Summary
Hier presenteren we een protocol dat near-infrarood kleurstoffen gebruikt in combinatie met Immunohistochemistry en hoge-resolutie scannen naar eiwitten in hersengebieden te testen.
Abstract
Neurowetenschappen is de studie van hoe cellen in de hersenen verschillende functies bemiddelen. Het meten van eiwitexpressie in neuronen en glia is van cruciaal belang voor de studie van de neurowetenschappen als cellulaire functie wordt bepaald door de samenstelling en activiteit van cellulaire eiwitten. In dit artikel beschrijven we hoe immunocytochemie kan worden gecombineerd met bijna-infrarood scannen met hoge resolutie om een semi-kwantitatieve maat van eiwitexpressie in verschillende hersengebieden te bieden. Deze techniek kan worden gebruikt voor enkele of dubbele eiwitexpressie in hetzelfde hersengebied. Het meten van proteïnen op deze manier kan worden gebruikt om een relatieve verandering in eiwituitdrukking met een experimentele manipulatie, moleculaire handtekening van het leren en geheugen, activiteit in moleculaire wegen, en neurale activiteit in veelvoudige hersenengebieden te verkrijgen. Met behulp van de juiste eiwitten en statistische analyse, functionele connectiviteit tussen hersengebieden kan ook worden bepaald. Gezien het gemak van de uitvoering immunocytochemie in een laboratorium, met behulp van immunocytochemie met near-infrarood hoge-resolutie scannen kan het vermogen van de neuro om neurobiologische processen te onderzoeken op een systeemniveau uit te breiden.
Introduction
De studie van neurowetenschappen betreft een onderzoek van hoe de cellen in de hersenen specifieke functies bemiddelen1. Deze kunnen worden cellulaire in de natuur, zoals hoe glia cellen verlenen immuniteit in het centrale zenuwstelsel of kan betrekken experimenten die gericht zijn om uit te leggen hoe de activiteit van neuronen in de dorsale Hippocampus leidt tot ruimtelijke navigatie. In brede zin wordt de cellulaire functie bepaald door de eiwitten die worden uitgedrukt in een cel en de activiteit van deze eiwitten2. Als gevolg daarvan, het meten van de expressie en/of activiteit van eiwitten in hersencellen zijn van cruciaal belang voor de studie van de neurowetenschappen.
Een aantal technieken zijn beschikbaar om eiwituitdrukking in de hersenen te meten. Deze omvatten in vivo methodes zoals positron emissie topografie voor receptor dichtheid3 en micro-dialyse voor kleine peptides4. Meer algemeen, ex vivo methoden worden gebruikt om de eiwitfunctie en expressie te onderzoeken. Deze omvatten massaspectrometrie technieken5, westelijke vlek en enzym-verbonden immunosorbent ASSAY (Elisa)6, en immunocytochemie7. Immunocytochemie wordt veel gebruikt op het gebied van neurowetenschappen. Deze techniek impliceert het gebruik van een primair antilichaam om een proteïne (of antigeen) van belang (b.v., c-FOS) en een geconjugeerd secundair antilichaam te ontdekken om het eiwit-primaire antilichamen complex te ontdekken (Figuur 1). Om opsporing van het eiwit-primaire antilichaam-secundair antilichamen complex toe te laten, hebben de secundaire antilichamen oxyderende agenten zoals mierikswortelperoxidase (HRP) die aan hen wordt vervoegd. Dit zorgt voor de vorming van precipitaten in cellen die kunnen worden gedetecteerd met behulp van lichte microscopie7. Secundaire antilichamen kunnen ook chemicaliën op te lichten geconjugeerde aan hen (dat wil zeggen, fluorophores). Wanneer bevorderd deze chemische producten licht uitstoten, dat kan worden gebruikt om proteïne-primair antilichaam-secundaire antilichamen complexen te ontdekken7. Ten slotte, soms hebben de primaire antilichamen het verminderen van agenten en fluorescentie chemische producten aan hen direct ontkennend de behoefte aan secundaire antilichamen7 (Figuur 1).
