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Neuroscience

면역 조직 화학을 위한 마우스 망막 극저온 단면도 단면도의 준비

Published: July 1, 2019 doi: 10.3791/59683

Summary

이 보고는 면역성 화학을 위한 동결된 마우스 망막 단면도를 준비하기 위한 포괄적인 방법을 기술합니다 (IHC). 설명된 방법은 안구 후방 컵의 해부, 파라포름알데히드 고정, 최적 절삭 온도(OCT) 매체 및 조직 배향에 포함, 단면화 및 면역 염색을 포함한다.

Abstract

면역 조직 화학 (IHC)를 위한 고품질 마우스 눈 단면도의 준비는 망막 구조물 및 기능을 평가하고 망막 질병의 근본적인 기계장치를 결정하기를 위해 중요합니다. 조직 준비 전반에 걸쳐 구조적 무결성을 유지하는 것은 재현 가능한 망막 IHC 데이터를 얻는 데 필수적이지만 망막 세포아키텍처의 취약성과 복잡성으로 인해 어려울 수 있습니다. 10% 포르말린 또는 Bouin의 용액과 같은 강한 고착제는 망막 구조를 최적으로 보존하며, 종종 배경 형광을 향상시키고 항체-에피토프 상호작용을 감소시킴으로써 IHC 분석을 방해합니다. 온화한 고착제는, 4% 파라포름알데히드와 같이, 배경 형광 및 에피토프 마스킹을 감소시키고, 세심한 해부 기술은 망막 구조물을 보존하기 위하여 이용되어야 합니다. 이 문서에서는, 우리는 망막 구조 무결성의 손실 없이 대부분의 항체 에피토프 상호 작용을 보존하기에 충분한 IHC를 위한 마우스 안구 후방 컵을 준비하는 포괄적인 방법을 제시합니다. 우리는 최적이고 최적이 아닌 조건 하에서 조직 보존 및 방향을 설명하기 위해 다양한 망막 세포 유형 마커에 대한 항체를 가진 대표적인 IHC를 포함합니다. 우리의 목표는 안구 후방 컵 해부에서 IHC에 완전한 프로토콜을 제공하여 망막의 IHC 연구를 최적화하는 것입니다.

Introduction

면역 조직 화학 (IHC)는 1,2,3의조직에서 특정 단백질 과 세포 구조를 국소화하기위한 강력한 기술입니다. 복잡한 조직의 부적절한 고정 방법 및 최적 절편은 조직 구조를 방해하거나, 높은 배경 염색을 생성하거나 항체 에피토프 상호 작용을 감소시켜 유물을 염색하고 결과적으로 잘못된 해석을 초래할 수 있습니다. IHC 데이터4. 척추동물 망막은 상호 연결된 광수용체, 인터뉴런 및 신경절 세포의 지층으로 구성된 복잡하고 고도로 조직된 신경 기관이기 때문에 매우 취약하며 해부 및 절편 중에 쉽게 중단 될 수 있습니다. 마우스 눈 해부 및 면역 염색에 이르는 상세하고 표준화되고 검증된 프로토콜은 IHC 아티팩트를 크게 감소시켜 결과의 신뢰성을 높이고 보다 정확한 비교 데이터를 가능하게 합니다. 분석.

IHC를 위한 조직 준비를 위한 많은 프로토콜이 있습니다, 그러나, 모두가 망막 조직을 위해 적당하지 않습니다. 10 % 포르말린 또는 Bouin의 용액과 같은 강력한 고정제는 해부 및 절편동안망막 구조를 보존5 . 불행하게도, 강한 고정식은 종종 에피토프 6의 화학적 변형으로 인해 향상된 배경 형광및 에피토프 마스킹으로 이어질 . 다른 한편으로는, 온화한 고착제, 같은 4% 파라 포름 알데히드 (PFA) 이러한 유물의 일부를 완화 수 있지만 최적의 망막 구조를 보존하기 위해 세심한 해부 및 단면이 필요합니다. PFA는 조직을 빠르게 관통하지만 단백질을 매우 느리게 연결하여 에피토프 마스킹의 위험을 줄입니다. 짧은 시간 PFA 배양은 상대적으로 온화한 고정이기 때문에, 조직은 수시로 항원을 보존하기 위하여 급속한 동결을 요구합니다. 그들은 왜곡세포와 조직의 무결성을 손상으로 조직 동결 동안 얼음 결정형성을 방지하는 것이 중요하다 7.

