Summary
Her præsenterer vi en protokol, der bruger nær-infrarøde farvestoffer sammen med Immunhistokemi og høj opløsning scanning til assay proteiner i hjernen regioner.
Abstract
Neurovidenskab er studiet af, hvordan celler i hjernen mægle forskellige funktioner. Måling protein udtryk i neuroner og glia er afgørende for studiet af neurovidenskab som cellulære funktion bestemmes af sammensætningen og aktiviteten af cellulære proteiner. I denne artikel beskriver vi, hvordan immuncytokemi kan kombineres med nærinfrarød scanning i høj opløsning for at give et semi-kvantitativt mål af protein udtryk i forskellige områder i hjernen. Denne teknik kan bruges til enkelt eller dobbelt protein udtryk i samme hjerneregion. Måling af proteiner på denne måde kan bruges til at opnå en relativ ændring i protein udtryk med en eksperimentel manipulation, Molekylær underskrift af indlæring og hukommelse, aktivitet i molekylære veje, og neurale aktivitet i flere hjerneregioner. Ved hjælp af de korrekte proteiner og statistisk analyse kan funktionel konnektivitet blandt hjerneregioner også bestemmes. I betragtning af den lethed at gennemføre immuncytokemi i et laboratorium, ved hjælp af immuncytokemi med nær-infrarød høj opløsning scanning kan udvide muligheden for Neuro videnskabsmand til at undersøge neurobiologiske processer på et systemniveau.
Introduction
Studiet af neurovidenskab vedrører en undersøgelse af, hvordan celler i hjernen mægle specifikke funktioner1. Disse kan være cellulære i naturen, såsom hvordan glia celler giver immunitet i det centrale nervesystem eller kan involvere eksperimenter, der har til formål at forklare, hvordan aktiviteten af neuroner i rygtet hippocampus fører til rumlig navigation. I bred forstand bestemmes cellulære funktion af de proteiner, der udtrykkes i en celle, og aktiviteten af disse proteiner2. Som et resultat, måling af udtryk og/eller aktivitet af proteiner i hjerneceller er afgørende for studiet af neurovidenskab.
En række teknikker er tilgængelige til at måle protein udtryk i hjernen. Disse omfatter in vivo metoder såsom Positron emission topografi for receptor tætheder3 og mikro-dialyse for små peptider4. Mere almindeligt, ex vivo metoder anvendes til at undersøge protein funktion og udtryk. Disse omfatter massespektrometri teknikker5, Western blot og enzym-linked immunosorbent assay (ELISA)6, og immuncytokemi7. Immunocytochemistry er meget udbredt inden for neurovidenskab. Denne teknik indebærer anvendelse af et primært antistof til påvisning af et protein (eller antigen) af interesse (f. eks. c-FOS) og et konjugeret sekundært antistof til påvisning af det protein-primære antistof kompleks (figur 1). For at muliggøre påvisning af det protein-primære antistof-sekundære antistof kompleks, har sekundære antistoffer oxiderende midler som peberrod peroxidase (HRP) konjugeret til dem. Dette giver mulighed for dannelsen af bundfald i celler, der kan påvises ved hjælp af let mikroskopi7. Sekundære antistoffer kan også have kemikalier fluoresceres konjugeret til dem (dvs., fluorophores). Når stimuleret disse kemikalier udsender lys, som kan bruges til at detektere protein-primære antistof-sekundære antistof komplekser7. Endelig, sommetider primære antistoffer har reduktionsmidler og fluorescens kemikalier knyttet til dem direkte virkningsløs behovet for sekundære antistoffer7 (figur 1).
Interessant, mange immuncytokemi metoder giver mulighed for visualisering af proteiner i hjerneceller, men ikke evnen til at kvantificere mængden af protein i en bestemt celle eller hjerneregion. Brug af let mikroskopi til at detektere bundfald fra reduktions reaktioner giver mulighed for visualisering af neuroner og glia, men denne metode kan ikke bruges til at kvantificere protein udtryk i celler eller i en bestemt hjerneregion. I teorien kan Fluorescens mikroskopi anvendes til dette, fordi det lys, der udsendes fra det fluorescerende sekundære antistof, er et mål for det protein-primære antistof-sekundære antistof kompleks. Men, autofluorescens i hjernevæv kan gøre det vanskeligt at bruge Fluorescens mikroskopi til at kvantificere protein ekspression i hjernevæv8. Som et resultat, lys udledt fra fluorescerende billeder af hjernevæv er sjældent bruges til at kvantificere protein udtryk i hjernen.
