Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

Summary

Bu raporda, immünhistokimya (ıHC) için dondurulmuş fare Retina bölümlerini hazırlamak için kapsamlı yöntemler açıklanmaktadır. Tanımlanan yöntemlerle oküler posterior bardak diseksiyonu, paraformaldehit fikstasyon, optimum kesme sıcaklığı (OCT) medya ve doku oryantasyonu, seksiyonlama ve immünostasyonu katıştırma bulunmaktadır.

Abstract

İmmünhistokimya (ıHC) için yüksek kaliteli fare göz bölümlerinin hazırlanması, Retina yapısının ve fonksiyonunun değerlendirilmesi ve Retina hastalıklarının temelindeki mekanizmaların belirlenmesi için önemlidir. Doku hazırlığı boyunca yapısal bütünlüğünü sürdürmek, tekrarlanabilir Retina IFC verilerini elde etmek için hayati önem taşımaktadır, ancak Retina sitilinin kırılganlık ve karmaşıklığı nedeniyle zor olabilir. % 10 formalin veya Bouin çözeltisi gibi güçlü fiksatörler Retina yapıyı optimum şekilde korur, genellikle arka plan floresan ve/veya azalan antikor-epitopu etkileşimleri, epitopu maskeleme olarak bilinen bir süreci artırarak IFC analizini azaltır. Diğer taraftan,% 4 paraformaldehit gibi daha hafif fiksatörler, retina yapısını korumak için arka plan floresan ve epitope-maskeleme, titiz diseksiyon tekniklerini azaltmıştır. Bu yazıda, Retina yapısal bütünlük kaybı olmadan en antikor-epitope etkileşimlerini korumak için yeterli olan IFC için fare oküler posterior bardakları hazırlamak için kapsamlı bir yöntem sunuyoruz. En uygun ve en uygun koşullarda doku koruma ve oryantasyonunu göstermek için çeşitli Retina hücre tipi belirteçleri için antikor ile temsilci ıHC içerir. Amacımız ihc 'de oküler posterior fincan diseksiyon tam bir protokol sağlayarak retinada ıFC çalışmalarını optimize etmektir.

Introduction

İmmünhistokimya (IHC), situ^1,2,3' te dokularda spesifik proteinleri ve hücresel yapıları yerelleştirme için güçlü bir tekniktir. Uygunsuz fiksasyon yöntemleri ve kompleks dokuların alt-optimum kesmesi doku yapısını bozabilir, yüksek arka plan boyama veya antikor-epitope etkileşimlerini azaltır, boyama eserler ve sonuç olarak yanlış yorumlama sonucu IFC veri⁴. Vertebrat retinası, birbirine bağlı fotoreceptörler, internöronlar ve ganglion hücrelerinin tabaklarından oluşan kompleks ve son derece organize nöral organdır, çok kırılgan ve diseksiyon ve sekleme sırasında kolayca bozulabilir. Fare göz diseksiyonu ve immünostasyon oryantasyonlarından ayrıntılı, standartlaştırılmış ve onaylanmış bir protokol, ıHC yapılarını önemli ölçüde azaltmaya yardımcı olur, böylece sonuçların güvenilirliğini arttırır ve daha doğru karşılaştırmalı veri sağlar Analysis.

IHC için doku hazırlama için birçok protokol vardır, ancak, tüm Retina doku için uygun değildir. % 10 formalin veya Bouin çözeltisi gibi güçlü fiksatörler, diseksiyon ve sekleme sırasında retina yapısını korur⁵. Ne yazık ki, güçlü fiksasyonlar genellikle Gelişmiş arka plan floresans ve epitopu maskeleme nedeniyle epitoplar kimyasal modifikasyon⁶yol açar. Öte yandan,% 4 paraformaldehit (PFA) gibi daha hafif fiksatörler, bu yapıtlardan bazılarını hafifletebilir ancak optimum retina yapısını korumak için titiz diseksiyon ve sekürleme gerektirir. PFA hızla dokuya nüfuz eder, ancak proteinleri çok yavaş çapraz bağlar, epitopu maskeleme riskini azaltır. Kısa süre içinde PFA inkübasyon nispeten hafif bir fikfasyon olduğundan, dokularda genellikle antijenleri korumak için hızlı donma gerektirir. Doku donma sırasında buz kristali oluşumunun önlenmemesi ve hücrelerin ve dokularının bütünlüğünü bozması önemlidir⁷.