여기서는 일관되고 신뢰할 수 있는 IHC 데이터를 산출하는 마우스 안구 후방 컵의 해부, 고정 및 냉동 보호를 위한 상세하고 표준화된 프로토콜을 설명합니다.

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Protocol

여기에 설명된 모든 방법은 실험실 동물 자원 연구소에서 제공하는 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 국립 보건 원의 권고사항에 따라 엄격하게 수행되었으며, 펜실베니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회.

메서드에 대한 모든 도구와 장비는 그림 1에 나와 있으며 재료표에 나열되어 있습니다.

1 . 마우스 눈 핵, 눈 컵 해부 및 포함

  1. 이산화탄소 (CO2)를 가진안락사 마우스는 참수 (산후 마우스 P0 - P11) 또는 자궁 경부 탈구 (성인 >P11 마우스)에 의해 뒤따릅니다. P0-P14 마우스의 경우, 눈은 피부로 덮여 있습니다. 후속 단계 전에 피부를 제거하십시오.
  2. 꼬리 소작기를 사용하여 각막을 약간 연소시켜 눈의 측두체 부분을 표시합니다(그림2A). 각막을 매우 가볍게 만져서 각막에 구멍을 뚫지 말고 소작으로 1 초 이상 두지 마십시오.
  3. 구부러진 Dumont #5/45 포셉을 사용하여 마우스 눈을 즉시 enucleate합니다. 1.5 mL 저온 튜브에서 1mL의 파라포름알데히드(PFA)를 얼음 위에 인산완충 식염수(PBS)로 15분 동안 배양합니다.
  4. 4% PFA에서 15분 후, 곡선 포셉 듀몬트 #5/45를 사용하여 고정된 눈을 수정된 35mm 해부 접시(재료 그림 1C참조)로 옮기고 해부 현미경 으로 배치합니다.
  5. 마이크로 나이프를 사용하여 팔다리 (각막의 테두리)에 수직으로 화상 자국에서 작은 절개를하십시오.
  6. 절개에 곡선 가위를 삽입하고 팔다리 다음 각막의 원주 절단을 수행 (그림2B).
  7. 각막을 제거하고 얇은 Dumont #5 집게로 렌즈를 추출하고 (그림2B)눈의 뒤쪽 부분에서 섬세하게 들어 올립니다. 렌즈와 망막 사이의 공간을 채우는 유리체, 클리어 젤은 렌즈 (그림2B)와함께 나올 것이며 망막은 후방 눈 컵의 내부를 덮는 흰색 표면으로 볼 수 있습니다. 구멍이나 눈물과 같은 망막에 눈에 띄는 손상이없는지 확인합니다(그림 2C).
  8. 실온에서 10분 동안 PBS 1mL에 아이컵을 두 번 씻습니다.
  9. 아이컵이 가라앉을 때까지 PBS에서 밤새 15% 자당용으로 평형화하여 아이컵을 냉동 보호
  10. 아이컵이 가라앉을 때까지 2-3시간 동안 PBS에서 30% 자당으로 아이컵을 옮김시.
  11. 10 x 10mm 크라이오몰드 (그림3A)에10 x 10mm의 눈 컵을 포함시다. 해부 현미경을 사용하여, 등쪽-복부 축을 따라 극저온에서 눈을 배향(그림 2D, 그림 3A)화상 마크가 상단에 될 때까지 눈을 회전시켜, 시신경은 왼쪽에 있고 금형의 절단 부분은 오른쪽을 향하고 ( 그림2D)를 참조하십시오. 조직 근처의 거품을 피하기 위해주의하십시오.
    참고: 아이컵을 조작하려면 파이펫 팁에 부착된 티타늄 와이어로 만든 티타늄 프로브를 사용하십시오.
  12. 망막 조직을 스냅 동결하려면, isopentane을 포함하는 금속 비커에 적어도 5 분 동안 cryomold를 담그고 액체 질소 또는 드라이 아이스 / 100 % 에탄올 목욕 (금속 비커 높이의 최대 1/3)에 비커를 놓습니다.
    참고 : 크라이오몰드는 이소마에 잠겨있어야합니다그것의 높이의 절반 이상으로 opentane하지만 완전히 침수 할 필요가 없습니다.
  13. 냉동 블록을 제거하고 알루미늄 호일에 포장합니다.
  14. -80 °C에서 보관하십시오.
  15. 펜이나 샤키를 사용하여 고정된 블록을 표시하여 블록의 방향을 기록합니다(그림3B).

2 . 저온 극저온을 이용한 절제

  1. 저온 온도(--20~-25°C 사이)를 조정한 후, 내장된 아이컵이 포함된 몰드가 1시간 동안 저온 온도에 평형을 되도록 합니다.
  2. 도르소 복부 방향(그림3C)으로블록을 설치하고 10 μm 두께의 직렬 섹션을 잘라냅니다. 주석이 달고 번호가 매겨진 현미경 슬라이드에 망막 절편을 조심스럽게 놓습니다.
  3. 슬라이드를 IHC 절차가 될 때까지 -20°C 또는 -80°C의 슬라이드 상자에 보관하십시오.

3 . 슬라이드 랙을 이용한 형광 면역 염색

참고: 슬라이드 랙 시스템(예: Sequenza)은 커버 플레이트가 있는 유리 현미경 슬라이드를 수납하여 슬라이드와 플레이트 사이에 ~100 μL 모세관 간격을 만듭니다.

  1. 저온 섹션을 실온(RT)에서 2시간 에서 4시간 동안 해동하여 건조시키고 현미경 슬라이드에 부착할 수 있도록 합니다.
    참고 : 30-37 °C에서 30 분 내지 1 시간 동안 건조할 수도 있습니다.
  2. 슬라이드 랙에 슬라이드를 놓고 망막 부분을 100-200 μL PBS에서 2 분 동안 두 번 씻습니다.
  3. RT에서 5분 동안 PBS에서 0.25% 트리톤-X/0.05% NaN 3로배양하여 망막 절편을 투과한다.
  4. 슬라이드에 차단 용액 100 μL을 추가합니다.
  5. 슬라이드에 차단 용액에서 희석 된 1 차 항체 100 μL을 추가하십시오.
  6. 4°C에서 하룻밤 동안 망막 절편을 배양한다.
    참고: 이 시간 동안 슬라이드 랙을 덮어 섹션의 탈수방지를 피하십시오.
  7. 망막 부분을 3회, 각각 15분 동안 200 μL PBS를 사용하여 세척합니다.
    참고 : 0.001- 0.002 % 트리톤-X100을 PBS (PBS-T)에 추가하면 보다 엄격한 세척이 허용되지만 일부 멤브레인 및 세포 구조를 방해 할 수 있습니다.
  8. RT에서 1 시간 동안 형광 표지 된 이차 항체에서 망막 절편을 배양하십시오. 지금부터 빛으로부터 보호합니다.
  9. 망막 부분을 3 회, 각각 15 분 동안 씻으소서.
  10. Hoechst 33342 또는 DAPI 용액과 같은 핵 마커로 RT에서 망막 절편을 5분 동안 배양합니다.
  11. 망막 부분을 15 분 동안 1 회 씻으하십시오.
  12. 실험실 벤치에 종이 타월 위에 덮개를 놓습니다.
  13. 커버슬립 중앙에 페이딩 방지 마운팅 미디어 2방울을 추가합니다.
  14. 슬라이드를 뒤집어 망막 저온 섹션이 아래를 향하도록 합니다.
  15. 커버슬립을 ~45° 각도로 천천히 천천히 장착하고 슬라이드를 장착 용지에 끼우십시오.
    참고: 슬라이드를 제자리에 낮출 때 거품형성을 피하십시오.
  16. 무거운 책이나 카탈로그(아래 참조)를 슬라이드 커버슬립 조합에 사용하여 압력을 균등하게 가하여 과도한 장착 매체를 제거합니다.
    참고: 샘플 준비의 일관성을 보장하려면 항상 동일한 객체(즉, 동일한 책 또는 카탈로그)를 사용하여 슬라이드 장착 중에 커버슬립에 균등한 압력을 가하십시오.
  17. 평평하게 유지하고 어둠 속에서 RT에서 하룻밤 동안 굳어지도록 하십시오. 슬라이드를 4°C에서 무기한으로 평평하게 보관하십시오.
  18. 광시야 또는 공초점 형광 현미경 검사법을통한 이미지(그림 4).

