラホルムアルデヒド(PFA)のような穏やかな固定剤は、これらのアーティファクトの一部を緩和することができますが、最適な尾膜構造を維持するために細心の解剖と断面が必要です。PFAは急速に組織に浸透するが、タンパク質を非常にゆっくりと交差させるので、エピトープマスキングのリスクを低減する。短時間のPFAインキュベーションは比較的軽度の固定であるため、組織はしばしば抗原を保存するために急速な凍結を必要とする。細胞や組織の完全性を歪め、損傷するので、組織凍結中の氷の結晶形成を避けることは重要です7.
ここでは、一貫性のある信頼性の高いIHCデータを生み出すマウス眼後カップの解剖、固定、およびクライオ保護のための詳細で標準化されたプロトコルについて説明します。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、実験動物資源研究所が提供する実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所の勧告に従って厳格に実施され、ペンシルバニア大学の施設動物ケア・使用委員会
この方法のすべてのツールと機器を図 1に示し、材料の表に示します。
1 .マウスの目のエニュレーション、アイカップの解剖、および埋め込み
- 二酸化炭素(CO2)でマウスを安楽死させ、その後に切断(出生後マウスP0-P11)または子宮頸部脱臼(成人>P11マウス)のいずれかが続く。P0-P14マウスの場合、目は皮膚で覆われています。後続の手順の前に、皮膚を取り除くようにしてください。
- テール焼灼器を使用して角膜をわずかに燃やして、眼の時間的な部分(図2A)をマークします。角膜に非常に軽く触れ、焼灼器で1秒以下で角膜に穴を開けないようにしてください。
- 湾曲したデュモン#5/45鉗子を使用して、マウスの目を直ちに取り込みます。1.5 mLのクライオチューブチューブで15分間インキュベートし、1mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を氷上のリン酸緩衝生理食液(PBS)でインキュベートします。
- 4%PFAで15分後、曲面鉗子デュモン#5/45を使用して固定眼をPBSで満たされた修正された35mm解剖皿(材料表および図1Cを参照)に移し、解剖顕微鏡の下に置きます。
- マイクロナイフを使用して、リム(角膜の境界)に垂直で、ちょうど上の火傷マークで小さな切開を行います。
- 湾曲したはさみを切開部に挿入し、四肢に続く角膜の円周切り取りを行います(図2B)。
- 角膜を取り出し、薄いデュモン#5鉗子でレンズを抽出し(図2B)、目の後部から繊細に持ち上げます。レンズと網膜の間の空間を埋める透明なゲルである静脈状体がレンズ(図2B)で出てきて、網膜が後眼カップの内側を覆う白い面として見えます。穴や涙などの網膜に目に見える損傷がないことを確認してください(図2C)。
- 眼のカップを1mLのPBSで2回、室温で10分間洗います。
- アイカップが沈むまで4°Cで一晩PBSで15%ショ糖の溶液でそれらを平衡化することにより、眼カップを凍結保護
- 眼カップが沈むまで2~3時間PBSで30%のショ糖に眼カップを移します。
- 10 x 10 mm のクライモルドで目のカップを OCT に埋め込みます (図 3A)。解剖顕微鏡を使用して、その背部腹部軸に沿って凍結で目を向けます (図 2D,図3A)火傷マークが上にあるまで目を回転させることによって、視神経が左側にあり、カビの切り取り部分が右側に向きます (図2D)。組織の近くの気泡を避けるために注意してください。
注:アイカップを操作するには、ピペットチップに取り付けられたチタンワイヤーで作られたチタンプローブを使用します。 - リネット組織をスナップ凍結するには、イソペンタンを含む金属ビーカーに少なくとも5分間クライモールドを浸し、ビーカーを液体窒素またはドライアイス/100%エタノール浴(金属ビーカーの高さの1/3まで)に入れます。
注:クライモルドは、その高さの半分以上にイゼンタンに浸漬する必要がありますが、完全に水没する必要はありません。 - 冷凍ブロックを取り出し、アルミホイルで包みます。
- -80 °C.で保存します。
- ペンまたはシャープを使用してフリーズブロックにマークを付け、ブロックの向きを記録します (図 3B)。
2 .クライオスタットを使用した断面
- クライオスタット温度(-20~-25°C)を調整した後、埋め込まれたアイカップを含む金型を1時間クライオスタット温度に平衡させます。
- ドーソ通気の向き(図3C)でブロックを取り付け、10μmの厚いシリアルセクションを切断します。注意深くアノンテットと番号付き顕微鏡スライド上に樹脂セクションを配置します。