Interessant, vele immunocytochemie methodes staan voor visualisatie van proteïnen in hersenen cellen toe, maar niet de capaciteit om de hoeveelheid proteïne in een specifieke cel of een hersenengebied te kwantificeren. Het gebruik van lichte microscopie om precipitaten van reductiereacties op te sporen zorgt voor visualisatie van neuronen en glia, maar deze methode kan niet gebruikt worden om eiwitexpressie in cellen of in een specifiek hersengebied te kwantificeren. In theorie, kan de fluorescentie microscopie voor dit worden gebruikt, omdat het licht dat van het fluorescente secundaire antilichaam wordt uitgezonden een maatregel van het eiwit-primaire antilichaam-secundaire antilichamen complex is. Nochtans, kan autofluorescentie in hersenenweefsel het moeilijk maken om fluorescentie microscopie te gebruiken om eiwituitdrukking in hersenenweefsel te kwantificeren8. Dientengevolge, wordt het licht dat van fluorescente beelden van hersenenweefsel wordt uitgezonden zelden gebruikt om eiwituitdrukking in de hersenen te kwantificeren.
Veel van deze problemen kunnen worden aangepakt met behulp van near-infrarood immunocytochemie in combinatie met hoge-resolutie scannen9,10. In dit artikel beschrijven we hoe immunocytochemie in combinatie met fluorophores in de near-infrarood emissie Spectra gecombineerd kan worden met hoge resolutie scanning (bijv. 10 – 21 µm) om scherpe beelden te verkrijgen die een semi-kwantificering van eiwitten mogelijk maken in verschillende hersengebieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol werd goedgekeurd door het institutioneel Comité voor Dierverzorging en-gebruik (DEC) van de Universiteit van Delaware. Mannelijke Sprague Delombaerde ratten ongeveer 55 – 75 dagen oud werden gebruikt voor dit protocol.
1. Brain extractie en weefsel voorbereiding
- Verdoven rat met Isofluraan in anesthesie inductie kamer tot rat niet langer vertoont een reactie op voet knijpen.
- Offer ratten via een snelle onthoofding met behulp van een guillotine.
- Snijd de huid op de schedel posterior naar anterior en duidelijk uit de top van de schedel.
- Gebruik Rongeurs om zorgvuldig te verwijderen van de achterkant van de schedel, en vervolgens met behulp van kleine ontleden schaar gekapt middellijn van de schedel, duwen opwaartse tegen de top van de schedel te allen tijde om te voorkomen dat beschadiging van het hersenweefsel.
- Gebruik Rongeurs om weg te schillen rechts en links de helft van de schedel om de hersenen bloot.
- Gebruik een kleine spatel te Scoop onder de hersenen en verbreken zenuwen, zorgvuldig verheffen hersenen en bevriezen hersenen in isopentane gekoeld op droog ijs (ten minste-20 ° c). Na deze, slaan hersenen in a-80 °C vriezer tot snijden.
- Snijd hersenen in gebieden van belang bij 30 – 50 µm in een cryostat gehandhaafd tussen-9 °C en-12 °C. Direct Mount Slices op glazen dia's en op te slaan in een-80 °C vriezer tot de tijd van immunocytochemie assay.
Opmerking: In dit protocol waren de hersenengebieden van belang het zeepaardje en amygdala.
2. single immunohistochemische reactie
Opmerking: Voor dubbele immunohistochemische reactie, is het protocol het zelfde als de enige immunohistochemische reactie behalve deze reactie heeft twee primaire antilichamen van verschillende gastheren (b.v., konijn en muis) en twee secundaire antilichamen voor het overeenkomstige de voor verkiezingen zouden van één enkele gastheer moeten zijn (b.v., geit antirabbit en geit antimouse). De secundaire antilichamen moeten ook uit twee verschillende spectra die beschikbaar zijn in hoge-resolutie scanners. Bijvoorbeeld, één secundair antilichaam met een piek van het emissiespectrum bij 680 nm en één secundair antilichaam 800CW (de piek van het emissiespectrum bij 780 nm).
- Verwijder glas dia's uit de vriezer en laat equilibrate tot kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Onder een rook kap, Fix hersenweefsel in 4% Paraformaldehyde in 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor 1 − 2 h bij kamertemperatuur.
