Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo que use tinturas near-infrared conjuntamente com a exploração immunohistochemistry e de alta resolução às proteínas do ensaio em regiões do cérebro.
Abstract
A neurociência é o estudo de como as células do cérebro mediam várias funções. A expressão da proteína de medição nos neurônios e na glia é fundamental para o estudo da neurociência, pois a função celular é determinada pela composição e atividade das proteínas celulares. Neste artigo, nós descrevemos como Immunocytochemistry pode ser combinado com a exploração de alta resolução infravermelho próximo para fornecer uma medida semiquantitativa da expressão da proteína em regiões distintas do cérebro. Esta técnica pode ser usada para a única ou expressão dobro da proteína na mesma região do cérebro. A medição de proteínas desta forma pode ser usada para obter uma mudança relativa na expressão protéica com uma manipulação experimental, assinatura molecular de aprendizado e memória, atividade em vias moleculares e atividade neural em várias regiões cerebrais. Usando as proteínas corretas e a análise estatística, a conectividade funcional entre as regiões cerebrais também pode ser determinada. Dada a facilidade de implementação de imunocitoquímica em um laboratório, usando Immunocytochemistry com varredura de alta resolução infravermelho próximo pode expandir a capacidade do neurocientista para examinar os processos neurobiológicos em um nível de sistemas.
Introduction
O estudo da neurociência diz respeito a uma investigação de como as células do cérebro mediam funções específicas1. Estes podem ser de natureza celular, como a forma como as células glia conferem imunidade no sistema nervoso central ou podem envolver experimentos que visam explicar como a atividade dos neurônios no hipocampo dorsal leva à navegação espacial. Em um sentido amplo, a função celular é determinada pelas proteínas que são expressas em uma célula e a atividade dessas proteínas2. Como resultado, medir a expressão e/ou atividade de proteínas nas células cerebrais são críticas para o estudo da neurociência.
Um número de técnicas estão disponíveis para medir a expressão da proteína no cérebro. Estes incluem métodos in vivo, como topografia de emissão de pósitrons para densidades de receptores3 e microdiálise para pequenos peptídeos4. Mais comumente, os métodos ex vivo são usados para examinar a função e a expressão protéica. Estes incluem técnicas de espectrometria de massas5, Western blot e ensaio imunoenzimático (ELISA)6, e Immunocytochemistry7. Immunocytochemistry é amplamente utilizado no campo da neurociência. Esta técnica envolve o uso de um anticorpo preliminar para detectar uma proteína (ou o antígeno) do interesse (por exemplo, c-fos) e um anticorpo secundário conjugado para detectar o complexo proteína-preliminar do anticorpo (Figura 1). Para permitir a deteção do complexo anticorpo-secundário da proteína-preliminar do Antibody, os anticorpos secundários têm agentes oxidantes tais como o peroxidase do rábano (HRP) conjugados a eles. Isso permite a formação de precipitados em células que podem ser detectadas por meio de microscopia de luz7. Os anticorpos secundários podem igualmente ter fluorescência dos produtos químicos conjugados a eles (isto é, Fluorophores). Quando estimulados estes produtos químicos emitem a luz, que pode ser usada para detectar complexos anticorpo-secundários proteína-primários do anticorpo7. Por fim, os anticorpos primários, por vezes, têm agentes redutores e produtos químicos de fluorescência anexados a eles, negando diretamente a necessidade de anticorpos secundários7 (Figura 1).
Curiosamente, muitos métodos Immunocytochemistry permitem a visualização de proteínas em células cerebrais, mas não a capacidade de quantificar a quantidade de proteína em uma determinada região da célula ou do cérebro. Usar a microscopia de luz para detectar precipitados das reações da redução permite o visualização dos neurônios e do glia, mas este método não pode ser usado para quantificar a expressão da proteína nas pilhas ou em uma região específica do cérebro. Na teoria, a microscopia de fluorescência pode ser usada para esta, porque a luz emitida do anticorpo secundário fluorescente é uma medida do complexo anticorpo-secundário proteína-preliminar do anticorpo. No entanto, a autofluorescência no tecido cerebral pode dificultar a utilização da microscopia de fluorescência para quantificar a expressão protéica no tecido cerebral8. Em conseqüência, a luz emitida das imagens fluorescentes do tecido de cérebro é usada raramente para quantificar a expressão da proteína no cérebro.
Muitas destas edições podem ser endereçadas usando Immunocytochemistry near-infrared conjuntamente com a exploração de alta resolução9,10. Neste artigo, nós descrevemos como o Immunocytochemistry acoplado com os fluoróforos nos espectros de emissão do próximo-infravermelho pode ser combinado com a exploração de alta resolução (por exemplo, 10 – 21 μm) para obter as imagens afiadas que permitem a semiquantificação da proteína em distinto regiões cerebrais.
