Summary
여기서, 우리는 뇌 영역에서 단백질을 분석 하기 위해 면역 조직 화학 및 고해상도 스캔과 함께 근 적외선 염료를 사용 하는 프로토콜을 제시 합니다.
Abstract
신경 과학은 두뇌에 있는 세포가 각종 기능을 중재 하는 방법의 연구 결과입니다. 세포 기능이 세포 단백질의 조성과 활동에 의해 결정 되기 때문에 뉴런 및 글 리아에서 단백질 발현을 측정 하는 것은 신경 과학의 연구에 매우 중요 합니다. 이 기사에서는 면역 세포 화학이 근 적외선 고 분해능 스캔과 결합 되어 별개의 뇌 영역에서 단백질 발현에 대 한 반 정량 측정을 제공 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 동일한 뇌 영역에서 단일 또는 이중 단백질 발현에 사용 될 수 있다. 이러한 방식으로 단백질을 측정 하는 것은 실험 조작, 학습 및 기억력의 분자 서명, 분자 경로의 활성 및 여러 뇌 영역에서의 신경 활동으로 단백질 발현의 상대적인 변화를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 올바른 단백질과 통계 분석을 사용 하 여 뇌 영역 간의 기능적 연결성도 확인할 수 있습니다. 실험실에서 면역 세포 화학 작용의 용이성을 감안할 때, 근 적외선 고 분해능 스캐닝으로 면역 세포 화학을 사용 하는 것은 신경 과학자가 시스템 수준에서 신경 생물학 프로세스를 검사 하는 능력을 확장할 수 있습니다.
Introduction
신경 과학의 연구는 두뇌에 있는 세포가 특정 기능을 중재 하는 방법1에 대 한 조사에 관련 됩니다. 이러한 세포가 중추 신 경계에서 면역을 부여 하는 방법과 같은 자연에서 세포가 될 수 있거나 등 쪽 해 마에서 뉴런의 활동이 공간적 탐색으로 이어지는 방법을 설명 하는 것을 목표로 하는 실험을 포함 할 수 있습니다. 광범위 한 의미에서, 세포 기능은 세포에서 발현 되는 단백질 및 이들 단백질2의 활성에 의해 결정 된다. 결과적으로 뇌 세포에서 단백질의 발현 및/또는 활성을 측정 하는 것은 신경 과학의 연구에 중요 합니다.
두뇌에 있는 단백질 발현을 측정 하기 위하여 다 수 기술이 이용 가능 합니다. 이들은 작은 펩 티 드를 위한 수용 체 밀도3 및 미세 투 석을 위한 양전자 방출 지형과 같은 생체 내 방법을 포함 한다4. 보다 일반적으로, ex 생체 내 방법은 단백질 기능 및 발현을 검사 하는 데 사용 됩니다. 이들은 질량 분석 법5, 웨스턴 블 롯 및 효소 결합 면역 흡수 법 (ELISA)6및 면역 세포 화학 물질7을 포함 한다. 면역 세포 화학은 신경 과학 분야에서 널리 사용 됩니다. 이 기법은 관심 있는 단백질 (또는 항 원)을 검출 하는 일차 항 체를 사용 하는 것을 수반 한다 (예컨대, c-Fos) 단백질을 검출 하는 공액 2 차 항 체 복합체 (도 1). 단백질-일차 항 체-이차 항 체 복합체의 검출을 가능 하 게 하기 위해, 2 차 항 체는 그들에 게 컨 쥬 게이 션 (과산화 효소)과 사비와 같은 산화 제를 갖는다. 이것은 빛 현미경 검사 법7을 사용 하 여 검출 될 수 있는 세포에 있는 침전 물의 대형을 허용 합니다. 이차 항 체는 또한 그들에 게 콘 쥬 게이 형광 화학 물질을 가질 수 있습니다 (즉, 형광 단). 이러한 화학 물질을 자극 하는 경우,이는 단백질-일차 항 체-2 차 항 체복합체를 검출 하는데 사용 될 수 있는 빛을 방출 한다. 마지막으로, 때로는 일차 항 체가 환 원제와 형광 화학 물질이 부착 되어 이차 항 체7 의 필요성을 직접적으로 부정 합니다 (그림 1).
