Summary
ここでは、近赤外染料と免疫組織化学、高分解能走査を併用し、脳領域におけるアッセイタンパク質を測定するプロトコルを紹介します。
Abstract
神経科学は、脳内の細胞が様々な機能を媒介する方法の研究であります.ニューロンおよびグリアにおけるタンパク質発現の測定は、細胞機能が細胞タンパク質の組成および活性によって決定されるため、神経科学の研究にとって重要である。この記事では、免疫細胞化学を近赤外高解像度スキャンと組み合わせることで、異なる脳領域におけるタンパク質発現の半定量的測定値を提供する方法について説明します。この技術は、同じ脳領域内の単一または二重タンパク質発現に使用することができる。この方法でタンパク質を測定することにより、実験的操作、学習と記憶の分子シグネチャ、分子経路での活動、複数の脳領域における神経活動を伴うタンパク質発現の相対的変化を得ることができます。正しいタンパク質と統計解析を使用して、脳領域間の機能的な接続性も決定することができます。実験室で免疫細胞化学を実装する容易さを考えると、近赤外高解像度スキャンで免疫細胞化学を使用すると、神経科学者の能力を拡張して、システムレベルで神経生物学プロセスを調べることができます。
Introduction
神経科学の研究は、脳内の細胞が特定の機能1を媒介する方法の調査に関するものです。これらは、グリア細胞が中枢神経系において免疫を与える方法などの性質の細胞であるか、または背部海馬におけるニューロンの活性が空間的なナビゲーションをもたらす方法を説明することを目的とする実験を伴うことができる。広い意味では、細胞機能は、セル内で発現されているタンパク質およびこれらのタンパク質2の活性によって決定される。その結果、脳細胞におけるタンパク質の発現および/または活性の測定は、神経科学の研究にとって重要である。
脳内のタンパク質発現を測定するために、多くの技術が利用可能である。これらには、小ペプチド4の受容体密度3およびマイクロ透析のための陽電子放射地形などのインビボの方法が含まれる。より一般的には、ex vivo の方法は、タンパク質の機能および発現を検査するために使用される。これらには、質量分析技術5、ウェスタンブロットおよび酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA)6、および免疫細胞化学7が含まれる。免疫細胞化学は、神経科学の分野で広く使用されています。この技術は、一次抗体を使用して、目的のタンパク質 (または抗原) を検出する (例えば、c − Fos) および共役二次抗体がタンパク質-一次抗体複合体を検出することを含む (図 1)。タンパク質-一次抗体-二次抗体複合体の検出を可能にするために、二次抗体は、それらに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) などの酸化剤を有する。これにより、光顕微鏡7を使用して検出することができる細胞における析出物の形成を可能にする。二次抗体はまた、化学物質がそれらに共役して蛍光を発することができます (すなわち、蛍光色素)。これらの化学物質を刺激すると光が放出され、これはタンパク質-一次抗体-二次抗体複合体7を検出するために使用することができる。最後に、一次抗体は還元剤と蛍光性化学物質を結合させ、二次抗体の必要性を直接否定することがあります (図 1)。
興味深いことに、多くの免疫細胞化学方法は、脳細胞のタンパク質の可視化を可能にするが、特定の細胞または脳領域内のタンパク質の量を定量化する能力はない。還元反応からの析出物を検出するために光顕微鏡を使用することは、ニューロンおよびグリアの可視化を可能にするが、この方法は、細胞内または特定の脳領域におけるタンパク質発現を定量化するために使用することはできない。理論上、蛍光顕微鏡は、このために使用することができるが、蛍光性二次抗体から放出される光は、タンパク質−一次抗体−二次抗体複合体の尺度であるからである。しかしながら、脳組織における自己蛍光は、脳組織8におけるタンパク質発現を定量化するために蛍光顕微鏡を使用することを困難にすることができる。結果として、脳組織の蛍光画像から放出される光は、脳内のタンパク質発現を定量化するためにめったに用いられない。
これらの問題の多くは、高解像度スキャン9,10と共に近赤外免疫細胞化学を使用して対処することができます。本稿では、近赤外発光スペクトルの蛍光色素と結合した免疫細胞化学を高解像度スキャニング (例えば 10 ~ 21 μ m) と組み合わせることで、異なるタンパク質の半定量を可能にするシャープな画像を得る方法について述べる。脳領域。
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Protocol
次のプロトコルは、デラウェア大学の制度的動物ケアと使用委員会 (IACUC) によって承認されました。男性スプレイグスプラーグラット約 55-75 日は、このプロトコルのために使用されました。
1. 脳の抽出と組織の準備
- ラットが麻酔誘導チャンバ内のイソフルランを有する麻酔ラットはもはや足のピンチに対する反応を示さない。
- ギロチンを使用して急速な斬首を介してラットを犠牲にする。
- 頭蓋骨の後部から前方に皮膚を切断し、頭蓋骨の上からクリアします。
- 慎重に頭蓋骨の後部を除去し、その後、頭蓋骨の正中線をカット小さな解剖はさみを使用して、脳組織を損傷を避けるために、常に頭蓋骨の上に押し上げて、rongeurs を使用してください。
- 脳を露出させるために頭蓋骨の右と左半分を剥がすために rongeurs を使用してください。
- 小さなスパチュラを使用して脳と神経をすくい、慎重に脳を高め、ドライアイス (少なくとも-20 ° c) で冷やしたイソペンタンで脳を凍結させます。この後、スライスするまで-80 ° c の冷凍庫で脳を保存します。
- -9 ° c から-12 ° c の間で維持されるクライオスタット内の 30 ~ 50 μ m の対象領域で、脳をスライスします。直接ガラススライド上にスライスをマウントし、免疫細胞化学アッセイの時間まで-80 ° c の冷凍庫に保管してください。
注:このプロトコルに関心のある脳領域は海馬と扁桃体であった。
2. 単一免疫組織化反応
注:二重免疫組織化反応の場合、このプロトコルは単一の免疫組織化学的反応と同じであり、この反応は、異なる宿主 (例えば、ウサギおよびマウス) の2つの一次抗体と、対応する2つの二次抗体を有するプライマリーは、単一のホスト (例えば、ヤギの antirabbit とヤギの antimouse) からでなければなりません。二次抗体はまた、高解像度スキャナで利用可能な2つの異なるスペクトルからでなければなりません。例えば、680 nm および1つの二次抗体800CW で発光スペクトルピークを有する1つの二次抗体 (780 nm での発光スペクトルピーク) がある。
- ガラスのスライドを冷凍庫から取り出し、室温まで30分平衡化ことができます。
- パラホルムアルデヒドの下で、室温で1− 2 h の 0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中に 4% の脳組織を固定します。
- スライドは、0.1 M トリスバッファ付き生理食塩水 (TBS) で3回、それぞれ10分間リンスします。透過処理は、軽度の洗剤 (例えば、0.01% の洗剤) で30−60分間スライドをインキュベートすることによって細胞膜を刺激する。
- TBS でスライドを15分間洗浄します。
- 正しい濃度で PBS 中の目的タンパク質の一次抗体を希釈します。例えば、直ちに初期遺伝子 c − Fos を検出し、1:500 の濃度でウサギ原発性抗 c − Fos 抗体を調製する。
- 一次抗体溶液を直接脳組織 (3 インチ x 1 インチのスライドあたり約200μ l) にピペットで挿入します。
- カバースリップを使用して、室温または一晩 (~ 17 h) で4° c の1− 2 h の一次抗体希釈で、ガラススライド上の脳組織をインキュベートします。
- 少量の洗剤を加えた TBS 中のカバースリップを取り除き、洗浄します (例: 0.01% の洗剤、「TBS-T」) それぞれ15分間で4回。
- 2時間室温で二次抗体で脳切片をインキュベートするためにカバースリップを使用します。
注:二次抗体は、適切な希釈液に、TBS、洗剤、および 1.5% の宿主血清を含有する希釈剤でなければならない。例えば、1: 2000 の希釈液中のヤギ二次抗体には、1.5% のヤギ血清と 0.05% の洗剤が含まれます。 - TBS-T でスライドを4回、それぞれ20分間、TBS で4回、それぞれ20分間洗浄します。
- ドライスライドを暗所で室温で一晩で乾燥させる。スライドが乾いている場合は、イメージングの準備ができています。
3. イメージング
- 近赤外の走査インターフェイスにスライドを置き、組織を下向きにします。選択ツールを使用して、一度に1つのガラススライドまたは複数のスライドのいずれかをイメージします。
- イメージスライドは、オフセットが 0 nm、解像度が21μ m の最高品質設定を使用します。スキャンは通常、使用するスキャン装置に応じて13−19時間かかります。
- 画像解析ソフトウェア (例: ImageStudio) にイメージをインポートして、半定量的なタンパク質分析を表示してマークします。
4. タンパク質発現解析
- 画像解析ソフトウェアを開き、画像がスキャンされた作業領域を選択します。
- 画像解析ソフトウェアでスキャンした画像を開き、スキャンを表示し、表示される波長と、未加工の画像または合計定量放出を変更せずに表示するコントラスト、明るさ、および倍率を調整します。
- 定量化する主要な領域を特定し、ページの上部にある [解析] タブを選択し、[矩形を描画] (または [楕円を描画/フリーハンドで描画)] を選択して、定量化する領域の上に四角形を描画します。
- 四角形のサイズを表示するには、画面の左下にある図形を選択してから、右下にある [列] を選択します。図形のサイズを指定するには、高さと幅の列を追加します。
注:定量化を比較する際には、形状サイズを制御することが重要です。その領域のエミッションの正確なサンプリングを得るためには、所望の定量化場所内に配置された同一の形状を使用することをお勧めします。 - その後、図形に名前を付け、繰り返します。すべてのリージョンをサンプリングしたら、[列] タブから使用可能なデータを集計および分析できます。
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Representative Results
免疫組織化学の高解像度スキャンを使用する前に、プロトコルが動作することを確認する必要があります。これは、同じ動物からの脳切片が一次および二次抗体と共にインキュベートされる検証アッセイを用いて、二次抗体単独で、または一次でも二次抗体でも達成することができる。このような検証アッセイの結果を図 2に示す。この反応において、我々は、背部海馬および扁桃体における直初期の遺伝子 c-ジュンを検出した。C-ジュンの発現は、一次および二次抗体が脳組織に適用された場合にのみ認められた。
図 3は扁桃核における二重タンパク質検出を示す。この実験では、同一脳組織におけるα-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-isoxazolepropionic 酸 (AMPA) 受容体と N-メチル-D-アスパルレセプター (NMDA) 受容体の NR2A サブユニットの GluR1 をアッセイした。これにより、扁桃体のサブ核における AMPA/NMDA レセプターの比率を調べることができた。この比率は、学習とメモリ11,12の神経生物学署名である。図 3に見られるように、GluR2 (緑に擬似着色した 780 nm の光) と NR2A (680 nm の光擬似着色された赤色) に対するシグナルは、一次および二次抗体に曝露した脳組織においてのみ観察することができる。
図 4は、腹側海馬の高解像度スキャンから、タンパク質発現の平均値と正規化された測定値をどのように得ることができるかを示しています。画像解析ソフトウェアを使用して、対象領域 (CA1 の分子層) に矩形を配置し、形状からの光の平均強度を蛍光色素の測定値として使用することができます (図 4a)。次に、これは、タンパク質発現の尺度 (すなわち、抗原−一次抗体−二次抗体複合体) である。この形状は、高い信号と低い信号を表す領域に配置して、正規化された曲線を得ることもできます (図 4b)。この例では、矩形を CA1 の分子層にわたって配置したが、このアッセイではかなりの量の c ジュンを発現しなかった樹状フィールドもカバーしていた。曲線の下の領域は、タンパク質発現の尺度として使用することができます。実験におけるセットアップが治療群 (例えば、ストレス暴露) および対照を伴う場合、脳内のタンパク質発現における相対的な変化が得られる。
図 1: 原発 (1st) および二次 (2nd) 抗体または単に一次抗体を用いた免疫組織化反応の図。塗りつぶされた黒丸は、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはホウ素-dipyrromethene (BODIPY) などの蛍光色素のような酸化剤であり得る標識を表す。緑色の四角は、免疫組織化反応において検出される抗原 (対象タンパク質上) を表す。
図 2: C-ジュンの検出のための検証アッセイの画像。このアッセイでは、同じ動物由来の組織をウサギ一次抗体で処理し、780 nm (緑、左パネル) で発光した蛍光色素を用いて antirabbit とヤギの二次抗体を認識した。隣接する組織は、二次抗体単独 (中間パネル) または no 抗体 (右パネル) のいずれかで処理した。スケールバー = 1 mm。