Burada, tutarlı ve güvenilir ıFC verilerini sağlayan fare oküler posterior bardakların diseksiyon, sabitleme ve Cryo koruması için ayrıntılı ve standartlaştırılmış protokoller açıklanmaktadır.

Protocol

Burada tarif edilen tüm yöntemler, laboratuar hayvan kaynakları Enstitüsü tarafından sağlanan Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Rehberi 'nin önerileri ile sıkı bir şekilde yürütülmüştür ve Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi.

Yöntem için tüm araç ve ekipmanlar Şekil 1 ' de gösterilir ve malzeme tablosundalistelenir.

1. Fare göz enucleation, göz bardağı diseksiyon ve gömme

1. Karbon dioksit (Co₂) ile ötenize fareler (postnatal fareler P0-P11) veya servikal çıkığı (Yetişkin > P11 fareler) ya dekasitasyon izledi. P0-P14 fareler için, gözler deri ile kaplıdır. Sonraki adımlardan önce cildi kaldırmak için emin olun.
2. Gözün temporal kısmını işaretleyin (Şekil 2a) bir kuyruk cauterizer kullanarak biraz kornea yakmak. Kornea çok hafifçe dokunarak ve cauterizer ile bir bölünmüş ikinci daha fazla değil, kornea bir delik yakmak kaçının.
3. Hemen eğimli Dumont #5/45 forseps kullanarak fare gözleri anlatabilirsin. Buz üzerinde fosfat-tamponlu tuz (PBS) içinde 1 ml% 4 paraformaldehit (PFA) ile 1,5 ml geminizi tüpünde 15 dakika boyunca inküye yapın.
4. % 4 PFA 15 dakika sonra, sabit göz kavisli forseps kullanarak transfer Dumont #5/45 değiştirilmiş bir 35 mm diseksiyon çanak için (bkz: malzeme ve Şekil 1C tablo ) PBS ile dolu ve diseksiyon mikroskop altında yer.
5. Mikro bıçağı kullanarak limbus (kornea sınırı) üzerinde ve sadece üzerinde dik, yanık işareti küçük bir kesi olun.
6. Eğri makas kesi içine yerleştirin ve limbus aşağıdaki kornea bir çevresel kesim gerçekleştirmek (Şekil 2B).
7. Kornea çıkarın ve ince bir Dumont #5 forseps ile objektif ayıklamak, (Şekil 2B) ve özenle uzak gözün posterior kısmından kaldırın. Vitreus Vücut, objektif ve Retina arasındaki boşluğu dolduran açık jel, objektif (Şekil 2B) ile ortaya çıkar ve Retina arka göz bardağı iç kapsayan beyaz bir yüzey olarak görünür olacaktır. Retinada delik veya gözyaşı gibi görünür bir hasar olmadığından emin olun (Şekil 2C).
8. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1 mL PBS 'de iki kez göz bardağı yıkayın.
9. Göz bardağı lavabolar kadar 4 °c gecede PBS% 15 sakaroz bir çözüm onları dengeleyici tarafından göz bardağı koruyun
10. Göz bardağı lavabolar kadar 2-3 h için PBS içinde% 30 sakaroz su bardağı aktarın.
11. 10 x 10 mm cryomolds (Şekil 3A) Ekim ayında göz bardağı katıştırın. Bir diseksiyon mikroskop kullanarak, onun dorsal-ventral ekseni boyunca cryomold göz yönlendirmek (Şekil 2D, Şekil 3A) yanık işareti üstte kadar göz çevirerek, optik sinir solda ve kalıp kesme parçası sağ yüzleri ( Şekil 2D). Doku yakınındaki kabarcıkları önlemek için dikkat alın.
    Not: göz bardağı manipüle etmek Için, bir pipet ucu bağlı bir titanyum tel yapılmış bir titanyum prob kullanın.
12. Retina dokusu Snap-dondurmak için, ısopentane içeren bir metal kabı en az 5 dk için cryomold daldırın ve sıvı nitrojen veya kuru buz/% 100 etanol banyosu içinde kabı yerleştirin (kadar 1/3 metal kabı yüksekliği).
    Not: cryomold ısopentane içinde yüksekliğinin yarısından daha büyük, ancak tamamen subbirleştirilmiş olması gerekmez dalmış olmalıdır.
13. Dondurulmuş bloğu çıkarın ve alüminyum folyo içinde sarın.
14. -80 °C ' de saklayın.
15. Blokun yönünü kaydetmek için bir kalem veya keskinleştirme kullanarak dondurulmuş bloğu işaretleyin (Şekil 3B).

