Summary
Qui, presentiamo un protocollo che utilizza coloranti Near-Infrared in combinazione con immunoistochimica e scansione ad alta risoluzione per analisi proteine nelle regioni cerebrali.
Abstract
La neuroscienza è lo studio di come le cellule nel cervello mediare varie funzioni. Misurare l'espressione proteica nei neuroni e nella glia è fondamentale per lo studio delle neuroscienze poiché la funzione cellulare è determinata dalla composizione e dall'attività delle proteine cellulari. In questo articolo, descriviamo come l'immunocitochimica può essere combinata con la scansione ad alta risoluzione vicino infrarosso per fornire una misura semi-quantitativa di espressione proteica in regioni cerebrali distinte. Questa tecnica può essere utilizzata per un'espressione proteica singola o doppia nella stessa regione cerebrale. La misurazione delle proteine in questo modo può essere utilizzata per ottenere un cambiamento relativo nell'espressione proteica con una manipolazione sperimentale, la firma molecolare dell'apprendimento e della memoria, l'attività nei percorsi molecolari e l'attività neurale in diverse regioni cerebrali. Utilizzando le proteine corrette e l'analisi statistica, è possibile determinare anche la connettività funzionale tra le regioni cerebrali. Data la facilità di implementazione di immunocitochimica in un laboratorio, utilizzando l'immunocitochimica con scansione ad alta risoluzione vicino infrarosso può espandere la capacità del neuroscienziato per esaminare i processi neurobiologici a livello di sistemi.
Introduction
Lo studio della neuroscienza riguarda un'indagine su come le cellule nel cervello mediano funzioni specifiche1. Questi possono essere di natura cellulare, come ad esempio il modo in cui le cellule glia conferiscono immunità nel sistema nervoso centrale o possono coinvolgere esperimenti che mirano a spiegare come l'attività dei neuroni nell'ippocampo dorsale conduce alla navigazione spaziale. In senso ampio, la funzione cellulare è determinata dalle proteine che si esprimono in una cellula e dall'attività di queste proteine2. Di conseguenza, la misurazione dell'espressione e/o dell'attività delle proteine nelle cellule cerebrali è critica per lo studio delle neuroscienze.
Una serie di tecniche sono disponibili per misurare l'espressione proteica nel cervello. Questi includono metodi in vivo come la topografia di emissione di positroni per le densità dei recettori3 e la microdialisi per i piccoli peptidi4. Più comunemente, i metodi ex vivo vengono utilizzati per esaminare la funzione e l'espressione delle proteine. Questi includono tecniche di spettrometria di massa5, Western blot e saggio immunosorbente legato all'enzima (ELISA)6e immunocitochimica7. L'immunocitochimica è ampiamente utilizzata nel campo delle neuroscienze. Questa tecnica prevede l'uso di un anticorpo primario per rilevare una proteina (o antigene) di interesse (ad esempio, c-fos) e un anticorpo secondario coniugato per rilevare il complesso di anticorpi proteina-primario (Figura 1). Per consentire il rilevamento del complesso anticorpale-anticorpo primario-derivato di proteina-primaria, gli anticorpi secondari hanno agenti ossidanti come la perossidasi di rafano (HRP) coniugato a loro. Questo permette la formazione di precipitati in cellule che possono essere rilevati utilizzando la microscopia leggera7. Gli anticorpi secondari possono anche avere prodotti chimici fluorati coniugati (cioè fluorofori). Quando stimolato queste sostanze chimiche emettono luce, che può essere utilizzato per rilevare proteina-primario anticorpo-anticorpi secondari complessi7. Infine, a volte gli anticorpi primari hanno agenti riducenti e sostanze chimiche a fluorescenza attaccate direttamente negando la necessità di anticorpi secondari7 (Figura 1).