Mange af disse problemer kan løses ved hjælp af nærinfrarød immuncytokemi sammen med højopløsnings scanning9,10. I denne artikel beskriver vi, hvordan immuncytokemi kombineret med fluorophores i de nærinfrarøde emissions spektre kan kombineres med scanning i høj opløsning (f. eks. 10 – 21 μm) for at opnå skarpe billeder, der giver mulighed for semi kvantificering af protein i særskilte områder i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol blev godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) ved universitetet i Delaware. Mand Sprague Dawley rotter ca. 55 – 75 dage gamle blev brugt til denne protokol.
1. hjerne udvinding og vævs forberedelse
- Anæstetize rotte med isofluran i anæstesi induktions kammer indtil rotte ikke længere udviser et respons på foden knibe.
- Ofrer rotter via hurtig halshugning ved hjælp af en guillotine.
- Skær huden på kraniet posteriort til forreste og klare fra toppen af kraniet.
- Brug rongeurs til forsigtigt at fjerne den bageste del af kraniet, og derefter bruge små dissekere saks skære ned midterlinjen af kraniet, skubbe opad mod toppen af kraniet på alle tidspunkter for at undgå at beskadige hjernevæv.
- Brug rongeurs til at skrælle væk fra højre og venstre halvdel af kraniet for at afsløre hjernen.
- Brug en lille spatel til at scoop under hjernen og bryde nerver, omhyggeligt ophøje hjernen og fryse hjerner i isopentan kølet på tøris (mindst-20 °c). Derefter opbevares hjerner i en-80 °C fryser indtil udskæring.
- Skær hjerner i områder af interesse på 30 – 50 μm i en kryostat vedligeholdt mellem-9 °C og-12 °C. Monter skiver direkte på glassene, og opbevar den i en-80 °C fryser indtil tidspunktet for immunocytokemi assay.
Bemærk: I denne protokol hjernen regioner af interesse var hippocampus og amygdala.
2. enkelt immun Histokemisk reaktion
Bemærk: For dobbelt immunohistokemisk reaktion er protokollen den samme som den enkelte immunohistokemiske reaktion, bortset fra at denne reaktion har to primære antistoffer af forskellige værter (f. eks. kanin og mus) og to sekundære antistoffer for den tilsvarende primærvalg skal være fra en enkelt vært (f. eks. ged antikanin og gede antimus). De sekundære antistoffer skal også være fra to forskellige spektre, der er tilgængelige i højopløsnings scannere. For eksempel et sekundært antistof med et emissions spektrum peak ved 680 nm og en sekundær antistof 800CW (emission spektrum peak ved 780 nm).
- Fjern glassene fra fryseren, og lad dem kalibrere til stuetemperatur i 30 minutter.
- Under en stinkhætte, fix hjernevæv i 4% PARAFORMALDEHYD i 0,1 M phosphatbufferet saltvand (PBS) i 1 − 2 timer ved stuetemperatur.
- Skyl slides i 0,1 M Tris buffer-bufferet saltvand (TBS) tre gange i 10 min hver. Permeabilize cellemembraner ved at inkuleere slides i et mildt rengøringsmiddel (f. eks. 0,01% vaskemiddel) i 30 − 60 minutter.
- Skyl slides i TBS tre gange i 15 minutter hver.
- Fortynde det primære antistof for protein af interesse i PBS i den korrekte koncentration. For eksempel, for at detektere den umiddelbare tidlige gen c-FOS, forberede en kanin primære anti-c-FOS antistoffer i en koncentration af 1:500.
- Pipette primære antistof opløsning direkte på hjernevæv (ca. 200 μL pr. 3 tommer x 1 tommer slide).
- Brug dæksedler til at infiltrere hjernens væv på glas slides i primær antistof fortynding i enten 1 − 2 timer ved stuetemperatur eller natten over (~ 17 timer) ved 4 °C.
- Fjern dæksedler og vask slides i TBS, der har en lille mængde vaskemiddel tilsat (f. eks. 0,01% vaskemiddel, "TBS-T") fire gange i 15 minutter hver.
- Brug dæksedler til at infiltrere hjerne sektioner i et sekundært antistof ved stuetemperatur i 2 timer.
Bemærk: Det sekundære antistof skal være til den korrekte fortynding og i en fortyndingsvæske indeholdende TBS, vaskemiddel og 1,5% af værts serum. For eksempel, en ged sekundære antistof i en fortynding af 1:2000 ville indeholde 1,5% gede serum og 0,05% vaskemiddel. - Skyl slides i TBS-T fire gange i 20 min hver, og derefter i TBS fire gange i 20 min hver.
- Tørre slides ved stuetemperatur i mørket natten over. Når slides er tørre, er de klar til billedbehandling.
3. billeddannelse
- Anbring diasene på den nærmeste infrarøde scannings grænseflade med vævet nedad. Enten billede et glas slide eller flere dias ad gangen ved hjælp af et markeringsværktøj.