- スライドは、IHCの手順まで-20 °Cまたは-80 °Cでスライドボックスに保管してください。
3 .スライドラックを用した蛍光免疫染色
注:スライドラックシステム(例えば、Sequenza)は、カバープレート付きのガラス顕微鏡スライドを保持し、スライドとプレートの間に約100μLの毛細血管ギャップを作成します。
- 室温(RT)で2時間から4時間凍結切片を解凍し、顕微鏡スライドに乾燥させて取り付けます。
注:30-37 °Cで30分から1時間乾燥することも可能です。 - スライドラックにスライドを配置し、100-200 μL PBSで2分間、樹脂片を2回洗浄します。
- RTで5分間PBSで0.25%トリトン-X/0.05%NaN3でそれらをインキュベートすることにより、再生片を透過化します。
- スライドに100 μLのブロッキング溶液を追加します。
- ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体を100μLの一次抗体をスライドに添加する。
- 4°Cで一晩で再生する。
注: この間、スライド ラックをカバーして、セクションの乾燥を防ぐ。 - 200 μL PBS を使用して、それぞれ 15 分間、樹脂切り切りを 3 回洗浄します。
注:0.001- 0.002% トリトンX100をPBS(PBS-T)に添加すると、より厳格な洗浄が可能になりますが、一部の膜や細胞構造を破壊する可能性があります。 - RTで1時間蛍光標識二次抗体で再生性の再生部。これからは光から守る。
- 樹脂切片を3回洗い、それぞれ15分間洗います。
- Hoechst 33342またはDAPI溶液などの核マーカーでRTのレチナルセクションを5分間インキュベートします。
- 樹脂切片を1回15分間洗います。
- ラボのベンチにペーパータオルの上にカバースリップを置きます。
- カバースリップの中心にフェージング防止マウントメディアを2滴追加します。
- スライドを裏返して、尾道の凍結セクションを下向きにします。
- カバースリップを慎重に約45°の角度でゆっくりと取り付け、スライドを取り付けメディアに先端にします。
注: スライドを下げると、バブルの形成を避けてください。 - 重い本またはカタログ(下記参照)を使用して、余分な取り付けメディアを排除するためにスライドカバースリップの組み合わせに均等な圧力を加えます。
注:サンプル調製の一貫性を確保するために、スライドの取り付け中にカバースリップに均等な圧力をかけるには、常に同じオブジェクト(同じブックまたはカタログ)を使用してください。 - 平らに保ち、暗闇の中でRTで一晩硬化させます。スライドを4°Cで無期限に平らに保管してください。
- 広視野または共焦点蛍光顕微鏡による画像(図4)。
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Representative Results
これらのプロトコルを説明するために、IHCに最適な網膜保存を確保するために、我々はロドプシン(光受容体マーカー)8、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65(Gad65、アマクリン細胞)に対する抗体を用いてP28 WTマウス(C57BL/6N)から網膜切除を調べた。マーカー)9、グルタミン合成酵素(GS、ミュラー細胞マーカー)10、及びカルビンジン(水平細胞マーカー)11(図4)。IHCは、当社のプロトコルが一貫して高品質で保存された樹脂セクションを生み出していることを示しています。特に、ロドプシンが豊富な内側および外側のセグメントは垂直であり、網膜色素上皮(RPE)の上に横たわってからほとんどまたは全く分離しないままである(図4A)。さらに、ミュラー細胞は、神経節細胞層(GCL)から外側核層(ONL)に及ぶソマと細胞質プロセスを適切に整列させ、十分に保存されたままである(図4B)。
Gad65陽性のアマクリン細胞のようなインターニューロンも、INLおよび内部プレキシフォーム層(IPL)内で適切に層化されたままであり、明確に定義された水平細胞はINLおよび外プレキシフォームで検出可能である。レイヤー (OPL) の境界線 (図 4C)。これらのデータは、光受容体から神経節細胞まで、網膜細胞と組織の完全性を維持することを示しています。