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Representative Results

이러한 프로토콜이 IHC에 대한 최적의 망막 보존을 보장하는 방법을 설명하기 위해, 우리는 P28 WT 마우스 (C57BL / 6N)에서 로도프신(광수용체 마커)에 대한 항체로 망막 절편을 8, 글루탐산 데카르복실라제 65 (Gad65, amacrine 세포)를 조사했습니다. 마커)9, 글루타민 합성체 (GS, 뮐러 세포 마커)10,및 칼빈딘 (수평 세포 마커)11 (도 4). IHC는 우리의 프로토콜이 지속적으로 높은 품질과 잘 보존 된 망막 섹션을 산출한다는 것을 나타냅니다. 특히, 로도신이 풍부한 내부 및 외부 세그먼트는 망막 색소 상피 (RPE)(그림 4A)를 겹치게하는 것을 거의 또는 전혀 분리하지 않고 수직및 그대로 남아 있습니다. 또한, 뮐러 세포는 신경절 세포층(GCL)에서 외부 핵층(ONL)까지 의 학적으로 적절하게 정렬되고 세포질 과정으로잘 보존되어 있다(그림 4B).

Gad65 양성 무축근 세포와 같은 인터뉴런은 INL 및 내부 플렉시폼 층(IPL) 내에서 제대로 계층화된 상태로 유지되지만(그림 4B)잘 정의된 수평 세포는 INL 및 외부 플렉시폼에서 검출가능합니다. 레이어(OPL) 테두리(그림 4C). 종합적으로, 이 데이터는 우리의 방법이 광수용체에서 신경절 세포에 망막 세포 및 조직 무결성을 보존한다는 것을 보여줍니다

횡단 절편을 용이하게 하기 위해 동결 전에 저온 금형의 광학 컵을 꼼꼼하게 방향을 지정하는 것이 중요합니다. 그림4에서와 같이 망막, 불량한 단면 기술 또는 둔하거나 손상된 마이크로토메 나이프를 사용한 절편은 망막 조직 눈물, 왜곡 및 세포 변위와 같은 아티팩트를 유발할 수 있습니다. 단면 아티팩트의 예는 그림 4D-F에나와 있습니다. 도 4D에서 가난한 단편 및 정렬은 광수용체 내부 및 외부 세그먼트 왜곡 (도4D)및 작은 조직 눈물 (그림4E,화살표)로 이어진다. 또 다른 예에서, 섹션 이전의 불량한 조직 배향은 뮬러 세포 소종 및 세포질 과정의 최적 정렬을 유도하는 도 4E. 도 4F는 OPL에서 GCL로 수평 세포가 비정상적으로 번짐을 일으킨 둔한 마이크로토메 칼에 의한 절편불량 가능성이 얼마나 낮은지를 보여줍니다. 따라서 IHC 데이터의 최고 품질과 재현성을 보장하기 위해 프로토콜에 설명된 각 단계의 실행에 정밀한 주의를 기울여야 합니다.

Figure 1
그림 1개 : 마우스 눈 해부, 임베딩 및 IHC용 도구입니다. (A) 소작자; (B) 왼쪽에서 오른쪽으로 해부 도구: Dumont #5/45 곡선 집게, 곡선 가위 및 Dumont #5 얇은 집게; (C) 35mm 해부 접시 (화살표가 챔버를 해부하는 지점); (d) 해부 현미경; (E) 왼쪽에서 오른쪽으로 냉동 도구 : 절연 쿨러, 이소펜탄 목욕 스테인레스 스틸 비커, 스테인레스 스틸 액체 N2 목욕; (f) 티타늄 프로브; (G) IHC용 슬라이드 랙 및 커버플레이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2개 : 마우스 아이컵 방향 및 설명. (A) 측두엽 마크 위치(빨간색 화살표)를 사용하여 눈 방향을 용이하게 합니다(도르소 = D, 복부 = V, 측두측 = T, 비강 = N). (B) 마우스 눈 해부를위한 회로도. 작은 절개는 화상 자국에서 각막에 수직으로, 미세 한 메스 (마이크로 나이프)를 사용하여 팔다리 바로 위에 만들어집니다. 각막 주위를 잘라 눈의 전방과 후방 부분을 분리합니다. (C) 손상되지 않은 망막이 있는 아이 컵. (D) 시신경(ON), 렌즈(L), 각막(C) 사지(OS)를 가진 마우스 눈의 도르소 복부 배향. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3개 : 마우스 아이 임베딩. (A) 도르소-복부 지향 마우스 아이컵은 OCT로 채워진 크라오졸드, (B) 주석이 달린 크라오졸드에 냉동 마우스 망막 컵을 채웠다. (C) 저온 극저온. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4개 : 마우스 망막 면역화학. (A-C) 좋은 품질 및 (D-F) P28 WT로부터의 품질이 좋지 않은 망막 절편은 로돕신(A, C) 아맥린 마커 GAD65(B, E) 및 뮐러 세포 마커 글루타민 합성체(GS)에 대한 항체로 표지되었다; B, E) 및 수평 셀 마커 칼빈딘 (C, F). 흰색 화살표는 조직의 눈물과 조직의 비정상적인 얼룩을 가리킵니다. 스케일 바, 20 μm. Hoechst 33342 (파란색)로 표시된 핵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

마우스 망막 절제술은 마우스 눈의 작은 크기와 모양과 망막 조직의 취약성으로 인해 섬세한 과정입니다. 고품질 해부를 수행하는 것은 연습의 문제이지만, 상세한 프로토콜을 갖는, 효율적인 방법과 팁을 제공하는 것은 망막 절편과 IHC를 얻기 위해 필수적이다. 여기에 설명된 프로토콜 외에도 재현 가능한 IHC에 적합한 일관된 고품질 망막 섹션을 허용하는 몇 가지 팁이 있습니다.

해부를 시작하기 전에, 편안하고 편안하고 마우스 눈 미세 해부 동안 최적의 시력을 위한 실내 조명을 설정하는 것이 중요합니다. 눈을 해부하면서 마우스 아이 컵 모양을 유지하기 위해, 우리는 사용자 정의 만든 왁스 코팅 해부 접시에 PBS에 잠긴 눈을 유지하는 것이 좋습니다. 우리는 밝은 분홍색 색깔의 치과 왁스 (그림1C)로35mm 해부 접시를 코팅하는 것이 좋습니다. 실제로, 치과 왁스의 밝은 분홍색 색상은 해부 범위에서 쉽게 눈 구조를 볼 수있는 적절한 대비를 제공하며, 왁스에 미세 퍼지 튜브의 베이스를 눌러 만든 왁스의 눈 크기의 인상은 눈 컵을 제자리에 유지합니다. 해부 하는 동안 눈 컵 주위 도구의 적절 한 회전을 허용. 또한, 렌즈를 제거하는 동안 가능한 한 눈컵에서 유리체 유체를 제거하는 것이 중요하며, 잔류 유리체는 조직 블록 동결 단계 동안 얼음 결정을 손상시키는 조직을 형성하는 경향이 있다. 우리는 일반적으로 티슈 페이퍼를 사용하여 해부 된 눈 컵의 테두리에 놓고 망막 조직을 방해하지 않고 모세관에 의해 남아있는 모든 유리체 유체를 조심스럽게 제거합니다. 소량의 잔류 유리체 유체가 여전히 눈 컵에 존재하는 불행한 경우, 단면은 얼음에서 유리체의 변형을 줄이고 따라서 블레이드의 선명도와 단면의 품질을 보존하기 위해 -20 °C에서 수행해야합니다. .

고정 및 임베디싱 방법은 섹션및 IHC의 품질에도 큰 영향을 미칩니다. 포르말린 고정 파라핀 내장 섹션은 안구 조직의 최적의 구조적 무결성을 산출하지만, 포르말린은 배경 형광을 향상시킬 수있는 메탄올을 함유하고 있습니다. 이러한 유물을 피하기 위해, 우리는 메탄올 또는 산화 PFA 4,5,6에 의한 배경 및 자동 형광을 제한하기 위해 신선한 EM 등급 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용하는 것이 좋습니다. 우리는 얼음에 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 눈을 고정 우리의 프로토콜에 설명 된 온화한 고정 조건을 권장합니다. PFA가 조직을 빠르게 침투하지만 단백질을 매우 느리게 교차하기 때문에 이러한 조건은 해부 동안 망막 구조적 무결성을 보존하고 항원없이 일반적인 망막 항원의 항원성을 보존하기에 충분합니다. 검색 방법4. 망막 구조가 잘 보존되지 않는 경우에, PFA 고정의 내구는 증가할 수 있습니다, 그러나 과다 고정 조직은 비특이적인 배경 형광을 향상시키고 에피토프 마스킹으로 이끌어 낼 수 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다, 과소 고정하는 동안 조직은 조직의 구조적 무결성을 손상시키고 단백질 분해되기 쉬운 일부 항원의 손실을 일으킬 수 있습니다. 짧은 시간 PFA 배양은 상대적으로 온화한 고정이기 때문에, 우리는 또한 액체 질소에 침지 된 이스펜탄 욕조에서 cryomold (10 mm x 10mm x 5mm)에 함유 된 OCT 내장 눈을 찍어 스냅 동결 망막을 권장합니다. 스냅 동결 조직은 항원을 보존하고 자당 용액과 OCT는 저온 보호제로 작용합니다. 이 방법은 소위 스위스 치즈 유형의 조직 손상을 일으킬 수있는 얼음 결정의 형성으로 인해 조직의 왜곡을 줄일 수 있습니다. 극저온은 액체 질소에 직접 담그지 않아야하거나 끓기 시작하여 증기 장벽을 형성하고 동결 과정을 느리게하여 이기종 고정 및 보존을 초래합니다. 더욱이, 액체 질소와 접촉하는 조직 및 OCT는 균열이 되어 눈의 무결성에 영향을 미칠 수있다7. 따라서, 우리는 작은 스테인레스 스틸 비커를 사용하여 5mm 이하의 깊이의 이소펜타네에 cryomold (10mm x 10mm x 5mm)를 담그는 것이 좋습니다, 자체는 액체 질소를 포함하는 더 큰 스테인레스 스틸 비커 (100mm 폭 최소)에 담근. 여러 샘플을 준비하는 동안 액체 질소의 급속한 증발을 피하기 위해 두 개의 욕조를 절연 쿨러에 보관합니다. OCT의 냉동 조직은 장기 보존 방법이 아니며, 시간이 지남에 따라 조직에 얼음 결정이 형성되어 세포 외 형태를 변경하거나 일부 항원을 변성시킬 수 있습니다. 따라서, 조직 블록 및 냉동 섹션은 단기 저장 및 -80 °C 장기 저장을 위해 -20 °C에 보관되어야합니다.

포유류 망막은 측두엽-비강 및 도소 복부 축에 걸쳐 세포의 특정 공간 분포를 가진 비대칭 기관입니다. 예를 들어, M-및 S-opsin 콘은 특정 도소-복부 그라데이션(12)으로 배열된다. 따라서, 비교 IHC를 수행하기 위해서는 조직 제제 및 단편화 전반에 걸쳐 눈의 적절한 방향을 보장하는 것이 필수적이다. 우리는 해부 (그림2A,D) 전에 눈에 참조 표시를 배치하기 위해 소작기를 사용하여 포함 단계에서 등쪽 복부 축을 따라 아이 컵을 방향을 지정할 수 있으므로 완벽하게 가로 절개를 얻을 수 있습니다. 우리는 소작기와 함께 잠시 동안 각막을 만져서 눈의 등두 측두엽 부분에 화상 자국을 놓습니다. 이것은 약간 그것에 구멍을 관통 하는 것을 피하면서 각막을 구울 수 있습니다. 눈 컵 해부 하는 동안, 우리는 작은 절개를, 화상 마크에서, 각막의 국경에 수직, 마이크로 나이프를 사용 하 여 (그림2B). 블록의 도르소 복부 방향을 용이하게하고 단면 화 하는 동안 방향 조정을 최소화 하기 위해, 우리는 극저온의 바닥을 향한 화상 마크와 각막의 개구부와 함께, cryomold에서 후방 눈 컵을 방향을 제안합니다. cryomold의 오른쪽의 평행 (그림3A,B). 동결된 블록은 블레이드를 향한 블록의 바닥과 함께 블레이드에 수직인 아이컵을 등쪽-복부 방향으로 설치한다(도3c).

신뢰할 수 있는 망막 IHC는 최적의 적응, 재현 가능한 해부 및 조직 처리로 시작합니다. 여기에 설명된 이 방법은 망막 구조와 무결성을 최적으로 보존하는 동시에 형광 IHC를 손상시킬 수 있는 자동 형광 및 에피토프 마스킹을 최소화합니다. 이 프로토콜을 따르면 재현 가능한 고품질 데이터가 있는지 확인합니다.

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Disclosures

공개가 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH (RO1-GMO97327)와 대학 연구 재단 (UPenn)의 기금에 의해 지원되었다. 우리는 특히 면역 조직 화학 프로토콜, 고든 루텔 (펜실베니아 대학) 및 현미경 검사법과 레슬리 킹, 이 원고를 읽는 중요한 박사에 대한 지원을 위한 펜실베니아 수의사 이미징 코어를 개발하는 그녀의 도움에 대한 스베틀라나 사비나 감사 .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) Gilson  #MA-48 For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil 
Cauterizer  Bovie #AA01 To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent  Electron Microscopy Sciences #72703-D For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge  Fine Science Tools  #15002-08 To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope  Leica, Houston, USA  MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle  Fine Science Tools  #10315-12 To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax  Electron Microscopy Sciences  #72660 For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate Ted Pella #36107 For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) Gilson  #MA-40 For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5   Fine Science Tools  #11254-20 To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm) Electron Miscroscopy Sciences  #62534-10 Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents Company Catalog Number Comments
Blocking solution 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.  
Gelvatol (anti-fading mounting media) Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8). 
Hoechst 33342 1000x Stock Thermo Scientific #62249 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x) 
Isopentane, 99%  GFS Chemicals #2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS Electron Microscopy Sciences  #15710 Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. 
Permeabilization solution PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS) Bioworld  #41620015-20 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock 
Sucrose solutions Fisher Scientific   #S-5-500 Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. 
Tissue-Tek OCT-compound  Sakura  #4583
Antibodies Company Catalog Number Comments
anti-calbindin Sigma-Aldrich C8666 To label horinzotal cells 
anti-GAD65 Chemicon AB5082 To label GABAergic amacrine cells
anti-GS BD Transduction 610517 To label Müller cells
anti-rhodopsin Millipore MAB5316 To label rods

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References

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신경 과학 문제 149 망막 극저온 절편 최적 절삭 온도 매체 OCT 면역 화학 마우스 눈 핵
면역 조직 화학을 위한 마우스 망막 극저온 단면도 단면도의 준비
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Léger, H., Santana, E.,More

Léger, H., Santana, E., Beltran, W. A., Luca, F. C. Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (149), e59683, doi:10.3791/59683 (2019).

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