2. Bir kriyostat kullanarak bölümleme

1. Kriyostat sıcaklığını (-20 ve-25 °C arasında) ayarladıktan sonra, gömülü göz bardakları içeren kalıpların 1 h için kriyostat sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
2. Bloğu Dorso-ventral oryantasyona (Şekil 3c) takın ve 10 μm kalınlığında seri bölümleri keser. Retina bölümlerini dikkatle detaylandırılmış ve numaralandırılmış mikroskop slaytlarına yerleştirin.
3. Slayt kutularındaki slaytlar-20 °C veya-80 °C ' ye kadar ıFC prosedürlerine kadar saklayın.

3. Slayt raf kullanarak floresan immünostans

Not: slayt raf sistemi (örn., Sequenza), cam mikroskop slaytlarını bir kapak plakasına sahiptir ve slayt ile plaka arasında bir ~ 100 μL kapiller boşluğu yaratmaktadır.

1. Oda sıcaklığında (RT) Cryo-bölümlerin, Kuru ve mikroskop slaytlarına bağlaymalarına izin vermek için 2 saat ile 4 saat arasında çözüyor.
   Not: Ayrıca 30-37 °C ' de 30 dakika ila 1 saat boyunca kurutmak mümkündür.
2. Slaytları Slayt rafa yerleştirin ve 100-200 μL PBS 'de 2 dakika boyunca retina bölümleri iki kez yıkayın.
3. RT 'de 5 dakika boyunca PBS 'de% 0,25 Triton-X/0,05% Nan₃' te onları inküle ederek Retina bölümleri geçirgen.
4. 100 Ekle μL slaytlar için çözüm engelleme.
5. 100 ekleme μL birincil antikor slaytlar için engelleme çözümü seyreltilmiş.
6. Retina bölümlerini 4 °C ' de geceleyin.
   Not: Bu süre zarfında, bölümlerin kurutmaması için slayt rafa 'nı kapun.
7. Retina bölümleri 3 kez, her biri 15 dakika boyunca, 200 μL PBS kullanarak yıkayın.
   Not: 0,001-0,002% Triton-X100 PBS (PBS-T) ilavesi daha sıkı bir yıkama sağlar ama bazı membranlar ve hücresel yapıları bozabilir.
8. RT 'de 1 h için floresan etiketli ikincil antikorlarda Retina bölümleri inkük. Şu andan itibaren ışığın korunması.
9. Retina bölümlerini 3 kez, her biri 15 dakika yıkayın.
10. Hoechst 33342 veya DAPI solüsyonu gibi bir nükleer Marker ile RT 'de Retina bölümleri 5 dakika boyunca kulvarın.
11. Retina bölümleri 15 dakika boyunca 1 kez yıkayın.
12. Laboratuvar tezgah üzerinde bir kağıt havlu üstüne bir lamel magazini yerleştirin.
13. Coverslip merkezine Anti-solma montaj medya 2 damla ekleyin.
14. Retina Cryo bölümünün aşağı bakacak şekilde slaytı çevirin.
15. Lamel magazini 'ı ~ 45 ° ' lik bir açı ile dikkatlice monte edin ve slayt üzerine montaj ortamına doğru kaydırın.
    Not: slaytı yerine düşürmeye çalıştığınızda baloncuklar oluşturarak kaçınarak.
16. Aşırı montaj ortamını ortadan kaldırmak için ağır bir kitap veya katalog kullanarak (aşağıya bakın), slayt-coverslip kombinasyonuna bile basınç uygulayın.
    Not: örnek hazırlıkta tutarlılığı sağlamak Için, her zaman aynı nesneyi kullanın (örn. aynı kitap veya katalog), slayt montajı sırasında kapak kaymasına bile baskı uygulamak için.
17. Düz tutun ve karanlıkta RT bir gecede sertleşmesine izin. Slaytlar 4 °C ' de sonsuza kadar düz saklayın.
18. Geniş alan veya konfokorik floresan mikroskobu ile görüntü (Şekil 4).