흥미롭게도, 많은 면역 세포 화학 법은 특정 세포 또는 뇌 영역에서 단백질의 양을 정량화 하는 능력은 아니지만 뇌 세포내에서 단백질의 시각화를 가능 하 게 합니다. 광 현미경을 사용 하 여 환 원 반응에서 침전 물을 검출 하는 것은 뉴런 및 글 리아의 시각화를 가능 하 게 하지만,이 방법은 세포 또는 특정 뇌 영역에서 단백질 발현을 정량화 하는 데 사용할 수 없습니다. 이론적으로, 형광 현미경은 형광 성 이차 항 체 로부터 방출 되는 빛이 단백질-일차 항 체-2 차 항 체 복합체의 척도 이기 때문에이를 위해 사용 될 수 있다. 그러나, 뇌 조직에서의 자동 형광은 뇌 조직8에서 단백질 발현을 정량화 하기 위해 형광 현미경을 사용 하기 어렵게 만들 수 있다. 결과적으로 뇌 조직의 형광 이미지에서 방출 되는 빛은 거의 뇌의 단백질 발현을 정량화 하는 데 사용 되지 않습니다.
이러한 문제의 대부분은 고 분해능 스캐닝9,10과 함께 근 적외선 면역 세포 화학을 사용 하 여 해결할 수 있습니다. 본 문서에서는 근 적외선 방출 스펙트럼의 형광 단에 면역 세포 화학을 결합 하 여 고 분해능 스캐닝 (예: µm)과 결합 하 여 단백질의 반 정량화를 허용 하는 선명한 이미지를 얻을 수 있는 방법을 설명 합니다. 뇌 영역.
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Protocol
다음 의정서는 델라웨어 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었다. 이 프로토콜에는 약 55 ~ 75 일이 사용 되었다.
1. 뇌 추출 및 조직 준비
- 쥐가 더 이상 발 핀치에 대 한 응답을 전시 하지 때까지 마 취 유도 챔버에 아이 소 루 레인으로 쥐를 마비.
- 길로 틴을 사용 하 여 빠른 침 강을 통해 쥐를 희생.
- 두개골 후부에 피부를 자르고 두개골 꼭대기에서 지웁니다.
- 신중 하 게 두개골의 뒤쪽 부분을 제거 하기 위해 rongeurs를 사용 하 여, 두개골의 중간 선을 잘라 작은 해 부가 위를 사용 하 여, 뇌 조직의 손상을 방지 하기 위해 항상 두개골의 상단에 대 한 위로 밀어.
- 사용 rongeurs 뇌를 노출 하는 두개골의 오른쪽 및 왼쪽 절반을 벗 겨.
- 작은 주걱을 사용 하 여 뇌 밑으로 스 쿱과 신경을 절단 하 고 드라이 아이스 (최소 20°c)에서 획기적 차게 하 여 두뇌를 강화 하 고 두뇌를 동결 시키십시오. 그 후, 슬라이스 할 때까지-80 ° c 냉동 고에 뇌를 저장 합니다.
- -9 ° c와-12 ° c 사이에서 유지 되는 저온 상태에서 30 ~ 50 µm의 관심 영역에서 뇌를 슬라이스 합니다. 글라스 슬라이드에 슬라이스를 직접 마운트하고 면역 세포 화학 분석을 할 때까지-80 ° c 냉동 고에 보관 하십시오.
참고: 이 프로토콜에서 관심 있는 뇌 부위는 해 마와 복숭아 류 였다.
2. 단일 면역 조직 화학 반응
참고: 이중 면역 조직 화학 반응의 경우,이 프로토콜은 단일 면역 조직 화학 반응과 동일 하며,이는 상이한 호스트 (예컨대, 토끼 및 마우스)의 2 개의 일차 항 체를 가지 며, 대응 하는 2 개의 이차 항 체 프라이 머리는 단일 호스트에서 해야 합니다 (예: 염소 토끼와 염소 안티 마우스). 이차 항 체는 또한 고해상 스캐너에서 이용 가능한 2 개의 다른 스펙트럼에서 이어야 합니다. 예를 들어, 680 nm에서의 발광 스펙트럼 피크와 1 차 항 체 800CW (780 nm에서의 방출 스펙트럼 피크)를 갖는 2 차 항 체.
- 냉장고에서 유리 슬라이드를 제거 하 고 30 분 동안 실 온으로 평형 화를 할 수 있습니다.
- 연기 두건에서, 실 온에서 1 − 2 시간 동안 0.1 M 인산 완충 식 염 액 (PBS)에서 4% 파라 포름알데히드에 뇌 조직을 고정 합니다.
- 0.1 M 트리 스 완충 식 염 분 (TBS)을 10 분 동안 세 번 헹 구 십시오. 30-60 분 동안 중성 세제 (예: 0.01% 세제)로 슬라이드를 배양 하 여 세포 막을 투과 합니다.
- 슬라이드를 15 분 동안 3 번 TBS로 헹 궈 주세요.
- 정확한 농도에서 PBS에 관심 단백질에 대 한 1 차 항 체를 희석. 예를 들어, 즉시 초기 유전자 c-Fos를 검출 하기 위해, 1:500의 농도로 토끼 1 차 안티 c-포스 항 체를 제조 하였다.
- 기본 항 체 용액을 뇌 조직에 직접 (약 200 µ L 3 인치 x 1 인치 슬라이드).
- 커버 슬립을 사용 하 여 상 온에서 1 − 2 시간 동안 일차 항 체 희석에서 유리 슬라이드에 뇌 조직을 배양 하 고 4°c에서 하룻밤 (17 시간).
- 커버 슬립을 제거 하 고 소량의 세제가 추가 된 TBS (예: 0.01% 세제, "TBS-T")를 15 분 동안 4 회 정도 세척 합니다.
- 커버 슬립을 사용 하 여 2 시간 동안 실 온에서 이차 항 체의 뇌 부분을 배양 합니다.
참고: 2 차 항 체는 숙주 혈 청의 TBS, 세제 및 1.5%를 함유 하는 희석제에서 정확한 희석을 하 여야 한다. 예를 들어, 1:2000의 희석에서 염소 2 차 항 체는 1.5% 염소 세럼과 0.05% 세제를 함유 할 것 이다. - 슬라이드를 테이블스푼에서 20 분 동안 4 번, 각각 20 분간 테이블스푼으로 헹 구 십시오.
- 밤새 어두운 곳에서 실내 온도에서 건조 한 슬라이드. 슬라이드가 건조 하면 이미징 준비가 완료 된 것입니다.
3. 이미징
- 조직을 아래로 향하게 하 여 근 적외선 스캐닝 인터페이스에 슬라이드를 놓습니다. 선택 도구를 사용 하 여 한 번에 하나의 유리 슬라이드 또는 여러 슬라이드를 이미지 합니다.
- 이미지 슬라이드는 오프셋이 0 nm이 고 해상도가 21 µm 최고 품질 설정을 사용 합니다. 스캐닝은 통상적으로 사용 되는 스캐닝 장비에 따라 13-19 시간을 소요 한다.
- 이미지 분석 소프트웨어 (예: ImageStudio)로 화상을 가져와 반 정량적 단백질 분석을 확인 하 고 표시 합니다.
4. 단백질 발현 분석
- 이미지 분석 소프트웨어를 열고 이미지를 스캔 한 작업 영역 을 선택 합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어에서 스캔 한 이미지를 열어 스캔을 확인 하 고, 볼 수 있는 파장을 조정 하 고, raw 이미지나 총 정량화 된 발광을 변경 하지 않고 표시 되는 대비, 밝기 및 배율을 조절 합니다.
- 정량화 할 주요 영역을 식별 하 고 페이지 상단의 분석 탭을 선택한 다음 사각형 그리기 (또는 타원 그리기/자유형그리기)를 선택 하 여 정량화 될 영역 위에 직사각형을 그립니다.
- 사각형의 크기를 보려면 화면 왼쪽 아래에 있는 모양을 선택한 다음 오른쪽 하단을 따라 열 을 선택 합니다. 높이 및 너비 열을 추가 하 여 모양 크기를 식별 합니다.
참고: 정량화를 비교할 때 모양 크기를 제어 하는 것이 중요 합니다. 해당 영역에 대 한 배출량의 정확한 샘플링을 얻기 위해 원하는 정량화 위치 내에 배치 된 동일한 형상을 사용 하는 것이 좋습니다. - 그런 다음 셰이프의 이름을 지정 하 고 반복 합니다. 모든 지역이 샘플링 되 면 열 탭에서 사용할 수 있는 데이터를 집계 하 고 분석할 수 있습니다.