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Protocol
O seguinte protocolo foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de Delaware. Os ratos masculinos de Sprague Dawley aproximadamente 55 – 75 dias velhos foram usados para este protocolo.
1. extração cerebral e preparação de tecidos
- Anestesie o rato com isoflurano na câmara de indução anestésica até que o rato não apresente mais uma resposta à pinça do pé.
- Sacrifique ratos através da decapitação rápida usando uma guilhotina.
- Corte a pele no crânio posterior ao anterior e desobstruído da parte superior do crânio.
- Use rongeurs para remover cuidadosamente a parte de trás do crânio, e, em seguida, usando pequenas tesouras de dissecação cortar Midline do crânio, empurrando para cima contra o topo do crânio em todos os momentos para evitar danificar o tecido cerebral.
- Use rongeurs para descascar afastado a metade direita e esquerda do crânio para expor o cérebro.
- Use uma espátula pequena para colher o cérebro e cortar os nervos, cuidadosamente elevar cérebro e congelar cérebros em isopentano refrigerados em gelo seco (pelo menos-20 ° c). Depois disso, armazene cérebros em um freezer de-80 ° c até fatiar.
- Corte cérebros em regiões de interesse em 30 – 50 μm em um criostat mantido entre-9 ° c e-12 ° c. Diretamente montar fatias em lâminas de vidro e armazenar em um-80 ° c freezer até o momento do ensaio Immunocytochemistry.
Nota: Neste protocolo, as regiões cerebrais de interesse foram o hipocampo e a amígdala.
2. única reacção imuno-histoquímica
Nota: Para a reação immunohistochemical dobro, o protocolo é o mesmo que a única reação immunohistochemical exceto esta reação tem dois anticorpos preliminares de anfitriões diferentes (por exemplo, coelho e rato) e dois anticorpos secundários para o correspondente primárias devem ser de um único hospedeiro (por exemplo, anticoelho de cabra e antimouse de cabra). Os anticorpos secundários também têm de ser de dois espectros diferentes que estão disponíveis em scanners de alta resolução. Por exemplo, um anticorpo secundário com um pico de espectro de emissão a 680 nm e um anticorpo secundário 800CW (pico de espectro de emissão a 780 nm).
- Retire as lâminas de vidro do congelador e deixe equilibrar a temperatura ambiente durante 30 min.
- uma capa de fumaça, corrigir o tecido cerebral em 4% paraformaldeído em 0,1 M fosfato tampão salino (PBS) para 1 − 2 h à temperatura ambiente.
- Enxágüe slides em 0,1 M Tris tampão salina (TBS) três vezes por 10 min cada. Permeabilize as membranas celulares incubando lâminas em detergente neutro (por exemplo, 0, 1% detergente) por 30 − 60 min.
- Enxague as lâminas em TBS três vezes por 15 min cada.
- Diluir o anticorpo preliminar para a proteína do interesse em PBS na concentração correta. Por exemplo, para detectar o gene adiantado imediato c-fos, prepare um anticorpo preliminar do anti c-fos do coelho em uma concentração de 1:500.
- Pipeta a solução preliminar do anticorpo diretamente no tecido de cérebro (aproximadamente 200 μL por 3 polegadas x 1 polegada de corrediça).
- Use coberturas para incubar o tecido cerebral em lâminas de vidro na diluição de anticorpos primários para 1 − 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite (~ 17 h) a 4 ° c.
- Remova as coberturas e lave as lâminas em TBS que tem uma pequena quantidade de detergente adicionado a ele (por exemplo, 0, 1% detergente, "TBS-T") quatro vezes por 15 min cada.
- Use coberturas para incubar seções cerebrais em um anticorpo secundário à temperatura ambiente por 2 h.
Nota: O anticorpo secundário tem que ser à diluição correta e em um diluente que contem TBS, detergente, e 1,5% do soro do anfitrião. Por exemplo, um anticorpo secundário de cabra numa diluição de 1:2000 conterá 1,5% de soro de cabra e 0, 5% de detergente. - Enxague as lâminas em TBS-T quatro vezes por 20 min cada, e depois em TBS quatro vezes por 20 min cada.
- Escorregas secas à temperatura ambiente no escuro durante a noite. Quando os slides estão secos, eles estão prontos para a imagem.
3. imagem latente
- Coloque os slides na interface de digitalização de infravermelho próximo com o tecido voltado para baixo. Qualquer imagem um slide de vidro ou slides múltiplos de cada vez usando uma ferramenta de seleção.