横方向断面を容易にするためには、凍結する前に、光カップをクライオ金型に細心の注意を払って向き方をすることが重要です。見当違いの網膜は、図4のように、鈍いまたは損傷したマイクロトームナイフによる断面化または断面化が、網膜組織の涙、歪み、および細胞変位などのアーティファクトを引き起こす可能性がある。断面アーティファクトの例を図 4D-Fに示します。図4D不良断面および位置合わせは、光受容体の内側および外側のセグメントの歪み(図4D)および小さな組織涙(図4E、矢印)につながる。別の例では、セクションの前に不十分な組織の向きは、ミュラー細胞ソマおよび細胞質プロセス図4Eの最適な位置合わせにつながる。図4Fは、鈍いマイクロトームナイフによって引き起こされる可能性が低い断面が、OPLからGCLに水平細胞を異常に塗りつぶす原因となったことを示す。したがって、IHCデータの最高品質と再現性を確保するために、プロトコルに概説されている各ステップの実行に正確な注意を払う必要があります。
図1:マウスの目の解剖、埋め込み、およびIHCのためのツール。(A) 焼灼器;(B) 左から右へ解剖ツール:デュモン#5/45曲げられた鉗子、湾曲したはさみ、およびデュモンは薄い鉗子#5。(C) 35 mm解剖皿(矢印は解剖室を指す)。(D) 解剖顕微鏡;(E)左から右に冷凍ツール:絶縁クーラー、アイオペンタン風呂用ステンレススチールビーカー、ステンレススチール液体N2浴。 (F)チタンプローブ;(G) IHC用スライドラックとカバープレート。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウスアイカップの向きと説明。(A)一時的な書き込みマーク位置(赤い矢印)は、眼の向きを容易にする(ドルソ=D、腹部=V、時間= T、鼻=N)。(B) マウスの目の解剖のための回路図。小さな切開は、細かいメス(マイクロナイフ)を使用して、角膜に垂直で、四肢のすぐ上に、火傷マークで行われます。角膜の周りを切り取り、眼の前部と後部を分離します。(C)網膜をそのままにしたアイカップ。(D)視神経(ON)、レンズ(L)、角膜(C)四肢(OS)を有するマウス眼のドルソ腹部方向き。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウスアイ埋め込み。(A)ドルソ腹部指向マウスアイカップをOCTで満たしたクライオモルドで、(B)注調されたクライオモルドで凍結マウスのレチナルカップ。(C) クライオスタットこの図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: マウス網膜免疫組織化学。(A-C) 良好な品質および(D-F)P 28 WTからの悪質なルネ膜切片を、ロドプシン(A,C)アマクリンマーカーGAD65(B,E)およびミュラー細胞マーカーグルタミン合成酵素(GS;に対する抗体で標識した。B、E)、および水平細胞マーカーカルビンジン(C、F)。白い矢印は、組織の涙と組織の異常な塗りつぶしを指しています。スケールバー、20 μm. Hoechst 33342(青)で標識されたNuclei。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マウス網膜解剖は、マウスの目の小さなサイズと形状と網膜組織の脆弱性による繊細なプロセスです。高品質の解剖を行うことは実践の問題ですが、詳細なプロトコルを持って、効率的な方法とヒントを提供することは、再生部とIHCを得るために必要です。ここで説明するプロトコルに加えて、再現可能な IHC に適した一貫した高品質の整膜セクションを可能にするいくつかのヒントがあります。
解剖を始める前に、マウスの目の微細解剖の間に最適な視力のための部屋の照明を快適に、リラックスして設定することが重要です。目を解剖しながらマウスアイカップの形状を維持するために、我々はカスタムメイドのワックスコーティング解剖皿でPBSに目を沈めておくことをお勧めします。薄いピンク色の歯科用ワックスで35mm解剖皿を塗布することをお勧めします(図1C)。確かに、歯科ワックスの明るいピンク色は、解剖範囲の下で容易に目の構造を見るのに十分なコントラストを提供し、ワックスの目の大きさの印象は、ワックスにマイクロフュージチューブのベースを押すことによって作られ、アイカップを所定の位置に保ちます。解剖の間に目のコップのまわりの用具の適切な回転を可能にする。また、レンズを取り外しながらアイカップからできるだけ多くの静脈液を取り除くことが重要であり、残存性静脈液は組織ブロック凍結工程中に氷結晶を損傷する組織を形成しやすい。私たちは一般的にティッシュペーパーを使用し、解剖された眼球の境界に置き、網膜組織を妨げることなく毛細血管によって残りの静脈液をすべて慎重に除去します。少量の残留静脈液が眼カップに残っている不幸な場合、氷の中の静脈の形質を減らし、刃の鋭さと断面の質を維持するために-20 °Cで断面を行う必要があります。.