Representative Results

Nasıl bu protokoller, IFC için optimum Retina koruma sağlamak göstermek için, biz P28 WT fareler (C57BL/6N) rodopsin (bir fotoreceptor Marker) antikorlar ile retina bölümler probed⁸, glutamik asit decarboksilaz 65 (Gad65, bir amacrine hücre Marker)⁹, glutamin sentetaz (GS, bir Müller hücre Marker)¹⁰, ve calbindin (yatay hücre işaretleyicisi)¹¹ (Şekil 4). IHC, protokollerimizin sürekli olarak yüksek kalitede ve iyi korunmuş Retina bölümler verdiğini gösteriyor. Özellikle, rhodopsin açısından zengin iç ve dış segmentler, Retina pigmentli epitelyum (RPE) (Şekil 4A) arasına hiç ayrılmadan az olan dikey ve bozulmamış kalır. Buna ek olarak, Müller hücreleri, ganglion hücre katmanından (GCL) dış nükleer tabakaya (ONL) kadar yayılan Soma doğru hizalanan ve sitoplazmik süreçlerle iyi korunmuş kalır (Şekil 4b).

Gad65-pozitif amacrin hücreleri gibi interneurons, aynı zamanda düzgün INL ve iç pleksiform tabakası (IPL) içinde tabakalı kalır (Şekil 4B) iyi tanımlanmış yatay hücreler inl ve Dış pleksiform içinde algılanabilir iken katman (OPL) kenarlık (Şekil 4C). Bu verileri topluca, bizim Yöntem Retina hücre ve doku bütünlüğü, fotoreseptör gelen ganglion hücrelere korur göstermektedir

Enine kesmeyi kolaylaştırmak için, dondurmadan önce Cryo-Mold optik bardağı titizlikle yönlendirmek önemlidir. Yanlış yönelimli retinalar, zayıf bölümleme tekniği veya mat veya hasarlı mikrotome bıçakları ile kesmeli Retina doku gözyaşları gibi eserler neden olabilir, deformatörler, ve hücresel deplasman, Şekil 4gibi. Bölüm yapıtları örnekleri Şekil 4d-F' d e gösterilir. Şekil 4d 'de kötü seksiyonlama ve hizalama, fotoreceptor iç ve dış segmentlerde bozulma (Şekil 4d) ve küçük doku gözyaşları (Şekil 4E, ok). Başka bir örnekte, bölüm öncesinde zayıf doku oryantasyonu Muller hücresi Soma ve sitoplazmik süreçlerin alt-optimum hizalamasına yol açar Şekil 4E. Şekil 4F ne kadar kötü bölümleme büyük olasılıkla bir donuk mikrotome bıçağı neden yatay hücreler aberrantly gcl için OPL smear neden gösterir. Bu nedenle, IHC verilerinin en yüksek kalitede ve yeniden üretilebilirliğini sağlamak için protokolde özetlenen her adımın yürütülmesi için kesin dikkat uygulanmalıdır.

Şekil 1 : Fare göz diseksiyonu, katıştırma ve ıHC Için Araçlar. (A) Cauterizer; (B) soldan sağa diseksiyon araçları: Dumont #5/45 kavisli forseps, eğri makas ve Dumont #5 ince forseps; (C) 35 mm diseksiyon çanak (diseksiyon odasına ok noktaları); (D) Diseksiyon mikroskobu; (E) soldan sağa dondurulmuş aletler: izolasyonlu soğutucu, ısopentane banyo için paslanmaz çelik kabı, paslanmaz çelik sıvı N₂ banyo; (F) titanyum prob; (G) ıHC için sürgülü raf ve Coverplate. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2 : Fare göz bardağı Oryantasyon ve açıklama. (A) göz yönünü kolaylaştırmak için temporal yanık işareti konumu (kırmızı ok) (Dorso = D, ventral = V, temporal = T, burun = N). (B) fare göz diseksiyonu için şematik. Küçük bir kesi yanık işareti, kornea içine dik ve güzel bir neşter (mikro bıçak) kullanarak limbus hemen üstünde yapılır. Göz ön ve arka kısmını ayırmak için kornea etrafında keser. (C) sağlam retinaya sahip göz bardağı. (D) optik sinir (ON), objektif (L), kornea (C) limbus (OS) ile fare gözü Dorso-ventral oryantasyon. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 3 ' ü : Fare göz gömme. (A) Ekim ile dolu cryomold içinde Dorso-ventral odaklı fareler göz bardağı, (B) açıklamalı cryomold dondurulmuş fare Retina fincan. (C) kriyostat. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 4 : Fare Retina immünhistokimya. (A-C) iyi kalite ve (D-F) P 28 WT 'den düşük kalitede Retina bölümlerrodopsin (A, C) amacrine Marker GAD65 (B, E) ve Muller hücre Marker glutamin sentetaz (GS; B, E) ve yatay hücre Marker calbindin (C, F). Beyaz oklar, doku gözyaşlarına ve dokuda anormal bir şekilde bulaşmaya işaret ederler. Ölçek çubuğu, 20 μm. Hoechst 33342 (mavi) ile etiketlenmiş çekirdekler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Discussion