- Slides de imagem usando a configuração da mais alta qualidade com um deslocamento de 0 nm e uma resolução de 21 μm. A digitalização normalmente levará 13 − 19 h, dependendo do equipamento de digitalização utilizado.
- Importe imagens para o software de análise de imagem (por exemplo, ImageStudio) para ver e marcar para análise de proteínas Semiquantitativas.
4. análise da expressão protéica
- Abra o software de análise de imagem e selecione a área de trabalho na qual a imagem foi digitalizada.
- Abra a imagem digitalizada no software de análise de imagem para visualizar a digitalização e ajuste quais comprimentos de onda são visualizados, bem como o contraste, o brilho e a ampliação mostrados sem alterar a imagem bruta ou a emissão total quantificada.
- Identifique as regiões-chave para quantificação e selecione a guia análise ao longo da parte superior da página e selecione desenhar retângulo (ou desenhar elipse/desenhar à mão livre) para desenhar um retângulo sobre a área que será quantificada.
- Para exibir o tamanho do retângulo, selecione formas ao longo da parte inferior esquerda da tela e, em seguida, selecione colunas ao longo da parte inferior direita. Adicione colunas de altura e largura para identificar o tamanho da forma.
Nota: É importante controlar o tamanho da forma ao comparar a quantificação. Recomenda-se o uso de formas idênticas colocadas dentro do local de quantificação desejado, a fim de obter uma amostragem exata das emissões para essa região. - Em seguida, nomeie a forma e repita. Uma vez que todas as regiões são amostradas, os dados disponíveis na guia colunas podem ser agregados e analisados.
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Representative Results
Antes de usar a varredura de alta resolução para immunohistochemistry, uma deve verificar que o protocolo trabalha. Isto pode ser conseguido usando um ensaio de validação onde seções cerebrais do mesmo animal são incubadas com anticorpos primários e secundários, anticorpo secundário sozinho, ou nenhum anticorpo primário ou secundário. Os resultados para tal ensaio de validação são mostrados na Figura 2. Nesta reação nós estávamos detectando o gene adiantado imediato c-Jun no hipocampo dorsal e no amygdala. A expressão de C-Jun só foi observada quando os anticorpos primários e secundários foram aplicados ao tecido cerebral.
A Figura 3 mostra a detecção de proteínas duplas em núcleos de amígdala. Neste experimento nós ensaiamos a subunidade GluR1 do receptor de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiônico (AMPA) e a subunidade NR2A do receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) no mesmo tecido cerebral. Isso nos permitiu examinar a proporção de receptores AMPA/NMDA em subnúcleos da amígdala. Esta relação é uma assinatura Neurobiológica da aprendizagem e da memória11,12. Como pode ser visto na Figura 3, sinal para GluR2 (780 nm luz pseudo colorido em verde) e NR2A (680 nm luz pseudo colorido em vermelho) só pode ser observado no tecido cerebral que foi exposto a anticorpos primários e secundários.
A Figura 4 mostra como as medidas médias e normalizadas de expressão protéica podem ser obtidas a partir de varreduras de alta resolução no hipocampo ventral. Usando o software de análise de imagem, um retângulo é colocado na região de interesse (camada molecular de CA1) e a intensidade média da luz da forma pode ser usada como uma medida de expressão de fluoróforo (figura 4a). Por sua vez, esta é uma medida de expressão protéica (i.e., o complexo anticorpo-primário anticorpo-secundário de antígeno). A forma também pode ser colocada em uma região que expresse sinal alto e baixo sinal para obter uma curva normalizada (Figura 4B). Neste exemplo, um retângulo foi colocado através da camada molecular de CA1, mas cobriu os campos dendríticos também, que não expresse quantidades significativas de c-Jun neste ensaio. A área a curva pode então ser usada como uma medida da expressão da proteína. Se a configuração em um experimento envolver grupos de tratamento (por exemplo, exposição ao estresse) e um controle, podem ser obtidas alterações relativas na expressão protéica no cérebro.
Figura 1 : Ilustração da reação immunohistochemical usando anticorpos preliminares (1St) e secundários (2ND) ou apenas o anticorpo preliminar. Círculos pretos preenchidos representam um rótulo, que pode ser um agente oxidante, como a peroxidase de rábano ou um fluoróforo, como o boro-dipirrometeno (BODIPY). Os quadrados verdes representam o antígeno (na proteína do interesse) que está sendo detectado na reação immunohistochemical.