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Representative Results
면역 조직 화학에 대 한 고해상도 스캐닝을 사용 하기 전에 프로토콜이 작동 하는지 확인 해야 합니다. 이는 동일한 동물의 뇌 부분이 1 차 및 2 차 항 체, 2 차 항 체가 단독으로 또는 1 차 또는 2 차 항 체와 함께 인큐베이션 되는 유효성 검사 분석을 사용 하 여 달성할 수 있습니다. 이러한 유효성 검사 분석에 대 한 결과는 도 2에 나타내 었 다. 이 반응에서 우리는 등 쪽 해 마 및 편도 체에서 즉각적인 초기 유전자 c 준을 검출 하였다. 3 월 발현은 뇌 조직에 일차 및 이차 항 체가 적용 되었을 때에만 관찰 되었다.
그림 3 은 편도 핵에서 이중 단백질 검출을 보여줍니다. 이 실험에서 우리는 동일한 뇌 조직에서 α-아미노-3-하이드 록 시 GluR1-isoxazolepropionic 산 (AMPA) 수용 체와 N 메 틸 D 아 스 파르테 이트 수용 체의 NR2A 서브 유닛의 서브 유닛에 대해 상기 시켰다. 이 복숭아의 하위 핵에 AMPA/NMDA 수용 체의 비율을 검사할 수 있었습니다. 이 비율은 학습 및 메모리11,12의 신경 생물학적 서명입니다. 도 3에서 볼 수 있듯이, GluR2 (780 nm 광 의사는 녹색으로 착 색 됨) 및 NR2A (적색으로 착 색 되는 680 nm 광 의사)는 일차 및 이차 항 체에 노출 된 뇌 조직 에서만 관찰 될 수 있다.
도 4 는 복 부 해 마에서 고 분해능 스캔 으로부터 단백질 발현의 평균과 정규화 된 측정이 어떻게 얻어질 수 있는지를 보여준다. 이미지 분석 소프트웨어를 이용 하 여, 사각형은 관심 영역 (CA1의 분자 층)에 위치 하 고, 그 형상 으로부터의 평균 광의 세기는 형광 단 식의 척도로 서 사용 될 수 있다 (도 4a). 차례로, 이것은 단백질 발현 (즉, 항 원-1 차 항 체-이차 항 체 복합체)의 척도 이다. 형태는 또한 높은 신호를 표현 하는 영역에 걸쳐 배치 될 수 있고 낮은 신호는 정규화 된 곡선을 얻었다 (도 4b). 이 예에서, 사각형은 CA1의 분자 층에 걸쳐 배치 되었지만 수지상 필드를 덮 었으 며,이는이 검정에서 상당한 양의 c-준을 표현 하지 않았다. 그런 다음 곡선 아래의 영역을 단백질 발현의 척도로 사용할 수 있습니다. 실험에서의 셋업이 치료 군 (예컨대, 스트레스 노출) 및 대조 군과 관련 되는 경우, 뇌에서 단백질 발현의 상대적인 변화를 얻을 수 있다.
그림 1 : 일차 (1 st) 및 2 차 (2nd) 항 체 또는 단지 일차 항 체 를 이용한 면역 조직 화학 반응의 예시. 채워진 흑색 원은와 사비 과산화 효소 또는 붕 소-디 피 르 메 넨 (BODIPY)과 같은 형광 성 등의 산화 제가 될 수 있는 라벨을 나타낸다. 녹색 사각형은 면역 조직 화학 반응에서 검출 되는 항 원 (관심 단백질)을 나타냅니다.
그림 2 : C-6의 검출을 위한 검증 검정의 이미지. 이 분석에서, 동일한 동물 로부터 조직 된 토끼 1 차 항 체를 780 nm에서 발광 하는 형광 단 (녹색, 좌측 패널)에서 방출 된 불 소 및 염소 토끼 2 차 항 체를 인식 하 고 처리 하였다. 인접 한 조직은 2 차 항 체 단독 (중 패널) 또는 no 항 체 (우측 패널)로 처리 하였다. 축척 막대는 1mm입니다.