固定および埋め込み方法は、セクションと IHC の品質にも大きな影響を与えます。ホルマリン固定パラフィン埋め込みセクションは、眼組織の最適な構造的完全性をもたらすが、ホルマリンは背景蛍光を増強することができるメタノールを含有する。これらのアーティファクトを避けるために、我々は、メタノールまたは酸化PFA4、5、6によって引き起こされる背景および自己蛍光を制限するために、新鮮なEMグレードのパラホルムアルデヒド(PFA)を使用することをお勧めします。私たちは、氷上で15分間4%のパラホルムアルデヒドで目を固定する私たちのプロトコルに記載されている穏やかな固定条件をお勧めします。PFAは急速に組織に浸透するが、タンパク質を非常にゆっくりと交差させるので、これらの条件は解剖中に樹脂構造の完全性を維持し、抗原を必要とせずに一般的な再生抗原の抗原を維持するのに十分である。取得方法4.網膜構造が十分に保存されていない場合、PFA固定の持続時間を増加させることができるが、過剰固定組織は非特異的な背景蛍光を増強し、エピトープマスキングにつながる可能性があることに注意することが重要である。組織は、組織の構造的完全性を損なう可能性があり、プロテオ分解になりやすいいくつかの抗原の損失を引き起こす可能性があります。短時間のPFAインキュベーションは比較的軽度の固定であるため、液体窒素に浸漬したイオペンタン浴場で、クリムド(10mm x 10 mm x 5mm)に含まれるOCT埋め込み眼を浸漬してスナップ凍結網膜を推奨します。スナップ凍結組織は抗原を保存し、ショ糖溶液とOCTは凍結保護剤として作用します。この方法は、いわゆるスイスチーズタイプの組織損傷を引き起こす可能性のある氷の結晶の形成による組織の歪みを低減します。クライモドールは液体窒素に直接浸したり、沸騰し始めたり、蒸気バリアを形成し、凍結プロセスが遅くなり、不均一な固定と保存が生じます。さらに、液体窒素と接触する組織およびOCTは割れることができ、それによって眼7の完全性に影響を与える。したがって、液体窒素を含むより大きなステンレススチールビーカー(幅100mm)に浸漬し、小さなステンレススチールビーカーを使用して、5mm以下の深さのイオペンタンでクライモルド(10mm x 10 mm x 5 mm)を浸すのをお勧めします。いくつかのサンプルの調製中に液体窒素の急速な蒸発を避けるために、我々は絶縁されたクーラーで両方の浴室を保つ。OCTの凍結保存組織は、細胞内の形態を変化させ、いくつかの抗原を変生させることができる時間の経過とともに組織内の氷結晶の形成のために、長期保存方法ではないことに留意すべきである。その結果、組織ブロックおよび凍結部は、短期保存および-80°C長期保存のために-20°Cで保存する必要があります。
哺乳類網膜は、側頭鼻軸と背腹部軸を横切る細胞の特定の空間分布を持つ非対称器官である。例えば、M-およびS-オプシンコーンは、特定のドルソ心勾配12に配置される。したがって、比較IHCを行うためには、組織の調製および断面を通じて目の適切な向きを確保することが不可欠です。我々は、埋め込み段階の間に背腹部軸に沿って眼球カップを向けることができるように、解剖の前に目に基準マークを配置するために焼灼器を使用し、したがって完全に横方向のセクションを得ることができます。私たちは、目のドーソ側の部分に火傷マークを置き、角膜に1秒間触れ、焼灼器で一瞬触します。これは、それに穴を突き刺すことを避けながら、わずかに角膜を燃やすことを可能にします。眼カップ解剖の間、我々は、マイクロナイフを使用して、角膜の境界に垂直な火傷マークで、小さな切開を行う(図2B)。ブロックのドルソ腹部の向きを容易にし、断面中の方向調整を最小限に抑えるために、クライオルドの後眼カップの向きを整え、焼け跡がクライモドールの底部と角膜の開口部に完全に向かうことを提案します。クライオモルドの右側の平行(図3A、B)。凍結したブロックは、凍結スタットのブレードに向かってブロックの底部、ブレードに垂直なアイカップ、ドルソ腹部向きで設置されます(図3c)。
信頼性の高い網膜IHCは、最適で適応性があり、再現性の高い解剖と組織処理から始まります。ここで概説する方法は、蛍光IHCを損なう可能性のある自己蛍光およびエピトープマスキングを最小限に抑えながら、樹脂構造と完全性を最適に維持します。このプロトコルに従って、再現可能な高品質のデータを持っていることを確認します。
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Disclosures
開示なし。
Acknowledgments
本研究は、NIH(RO1-GMO97327)と大学研究財団(UPenn)の資金で支援されました。特にスヴェトラーナ・サヴィーナが免疫組織化学プロトコル、ゴードン・ルセル(ペンシルバニア大学)、ペン・ヴェット・イメージング・コアの顕微鏡検査とレスリー・キング博士の助けを借りて、この原稿を批判的に読んでくれたことに感謝します。.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | For liquid nitrogen (Figure 1E) |
| Aluminum foil | |||