È interessante notare che, molti metodi di immunocitochimica consentono la visualizzazione delle proteine nelle cellule cerebrali, ma non la capacità di quantificare la quantità di proteine in una regione specifica della cellula o del cervello. Utilizzando la microscopia leggera per rilevare i precipitati dalle reazioni di riduzione consente la visualizzazione di neuroni e glia, ma questo metodo non può essere utilizzato per quantificare l'espressione proteica nelle cellule o in una specifica regione del cervello. In teoria, la microscopia a fluorescenza può essere utilizzata per questo, perché la luce emessa dall'anticorpo secondario fluorescente è una misura del complesso anticorpale-anticorpo primario-secondario proteina-primaria. Tuttavia, l'autofluorescenza nel tessuto cerebrale può rendere difficile l'uso della microscopia a fluorescenza per quantificare l'espressione proteica nel tessuto cerebrale8. Di conseguenza, la luce emessa dalle immagini fluorescenti del tessuto cerebrale è raramente utilizzata per quantificare l'espressione proteica nel cervello.
Molti di questi problemi possono essere affrontati utilizzando immunocitochimica Near-Infrared in combinazione con scansione ad alta risoluzione9,10. In questo articolo descriviamo come l'immunocitochimica accoppiata con i fluorofori negli spettri di emissione Near-Infrared può essere combinata con la scansione ad alta risoluzione (ad esempio, 10 – 21 μm) per ottenere immagini nitide che consentano la semi quantificazione delle proteine in distinte regioni cerebrali.
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Protocol
Il seguente protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Delaware. Maschi Sprague Dawley ratti circa 55 – 75 giorni di età sono stati utilizzati per questo protocollo.
1. estrazione del cervello e preparazione dei tessuti
- Anestetizzare ratto con isoflurano in anestesia camera di induzione fino a quando il ratto non presenta più una risposta al piede pizzico.
- Sacrifica i ratti attraverso una rapida decapitazione usando una ghigliottina.
- Tagliare la pelle sul cranio posteriore a anteriore e chiaro dalla parte superiore del cranio.
- Utilizzare i ossivore per rimuovere con cautela la parte posteriore del cranio, e quindi utilizzando piccole forbici dissezione tagliare la linea mediana del cranio, spingendo verso l'alto contro la parte superiore del cranio in ogni momento per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale.
- Utilizzare i ossivore per staccare la metà destra e sinistra del cranio per esporre il cervello.
- Utilizzare una piccola spatola per misurarsi sotto il cervello e recidere i nervi, elevare accuratamente cervello e congelare i cervelli in isopentano refrigerati su ghiaccio secco (almeno-20 ° c). Dopo questo, conservare i cervelli in un-80 ° c congelatore fino a affettare.
- Tagliare il cervello in regioni di interesse a 30 – 50 μm in un criostato mantenuto tra-9 ° c e-12 ° c. Montare direttamente le fette su vetrini di vetro e conservare in un congelatore-80 ° c fino al momento del saggio immunocitochimico.
Nota: In questo protocollo le regioni cerebrali di interesse erano l'ippocampo e l'amigdala.
2. singola reazione immunoistochimica
Nota: Per la doppia reazione immunoistochimica, il protocollo è lo stesso della singola reazione immunoistochimica, ad eccezione di questa reazione ha due anticorpi primari di diversi host (ad esempio, coniglio e topo) e due anticorpi secondari per il corrispondente primarie devono essere da un singolo ospite (ad esempio, antirabbit di capra e antimouse di capra). Gli anticorpi secondari devono essere anche da due diversi spettri che sono disponibili in scanner ad alta risoluzione. Ad esempio, un anticorpo secondario con un picco dello spettro di emissione a 680 Nm e un anticorpo secondario 800CW (picco dello spettro di emissione a 780 nm).
- Rimuovere i vetrini di vetro dal congelatore e consentire di equilibrare a temperatura ambiente per 30 min.
- Sotto una cappa aspirante, fissare il tessuto cerebrale in 4% paraformaldeide in 0,1 M fosfato salina tamponata (PBS) per 1 − 2 h a temperatura ambiente.
- Risciacquare i vetrini in 0,1 M di soluzione salina tampone (TBS) tre volte per 10 min ciascuno. Permeabilizzare le membrane cellulari incubando le diapositive in un detergente delicato (ad esempio, 0,01% di detergente) per 30 − 60 min.
- Risciacquare i vetrini in TBS tre volte per 15 min ciascuno.
- Diluire l'anticorpo primario per la proteina di interesse in PBS nella concentrazione corretta. Per esempio, per rilevare l'immediato gene precoce c-fos, preparare un coniglio primario anti c-Fos anticorpo in una concentrazione di 1:500.
- Pipettare la soluzione di anticorpi primari direttamente sul tessuto cerebrale (circa 200 μL per slitta da 3 pollici x 1 pollice).
- Utilizzare i coprioggetti per incubare il tessuto cerebrale su vetrini in diluizione degli anticorpi primari per 1 − 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte (~ 17 h) a 4 ° c.
- Rimuovere i coprioggetti e lavare i vetrini in TBS che ha una piccola quantità di detergente aggiunto (ad esempio, 0,01% detergente, "TBS-T") quattro volte per 15 min ciascuno.
- Utilizzare coprioggetti per incubare le sezioni cerebrali in un anticorpo secondario a temperatura ambiente per 2 h.
Nota: L'anticorpo secondario deve essere alla diluizione corretta e in un diluente contenente TBS, detergente e 1,5% di siero ospite. Ad esempio, un anticorpo secondario di capra in una diluizione di 1:2000 conterrebbe 1,5% di siero di capra e 0,05% detergente. - Risciacquare i vetrini in TBS-T quattro volte per 20 min ciascuno, e poi in TBS quattro volte per 20 min ciascuno.
- Scivoli asciutti a temperatura ambiente nel buio durante la notte. Quando le diapositive sono asciutte, sono pronte per l'imaging.
3. l'imaging
- Posizionare le diapositive sull'interfaccia di scansione vicino all'infrarosso con il tessuto rivolto verso il basso. Un'immagine una diapositiva di vetro o più diapositive alla volta utilizzando uno strumento di selezione.
- Immagini diapositive utilizzando l'impostazione di alta qualità con un offset di 0 Nm e una risoluzione di 21 μm. La scansione in genere prenderà 13 − 19 h a seconda dell'apparecchiatura di scansione utilizzata.
- Importare immagini nel software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageStudio) per visualizzare e contrassegnare l'analisi delle proteine semi-quantitative.
4. analisi dell'espressione proteica
- Aprire il software di analisi delle immagini e selezionare l' area di lavoro in cui è stata acquisita l'immagine.
- Aprire l'immagine acquisita nel software di analisi delle immagini per visualizzare la scansione e regolare le lunghezze d'onda visualizzate, nonché il contrasto, la luminosità e l'ingrandimento mostrati senza alterare l'immagine grezza o l'emissione quantificata totale.
- Identificare le aree chiave per la quantificazione e selezionare la scheda analisi nella parte superiore della pagina, quindi selezionare Disegna rettangolo (o Disegna ellisse/disegna mano libera) per disegnare un rettangolo sull'area che sarà quantificato.
- Per visualizzare le dimensioni del rettangolo, selezionare forme lungo la parte inferiore sinistra dello schermo, quindi selezionare colonne lungo in basso a destra. Aggiungere colonne altezza e larghezza per identificare la dimensione della forma.
Nota: È importante controllare la dimensione della forma quando si confronta la quantificazione. Si consiglia di utilizzare forme identiche collocate all'interno della posizione di quantificazione desiderata, al fine di ottenere un campionamento accurato delle emissioni per quella regione. - Quindi denominare la forma e ripetere. Una volta che tutte le regioni sono campionati i dati disponibili dalla scheda colonne possono essere aggregati e analizzati.
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Representative Results
Prima di utilizzare la scansione ad alta risoluzione per l'immunoistochimica, si dovrebbe verificare che il protocollo funzioni. Questo può essere realizzato utilizzando un saggio di validazione in cui le sezioni cerebrali dello stesso animale sono incubate con anticorpi primari e secondari, anticorpo secondario da solo, o nessun anticorpo primario o secondario. I risultati di tale saggio di convalida sono illustrati nella Figura 2. In questa reazione stavamo rilevando l'immediato gene iniziale c-Jun nell'ippocampo dorsali e nell'amigdala. L'espressione di C-Jun è stata osservata solo quando sono stati applicati anticorpi primari e secondari al tessuto cerebrale.
La Figura 3 Mostra il rilevamento della doppia proteina nei nuclei di amigdala. In questo esperimento abbiamo analizzati la subunità GluR1 del recettore dell'acido α-amino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionico (AMPA) e la subunità NR2A del recettore N-metil-D-aspartato (NMDA) nello stesso tessuto cerebrale. Questo ci ha permesso di esaminare il rapporto dei recettori AMPA/NMDA in Sub-nuclei dell'amigdala. Questo rapporto è una firma neurobiologica di apprendimento e memoria11,12. Come si può vedere in Figura 3, segnale per GluR2 (780 nm luce pseudo colorato in verde) e NR2A (680 nm luce pseudo colorato in rosso) può essere osservato solo nel tessuto cerebrale che è stato esposto agli anticorpi primari e secondari.
Figura 4 Mostra come media e normalizzato le misure di espressione proteica possono essere ottenute da scansioni ad alta risoluzione nell'ippocampo ventrale. Utilizzando il software di analisi delle immagini, un rettangolo è collocato nella regione di interesse (strato molecolare di CA1) e l'intensità media della luce dalla forma può essere utilizzata come misura dell'espressione del fluoroforo (Figura 4a). A sua volta, si tratta di una misura dell'espressione proteica (cioè il complesso anticorpale-anticorpo primario-secondario-antigene). La forma può anche essere posizionata in una regione che esprime segnale elevato e segnale basso per ottenere una curva normalizzata (Figura 4B). In questo esempio, un rettangolo è stato collocato sullo strato molecolare di CA1, ma ha coperto anche i campi dendritici, che non hanno espresso quantità significative di c-Jun in questo saggio. L'area sotto la curva può quindi essere utilizzata come misura dell'espressione proteica. Se l'impostazione in un esperimento coinvolge gruppi di trattamento (ad esempio, esposizione allo stress) e un controllo, possono essere ottenute variazioni relative nell'espressione proteica nel cervello.
Figura 1 : Illustrazione della reazione immunoistochimica che utilizza anticorpi primari (1St) e secondari (2ND) o solo anticorpo primario. I cerchi neri riempiti rappresentano un'etichetta, che potrebbe essere un agente ossidante come la perossidasi di rafano o un fluoroforo come il boro-dipirrometene (BODIPY). I quadrati verdi rappresentano l'antigene (sulla proteina di interesse) rilevato nella reazione immunoistochimica.
Figura 2 : Immagini di un saggio di validazione per il rilevamento di c-Jun. In questo saggio, il tessuto dello stesso animale è stato trattato con un anticorpo primario di coniglio che riconosce l'anticorpo secondario di c-Jun e di capra antirabbit con fluoroforo attaccato con emissione a 780 nm (pseudo colorato in verde, pannello sinistro). Il tessuto adiacente è stato trattato con un anticorpo secondario da solo (pannello centrale) o senza anticorpo (pannello destro). Barra di scala = 1 mm.
Figura 3 : Saggio di validazione per la reazione immunoistochimica a doppia etichettatura nell'amigdala. Le sezioni cerebrali triplicate dello stesso ratto sono state esposte all'anticorpo coniglio che riconosce GluR1 e anticorpo del topo che riconosce NR2A (pannelli a sinistra), anticorpo secondario (pannelli intermedi) o nessun anticorpo (pannelli a destra). GlurR1 è stato visualizzato con l'anticorpo secondario di capra anti-coniglio 800CW (780 nm, pseudo colorato in verde) e NR2A è stato visualizzato utilizzando un anticorpo secondario di antimouse di capra 680RD (680 Nm, pseudo colorato in rosso). Barra di scala = 1 mm. OT = tratto ottico; IC = capsula interna; EC = capsula esterna. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4 : Ottenimento di misure semi quantitative di espressione proteica nel tessuto cerebrale. (A e B) screenshot delle immagini con punteggio nel software di analisi delle immagini utilizzato per analizzare le foto dallo scanner. Tissue era dall'ippocampo ventrale e trattato per visualizzare c-Jun. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
I risultati presentati in questo articolo dimostrano che l'immunocitochimica vicino all'infrarosso in combinazione con la scansione ad alta risoluzione può essere utilizzata per ottenere misure semi-quantitative dell'espressione proteica nel tessuto cerebrale. Può anche essere usato per etichettare due proteine contemporaneamente nella stessa regione del cervello. In precedenza abbiamo usato immunoistochimica vicino all'infrarosso per misurare l'immediata espressione genica precoce in più regioni cerebrali9,10. I primi geni immediati possono essere usati come misura di attività neurale. Abbiamo anche sottoposto queste misure semi-quantitative di espressione proteica a analisi statistiche che ci hanno permesso di raggruppare le regioni cerebrali con livelli correlati di geni immediati precoci (IEGs). Abbiamo usato questo come una misura di connettività funzionale per esaminare come lo stress influisce sulla connettività funzionale tra i nodi all'interno del circuito di paura durante l'apprendimento emotivo e la memoria9,10. Abbiamo mostrato come i rapporti AMPA/NMDA (una firma di apprendimento e memoria) possono essere misurati utilizzando immunocitochimica Near-Infrared con scansione ad alta risoluzione13. Una tecnica simile può essere utilizzata per misurare il Pan e le FoSho-proteine per determinare la segnalazione molecolare. Questo si ottiene utilizzando Western blot14. Tuttavia, questo richiede dissezione regioni cerebrali di spesse fette di cervello e non è suscettibile di piccole regioni cerebrali. Questo problema può essere aggirato utilizzando immunocitochimica Near-Infrared con scansione ad alta risoluzione. Infine, tutte le immagini immunocitochimiche sono digitalizzati, il che consente una memorizzazione illimitata e una comoda rianalisi dei saggi precedenti.
Come con tutti i metodi ci sono svantaggi. Non c'è ingrandimento in scanner ad alta risoluzione e il trattamento dei tessuti non consente prontamente di sondare utilizzando tecniche microscopiche di fluorescenza. Anche l'assunzione di fette alternate dal cervello potrebbe non funzionare, poiché la microscopia confocale può funzionare meglio nel tessuto cerebrale perfuso, ma l'imaging near-infrared con scansione ad alta risoluzione è tipicamente fatto su cervello Flash congelato. L'espressione proteica in neuroni specifici (ad esempio, Interneurone contro neurone piramidale) o diversi tipi di cellule nel cervello (ad esempio, neuroni contro glia) non può essere determinata utilizzando immunocitochimica vicino all'infrarosso con scansione ad alta risoluzione. L'esecuzione di saggi di convalida è fondamentale in quanto questo è ancora un metodo relativamente nuovo per l'esame dell'espressione proteica nel tessuto cerebrale.
Se usato in modo appropriato, l'immunocitochimica Near-Infrared con scansione ad alta risoluzione offre vantaggi. La autofluorescenza nel tessuto cerebrale è ridotta nella gamma Near-Infrared, si possono ottenere misure semi-quantitative dell'espressione proteica, si può ottenere l'espressione di due proteine nella stessa regione cerebrale e le immagini del saggio possono essere conservate a tempo indeterminato. Se abbinato al corretto metodo proteico e/o statistico, questa tecnica può essere utilizzata per esaminare l'espressione proteica, l'attività neurale, la segnalazione molecolare e la connettività funzionale all'interno del cervello.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca in questo rapporto è stata finanziata da una sovvenzione bersaglio dai NIGMS (1P20GM103653) assegnato a DK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. |
References
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