Fare Retina diseksiyon küçük boyutu ve fare gözleri şekli ve Retina doku kırılganlık nedeniyle hassas bir süreçtir. Yüksek kaliteli diseksiyon yapmak bir uygulama meselesi olsa da, ayrıntılı bir protokole sahip olmak, verimli yöntemler ve ipuçları sağlamak Retina bölümler ve IHC elde etmek için bir zorunluluktur. Burada açıklanan protokollere ek olarak, tekrarlanabilir IHC için uygun olan tutarlı yüksek kaliteli Retina bölümler için izin çeşitli ipuçları vardır.

Diseksiyon başlamadan önce, rahat olmak önemlidir, rahat ve fare göz mikrodiseksiyon sırasında optimum vizyon için oda aydınlatma ayarlamak. Göz diseksiyon sırasında fare göz bardağı şeklini korumak için, biz özel yapılan balmumu kaplı diseksiyon yemeklerde PBS altında gözleri tutmak öneririz. Biz açık pembe renkli diş mumu ile 35mm diseksiyon çanak kaplama öneririz (Şekil 1C). Nitekim, Diş balmumu açık pembe renk bir diseksiyon kapsamı altında kolayca göz yapıları görmek için yeterli kontrast sağlar, balmumu içine mikrofuge tüpler tabanına basarak yapılan Wax göz ölçekli gösterimler, yerde göz bardağı tutacak iken diseksiyon sırasında göz bardağı etrafında araçların uygun rotasyon izin. Buna ek olarak, objektif kaldırarak mümkün olduğunca göz bardağı kadar vitreus sıvı kaldırmak önemlidir, kalıntı vitreus sıvı doku bloğu donma adım sırasında doku zararlı buz kristalleri oluşturmak için eğilimli olduğu gibi. Genellikle bir doku kağıt kullanın ve disseke göz bardağı sınırına yerleştirin, dikkatle Retina doku rahatsız etmeden kapiller tarafından kalan tüm vitreus sıvı kaldırmak için. Az miktarda kalıntı vitreus sıvısının hala göz bardakında olduğu talihsiz bir durumda, buzun içinde vitreus dönüşümünü azaltmak ve bu nedenle bıçağın keskinliğini ve kesmenin kalitesini korumak için-20 °C ' de kesiş yapılmalıdır. .