図 3: 扁桃体において免疫組織化反応を二重ラベリングする検証アッセイ。同じラットからの三連脳切片は、NR2A を認識する GluR1 およびマウス抗体を認識するウサギ抗体 (左パネル)、二次抗体 (中央パネル)、または抗体なし (右パネル) に暴露されたいずれかであった。GlurR1 をヤギ抗ウサギで可視化した800CW 二次抗体 (780 nm、緑色の疑似着色) と NR2A を用いて、ヤギ antimouse 680RD 二次抗体 (680 nm、疑似着色レッド) を使用して可視化した。スケールバー = 1 mm. ot = 視神経管;ic = 内部カプセル;ec = 外部カプセル。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 脳組織におけるタンパク質発現の半定量的な測定値を得る。(AおよびB) スキャナからの画像を分析するために使用される画像解析ソフトウェアのスコア画像のスクリーンショット。組織は腹側海馬からのもので、c ジュンを可視化するために処理されました。 この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、近赤外免疫細胞化学を高解像度スキャニングと組み合わせて使用することで、脳組織におけるタンパク質発現の半定量的な測定値を得ることができることを示しています。また、同じ脳領域で同時に2つのタンパク質を標識するために使用することができます.我々は以前、近赤外免疫組織化学を用いて、複数の脳領域9,10における早期の遺伝子発現を測定してきた。早期の初期の遺伝子は、神経活動の尺度として使用することができる。また、これらの半定量的なタンパク質発現の測定を統計分析に適用し、脳領域を、即時初期遺伝子の相関レベル (IEGs) でグループ化することを可能にしました。これを機能的接続性の尺度として使用し、感情学習とメモリ9,10の間の恐怖回路内のノード間のストレスが機能的な接続にどのように影響するかを調べた。我々は、高解像度スキャニング13を備えた近赤外免疫細胞化学を用いて、AMPA/NMDA 比 (学習と記憶のシグネチャー) を測定する方法を示しました。同様の技術を使用して、パンおよびホスホタンパク質を測定し、分子シグナル伝達を決定することができる。これは、ウエスタンブロット14を使用して達成される。しかし、これは、厚い脳スライスのうち、脳領域を解剖する必要があり、小さな脳領域に適していません。この問題は、高解像度のスキャンで近赤外免疫細胞化学を使用して回避することができます。最後に、すべての免疫細胞化学のイメージはデジタル化され、無制限の貯蔵および前の試金の便利な再分析を可能にする。
すべての方法と同様に欠点があります。高分解能スキャナには倍率がなく、組織の治療では蛍光顕微鏡技術を使用したプロービングが容易にできません。共焦点顕微鏡は脳組織の灌流に最も適しているかもしれないので、脳から別のスライスを服用してもうまくいかないことがありますが、高解像度スキャニングによる近赤外イメージングは通常、フラッシュ凍結脳上で行われます。特定のニューロンにおけるタンパク質発現 (例えば、介在ニューロン対錐体ニューロン) または脳内の異なる細胞型 (例えば、ニューロン対グリア) は、高解像度走査を伴う近赤外免疫細胞化学を用いて決定することはできない。これはまだ脳組織のタンパク質発現を検査するための比較的新しい方法であるため、検証アッセイを行うことは重要です。
適切に使用すると、高解像度スキャニングによる近赤外免疫細胞化学が利点を提供します。脳組織における自己蛍光は近赤外範囲で低減され、タンパク質発現の半定量的な測定が得られ、同一の脳領域における2つのタンパク質の発現が得られ、そしてアッセイの画像を無期限に保存することができる。適切なタンパク質および/または統計的方法と組み合わせることにより、この技術は、タンパク質発現、神経活動、分子シグナル伝達、および脳内の機能的接続性を調べるために使用することができます。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
この報告書の研究は、DK に授与される NIGMS (1P20GM103653) の助成金によって賄われた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. |
References
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