- Spoel dia's in 0,1 M Tris gebufferde zoutoplossing (TBS) drie keer voor 10 min elk. Permeabilize celmembranen door het uitbroeden van dia's in een mild wasmiddel (bijv. 0,01% wasmiddel) voor 30 − 60 min.
- Spoel dia's in TBS drie keer voor 15 min elk.
- Verdun primair antilichaam voor proteïne van belang in PBS in de correcte concentratie. Bijvoorbeeld, om het onmiddellijke vroege gen c-fos te ontdekken, bereid een konijn primair anti c-fos antilichaam in een concentratie van 1:500 voor.
- Pipetteer de primaire antilichamen oplossing direct op het hersenweefsel (ongeveer 200 µ L per 3 inch x 1 inch glijbaan).
- Gebruik-dekglaasjes om het hersenweefsel op glas dia's in het primaire antilichaam verdunning voor ofwel 1 − 2 h bij kamertemperatuur of overnachting (~ 17 uur) bij 4 ° c incuberen.
- Verwijder-dekglaasjes en was dia's in TBS dat een kleine hoeveelheid wasmiddel toegevoegd aan het (bijv., 0,01% wasmiddel, "TBS-T") vier keer voor 15 min elk.
- Gebruik-dekglaasjes te broeden hersen secties in een secundair antilichaam bij kamertemperatuur voor 2 uur.
Opmerking: Het secundaire antilichaam moet aan de correcte verdunning en in een oplosmiddel zijn dat TBS, detergens, en 1,5% van gastheer serum bevat. Bijvoorbeeld, een geit secundair antilichaam in een verdunning van 1:2000 zou bevatten 1,5% geit serum en 0,05% wasmiddel. - Spoel dia's in TBS-T vier keer voor 20 min elk, en vervolgens in TBS vier keer voor 20 min elk.
- Droge dia's bij kamertemperatuur in het donker 's nachts. Wanneer de dia's droog zijn, zijn ze klaar voorbeeld vorming.
3. Imaging
- Plaats dia's op de near-infrarood scaninterface met het weefsel naar beneden. Afbeelding één glas dia of meerdere dia's tegelijk gebruiken met een selectiegereedschap.
- Afbeelding dia's met behulp van de hoogste kwaliteit instelling met een offset van 0 nm en een resolutie van 21 µm. Het scannen duurt meestal 13 − 19 h, afhankelijk van de gebruikte scanapparatuur.
- Importeer afbeeldingen in de beeldanalyse software (bijv. ImageStudio) om te bekijken en te markeren voor semi-kwantitatieve eiwitanalyse.
4. eiwitexpressie analyse
- Open de software voor het analyseren van afbeeldingen en selecteer het werkgebied waarin de afbeelding is gescand.
- Open de gescande afbeelding in de Image Analysis software om de scan te bekijken, en aan te passen welke golflengten worden bekeken, evenals het contrast, helderheid en vergroting getoond zonder wijziging van de RAW-beeld of de totale gekwantificeerde emissie.
- Identificeer de belangrijkste regio's voor kwantificering en selecteer het tabblad analyse langs de bovenkant van de pagina, selecteer vervolgens teken rechthoek (of teken ellips/draw Freehand) om een rechthoek te tekenen over het gebied dat zal worden gekwantificeerd.
- Als u de grootte van de rechthoek wilt weergeven, selecteert u Shapes in de linkerbenedenhoek van het scherm en selecteert u vervolgens de kolommen rechtsonder. Kolommen met hoogte en breedte toevoegen om de vormgrootte te bepalen.
Opmerking: Het is belangrijk om te controleren op vormgrootte bij het vergelijken van kwantificering. Het wordt aanbevolen om identieke vormen te gebruiken die binnen de gewenste kwantificatie locatie zijn geplaatst, om een nauwkeurige bemonstering van de emissies voor die regio te krijgen. - Noem de vorm en herhaal. Als alle regio's zijn bemonsterd, kunnen de beschikbare gegevens van het tabblad kolommen worden samengevoegd en geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorafgaand aan het gebruik van hoge-resolutie scannen voor Immunohistochemistry, moet men controleren of het protocol werkt. Dit kan worden bereikt gebruikend een bevestigings analyse waar de hersenen secties van het zelfde dier met primaire en secundaire antilichamen, secundair antilichaam alleen, of noch primair noch secundair antilichaam worden uitgebroed. De resultaten voor een dergelijke validatie test worden weergegeven in Figuur 2. In deze reactie waren we het opsporen van de onmiddellijke vroege Gene c-jun in de dorsale Hippocampus en amygdala. De C-jun uitdrukking werd slechts waargenomen toen de primaire en secundaire antilichamen op het hersenenweefsel werden toegepast.