Sabitleme ve gömme yöntemleri de bölümler ve ıHC kalitesi üzerinde büyük bir etkiye sahiptir. Formalin-sabit parafin-gömülü bölümler göz dokusunun optimum yapısal bütünlüğünü verim rağmen, formalin arka plan floresans artırabilir metanol içerir. Bu yapılardan kaçınmak için, metanol veya oksitlenmiş PFA^4,5,6' nın neden olduğu arka plan ve otomatik sınırsızlık sınırlamak için taze em Grade civarında formaldehite (PFA) kullanmanızı öneririz. İletişim kuralımızda açıklanan hafif fiksasyon koşullarını, buzda 15 dakika boyunca% 4 civarında formaldehite ile tespit etmenizi öneririz. PFA hızla dokuya nüfuz eder, ancak proteinleri çok yavaş çapraz bağlar olduğundan, bu koşullar diseksiyon sırasında Retina yapısal bütünlüğünü korumak ve antijen gerekmeksizin ortak Retina antijenlerin antigenisite korumak için yeterlidir alma yöntemleri⁴. Retina yapısı iyi korunmamış ise, PFA fikfasyon süresi artırılabilir, ancak aşırı sabitleme dokularının spesifik olmayan arka plan floresans geliştirecek ve epitopu maskeleme yol açabilir farkında olmak önemlidir, iken altında-Fixating dokularda dokuların yapısal bütünlüğünü tehlikeye atabilir ve proteolitik bozulmaya eğilimli bazı antijenlerin kaybına neden olabilir. Kısa süre içinde PFA inkübasyon nispeten hafif bir fiksasyon olduğundan, aynı zamanda, sıvı nitrojen içine batırılmış bir isopentane banyosunda, bir cryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm) içinde bulunan OCT gömülü gözü daldırma ile ek donma retinaları öneriyoruz. Snap-donma dokularında antijenler koruyacaktır, sakaroz çözüm ve Ekim Cryo-koruyucular olarak hareket ederken. Bu yöntem, buz kristalleri oluşumu nedeniyle doku bozulması azaltır, hangi sözde Isviçre peyniri doku hasarı türüne neden olabilir. Cryomold sıvı azot doğrudan daldırılmış olmamalıdır ya da kaynatmaya başlar, bir buhar bariyeri şekillendirme ve bu donma sürecini yavaşlatacak, heterojen bir fiksasyon ve koruma sonucu. Dahası, sıvı nitrojen ile temas halinde doku ve OCT, böylece göz bütünlüğü etkileyen çatlak olabilir⁷. Bu nedenle, küçük bir paslanmaz çelik kabı kullanarak 5 mm 'den fazla derin isopentane (10 mm x 10 mm x 5 mm) ile cryomold daldırma tavsiye, kendisi daha büyük bir paslanmaz çelik kabı (100 mm genişliğinde minimum) sıvı nitrojen içeren daldırılmış. Çeşitli numunelerin hazırlanması sırasında sıvı nitrojen hızlı buharlaşma önlemek için, biz yalıtılmış bir soğutucu her iki banyo tutmak. Bu Oct içinde cryopreserving dokularda uzun vadeli bir koruma yöntemi değildir unutulmamalıdır, zaman içinde doku buz kristalleri oluşumu nedeniyle alt hücresel morfoloji değiştirebilir ve/veya bazı antijenleri denatüre. Sonuç olarak, doku blokları ve dondurulmuş bölümler kısa süreli depolama ve-80 °C uzun süreli depolama için-20 °C ' de depolanmalıdır.

Memelinin retinası, temporal-burun ve Dorso-ventral eksenleri arasında hücrelerin belirli bir uzamsal dağılımına sahip asimetrik bir organıdır. Örneğin, M-ve S-opsin koni belirli bir Dorso-ventral gradyan ¹²düzenlenmiştir. Bu nedenle, karşılaştırmalı ıHC gerçekleştirmek için doku hazırlama ve sektirme boyunca göz doğru oryantasyonu sağlamak için esastır. Diseksiyon öncesinde göz üzerine bir referans işareti yerleştirmek için bir koterizer kullanıyoruz (Şekil 2a, D) böylece gömme aşaması sırasında göz bardağı dorsal-ventral ekseni boyunca yönlendirebiliriz ve bu nedenle mükemmel enine bölümler elde edebilirsiniz. Biz göz Dorso-temporal parçası üzerinde yanık işareti yer, cauterizer ile bir iki saniye için kornea dokunarak. Bu biraz içine bir delik delici kaçınarak kornea yakmak için izin verecektir. Göz bardağı diseksiyon sırasında, küçük bir kesi yapmak, yanık işareti, kornea sınırına dik, mikro bıçak kullanarak (Şekil 2B). Bloğun Dorso-ventral yönünü kolaylaştırmak ve kesit sırasında oryantasyon ayarlamaları en aza indirmek için, biz cryomold arka göz bardağı yönlendirilmesi öneririz, yanık işareti ile cryomold alt bakan ve mükemmel kornea açılması sağ tarafına paralel olarak (Şekil 3A, B). Dondurulmuş blok, kriyostat içinde bıçak doğru bakan bloğun alt ile monte edilecektir, bir Dorso-ventral yönde (Şekil 3c) bıçak dik göz bardağı.

Güvenilir Retina ıHC optimum, uyarlanmış ve tekrarlanabilir disilitler ve doku işleme ile başlar. Burada özetlenen Yöntem, floresan IHC 'yi tehlikeye atabilecek otofloresans ve epitopu maskelemeyi minimize ederken retina yapısını ve bütünlüğünü optimum şekilde korur. Bu protokolün ardından, yeniden üretilebilir yüksek kaliteli verilere sahip olmanızı sağlar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods