Summary
Здесь мы представляем протокол, который использует инфракрасные красители в сочетании с иммуногистохимии и сканирование с высоким разрешением на белки анализа в областях мозга.
Abstract
Нейробиология – это изучение того, как клетки головного мозга опосредуют различные функции. Измерение экспрессии белка в нейроне и глии имеет решающее значение для изучения нейронауки, поскольку клеточная функция определяется составом и активностью клеточных белков. В этой статье мы описываем, как иммуноцитохимия может сочетаться с сканированием с высоким разрешением в высоком разрешении, чтобы обеспечить полуколичественное измерение экспрессии белка в отдельных областях мозга. Этот метод может быть использован для одного или двойного выражения белка в том же регионе мозга. Измерение белков в этой моде может быть использовано для получения относительного изменения в экспрессии белка с экспериментальной манипуляции, молекулярные подписи обучения и памяти, активность в молекулярных путей, и нейронной активности в нескольких регионах мозга. Используя правильные белки и статистический анализ, можно также определить функциональную связь между регионами мозга. Учитывая легкость внедрения иммуноцитохимии в лабораторных условиях, использование иммуноцитохимии с инфракрасным сканированием с высоким разрешением может расширить способность нейробиолога рассматривать Нейробиологические процессы на системном уровне.
Introduction
Изучение неврологии касается исследования того, как клетки мозга опосредуют специфические функции1. Они могут быть сотовой характер, например, как глии клеток придать иммунитет в центральной нервной системе или может включать эксперименты, которые направлены, чтобы объяснить, как активность нейронов в спинной гиппокамп приводит к пространственной навигации. В широком смысле, клеточная функция определяется белками, которые выражаются в клетке и активностью этих белков2. В результате измерение экспрессии и/или активности белков в клетках головного мозга имеет решающее значение для изучения нейронауки.
Для измерения экспрессии белков в головном мозге имеется ряд методик. Они включают в себя методы естественных условиях, такие как топография выбросов Позитрон для плотности рецептора3 и микро-диализа для малых пептидов4. Чаще всего, бывшие методы в естественных условиях используются для изучения белка функции и выражения. К ним относятся методы масс-спектрометрии5, Вестерн-блот и фермент-связанный иммуноосорбентный анализ (ИФА)6и иммуноцитохимия7. Иммуноцитохимия широко используется в области неврологии. Этот метод включает в себя использование первичного антитела для обнаружения белка (или антигена) интереса (например, c-Фос) и сопряженной вторичной антитела для обнаружения белка-первичного антитела комплекса (рис. 1). Чтобы включить обнаружение белка-первичного антитела-вторичного антитела, вторичные антитела имеют окисляющие вещества, такие как пероксидазы хрена (HRP), сопряженными с ними. Это позволяет формировать осадки в клетках, которые могут быть обнаружены с помощью световой микроскопии7. Вторичные антитела могут также иметь химикаты флуорессе сопрягано к им (т.е., флюорофоры). При стимуляции эти химические вещества излучают свет, который может быть использован для обнаружения белка-первичные антитела-вторичные комплексы антител7. Последн, иногда первичные антитела имеют уменьшая вещества и химикаты флуоресценции прикрепленные к им сразу отрицая потребность для вторичных антител7 (Диаграмма 1).
Интересно, что многие методы иммуноцитохимии допускают визуализацию белков в клетках головного мозга, но не способность количественно определить количество белка в определенной клетке или области мозга. Использование световой микроскопии для обнаружения осадков от снижения реакций позволяет визуализировать нейроны и глии, но этот метод не может быть использован для количественной оценки экспрессии белка в клетках или в конкретной области мозга. В теории, Флуоресцентная микроскопия может быть использована для этого, потому что свет излучается от люминесцентного вторичного антитела измерение протеина-первичного антитела-вторичного комплекса антитела. Тем не менее, аутофлуоресценции в тканях головного мозга может сделать это трудно использовать флуоресцентной микроскопии количественно экспрессии белка в мозговой ткани8. В результате, свет, излучаемый люминесцентными изображениями мозговой ткани, редко используется для количественной оценки экспрессии белков в головном мозге.
Многие из этих вопросов могут быть решены с использованием околоинфракрасной иммуноцитохимии в сочетании с сканирования с высоким разрешением9,10. В этой статье мы описываем, как иммуноцитохимия в сочетании с флюорофорсами в спектре околоинфракрасного излучения может сочетаться с сканированием с высоким разрешением (например, 10 – 21 мкм) для получения острых изображений, позволяющих полу квантификации белка в различных областях мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол был утвержден институциональным Комитетом по уходу и использованию животных (ИАКУК) университета штата Делавэр. Для этого протокола были использованы мужчины-крысы Спраг даули, приблизительно 55 – 75 дней.
1. Извлечение мозга и тканевые приготовления
- Обезболивание крыс с изофлуран в анестезии индукционной камере, пока крыса больше не проявляет ответ на ногу щепотку.
- Жертва крыс через быстрое обезглавливание использованием гильотины.
- Вырезать кожу на черепе задней передней и ясно сверху черепа.
- Использование rongeурс для тщательного удаления задней части черепа, а затем с помощью небольших рассекает ножницы сократить Срединно черепа, толкая вверх против верхней части черепа во все времена, чтобы избежать повреждения мозговой ткани.
- Используйте rongeуры для того чтобы слезть прочь правую и левую половину черепа для того чтобы подвергнуть действию мозг.
- Используйте небольшой шпатель для совок под мозг и разорвать нервы, тщательно поднять мозг и заморозить мозги в isopentane охлажденной на сухом льду (по крайней мере-20 ° c). После этого, хранить мозги в-80 ° c морозильник до нарезки.
- Нарежьте мозги в регионах, представляющих интерес в 30 – 50 мкм в криостате, поддерживаем от-9 °C до-12 °C. Непосредственно смонтировать ломтики на стеклянные горки и хранить в-80 ° c морозильник до времени иммуноцитохимии анализа.
Примечание: В этом протоколе области мозга интерес были гиппокамп и миндалины.
2. одиночная Иммуноги, химическая реакция
Примечание: Для двойной иммуногибхимической реакции протокол такой же, как и у одной иммуногиостахимической реакции, за исключением этой реакции, имеет два первичных антитела различных узлов (например, кролик и мышь) и два вторичных антитела для соответствующего праймериз должны быть из одного хозяина (например, козьего антикролика и козы противокозий). Вторичные антитела также должны быть из двух различных спектров, которые доступны в высоком разрешении сканеров. Например, одно вторичное антитело с пиком спектра излучения на 680 нм и одно вторичное антитело 800 CW (пик спектра излучения на 780 нм).
- Удалите стеклянные слайды из морозильника и дайте ему сравнить температуру до комнатной температуры на 30 минут.
- Под вытяжным колпаком, исправить мозговой ткани в 4% параформальдегид в 0,1 м фосфат буферизованные физиологический раствор (PBS) для 1 − 2 ч при комнатной температуре.
- Промыть слайды в 0,1 M рис буферизованные физиологический раствор (Бист) три раза по 10 мин каждый. Мембраны клеточных мембран путем инкубации слайдов в мягкой моющего средства (например, 0,01% моющего средства) для 30 − 60 мин.
- Сполосните слайды в Бист три раза по 15 мин каждый.
- Разбавить первичные антитела для белка интерес к PBS в правильной концентрации. Например, для обнаружения немедленного раннего гена c-Фос, подготовить кролика первичной анти c-Фос антитела в концентрации 1:500.
- Пипетки первичного антитела решение непосредственно на ткани головного мозга (около 200 мкл на 3 дюйма х 1 дюйм слайд).
- Используйте комбинезон для инкубации мозговой ткани на стеклянных слайдах в первичном разведении антител для 1 − 2 ч при комнатной температуре или на ночь (~ 17 ч) при 4 °C.
- Удалите комбинезон и мыть слайды в бит, который имеет небольшое количество моющего средства, добавленного к нему (например, 0,01% моющего средства, "ти-т") четыре раза по 15 мин каждый.
- Используйте комбинезон для инкубации участков мозга в вторичное антитело при комнатной температуре в течение 2 ч.
Примечание: Вторичное антитело должно быть к правильно разбавлять и в разбавителя содержа, котор, моющего средства, и 1,5% из сыворотки хозяина. Например, коза вторичного антитела в разведении 1:2000 будет содержать 1,5% козьего сыворотки и 0,05% моющего средства. - Сполосните слайды в Бист-т четыре раза по 20 мин каждый, а затем в БИБС четыре раза по 20 мин каждый.
- Сухие горки при комнатной температуре в темное время суток. Когда слайды сухие, они готовы для визуализации.
3. Визуализация
- Место слайды на ближне-Инфракрасное сканирование интерфейса с тканью вниз. Либо изображение одного стекла слайд или несколько слайдов в то время, с помощью выбора инструмента.
- Слайды изображения с использованием параметра наивысшего качества с смещение в 0 Нм и разрешением 21 мкм. Сканирование обычно занимает 13 − 19 ч в зависимости от используемого сканирующего оборудования.
- Импорт изображений в программное обеспечение для анализа изображений (например, имиджесто) для просмотра и обозначения для полуколичественного анализа белка.
4. анализ экспрессии белков
- Откройте программное обеспечение для анализа изображений и выберите рабочую зону , в которую было отсканировано изображение.
- Откройте отсканированную картинку в программном обеспечении для анализа изображений, чтобы просмотреть сканирование, и настройте, какие длины волн просматриваются, а также контраст, яркость и увеличение, показанные без изменения исходного изображения или суммарной количественной эмиссии.
- Определите ключевые регионы для количественной оценки и выберите вкладку анализа в верхней части страницы, затем выберите прямоугольник рисования (или Нарисуйте эллипс/Нарисуйте от руки), чтобы нарисовать прямоугольник над областью, которая будет определена количественно.
- Чтобы просмотреть размер прямоугольника, выберите фигуры в левом нижнем углу экрана, затем выберите столбцы вдоль правого дна. Добавление столбцов высоты и ширины для определения размера фигуры.
Примечание: При сравнении количественных размеров важно контролировать размер фигуры. Чтобы получить точную выборку выбросов в этом регионе, рекомендуется использовать одинаковые фигуры, помещенную в нужное место для количественной оценки. - Затем назовите форму и повторите. После отбора всех регионов данные, имеющиеся в вкладке столбцов , могут быть агрегированы и проанализированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Перед использованием сканирования с высоким разрешением для иммуногистохимии, необходимо убедиться, что протокол работает. Это может быть достигнуто с помощью анализа проверки, где отделы мозга от одного и того же животного инкубировали с первичными и вторичными антителами, вторичным антителом только, или ни первичного, ни вторичного антитела. Результаты для такого анализа проверки отображаются на рисунке 2. В этой реакции мы были обнаружения немедленного раннего гена c-Июнь в спинной гиппокамп и миндалины. Выражение C-Июнь наблюдалось только при применении первичных и вторичных антител к ткани головного мозга.
На рисунке 3 показано двойное Обнаружение белка в ядрах миндалины. В этом эксперименте мы исследовали GluR1 подединицу а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-исоксаолепропионовой кислоты (АМПА) рецептора и NR2A подединицу N-метил-D-аспартат рецепторов (NMDA) рецепторов в той же ткани головного мозга. Это позволило нам изучить соотношение рецепторов АМРА/NMDA в суб-ядер миндалины. Это соотношение является нейробиологической подписью обучения и памяти11,12. Как видно на рисунке 3, сигнал для GluR2 (780 нм светло-псевдо цвета в зеленом) и NR2A (680 нм свет псевдо красного цвета) может наблюдаться только в тканях головного мозга, что подвергается воздействию первичных и вторичных антител.
На рисунке 4 показано, как среднее и нормализованные показатели экспрессии белка могут быть получены в результате сканирования с высоким разрешением в брюшной гиппокампе. Использование программного обеспечения для анализа изображений, прямоугольник помещается в область интересов (молекулярный слой СА1) и средняя интенсивность света от формы может быть использован в качестве показателя экспрессии флюффора (рис. 4A). В свою очередь, это показатель экспрессии белка (т.е. антиген-первичный антитело-вторичный комплекс антител). Форма также может быть размещена в регионе, который выражает высокий сигнал и низкий сигнал для получения нормализованной кривой (Рисунок 4B). В этом примере, прямоугольник был помещен через молекулярный слой СА1, но охватывал дендритные поля, а также, которые не выражают значительное количество c-Июнь в этом анализа. Область под кривой может быть использована как мера экспрессии белка. Если установка в эксперименте включает группы обработки (например, подвержение напряжения) и управление, то относительные изменения в выражении протеина в мозге можно получить.
Рисунок 1 : Иллюстрация иммуногив-химической реакции с использованием первичных (1-й) и вторичных (2-х) антител или просто первичных антител. Заполненные черные круги представляют собой ярлык, который может быть окислителем, таким как хрен пероксидазы или флюлофор, таких как бор-дипиррометене (BODIPY). Зеленые квадраты представляют собой антиген (на белок интереса) обнаруживаются в иммуногиструхимической реакции.
Рисунок 2 : Изображения валидации анализа для обнаружения c-июнь. В этом анализа, ткани из того же животного лечили с кроликом первичных антител, что признает c-Июнь и козьего антикроличьего вторичного антитела с прикрепленным флюффора с излучением на 780 нм (псевдо-цветные в зеленом, левая панель). Соседние ткани лечилась либо вторичным антителом в одиночку (средняя панель), либо без антител (правая панель). Полоска шкалы = 1 мм.
Рисунок 3 : Анализ валидации для двойной этикетихимической реакции в мозжечковой миндалины. Разделы мозга трикатного от такой же крысы или подверглись действию к антителу кролика которое узнает антитело GluR1 и мыши которое узнает NR2A (левые панели), вторичное антитело (средние панели), или никакое антитело (правые панели). GlurR1 был визуализирован с козьим анти кролика 800 CW вторичное антитело (780 нм, псевдо цвета в зеленом) и NR2A был визуализирован с помощью козы античный 680RD вторичное антитело (680 нм, псевдо окрашены в красный цвет). Полоска шкалы = 1 мм. OT = оптический тракт; IC = Внутренняя капсула; EC = внешняя капсула. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 4 : Получение полуколичественного измерения экспрессии белка в тканях головного мозга. ( А и б) скриншоты забитых изображений в программном обеспечении для анализа изображений, которое используется для анализа изображений из сканера. Ткань была из брюшной гиппокампа и лечилась, чтобы визуализировать c-июнь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Результаты, представленные в этой статье, показывают, что почти инфракрасная иммуноцитохимия в сочетании с сканированием с высоким разрешением может быть использована для получения полуколичественного измерения экспрессии белка в тканях головного мозга. Он также может быть использован для обозначения двух белков одновременно в одной и той же области мозга. Мы ранее использовали околоинфракрасную иммуногистохимию для измерения немедленного раннего экспрессии генов в нескольких регионах мозга9,10. Немедленные ранние гены могут использоваться как мера нейронной активности. Мы также подвергли эти полуколичественные показатели экспрессии белков статистическому анализу, который позволил нам сгруппировать области мозга с коррелированными уровнями непосредственных ранних генов (ИЭГ). Мы использовали это как меру функциональной связи, чтобы изучить, как стресс влияет на функциональную связь между узлами в пределах цепи страха во время эмоционального обучения и памяти9,10. Мы показали, как АМРА/NMDA коэффициенты (подпись обучения и памяти) могут быть измерены с помощью околоинфракрасной иммуноцитохимии с высоким разрешением сканирования13. Аналогичный метод может быть использован для измерения Пан и фосфорно-белки для определения молекулярной сигнализации. Это достигается с помощью Вестерн-блот14. Тем не менее, это требует рассечения участков мозга из толстых ломтиков мозга и не поддаются малым регионам мозга. Эту проблему можно обойти с помощью иммуноцитохимии ближней инфракрасной области с сканированием с высоким разрешением. Наконец, все изображения иммуноцитохимии оцифрованы, что позволяет неограниченное хранение и удобный повторный анализ предыдущих анализов.
Как и все методы есть недостатки. Существует не увеличение в высоком разрешении сканеров и лечения ткани не легко позволяют зондирования с использованием флуоресцентных микроскопических методов. Даже принимая альтернативные ломтики из головного мозга не может работать, так как конфокальная микроскопия может работать лучше в перперили мозговой ткани, но почти инфракрасные изображения с высоким разрешением сканирования, как правило, делается на флэш замороженных мозгов. Выражение белка в специфических нейронами (например, интернейрон против пирамидального нейрона) или различные типы клеток головного мозга (например, нейроны против глии) не могут быть определены с помощью иммуноцитохимии ближнего инфракрасного с сканированием с высоким разрешением. Проведение валидации исследования имеют решающее значение, поскольку это еще сравнительно новый метод для изучения экспрессии белка в тканях головного мозга.
При правильном использовании, ближне-инфракрасная иммуноцитохимия с сканированием с высоким разрешением дает преимущества. Аутофлуоресцентное в мозговой ткани снижается в околоинфракрасном диапазоне, полу-количественные показатели экспрессии белка могут быть получены, выражение двух белков в одной и той же области мозга могут быть получены, и образы анализа могут храниться бесконечно. Когда в паре с правильного белка и/или статистический метод этот метод может быть использован для изучения экспрессии белка, нейронной активности, молекулярные сигнализации и функциональных соединений в головном мозге.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследование в этом отчете финансировалось за счет целевого гранта от NIГРОССМЕЙСТЕРОВ (1P20GM103653), присужден ДК.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. |
References
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