Figura 2 : Imagens de um ensaio de validação para a detecção de c-Jun. Neste ensaio, o tecido do mesmo animal foi tratado com um anticorpo preliminar do coelho que reconheça o anticorpo secundário do antirabbit de c-Jun e da cabra com o fluoróforo Unido com emissão em 780 nanômetro (pseudo colorido no painel verde, esquerdo). O tecido adjacente foi tratado com um ou outro anticorpo secundário sozinho (painel médio) ou nenhum anticorpo (painel direito). Barra de escala = 1 mm.
Figura 3 : Ensaio de validação para reação imuno-histoquímica de dupla rotulagem na amígdala. As seções do cérebro do Triplicate do mesmo rato foram expor ao anticorpo do coelho que reconhece o anticorpo do GluR1 e do rato que reconhece NR2A (painéis esquerdos), anticorpo secundário (painéis médios), ou nenhum anticorpo (painéis direito). GlurR1 foi visualizado com o anticorpo secundário do coelho 800cw da cabra (780 nanômetro, pseudo colorido no verde) e o NR2A foi visualizado usando um anticorpo secundário do da 680rd da cabra (680 nanômetro, pseudo colorido no vermelho). Barra de escala = 1 mm. OT = trato óptico; IC = cápsula interna; EC = cápsula externa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Obtenção de medidas Semiquantitativas de expressão protéica no tecido cerebral. (A e B) capturas de tela de imagens pontuadas no software de análise de imagem que é usado para analisar imagens do scanner. O tecido era do hipocampo ventral e tratado para visualizar c-Jun. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os resultados apresentados neste artigo mostram que o Immunocytochemistry próximo-infravermelho em combinação com a exploração de alta resolução pode ser usado para obter medidas Semiquantitativas da expressão da proteína no tecido de cérebro. Ele também pode ser usado para rotular duas proteínas simultaneamente na mesma região do cérebro. Nós usamos previamente immunohistochemistry próximo-infravermelho para medir a expressão adiantada imediata do gene em regiões múltiplas do cérebro9,10. Os genes adiantados imediatos podem ser usados como uma medida da atividade neural. Nós igualmente sujeitamos estas medidas Semiquantitativas da expressão da proteína às análises estatísticas que permitiram que nós agrupem regiões do cérebro com níveis correlacionados de genes adiantados imediatos (IEGs). Utilizamos isso como uma medida de conectividade funcional para examinar como o estresse afeta a conectividade funcional entre os nós dentro do circuito de medo durante o aprendizado emocional e a memória9,10. Nós mostramos como as relações de AMPA/NMDA (uma assinatura da aprendizagem e da memória) podem ser medidas usando o Immunocytochemistry próximo-infravermelho com exploração de alta resolução13. Uma técnica similar pode ser usada para medir a bandeja e as phospho-proteínas para determinar a sinalização molecular. Isto é conseguido usando o borrão ocidental14. No entanto, isso requer dissecando regiões cerebrais fora de fatias de cérebro grossas e não é capaz de pequenas regiões cerebrais. Este problema pode ser contornado usando Immunocytochemistry near-infrared com varredura de alta resolução. Finalmente, todas as imagens Immunocytochemistry são digitalizadas, que permite o armazenamento ilimitado e a re-análise conveniente de ensaios precedentes.
Como com todos os métodos há inconvenientes. Não há nenhuma ampliação em varredores de alta resolução e o tratamento do tecido não permite prontamente sondagem usando técnicas microscópicas da fluorescência. Mesmo tomando fatias alternadas do cérebro pode não funcionar, uma vez que a microscopia confocal pode funcionar melhor no tecido cerebral perfundidos, mas a imagem latente near-infrared com varredura de alta resolução é feita tipicamente em cérebros congelados flash. A expressão protéica em neurônios específicos (por exemplo, interneurônio versus neurônio piramidal) ou diferentes tipos de células no cérebro (por exemplo, neurônios versus glia) não pode ser determinada usando Immunocytochemistry near-infrared com varredura de alta resolução. Realizar ensaios de validação é crítico, pois este ainda é um método relativamente novo para examinar a expressão protéica no tecido cerebral.
Quando usado apropriadamente, o Immunocytochemistry próximo-infravermelho com varredura de alta resolução oferece vantagens. A autofluorescência no tecido cerebral é reduzida na faixa de infravermelho próximo, as medidas Semiquantitativas da expressão protéica podem ser obtidas, a expressão de duas proteínas na mesma região cerebral pode ser obtida, e as imagens do ensaio podem ser armazenadas indefinidamente. Quando emparelhado com a proteína correta e/ou método estatístico, essa técnica pode ser usada para examinar a expressão protéica, a atividade neural, a sinalização molecular e a conectividade funcional dentro do cérebro.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A pesquisa neste relatório foi financiada por uma subvenção-alvo dos NIGMS (1P20GM103653) concedido à DK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. |
References
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