Figuur 3 toont dubbele eiwit detectie in amygdala kernen. In dit experiment hebben we de GluR1 subeenheid van de α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic zuur (AMPA) receptor en de NR2A subeenheid van de N-methyl-D-aspartaat receptor (NMDA) receptor in hetzelfde hersenweefsel. Dit liet ons toe om de verhouding van AMPA/NMDA receptoren in sub-kernen van de amygdala te onderzoeken. Deze verhouding is een neurobiologische handtekening van het leren en geheugen11,12. Zoals kan worden gezien in Figuur 3, signaal voor GluR2 (780 nm licht pseudo gekleurd in het groen) en NR2A (680 nm licht pseudo gekleurd in het rood) kan alleen worden waargenomen in het hersenweefsel dat werd blootgesteld aan primaire en secundaire antilichamen.
Figuur 4 laat zien hoe gemiddelde en genormaliseerde maatregelen van eiwitexpressie kan worden verkregen uit hoge-resolutie scans in de buik Hippocampus. Gebruikend de software van de beeldanalyse, wordt een rechthoek geplaatst in de streek van belang (moleculaire laag van CA1) en de gemiddelde intensiteit van licht van de vorm kan als maatregel van fluorophore uitdrukking (figuur 4a) worden gebruikt. Beurtelings, is dit een maatregel van eiwituitdrukking (d.w.z., het antigeen-primaire antilichaam-secundair antilichaam complex). De vorm kan ook worden geplaatst in een regio die hoog signaal en laag signaal uitdrukt om een genormaliseerde kromme te verkrijgen (figuur 4b). In dit voorbeeld, werd een rechthoek geplaatst over de moleculaire laag van CA1, maar behandelde ook de dendritische gebieden, die geen significante hoeveelheden van c-jun in deze analyse uitdrukten. Het gebied onder de kromme kan dan als maatregel van eiwituitdrukking worden gebruikt. Als de opstelling in een experiment behandelingsgroepen (b.v., spannings blootstelling) en een controle impliceert, kunnen de relatieve veranderingen in eiwituitdrukking in de hersenen worden verkregen.
Figuur 1 : Illustratie van de immunohistochemische reactie met primaire (1St) en secundaire (2ND) antilichamen of enkel primair antilichaam. De gevulde zwarte cirkels vertegenwoordigen een etiket, dat een oxyderende agent zoals mierikswortelperoxidase of een fluorophore zoals borium-dipyrromethene (BODIPY'S) zou kunnen zijn. De groene vierkanten vertegenwoordigen antigeen (op proteïne van belang) die in de immunohistochemische reactie wordt ontdekt.
Figuur 2 : Beelden van een validatie assay voor detectie van c-jun. In deze analyse, werd het weefsel van het zelfde dier behandeld met een konijn primair antilichaam dat c-jun en het secundaire antilichaam van de geit antirabbit met in bijlage fluorophore met emissie bij 780 nm erkent (pseudo gekleurd in groen, linkerpaneel). Het aangrenzende weefsel werd behandeld met of secundair antilichaam alleen (midden paneel) of geen antilichaam (juist paneel). Schaalbalk = 1 mm.