- Billed slides ved hjælp af den højeste kvalitetsindstilling med en forskydning på 0 nm og en opløsning på 21 μm. Scanningen vil typisk tage 13 − 19 timer afhængigt af det anvendte scanningsudstyr.
- Importer billeder til billedanalyse softwaren (f. eks. ImageStudio) for at se og markere for semi-kvantitativ proteinanalyse.
4. analyse af protein udtryk
- Åbn billedanalyse softwaren, og vælg det arbejdsområde , som billedet blev scannet til.
- Åbn det scannede billede i billedanalyse softwaren for at se scanningen, og Juster, hvilke bølgelængder der vises, samt kontrasten, lysstyrken og forstørrelsen vist uden at ændre det rå billede eller den samlede kvantificerede emission.
- Identificer de nøgleområder, der skal kvantificeres, og vælg fanen analyse øverst på siden, og vælg derefter tegn rektangel (eller tegn ellipse/tegn Freehand) for at tegne et rektangel over det område, der skal kvantificeres.
- Hvis du vil have vist størrelsen på rektanglet, skal du vælge figurer nederst til venstre på skærmen og derefter vælge kolonner nederst til højre. Tilføj kolonner for højde og bredde for at identificere figurens størrelse.
Bemærk: Det er vigtigt at kontrollere for figurens størrelse, når kvantificeringen sammenlignes. Det anbefales at bruge identiske former placeret inden for den ønskede kvantificerings placering for at få en nøjagtig prøvetagning af emissionerne for den pågældende region. - Navngiv derefter figuren, og Gentag. Når alle regioner er udtaget, kan de data, der er tilgængelige fra fanen kolonner , aggregeres og analyseres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før du bruger høj opløsning scanning for immunohistochemistry, bør man kontrollere, at protokollen virker. Dette kan opnås ved hjælp af en validerings analyse, hvor hjerne sektioner fra samme dyr inkubieres med primære og sekundære antistoffer, sekundært antistof alene eller hverken primær eller sekundær antistof. Resultaterne for en sådan validerings analyse er vist i figur 2. I denne reaktion var vi detektere det umiddelbare tidlige gen c-Jun i rygfinne hippocampus og amygdala. C-Jun-udtryk blev kun observeret, når primære og sekundære antistoffer blev anvendt på hjernevæv.
Figur 3 viser dobbelt protein påvisning i amygdala kerner. I dette eksperiment vi analyseret den GluR1 underenhed af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionsyre (AMPA) receptor og NR2A underenhed af N-methyl-D-aspartat receptor (NMDA) receptor i samme hjernevæv. Dette tillod os at undersøge forholdet mellem AMPA/NMDA-receptorer i sub-kerner af amygdala. Dette forhold er en neurobiologisk underskrift af indlæring og hukommelse11,12. Som det kan ses i figur 3, signal for GluR2 (780 nm lys pseudo farvet i grøn) og NR2A (680 nm lys pseudo farvet i rødt) kan kun observeres i hjernevæv, der blev udsat for primære og sekundære antistoffer.
Figur 4 viser, hvordan gennemsnitlige og normaliserede målinger af protein udtryk kan opnås fra høj opløsning scanninger i ventrale hippocampus. Ved hjælp af billedanalyse softwaren anbringes et rektangel i det pågældende område (molekylært lag), og den gennemsnitlige lysstyrke for lys fra formen kan anvendes som et mål for fluorophore-udtryk (figur 4a). Til gengæld er dette et mål for protein udtryk (dvs. det antigen-primære antistof-sekundære antistof kompleks). Formen kan også placeres på tværs af en region, der udtrykker høj signal og lavt signal for at opnå en normaliseret kurve (figur 4b). I dette eksempel blev et rektangel placeret på tværs af det molekylære lag af Carin, men dækkede også de dendritiske felter, som ikke udtrykte betydelige mængder af c-Jun i denne analyse. Arealet under kurven kan derefter bruges som et mål for protein udtryk. Hvis opsætningen i et eksperiment involverer behandlingsgrupper (f. eks. stress eksponering) og en kontrol, kan der opnås relative ændringer i protein ekspression i hjernen.
Figur 1 : Illustration af den immunohistokemiske reaktion ved brug af primære (1St) og sekundære (2nd) antistoffer eller blot det primære antistof. Fyldte sorte cirkler repræsenterer en etiket, som kan være et oxiderende middel såsom peberrod peroxidase eller en fluorophore såsom Boron-dipyrromethene (BODIPY). Grønne firkanter repræsenterer antigen (på protein af interesse), der påvises i den immunohistokemiske reaktion.