| Cauterizer | Bovie | #AA01 | To mark eye orientation (Figure 1A) |
| Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A) |
| Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | #15002-08 | To circumferentially cut the cornea (Figure 1B) |
| Dental wax-coated 35mm dissection dish | For eye cup dissection (Figure 1C) | ||
| Dissecting microscope | Leica, Houston, USA | MZ12.5 High-performance stereomicroscope | |
| Micro Knives - Plastic Handle | Fine Science Tools | #10315-12 | To make a small incision at the burn mark (Figure 1A) |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | #72660 | For coating dissection dish |
| Slide Rack and Coverplate | Ted Pella | #36107 | For retinal IHC (Figure 1G) |
| Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | For isopentane bath (Figure 1E) |
| Styrofoam box | For insulated cooler | ||
| Thin forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Electron Miscroscopy Sciences | #62534-10 | Mold for OCT embedding |
| Buffers and Reagents | Company | Catalog Number | Comments |
| Blocking solution | 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer. | ||
| Gelvatol (anti-fading mounting media) | Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops). Store in amber drop bottle at 4°C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh at 1 ug/mL (1x) |
| Isopentane, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| Paraformaldehyde (PFA) in PBS | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. |
| Permeabilization solution | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3. Prepare fresh. | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. Prepared from 10x stock |
| Sucrose solutions | Fisher Scientific | #S-5-500 | Dissolve the appropriate amount of sucrose in 37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. |
| Tissue-Tek OCT-compound | Sakura | #4583 | |
| Antibodies | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | To label horinzotal cells |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | To label GABAergic amacrine cells |
| anti-GS | BD Transduction | 610517 | To label Müller cells |
| anti-rhodopsin | Millipore | MAB5316 | To label rods |
References
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