Figuur 3 : Validatie assay voor dubbele etikettering immunohistochemische reactie in de amygdala. Drievoud de hersenen secties van de zelfde rat werden of blootgesteld aan het antilichaam van het konijn dat GluR1 en muis antilichamen erkent die NR2A (linker panelen), secundair antilichaam (midden panelen), of geen antilichaam (juiste panelen) erkent. GlurR1 werd gevisualiseerd met geit anti konijn 800CW secundair antilichaam (780 nm, pseudo gekleurd in groen) en NR2A werd gevisualiseerd gebruikend een geit antimouse 680RD secundair antilichaam (680 nm, pseudo die in rood wordt gekleurd). Schaalbalk = 1 mm. OT = optische tractus; IC = interne capsule; EC = externe capsule. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Het verkrijgen van semi-kwantitatieve maatregelen van eiwitexpressie in hersenweefsel. (A en B) screenshots van gescoorde beelden in de beeldanalyse software die wordt gebruikt om beelden te analyseren van de scanner. Weefsel was van de buik Hippocampus en behandeld om te visualiseren c-jun. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De resultaten in dit artikel tonen aan dat near-infrarood immunocytochemie in combinatie met scannen met hoge resolutie kan worden gebruikt voor het verkrijgen van semi-kwantitatieve maatregelen van eiwitexpressie in hersenweefsel. Het kan ook worden gebruikt om twee eiwitten gelijktijdig label in hetzelfde hersengebied. We hebben eerder gebruikt near-infrarood immunohistochemistry te meten onmiddellijke vroege genexpressie in meerdere hersengebieden9,10. De directe vroege genen kunnen als maatregel van neurale activiteit worden gebruikt. We hebben ook onderworpen aan deze semi-kwantitatieve maatregelen van eiwitexpressie aan statistische analyses die ons in staat om de hersenen regio's met gecorreleerde niveaus van onmiddellijke vroege genen groep (IEGs). We gebruikten dit als een maat voor functionele connectiviteit te onderzoeken hoe stress invloed op functionele connectiviteit tussen knooppunten binnen de angst circuit tijdens emotionele leren en geheugen9,10. We hebben laten zien hoe AMPA/NMDA ratio's (een handtekening van leren en geheugen) kan worden gemeten met behulp van near-infrarood immunocytochemie met hoge resolutie scannen13. Een gelijkaardige techniek kan worden gebruikt om pan en phospho-proteïnen te meten om het moleculaire signaleren te bepalen. Dit wordt verwezenlijkt gebruikend westelijke vlek14. Nochtans, vereist dit het ontleden van hersenengebieden uit dikke hersenen plakken en is niet vatbaar voor kleine hersenengebieden. Dit probleem kan worden omzeild met behulp van near-infrarood immunocytochemie met hoge resolutie scannen. Ten slotte zijn alle immunocytochemie beelden gedigitaliseerd, die het mogelijk maakt voor onbeperkte opslag en handige re-analyse van de vorige tests.
Zoals met alle methodes zijn er nadelen. Er is geen vergroting in hoge-resolutie scanners en de behandeling van weefsel niet gemakkelijk mogelijk voor sonderen met behulp van fluorescentie microscopische technieken. Zelfs het nemen van alternatieve plakjes uit de hersenen kan niet werken, omdat confocale microscopie kan het beste werken in doorbloede hersenweefsel, maar near-infrarood Imaging met hoge resolutie scannen wordt meestal gedaan op Flash bevroren hersenen. Eiwitexpressie in specifieke neuronen (bijv. Interneuron versus pyramidal neuron) of verschillende soorten cellen in de hersenen (bijv. neuronen versus glia) kan niet worden bepaald met behulp van near-infrarood immunocytochemie met hoge-resolutie scannen. Het uitvoeren van validatie-analyses zijn kritisch, omdat dit nog steeds een relatief nieuwe methode voor de behandeling van eiwitexpressie in hersenweefsel.
Bij gebruik op de juiste wijze, near-infrarood immunocytochemie met hoge-resolutie scannen biedt voordelen. Autofluorescentie in hersenweefsel wordt verminderd in de nabij-infrarood bereik, semi-kwantitatieve maatregelen van eiwitexpressie kan worden verkregen, expressie van twee eiwitten in hetzelfde hersengebied kan worden verkregen, en beelden van de assay kan voor onbepaalde tijd worden opgeslagen. Wanneer gecombineerd met de correcte eiwit en/of statistische methode kan deze techniek worden gebruikt om eiwituitdrukking, neurale activiteit, moleculaire signalering, en functionele connectiviteit binnen de hersenen te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het onderzoek in dit rapport werd gefinancierd door een doel subsidie van de NIGMS (1P20GM103653) toegekend aan DK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. |
References
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