Figur 2 : Billeder af en validerings analyse til påvisning af c-jun. I denne analyse, væv fra samme dyr blev behandlet med en kanin primære antistof, der genkender c-Jun og Goat antikanin sekundært antistof med vedhæftet fluorophore med emission ved 780 nm (pseudo farvet i grøn, venstre panel). Tilstødende væv blev behandlet med enten sekundært antistof alene (midterste panel) eller intet antistof (højre panel). Skala stang = 1 mm.
Figur 3 : Validerings analyse for dobbelt mærkning immunhistokemiske reaktion i amygdala. Triplicate hjerne sektioner fra samme rotte blev enten eksponeret for kanin antistof, der genkender GluR1 og mus antistof, der genkender NR2A (venstre paneler), sekundært antistof (midterste paneler), eller ingen antistof (højre paneler). GlurR1 blev visualiseret med ged anti kanin 800CW sekundært antistof (780 nm, pseudo farvet i grøn) og NR2A blev visualiseret ved hjælp af en ged antimouse 680RD sekundært antistof (680 nm, pseudo farvet i rødt). Skala stang = 1 mm. OT = optisk kanal; IC = indvendig kapsel; EC = udvendig kapsel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Opnåelse semikvantitative målinger af protein udtryk i hjernevæv. (A og B) screenshots af scorede billeder i billedanalyse softwaren, der bruges til at analysere billeder fra scanneren. Væv var fra den ventrale hippocampus og behandlet for at visualisere c-jun. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De resultater, der præsenteres i denne artikel viser, at nær-infrarød immuncytokemi i kombination med høj opløsning scanning kan bruges til at opnå semi-kvantitative målinger af protein udtryk i hjernevæv. Det kan også bruges til at mærke to proteiner samtidigt i samme hjerneregion. Vi har tidligere brugt nær-infrarød Immunhistokemi til at måle umiddelbar tidlig genekspression i flere hjerneregioner9,10. Umiddelbare tidlige gener kan bruges som et mål for neurale aktivitet. Vi har også udsat disse semi-kvantitative målinger af protein udtryk til statistiske analyser, der tillod os at gruppere hjerneregioner med korreleret niveauer af umiddelbare tidlige gener (Ieg'er). Vi brugte dette som et mål for funktionel konnektivitet til at undersøge, hvordan stress påvirker funktionel konnektivitet blandt knudepunkter i frygt kredsen under følelsesmæssig læring og hukommelse9,10. Vi viste, hvordan AMPA/NMDA nøgletal (en underskrift af læring og hukommelse) kan måles ved hjælp af nær-infrarød immuncytokemi med høj opløsning scanning13. En lignende teknik kan bruges til at måle pander og fosho-proteiner til at bestemme Molekylær signalering. Dette opnås ved hjælp af Western blot14. Dette kræver dog at dissekere hjerneregioner ud af tykke hjerne skiver og er ikke underholdende for små hjerneregioner. Dette problem kan omgås ved hjælp af nærinfrarød immuncytokemi med scanning i høj opløsning. Endelig, alle immuncytokemi billeder er digitaliseret, som giver mulighed for ubegrænset opbevaring og bekvem re-analyse af tidligere assays.
Som med alle metoder er der ulemper. Der er ingen forstørrelse i højopløselige scannere, og behandlingen af væv giver ikke let mulighed for sondering ved hjælp af fluorescens mikroskopiske teknikker. Selv at tage alternative skiver fra hjernen kan ikke arbejde, da confokal mikroskopi kan fungere bedst i perfbrugt hjernevæv, men nær-infrarød billedbehandling med høj opløsning scanning er typisk gjort på flash frosne hjerner. Protein udtryk i specifikke neuroner (f. eks. interneuron vs. pyramide neuron) eller forskellige celletyper i hjernen (f. eks. neuroner vs. glia) kan ikke bestemmes ved hjælp af nærinfrarød immunocytokemi med scanning i høj opløsning. Udførelse validering analyser er afgørende, da dette er stadig en relativt ny metode til at undersøge protein udtryk i hjernevæv.
Når det anvendes korrekt, nær-infrarød immuncytokemi med høj opløsning scanning giver fordele. Autofluorescens i hjernevæv reduceres i det nær-infrarøde område, semi-kvantitative målinger af protein udtryk kan opnås, udtryk for to proteiner i samme hjerneregion kan opnås, og billeder af analysen kan lagres på ubestemt tid. Når parret med den korrekte protein og/eller statistisk metode denne teknik kan bruges til at undersøge protein udtryk, neurale aktivitet, Molekylær signalering, og funktionelle tilslutningsmuligheder i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskningen i denne rapport blev finansieret af et mål-tilskud fra NIGMS (1P20GM103653), der blev tildelt DK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. |
References
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