그림 3 : 복숭아 류에서의 이중 라벨링 면역 조직 화학 반응에 대 한 검증 검정. 동일한 쥐에서 3 중의 뇌 절편은 NR2A (좌측 패널), 이차 항 체 (우측 패널)를 인식 하는 GluR1 및 마우스 항 체를 인식 하는 토끼 항 체에 노출 되거나 또는 없는 항 체 이다. GlurR1는 염소 안티 토끼 800CW 2 차 항 체 (780 nm, 녹색으로 착 색 된 의사) 및 NR2A를 사용 하 여 가시화 하였으며 염소 항 마우스 680RD 2 차 항 체 (680 nm, 의사 적색으로 착 색)를 이용 하 여 가시화 하였다. 축척 막대 = 1mm. ot = 광학 관; ic = 내부 캡슐; ec = 외부 캡슐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 뇌 조직에서 단백질 발현의 반 정량 측정을 획득. (A 와 B) 스캐너에서 이미지를 분석 하는 데 사용 되는 이미지 분석 소프트웨어에서 점수가 매겨진 이미지의 스크린샷. 조직은 복 부 해 마 로부터, c-준을 가시화 하 여 처리 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 기사에서 제시 된 결과는 근 적외선 면역 세포 화학이 고 분해능 스캐닝과 결합 하 여 뇌 조직에서 단백질 발현의 반 정량적 측정을 얻는 데 사용 될 수 있음을 보여준다. 또한 동일한 뇌 영역에서 동시에 두 개의 단백질을 라벨링 하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이전에 여러 뇌 영역에서 즉각적인 초기 유전자 발현을 측정 하기 위해 근 적외선 면역 조직 화학을 사용 하였다9,10. 즉각적인 초기 유전자는 신경 활동의 척도로 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 즉각적인 초기 유전자 (IEGs)의 상관관계가 있는 수준으로 뇌 지역을 그룹화 하는 것을 허용 하는 통계적 인 분석에 단백질 표현의이 반 정량적 측정을 복종 시켰습니다. 이를 기능적 연결성의 척도로 사용 하 여 정서적 학습 및 메모리9,10동안 공포 회로 내에서 노드 간 기능적 연결성에 미치는 영향을 조사 했습니다. 우리는 어떻게 AMPA/NMDA 비율 (학습과 메모리의 서명) 높은 해상도 스캐닝13에 가까운 적외선 면역 세포 화학을 사용 하 여 측정 할 수 있는 방법을 보여 주었다. 유사한 기술은 팬 및 포스 포 단백질을 측정 하 여 분자 시그널링을 결정 하는데 사용 될 수 있다. 이는 웨스턴 블랏 (14)을 사용 하 여 이루어진다. 그러나, 이것은 두꺼운 뇌 조각에서 뇌 영역을 해 부 하 고 작은 뇌 영역에 대 한 의무가 하지 필요. 이 문제는 고 분해능 스캐닝과 함께 근 적외선 면역 세포 화학을 사용 하 여 우회할 수 있습니다. 최종적으로, 모든 면역 세포 화학 이미지는 디지털화 되어,이를 통해 이전 분석에 대 한 무제한 저장 및 편리한 재 분석이 가능 합니다.
모든 방법과 마찬가지로 단점이 있습니다. 고해상도 스캐너에는 배율이 없으며, 조직의 치료는 형광 현미경 기술을 사용 하 여 프로 빙을 용이 하 게 허용 하지 않습니다. 심지어 뇌에서 다른 슬라이스를 복용 하는 것은 작동 하지 않을 수 있습니다, 이후 공초점 현미경은 잘 사용 뇌 조직에서 최고의 작동 할 수 있다, 하지만 고해상도 스캐닝과 근 적외선 이미징 일반적으로 플래시 냉동 두뇌에 이루어집니다. 특정 뉴런의 단백질 발현 (예: 인터 뉴런 대 피라미드 뉴런) 또는 뇌의 다른 세포 유형 (예: 뉴런 대 글 리아)은 고해상도 스캐닝과 함께 근 적외선 면역 세포 화학을 사용 하 여 결정할 수 없습니다. 이는 여전히 뇌 조직에서 단백질 발현을 검사 하는 비교적 새로운 방법 이므로 유효성 검사 분석을 수행 하는 것은 매우 중요 합니다.
적절 하 게 사용 하는 경우, 고 분해능 스캐닝과 근 적외선 면역 세포 화학은 이점을 제공 합니다. 뇌 조직의 자동 형광은 근 적외선 범위에서 감소 되 고, 단백질 발현의 반 정량적 측정이 얻어질 수 있고, 동일한 뇌 영역에서 2 개의 단백질의 발현이 얻어질 수 있고, 검정의 심상은 무기한으로 저장 될 수 있다. 올바른 단백질 및/또는 통계적 방법과 결합 하면이 기술은 뇌 내에서 단백질 발현, 신경 활동, 분자 신호 및 기능적 연결성을 검사 하는 데 사용 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 보고서에 대 한 연구는 DK에 게 부여 된 니 터 (1P20GM10363) 로부터 목표 보조금에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. |
References
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