Beredning av Mouse retinal Cryo-sektioner för immunhistokemi

Summary

Denna rapport beskriver omfattande metoder för beredning av frysta musens näthinnan sektioner för immunhistokemi (IHC). Metoder som beskrivs inkluderar dissektion av okulär bakre kopp, paraformaldehyd fixering, inbäddning i optimal skär temperatur (ULT) media och vävnads orientering, snittning och immunofärgning.

Abstract

Beredning av högkvalitativa mus ögat sektioner för immunhistokemi (IHC) är avgörande för att bedöma näthinnans struktur och funktion och för att fastställa mekanismerna bakom retinala sjukdomar. Upprätthålla strukturell integritet hela vävnads beredningen är avgörande för att få reproducerbara retinal IHC data men kan vara utmanande på grund av bräcklighet och komplexitet retinal cytoarchitecture. Starka fixativ som 10% formalin eller Bouin lösning optimalt bevara näthinnans struktur, de ofta hämma IHC analys genom att förbättra bakgrunden fluorescens och/eller minskande anti kroppar-epitop interaktioner, en process som kallas epitop maskering. Mildare fixativ, å andra sidan, som 4% paraformaldehyd, minskar bakgrundsfluorescens och Epitope-maskering, noggrann dissektion tekniker måste användas för att bevara näthinnans struktur. I denna artikel presenterar vi en omfattande metod för att förbereda mus okulär bakre koppar för IHC som är tillräcklig för att bevara de flesta anti kroppar-epitop interaktioner utan förlust av näthinnans strukturella integritet. Vi inkluderar representativa IHC med anti kroppar mot olika retinal cell typ markörer för att illustrera vävnads bevarande och orientering under optimala och suboptimala förhållanden. Vårt mål är att optimera IHC studier av näthinnan genom att tillhandahålla ett komplett protokoll från okulär bakre kopp dissektion till IHC.

Introduction

Immunhistokemi (IHC) är en kraftfull teknik för lokalisering av specifika proteiner och cellulära strukturer i vävnader på situ^1,2,3. Olämpliga fixeringsmetoder och suboptimala snittning av komplexa vävnader kan störa vävnads strukturen, generera hög bakgrunds färgning eller minska antikroppskoncentrationen, vilket resulterar i infärgning artefakter och därav felaktig tolkning av IHC-data⁴. Eftersom ryggradsdjur näthinnan är en komplex och mycket organiserad neurala organ som består av skikt av sammankopplade foto receptorer, interneuroner och ganglion celler, det är mycket bräcklig och kan lätt störas under dissektion och snittning. En detaljerad, standardiserad, och validerade protokoll från mus öga dissektion och orientering till immunofärgning kommer att bidra avsevärt minska IHC artefakter, därmed öka tillförlitligheten av resultaten och möjliggör mer exakta jämför ande data Analys.

Det finns många protokoll för vävnads beredning för IHC, emellertid, inte alla är lämpliga för näthinne vävnad. Starka fixativ som 10% formalin eller Bouin lösning bevara näthinnans struktur under dissektion och snittning⁵. Tyvärr, starka fixativ leder ofta till den förbättrade bakgrunden fluorescens och epitop maskering på grund av kemisk modifiering av epitoper⁶. Å andra sidan, mildare fixativ, som 4% paraformaldehyd (PFA) kan lindra några av dessa artefakter men kräver noggrann dissektion och snittning för att bevara den optimala näthinnans struktur. PFA penetrerar snabbt vävnad, men tvär länkar proteiner mycket långsamt, vilket minskar risken för epitop maskering. Eftersom kort tid PFA inkubation är en relativt mild fixering, vävnader kräver ofta snabb frysning för att bevara antigener. Det är viktigt att undvika is kristall formation under vävnads frysning eftersom de snedvrider och skadar integriteten hos celler och vävnader⁷.

Här beskriver vi detaljerade och standardiserade protokoll för dissektion, fixering, och Cryo-skydd av mus okulär bakre koppar som ger konsekventa och pålitliga IHC-data.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här utfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i de nationella hälso-och sjukvårds instituten för skötsel och användning av försöks djur som tillhandahölls av Institutet för laboratorie djurs resurser och godkändes av Institutionell djur vård och användning kommittén vid University of Pennsylvania.

Alla verktyg och all utrustning för metoderna visas i figur 1 och listas i material tabellen.

1. Musklick för att enucleation, ögon kopp dissektion, och bädda

1. Euthanize möss med koldioxid (co₂) följt av antingen hals huggning (postnatal möss P0-p11) eller cervikal dislokationen (vuxna > p11 möss). För P0-p14-möss täcks ögonen av huden. Se till att ta bort huden före efterföljande steg.
2. Markera den temporala delen av ögat (figur 2A) genom att lätt bränna horn hinnan med hjälp av en svans cauterizer. Undvik att bränna ett hål i horn hinnan genom att röra horn hinnan mycket lätt och för inte mer än en bråkdels sekund med cauterizer.
3. Omedelbart enucleate mus ögon med böjda Dumont #5/45 pincett. Inkubera i 15 minuter i en 1,5 mL frys rör med 1 mL 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på is.
4. Efter 15 min i 4% PFA, överföra det fasta ögat med hjälp av böjda pincett Dumont #5/45 till en modifierad 35 mm dissektion skålen (se tabell över material och figur 1c) fylld med PBS och placera under dissekera Mikroskop.
5. Gör ett litet snitt vid bränningen märke, vinkel rätt mot och precis ovanför limbus (gränsen av horn hinnan) med hjälp av mikro kniven.
6. För in den böjda saxen i snittet och utföra en omkringskurna av horn hinnan efter limbus (figur 2b).
7. Ta bort horn hinnan och extrahera linsen med en tunn Dumont #5 pincett, (figur 2b) och lyft den försiktigt bort från den bakre delen av ögat. Glas kroppen, den genomskinliga gelen som fyller utrymmet mellan linsen och näthinnan, kommer att komma ut med linsen (figur 2b) och näthinnan kommer att vara synlig som en vit yta som täcker insidan av den bakre ögonkoppen. Se till att det inte finns några synliga skador på näthinnan, såsom hål eller tårar (figur 2C).
8. Tvätta ögon kopparna två gånger i 1 mL PBS i 10 min vid rums temperatur.
9. Krybskydda ögon kopparna genom att ge dem jämvikt i en lösning med 15% sackaros i PBS över natten vid 4 ° c tills ögon bägaren sjunker
10. Överför ögon kopparna till 30% sackaros i PBS för 2-3 h tills ögon bägaren sjunker.
11. Bädda in ögon kopparna i ULT i 10 x 10 mm cryomolds (figur 3a). Med hjälp av en dissekera Mikroskop, orientera ögat i cryomold längs sin rygg-ventrala axel (figur 2D, figur 3a) genom att vrida ögat tills bränningen märket är på toppen, syn nerven är till vänster och utskuren del av formen ansikten rätt ( Figur 2D). Var noga med att undvika bubblor nära vävnaden.
    Anmärkning: för att manipulera ögon koppen, Använd en Titan sond gjord av en Titan tråd fäst vid en pipettspets.
12. För att nafsa-frysa näthinnans vävnad, Sänk ner cryomold i minst 5 min i en metall bägare som innehåller isopentan och placera bägaren i flytande kväve eller torr is/100% etanol bad (upp till 1/3 av höjden av metall bägaren).
    Anmärkning: den cryomold bör nedsänkt i isopentan till mer än hälften av sin höjd, men behöver inte vara helt nedsänkt.
13. Ta bort den frusna blocket och Linda in den i aluminiumfolie.
14. Förvaras vid-80 ° c.
15. Markera det frusna blocket med en penna eller en Sharpie för att registrera blockets orientering (figur 3b).

2. Snittning med kryostat

1. Efter justering av kryostatstemperaturen (mellan-20 och-25 ° c), låt formar som innehåller de inbäddade ögon kopparna att jämställa sig med kryostattemperaturen i 1 h.
2. Installera blocket med dorso-ventral orientering (figur 3c) och skär 10 μm tjocka serie sektioner. Placera försiktigt näthinnans sektioner på Annoterade och numrerade Mikroskop dia bilder.
3. Förvara dia bilder i glid boxar vid-20 ° c eller-80 ° c till IHC-procedurer.

3. Fluorescensimmunofärgning med hjälp av glid rack

Obs: glid rack systemet (t. ex. Sequenza) håller glaset Mikroskop dia bilder med en täckplåt, vilket skapar en ~ 100 μL kapillärgap mellan bilden och plattan.

1. Tina Cryo-sektionerna vid rums temperatur (RT) i 2 h till 4 timmar så att de kan torka och fästa på Mikroskop glas.
   Obs: det är också möjligt att torka dem vid 30-37 ° c i 30 min till 1 timme.
2. Placera dia bilder i Slide rack och tvätta näthinnans sektioner två gånger i 100-200 μL PBS i 2 min.
3. Permeabilize näthinnans avsnitt genom att ruinera dem i 0,25% Triton-X/0,05% NaN₃i PBS för 5 min vid RT.
4. Tillsätt 100 μL blockeringslösning i glasen.
5. Tillsätt 100 μL primär anti kropp utspädd i blockerande lösning till glasen.
6. Inkubera retinalsnitt över natten vid 4 ° c.
   Obs: under denna tid, täck Slide rack för att undvika uttorkning av avsnitten.
7. Tvätta näthinnans avsnitt 3 gånger, vardera i 15 minuter, med 200 μL PBS.
   Anmärkning: tillägget av 0,001-0,002% Triton-X100 till PBS (PBS-T) tillåter en strängare tvätt men kan störa vissa membran och cellulära strukturer.
8. Inkubera retinala sektioner i fluorescerande-märkta sekundära anti kroppar för 1 h vid RT. Från och med nu skyddas från ljus.
9. Tvätta retinal avsnitt 3 gånger, vardera för 15 min.
10. Inkubera näthinnans avsnitt vid RT i 5 min med en nukleär markör som Hoechst 33342 eller DAPI lösning.
11. Tvätta näthinnans avsnitt 1 gång i 15 minuter.
12. Lägg en täckslip ovanpå en pappers hand duk på labb bänken.
13. Tillsätt 2 droppar anti-fading monterings material till mitten av täckglasets.
14. Vrid bilden över för att få näthinnans Cryo-sektion vänd nedåt.
15. Montera försiktigt täckglasen långsamt, i en ~ 45 ° vinkel, spetsen på bilden på monterings mediet.
    Obs: Undvik att forma bubblor när du sänker ned bilden på plats.
16. Applicera jämnt tryck, med hjälp av en tung bok eller katalog (se nedan), till Slide-Coverslip kombination för att eliminera överskott monterings material.
    Anmärkning: för att säkerställa konsekvens i prov beredning, alltid använda samma objekt, (dvs. samma bok eller katalog) att tillämpa jämnt tryck på täckglasen under bild montering.
17. Håll platt och låt härda över natten på RT i mörkret. Förvara bilderna Plant vid 4 ° c på obestämd tid.
18. Bild via brett fält eller konfokal fluorescensmikroskopi (figur 4).

Representative Results

För att illustrera hur dessa protokoll, säkerställa optimal näthinne bevarande för IHC, vi probed retinal sektioner från P28 WT möss (C57BL/6N) med anti kroppar mot rhodopsin (en foto receptor markör)⁸, glutaminsyra dekarboxylas 65 (Gad65, en amakrina cell markör)⁹, glutaminsynthetas (GS, en Müller-cellmarkör)¹⁰, och calbindin (en horisontell cell markör)¹¹ (figur 4). IHC visar att våra protokoll konsekvent ger hög kvalitet och välbevarade retinala sektioner. Särskilt de rhodopsinrika inre och yttre segmenten förblir vertikala och intakt med liten eller ingen separation från överliggande retinal pigmenterade epitel (RPE) (figur 4a). Dessutom är Müller-cellerna väl bevarade med Soma korrekt justerade och cytoplasmatiska processer som spänner från ganglioncellskiktet (GCL) till det yttre nukleära skiktet (ONL) (figur 4b).

Interneuroner, såsom Gad65-positiva amakrina celler, också förbli korrekt stratifierade inom inl och inre plexiform lager (IPL) (figur 4B) medan väldefinierade horisontella celler är detekterbara vid inl och yttre plexiform (figur 4C). Sammantaget visar dessa data att vår metod bevarar näthinnans cell-och vävnads integritet, från foto receptorer till ganglionceller

För att under lätta tvärgående snittning, är det viktigt att noggrant orientera den optiska koppen i Cryo-mögel före frysning. Felorienterad retinas, dålig snittnings teknik eller snittning med tråkig eller skadade mikrotomen knivar kan orsaka artefakter såsom retinal vävnad tårar, snedvridningar, och cellulär förskjutning, som i figur 4. Exempel på avsnitts artefakter visas i figur 4D-F. I figur 4D dålig snittning och justering leda till foto receptor inre och yttre segment distorsion (figur 4D) och små vävnads tårar (figur 4e, pil). I ett annat exempel, dålig vävnad orientering före avsnitt leder till suboptimala anpassningen av Muller cell Soma och cytoplasmatiska processer figur 4E. Figur 4F visar hur dålig snittning troligen orsakad av en tråkig mikrotomkniv orsakade horisontella celler att aberrantly smeta från OPL till gcl. Därför måste noggrann uppmärksamhet fästas vid utförandet av varje steg som beskrivs i protokollet för att säkerställa högsta kvalitet och reproducerbarhet för IHC-data.

Siffra 1 den första : Verktyg för mus öga dissektion, inbäddning och IHC. (A) Cauterizer; (B) dissektion verktyg från vänster till höger: Dumont #5/45 böjda pincett, böjda saxar, och Dumont #5 tunna pincett; (C) 35 mm dissekera skålen (pilen pekar på dissekera kammaren); (D) dissekera Mikroskop; (E) frysta verktyg från vänster till höger: isolerad kylare, rost fritt stål bägare för isopentan bad, rost fritt stål vätska N₂ bad; F) Titan sond. (G) glid rack och täckplåt för IHC. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Siffra 2 för att : Musens ögonkopp orientering och beskrivning. (A) tidsmässigt brännings märke plats (röd pil) för att under lätta ögon orientering (dorso = D, ventrala = V, temporal = T, nasal = N). (B) schematiskt för dissektion av musens öga. Ett litet snitt görs vid bränningen märke, vinkel rätt in i horn hinnan och strax ovanför limbus med en fin skalpell (Micro kniv). Skär runt horn hinnan för att separera den främre och bakre delen av ögat. (C) ögon Mugg med intakt näthinnan. (D) dorso-ventral orientering av mus ögat med syn nerven (på), lins (L), horn hinnan (C) limbus (OS). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Siffra 3 för att : Musens öga inbäddning. (A) dorso-ventral orienterade möss ögonkopp i cryomold fylld med OCT, (B) fryst mus retinal Cup i kommenterad cryomold. (C) kryostat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Siffra 4 för att : Mus näthinnan immunhistokemi. (A-C) god kvalitet och (D-F) dålig kvalitet retinala sektioner från P28 WT var märkta med anti kroppar mot rhodopsin (a, C) amakrina markör GAD65 (B, E) och Müller cell markör glutamin synt Etas (GS; B, E) och horisontell cell markör calbindin (C, F). Vita pilar pekar på vävnads tårar och avvikande smetar av vävnaden. Skalbar, 20 μm. kärnor märkta med Hoechst 33342 (blå). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Mus näthinnan dissektion är en delikat process på grund av den lilla storleken och formen av mus ögon och bräcklighet av näthinnans vävnad. Även om att utföra hög kvalitet dissektion är en fråga om praxis, med ett detaljerat protokoll, som ger effektiva metoder och tips är en nödvändighet för att få retinala avsnitt och IHC. Förutom de protokoll som beskrivs här, det finns flera tips som möjliggör konsekvent högkvalitativa retinala sektioner som är lämpliga för reproducerbara IHC.

Innan du börjar med dissektion, är det viktigt att vara bekväm, avslappnad och ställa in rummet belysning för optimal syn under mus öga microdissektion. För att bibehålla musen ögat kopp form medan dissekera ögat, föreslår vi att hålla ögonen nedsänkt i PBS i skräddarsydda vax-belagda dissektion rätter. Vi föreslår beläggning en 35mm dissektion skålen med ljusrosa färgat tand vax (figur 1c). Faktum är att den ljusrosa färgen på tand vaxet ger tillräcklig kontrast för att se lätt öga strukturer under en dissektion omfattning, den öga-sized intryck i vaxet, genom att trycka på basen av mikrofugrör rören i vaxet, kommer att hålla ögat kopp på plats medan lämplig rotation av verktygen runt ögon bägaren under dissektion. Dessutom är det viktigt att ta bort så mycket glas kroppen vätska från ögonkoppen som möjligt medan du tar bort linsen, som resterande glas kroppen vätska är benägna att bilda vävnad skadar iskristaller under vävnads blocket frysning steg. Vi använder i allmänhet ett silkes papper och placera den till gränsen av dissekerade ögon kopp, att försiktigt ta bort alla kvarvarande glas kroppen vätska genom kapillär utan att störa näthinnan vävnad. I det olyckliga fall där en liten mängd kvarvarande glas kroppen vätska finns kvar i ögonkoppen, bör snittningen göras vid-20 ° c för att minska omvandlingen av glas kroppen i is och därmed bevara skärpan i bladet och kvaliteten på snittningen .

Fixering och inbäddning metoder har också en stor inverkan på kvaliteten på avsnitten och IHC. Även om Formalinfixerade Paraffininbäddade sektioner ger optimal strukturell integritet i ögonvävnaden innehåller formalin metanol som kan förbättra bakgrundfluorescens. För att undvika dessa artefakter, rekommenderar vi att du använder Fresh EM grade paraformaldehyd (PFA) för att begränsa bakgrunden och autofluorescens orsakas av metanol eller oxiderade PFA^4,5,6. Vi rekommenderar de milda bindnings förhållanden som beskrivs i vårt protokoll fast ställande av ögat med 4% paraformaldehyd för 15 min på is. Eftersom PFA snabbt tränger in i vävnaden, men tvär länkar proteiner mycket långsamt, dessa villkor är tillräckliga för att bevara näthinnans strukturella integritet under dissektion och bevara antigeniciteten hos vanliga retinala antigener utan behov av antigen hämtnings metoder⁴. Om näthinnan strukturen inte är väl bevarad, varaktigheten av PFA fixering kan ökas, men det är viktigt att vara medveten om att över-fixerande vävnader kommer att förbättra icke-specifik bakgrund fluorescens och kan leda till epitop maskering, medan under-fixering vävnader kan äventyra den strukturella integriteten i vävnaden och orsaka förlust av vissa antigener benägna att proteolytisk nedbrytning. Eftersom kort tid PFA inkubation är en relativt mild fixering, rekommenderar vi också Snap-frysning näthinnor genom att doppa den Oct-inbäddade ögat, som finns i en cryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm), i en isopentan bad nedsänkt i flytande kväve. Snap-frysning vävnader kommer att bevara antigener, medan sackaros lösning och OCT fungera som Cryo-protectants. Denna metod kommer att minska distorsionen av vävnaden på grund av bildandet av iskristaller, som kan orsaka den så kallade Swiss Cheese typ av vävnads skada. Den cryomold bör inte doppas direkt i flytande kväve eller det kommer att börja koka, bildar en ångspärr och som kommer att bromsa frys processen, vilket resulterar i en heterogen fixering och bevarande. Dessutom kan vävnad och ULT i kontakt med flytande kväve spricka, vilket påverkar integriteten i ögat⁷. Vi rekommenderar därför att doppa den cryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm) i högst 5 mm djup isopentan med hjälp av en liten bägare av rost fritt stål, själv doppad i en större rostfri bägare (100 mm bred minimum) som innehåller flytande kväve. För att undvika den snabba avdunstning av flytande kväve under beredningen av flera prover, håller vi båda bad i en isolerad kylare. Det bör noteras att frys bevarande vävnader i ULT inte är en långsiktig konserverings metod, på grund av bildandet av iskristaller i vävnaden över tiden som kan förändra subcellulär morfologi och/eller denaturera vissa antigener. Vävnads block och frysta sektioner bör därför förvaras vid-20 ° c för korttids förvaring och för-80 ° c långtids lagring.

Däggdjurs näthinnan är ett asymmetriskt organ med en specifik geografisk fördelning av cellerna över de tidsmässiga-nasala och dorso-ventrala axlarna. Till exempel, M-och S-opsin koner är ordnade i en specifik dorso-ventral lutning ¹². Därför är det viktigt att säkerställa korrekt orientering av ögat genom vävnads beredning och snittning för att utföra jämför ande IHC. Vi använder en cauterizer att placera en referens markering på ögat före dissektion (figur 2A, D) så att vi kan orientera ögon koppen längs sin rygg-ventrala axel under inbäddnings fasen, och därmed få perfekt tvärgående sektioner. Vi placerar bränningen märket på dorso-temporal delen av ögat, genom att röra horn hinnan för en bråkdels sekund med cauterizer. Detta gör det möjligt att lätt bränna horn hinnan samtidigt undvika piercing ett hål i den. Under ögon bägaren dissektion, gör vi ett litet snitt, vid bränningen märke, vinkel rätt mot gränsen av horn hinnan, med hjälp av mikro kniven (figur 2b). För att under lätta den dorso-ventrala orienteringen av blocket och minimera orientering justeringar under snittning, föreslår vi orientera den bakre ögon koppen i cryomold, med bränningen märket mot botten av cryomold och öppnandet av horn hinnan perfekt parallellt med cryomold-högersidan (figur 3a, B). Den frusna blocket kommer att installeras med botten av blocket vänd mot bladet i kryostaten, ögon koppen vinkel rät mot bladet, i en dorso-ventral orientering (figur 3c).

Pålitlig näthinnan IHC börjar med optimala, anpassade och reproducerbara dissektioner och vävnads bearbetning. Metoden beskrivs här optimalt bevarar näthinnans struktur och integritet samtidigt minimera autofluorescence och epitop maskering som kan äventyra fluorescerande IHC. Genom att följa detta protokoll ser du till att du har reproducerbara data av hög kvalitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods