Summary
Il protocollo descrive l'uso della Miografia dei fili per valutare la tensione isometrica transmurale delle arterie mesenteriche isolate dai topi, con particolare attenzione alla modulazione da fattori rilasciati da cellule endoteliali e tessuti adiposi perivascolare.
Abstract
Alterazione del tono vascolare reattività agli stimoli fisiopatologici contribuisce allo sviluppo di una vasta gamma di malattie cardiovascolari e metaboliche. La disfunzione endoteliale rappresenta un grave colpevole per la ridotta vasodilatazione e una maggiore vasocostrizione delle arterie. Adiposo (grasso) tessuti che circondano le arterie svolgono ruoli importanti nella regolazione del rilassamento endotelio-dipendente e/o contrazione delle cellule muscolari lisce vascolari. I colloqui incrociati tra l'endotelio e i tessuti adiposi perivascolare possono essere valutati ex vivo utilizzando vasi sanguigni montati da un sistema di Miografia a filo. Tuttavia, dovrebbero essere stabilite impostazioni ottimali per le arterie derivate da animali di diverse specie, età, background genetici e/o condizioni fisiopatologiche.
Introduction
Le dilatazioni e le costrizioni delle arterie sono raggiunte da rilassanti e contrazioni, rispettivamente, delle loro cellule muscolari lisce vascolari. I cambiamenti nella reattività vascolare delle piccole arterie contribuiscono alla regolazione omeostatica della pressione arteriosa da parte dei nervi autonomici e degli ormoni presenti nel sangue (ad esempio, catecolamine, angiotensina II, serotonina, vasopressina). A livello locale, le risposte vascolari delle cellule muscolari lisce sono modulate dai segnali provenienti sia dalle cellule endoteliali dell'intima che dal tessuto adiposo che circonda le arterie (Figura 1).
L'endotelio non è solo una barriera passiva, ma funge anche da superficie per scambiare segnali tra il sangue e le cellule muscolari lisce vascolari sottostanti. Rilasciando varie sostanze vasoattive, l'endotelio svolge un ruolo critico nel controllo locale delle risposte di tono vascolare1. Ad esempio, in risposta all'acetilcolina, l'ossido nitrico sintasi (eNOS) endoteliale viene attivato nell'endotelio per produrre ossido nitrico (no), che induce il rilassamento del muscolo liscio vascolare sottostante attivando guanil ciclasi solubile (SGC) 2. altre sostanze vasoattive includono i prodotti di cicloossigenasi (ad esempio, prostaciclina e trombossano a2), lipossigenasi (ad es., 12-idrossietilosatetraenoico, 12-HETE) e monoossigenasi del citocromo P450 (HETEs e acido epoxyeicosatrienoico, S.e.t.), specie reattive dell'ossigeno (ROS) e peptidi vasoattivi (ad es., endothelin-1 e angiotensina II), e fattori iperpolarizzanti derivati dall'endotelio (EDHF)3. Un delicato equilibrio tra vasodilatatori e vasocostrittori derivati dall'endotelio mantengono il tono vasomotore locale4,5.
La disfunzione endoteliale è caratterizzata dalla compromissione dell'endothelio-dipendente vasodilatazione6, un segno distintivo di invecchiamento vascolare7. Con l'età, la capacità di endotelio per promuovere la vasodilatazione è progressivamente ridotta, dovuto in gran parte a una diminuzione della biodisponibilità NO, così come l'espressione anormale e la funzione di eNOS nell'endotelio e sGC nelle cellule muscolari lisce vascolari8 , 9 il , 10. riduzione della biodisponibilità non potenzia la produzione di vasocostrittori dipendenti dall'endotelio11,12. Nelle arterie invecchiate, la disfunzione endoteliale provoca iperplasia nei media, come riflessa dai marcati aumenti dello spessore della parete, numero di nuclei mediali, che ricordano l'ispessimento arterioso nell'ipertensione e l'aterosclerosi osservata negli esseri umani pazienti13,14. Inoltre, le condizioni fisiopatologiche come l'obesità, il diabete o l'ipertensione accelerano lo sviluppo della disfunzione endoteliale15,16.
Tessuto adiposo perivascolare (pvat) rilascia numerosi adipochine per regolare la struttura vascolare e la funzione17. L'effetto anti-contrattile di pvat è mediato da fattori rilassanti, come adiponectina, no, perossido di idrogeno e solfuro di idrogeno18,19,20. Tuttavia, a seconda della posizione e della condizione patofisiologica, PVAT può anche migliorare le risposte contrattili in varie arterie21. Le sostanze pro-contrattili prodotte da pvat includono l'angiotensina-II, la leptina, la resistina e la Ros22,23. Nella maggior parte degli studi sui vasi sanguigni isolati, il PVAT è stato considerato come un semplice supporto strutturale per la vascolarizzazione e quindi rimosso durante la preparazione dei segmenti di anello dei vasi sanguigni. Poiché la disfunzione adiposa rappresenta un fattore di rischio indipendente per l'ipertensione e le complicanze cardiovascolari associate24, il pvat che circonda i vasi sanguigni deve essere considerato quando si studia la reattività vascolare di diverse arterie.
I sistemi di miografo multifilo sono stati ampiamente utilizzati per indagare le funzioni vasomotore di una varietà di vasi sanguigni, tra cui l'aorta, mesenterica, renale, femorale, cerebrale e arterie coronarie25,26. I protocolli qui descritti utilizzeranno la Miografia dei fili per valutare la reattività vascolare nelle arterie mesenteriche isolate da modelli murini geneticamente modificati, con particolare attenzione alla modulazione da parte di PVAT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli animali utilizzati per il seguente studio sono stati forniti dal laboratorio animale unità della facoltà di medicina, l'Università di Hong Kong. L'approvazione etica è stata ottenuta dal Comitato dipartimentale sull'uso degli animali da laboratorio per l'insegnamento e la ricerca (CULATR, no.: 4085-16).
1. i preparativi
- Preparazione di farmaci
- Conservare i farmaci in modo appropriato come indicato nella scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) subito dopo averli ricevuti. Sciogliere i farmaci in polvere in solventi come soluzioni di stock ad alta concentrazione e poi aliquota per lo stoccaggio a-20 ° c.
Nota: la maggior parte dei farmaci sono disciolti in acqua distillata per preparare le soluzioni stock; riscaldamento o sonicazione può essere richiesto per alcuni farmaci. Se i farmaci non completamente sciogliere in acqua, una goccia di 1 M NaOH può essere aggiunto, mentre per i farmaci di base una goccia di 1 M HCl può essere utilizzato. I farmaci idrofobici possono essere disciolti in dimetilsolfossido (DMSO) o etanolo assoluto. In questi ultimi casi, la concentrazione finale del bagno (in M) deve essere nota e devono essere eseguiti controlli appropriati per escludere gli effetti dei solventi. - Prima di sperimentare, sciogliere le aliquote del farmaco (tabella dei materiali) in Krebs-Ringer bicarbonato soluzione (Krebs) contenente 115 mm nacl, 4,6 mm kcl, 2,5 mm CAcl2, 1,17 mm mgso4, 1,17 mm KH2po4, 25 mm NaHCO3, 11,1 mm D-glucosio e 0,01 mm EDTA, pH 7,4.
- Per le curve di concentrazione cumulative-risposta, preparare le scorte e le soluzioni di lavoro di diversi farmaci per diluizioni seriali (tabella 1).
- Conservare i farmaci in modo appropriato come indicato nella scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) subito dopo averli ricevuti. Sciogliere i farmaci in polvere in solventi come soluzioni di stock ad alta concentrazione e poi aliquota per lo stoccaggio a-20 ° c.
- Impostazione dello strumento
- Calibrare il trasduttore di forza per tutti i canali prima di utilizzare il sistema myograph ogni giorno, o ogni volta che il sistema è stato spostato.
Nota: la procedura di calibrazione dettagliata varia a seconda del modello. In generale, un peso di due grammi viene applicato alle mascelle e la forza corrispondente dovrebbe 9,81 ± 0,1 mN. Se la lettura è disattivata di oltre 0,1 mN, il trasduttore deve essere ricalibrato. Per il sistema utilizzato nel presente protocollo (vedere la tabella dei materiali) i valori di funzionamento del trasduttore di forza durante la calibrazione devono essere compresi tra 3000 e 3500. Se il valore del trasduttore è superiore o inferiore, il trasduttore di forza deve essere sostituito. - Regolare e allineare i supporti di montaggio in ogni camera. L'uso continuo e ripetuto della camera del miografo può causare un certo disallineamento del supporto di montaggio, che necessita di una regolazione occasionale prima degli esperimenti per garantire che le ganasce siano correttamente allineate.
Nota: è necessario prestare particolare attenzione quando si regolano i supporti di montaggio poiché i trasduttori di forza sono molto sensibili e fragili. - Accendere riscaldatori e gas (95% O2 e 5% Co2) almeno 30 minuti prima dell'esperimento per consentire che le camere e i tamponi siano riscaldati fino a 37 ± 0,1 ° c e bilanciati con la miscela di gas.
- Controllare la temperatura del termometro per garantire la precisione del riscaldatore. La temperatura può essere modificata per eseguire esperimenti di raffreddamento o riscaldamento. Se la temperatura non è corretta come impostato, applicare la funzione di offset della macchina per aumentare o diminuire le impostazioni per raggiungere la temperatura desiderata.
- Alla fine dell'esperimento, pulire tutte le camere e spegnere il riscaldatore, nonché il gas che corre alla configurazione.
- Non spegnere il gas prima che tutto il liquido nella camera sia stato aspirato fuori dal sistema, altrimenti l'acqua acida/distillata può rigurgitare e raggiungere la camera d'organo durante il successivo utilizzo.
- Per pulire le camere del miografo filo, il modo più efficace è quello di eseguire il lavaggio acido utilizzando una soluzione di acido acetico diluito. Pulire il bordo e l'interno delle camere con un batuffolo di cotone.
- Dopo il lavaggio, sciacquare accuratamente le camere con acqua distillata. Pulire l'esterno delle camere con un panno umido per rimuovere il sale essiccato. L'etanolo può essere utilizzato anche se durante l'esperimento sono stati utilizzati farmaci idrofobici.
- Un esempio della procedura di lavaggio è il seguente. Riempire le camere con 8% soluzione di acido acetico e incubare per 2 min. utilizzare un applicatore a punta di cotone per pulire meccanicamente la superficie della camera d'acciaio. Evitare qualsiasi contatto con la parte in alluminio del miografo.
- Aspirare l'acido acetico e lavare la camera del miografo e sostare più volte con acqua distillata e asciugare le superfici utilizzando carta assorbente o applicatori in cotone.
- Calibrare il trasduttore di forza per tutti i canali prima di utilizzare il sistema myograph ogni giorno, o ogni volta che il sistema è stato spostato.
- Dissezione degli anelli arteriosi mesenterici
Nota: gli animali utilizzati per lo studio corrente erano dieta ad alto contenuto di grassi alimentati maschio adipo-SIRT1 topi e tipo selvaggio cucciolata come controlli. Ogni animale pesava approssimativamente 45 g al momento degli esperimenti.- Euthanize il topo mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico (50 mg/kg).
- Con forbici chirurgiche e pinze, eseguire una laparotomia Mid-line per rivelare il contenuto addominale.
- Raccogli il porticato mesenterico in una capsula di Petri rivestita di silicio.
- Stendere e fissare la rete mesenterica nella capsula di Petri per rivelare la ramificazione del mesentere e del tessuto connettivo.
- Sotto un microscopio (10x), e con forbici fini e pinze, sezionare attentamente i tessuti connettivi circostanti. Evitare di danneggiare lo strato avventitiale. In alternativa, il tessuto adiposo circostante può essere conservato intorno al vaso sanguigno per l'esperimento (se necessario).
- Utilizzando le forbici fini e pinze, accisa i rami secondari delle arterie mesenteriche in tampone ghiacciato Krebs.
Nota: ogni ricercatore dovrebbe avere la propria serie di kit di dissezione, corde e staffe. Questi strumenti devono essere mantenuti correttamente e puliti-up ogni volta dopo l'esperimento come alcuni farmaci sono difficili da lavare via e residui possono attenersi a loro.- Tenere i vasi sanguigni nel tampone Krebs freddo separando i tessuti connettivi circostanti, compreso il PVAT. Durante la manipolazione del vaso sanguigno, essere delicato per evitare danni inutili all'endotelio.
- Se l'esperimento coinvolge lo studio di PVAT, mantenere un 1,5 sfera di diametro di 2 mm di PVAT intorno al vaso sanguigno. In alternativa, le stesse quantità di tessuti adiposi possono essere aggiunte in ogni camera per l'esperimento.
- Opzionale Rimuovere l'endotelio dal vaso sanguigno dissezionato come un controllo per valutare la dipendenza endotelium delle risposte. Per le arterie mesenteriche, rimuovere l'endotelio da arrotolare delicatamente su una staffa di filo o un capello.
- Tagliare il vaso sanguigno preparato come sopra in piccoli anelli (~ 2 mm di lunghezza) e metterli in un piatto di plastica pieno di aerato (95% O2 e 5% Co2) tampone Krebs per montaggio successivo nelle camere di un filo myograph27.
- Trasferire gli anelli della nave in una camera myograph posizionata al microscopio. Gli anelli devono essere posizionati uniformemente, con le staffe superiori e inferiori parallele. Il filo di fissaggio (40 μm) deve essere appena preparato poiché i farmaci possono legarsi alle corde.
- Infilare l'anello del vaso sanguigno su una lunghezza idonea (2 cm) del filo e fissarlo a una mascella della camera di montaggio avvitando per fissare la posizione.
- Passare un secondo filo attraverso l'anello e ancorare alla mascella opposta.
- Con anelli filettati e fissati a mascelle a camera, montare la camera sulla configurazione myograph e ruotare la vite micrometrica in senso orario per spostare i fili vicini l'uno all'altro fino a quando la forza di lettura sull'interfaccia utente corrispondente alla camera montata è zero o semplicemente sotto.
Nota: il filo attaccato alla mascella superiore deve essere di lunghezza minima per garantire che la tensione possa essere completamente trasfilata al rivelatore. - Equilibrare i preparativi a 37 ° c per almeno 30 minuti prima della prima applicazione della forza utilizzando il micrometro regolabile.
- Valutare la vitalità tissutale in 115 mM di potassio alto (NaCl sostituito da KCl su base molare) krebs contenenti 4,6 mm NaCl, 115 mm KCl, 2,5 mm cacl2, 1,17 mM MGSO4, 1,17 mm KH2po4, 25 mm NaHCO3 e 11,1 mM D-glucosio a pH 7,4.
Nota: i recipienti isolati sono considerati vitali se la forza contrattile trascorsa e registrata come deviazione al di sopra della linea di base nel software di registrazione dati del sistema myograph è superiore al 40% del loro tono di riposo, in risposta a un agente contrattile. Se l'arteria non si contrae in modo appropriato, la tensione basale/pressione della parete ottimale non è stata regolata correttamente o l'arteria potrebbe essere stata danneggiata durante l'isolamento o il montaggio della nave. - Opzionale Valutare l'integrità delle cellule endoteliali applicando fenilefrina per indurre la contrazione della nave al 50% della risposta iniziale a KCl (come registrato dal trasduttore di forza nel software di registrazione dei dati), seguita dall'aggiunta di 1 μm di acetilcolina.
Nota: una buona preparazione dei vasi sanguigni è cruciale per ottenere risultati coerenti e accurati. Un preparato non deve essere utilizzato per l'esperimento se il test di integrità endoteliale non è soddisfacente o non risponde alla KCl, indicando che la funzione endoteliale o la contrattilità muscolare liscia vascolare, rispettivamente, non sono soddisfacenti. In questo caso, il preparato deve essere sostituito con un nuovo anello dello stesso vaso sanguigno o di un nuovo vaso sanguigno.
2. normalizzazione per determinare la tensione iniziale ottimale
Nota: la procedura di normalizzazione consente la determinazione del diametro interno ottimale (IC) delle arterie in cui il vaso sanguigno sperimenta una pressione transmurale idonea a riposo (100 mmHg o 13,3 kPa per le arterie mesenteriche) e produce il massimo attivo forze in risposta agli agenti vasoattivi.
- Accendere il computer e aprire il software di registrazione dei dati (vedere la tabella dei materiali).
- Salvare l'esperimento come "file di dati LabChart" con un nuovo nome per evitare di sovrascrivere il file di impostazione originale.
- Aprire la finestra delle impostazioni di normalizzazione e impostare il fattore k come 1. Accettare i valori di default per la calibrazione oculare (0,3 Se la lunghezza della nave è sconosciuta o 1 se è nota la lunghezza della nave), la pressione di destinazione (13,3), il tempo di media online (2) e il tempo di ritardo (60). Fare clic su OK per salvare le impostazioni.
- Selezionare i canali di interesse e inserire il diametro del filo (40 μm), gli endpoint tissutali (a1:0; a2: lunghezza del tessuto misurata), la lettura iniziale dei micrometri nella finestra di normalizzazione.
- Avviare la procedura di normalizzazione applicando il primo tratto passivo al vaso sanguigno (ruotare la vite del micrometro in senso antiorario).
- Attendere che la nave si stabilizzi (3 min) e inserire la nuova lettura del micrometro nella finestra di normalizzazione. La tensione della parete viene calcolata automaticamente e mostrata come un punto sul grafico.
Nota: i "passi" del micrometro utilizzati durante l'allungamento passivo non devono essere uguali. I primi tratti possono essere di 20 μm ciascuno. Mentre i tratti si avvicinano alla linea Isobar, i gradini possono essere ridotti a 10 μm, 5 μm, 2 μm o anche più piccoli. Aprire la finestra principale del grafico mentre si regolano le impostazioni del micrometro — se appare un grande picco che supera la linea di Isobar su un grafico di lunghezza/tensione (che indica i punti di pressione corrispondenti a un valore predeterminato), ridurre la tensione. - Dopo ogni tratto passivo, sostituire il controllo Krebs con un Krebs alto potassio ISO-osmotico contenente 115 mM KCl. Quando la contrazione raggiunge un altopiano (circa 3 min), registrare la forza attiva (F) sottraendo la forza passiva ad ogni tratto dalla forza attivata dal potassio. Calcolare la tensione della parete e i valori della circonferenza interna (IC).
- Misurare la tensione attiva come la deviazione sopra la linea di base. La tensione attiva (T) viene calcolata in base all'equazione F (mN) = T (mN/mm) x 2 x lunghezza del recipiente (mm). I valori della circonferenza interna (IC) sono calcolati dai dati del micrometro (IC = 205,6 μm + 2 x "gap").
- Rimuovere l'elevata condizione di potassio sostituendo con Krebs freschi. Ripetere il lavaggio per tre volte in 5 minuti.
- Ripetere i passaggi da 2,5 a 2,8 (inducendo i tratti passivi seguiti dalla contrazione attiva in turni alternati) fino a quando la tensione attiva non inizia a diminuire (Figura 2).
- Dopo più turni di tratti alternativi, le curve di lunghezza/tensione passiva danno il valore di IC100, la circonferenza interna del recipiente ad una pressione transmurale di 100 mmHg, come punto di attraversamento con la linea di Isobar.
Nota: ogni valore del micrometro durante i tratti passivi viene introdotto manualmente nel modulo di normalizzazionedel software. Il programma registra automaticamente la misura di forza corrispondente per generare la curva di lunghezza/tensione passiva, che dà il valore di IC100 come punto di incrocio con la linea Isobar (Figura 2, pannelli a destra). Più l'ultimo punto è vicino alla linea Isobar, ma appena sopra la migliore normalizzazione è senza danneggiare i vasi. Un punto troppo sopra la linea di Isobar può danneggiare fisicamente la nave montata, causando risultati inaffidabili durante l'esperimento. - Creare le curve di lunghezza/tensione attive per determinare i valori IC1 e calcolare il fattore k di normalizzazione come rapporto di IC1/IC100, che verrà utilizzato per questo tipo di vaso sanguigno nei successivi esperimenti di Miografia.
Nota: le curve di lunghezza/tensione attive vengono create tracciando i valori IC calcolati dai dati del micrometro sull'asse x e dalle tensioni attive sull'asse y. Il IC1 è il valore che giace all'interno della regione di picco Plateau (tracce rosse in Figura 2, pannelli a destra). Dopo aver tracciato le curve di lunghezza/tensione attive e aver determinato IC1, il fattore k di normalizzazione viene calcolato come rapporto di IC1/IC100. Sulla base del fattore di normalizzazione k , l'IC ottimale per il basale, indicato come IC1, mostrerà sulla curva di lunghezza/tensione passiva. L'impostazione del micrometro per questo IC appare sotto la curva e deve essere utilizzata per impostare il microposizionatore per i successivi esperimenti di Miografia. La tensione iniziale (T) equivale alla pressione target (PI) x IC/2π e la forza ottimale (F) applicata al recipiente equivale a T x 2 x lunghezza del recipiente. - Lavare accuratamente le alte Krebs di potassio e equilibrare i preparativi per un altro 30 a 45 min. reimpostare le tensioni basali su "zero" in modo che solo le risposte contrattili attive vengano registrate durante l'esperimento successivo.
3. contrazioni indotte da phenylephrine
Nota: i farmaci che possono essere selezionati per indurre le risposte vasocostrittive includono l'adrenocettore agonista non specifico norepinefrina, il selettivo α-1 adrenocettore agonista phenylephrine, l'ormone peptidico angiotensina II, e la monoamina neurotrasmettitore 5-idrossitritptamina. Phenylephrine è usato nel presente protocollo per l'esame (tabella dei materiali).
- Preparare e montare gli anelli arteriosi accoppiati come descritto nel paragrafo 1,3, uno con PVAT intatto e l'altro con PVAT rimosso, dalle sezioni adiacenti di ciascuna arteria per l'esperimento.
- Dopo la normalizzazione (descritta al paragrafo 2), pre-contrarre i segmenti arteriosi con alto tampone di potassio Krebs aggiungendo 115 mM di soluzione KCl alla camera contenente Krebs.
- Attendere la contrazione a Plateau (3 min), lavare l'alto potassio e sostituirlo con tampone di Krebs fresco aerato. Ripetere il lavaggio tre volte in 5 minuti.
- Ripetere la stimolazione e il lavaggio del KCl tre volte e registrare la massima risposta contrattile/tensione al KCl sottraendo la tensione di base dalla tensione dovuta alla stimolazione del KCl.
- Dopo l'ultima contrazione e lavaggio, riempire la camera con caldo, aerato tampone Krebs e consentire l'arteria di recuperare per circa 30 minuti prima di eseguire il compito successivo.
- Per ogni camera, aggiungere quantità cumulative di fenilfrina (incrementi di Half-log da 10-10 a 10-4 M) per indurre gli aumenti di concentrazione-dipendenti della tensione isometrica dei preparati quiescenti.
- Iniziare aggiungendo una bassa concentrazione dell'agonista alla camera. Dopo aver permesso abbastanza tempo per una contrazione stabile (3 – 5 min), aggiungere la concentrazione successiva. Ripetere i passaggi con concentrazioni crescenti di fenilfrina.
- Dopo aver aggiunto l'ultima dose di agonista (phenylephrine), lavare accuratamente il farmaco e riempire la camera con tampone Krebs fresco. Tracciare le risposte dipendenti dalla concentrazione come percentuali crescenti delle contrazioni massime indotte dalla KCl (Figura 3).
- Opzionale Per valutare il contributo di NO, incubare i preparati con l'inibitore della NO sintasi, L-nome (10-4 M), per 30 minuti prima dell'aggiunta di fenilfrina. L-NAME migliora le contrazioni indotte da fenilfrina nelle preparazioni quiescenti delle arterie mesenteriche (Figura 4).
Nota: gli inibitori o gli antagonisti devono avere tempo sufficiente per raggiungere l'equilibratura, di solito 30 – 45 min (essere coerenti per qualsiasi insieme di esperimenti). - Per eseguire una seconda curva di concentrazione-risposta in sequenza, lavare la camera completamente e ripetutamente per rimuovere tutti gli agonisti precedenti, fino a quando non si osservano ulteriori cambiamenti di tono.
Nota: la sperimentazione parallela espone almeno due anelli ottenuti dallo stesso vaso sanguigno all'agonista, uno in condizioni di controllo e uno in presenza dell'inibitore o degli inibitori; in ogni anello la curva di concentrazione-risposta verrà eseguita una sola volta. È preferibile eseguire esperimenti paralleli, poiché questo fornisce un migliore controllo per l'azione del farmaco e la sensibilità dei vasi sanguigni. Gli esperimenti seriali ottengono una curva di concentrazione-risposta ad un agonista in un unico anello; lavarlo fuori, cambiando le condizioni sperimentali (ad esempio, aggiungendo un inibitore), e poi ripetendo la curva di risposta di concentrazione sullo stesso anello. In questo caso, sono necessari controlli temporali per dimostrare che le risposte al farmaco non sono dovute a cambiamenti del tessuto nel tempo. Non si può mai essere certi che il tessuto sia esattamente nello stesso stato dopo l'esposizione ad un esperimento di concentrazione-risposta. Deve essere somministrato un tempo sufficiente (almeno 30 – 60 min) per consentire ai segmenti della nave di ritornare alla loro tensione di riposo (basale), anche se in alcuni casi, questo potrebbe non verificarsi immediatamente dopo la dissociazione dell'agonista ad alta affinità dai recettori. Inoltre, i Krebs ad alto potassio possono essere applicati tra le curve di concentrazione-risposta cumulative per ridurre la desensibilizzazione28. Ricordate che la maggior parte degli antagonisti non possono essere lavati completamente, quindi continuate ad aggiungerla per il resto dell'esperimento.
4. rilassamento/contrazioni a carico dell'endotelio
- Pre-contrattare un segmento arterioso appena montato (come descritto nei passaggi da 3,2 a 3,5). Ancora una volta, registrare la massima risposta contrattile/tensione a KCl sottraendo la tensione di base dalla tensione dovuta alla stimolazione di KCl.
- Opzionale Incubare i preparati con l'inibitore di NO sintasi, L-NAME (10-4 M), per 30 minuti prima dell'aggiunta di U46619.
- Aggiungere le concentrazioni pre-calcolate di U46619 alla camera e consentire una contrazione stabile e sostenuta dei segmenti dell'arteria.
Nota: le risposte vasodilatatorie sono indotte nelle arterie mesenteriche pre-contrattate a circa 80% delle risposte massime a 115 mM KCl. diversi agonisti possono essere utilizzati per indurre la contrazione per attivazione dei loro recettori specifici. Qui, i segmenti dei vasi sanguigni con o senza PVAT sono pre-contrattati con U46619 (1 – 3 x 10-8 M; Tabella dei materiali), un agonista del recettore a2 del trombossano, per indurre contrazioni muscolari lisce stabili e sostenute. - Aggiungere concentrazioni cumulative di acetilcolina (10-10 a 10-4 M) alla camera d'organo. Le risposte vasodilatatorie dipendenti dalla concentrazione dei segmenti delle arterie sono presentate in percentuale delle risposte contrattili indotte da U46619 (Figura 5).
Nota: per la maggior parte dell'esperimento, la prossima concentrazione dell'agonista rilassante deve essere aggiunta immediatamente quando si osserva un plateau per prevenire il rimbalzo in tensione. Le risposte vasodilatatorie dipendenti dalla concentrazione dei segmenti delle arterie sono normalizzate in percentuale delle risposte contrattili indotte da U46619 per adattarsi alle lievi differenze di internervazione e di diametro tra i segmenti dell'arteria (Figura 5). Piccole variabilità nella reattività tra i singoli anelli ottenuti dallo stesso vaso sanguigno diventano minime quando un gruppo di sei o più esperimenti vengono analizzati statisticamente. Quando si esprimono le risposte come percentuale delle contrazioni massime del singolo tessuto, è opportuno utilizzare un'analisi accoppiata (ad esempio, il test t associato dello studente) per confrontare le risposte dello stesso tipo di tessuti di diversi animali da confrontare delle risposte di un singolo tessuto prima e dopo un intervento. Quando si analizzavano gli effetti di PVAT, viene utilizzata l'ANOVA bidirezionale seguita dal test di confronto multiplo. - Dopo aver aggiunto la dose finale dell'agonista rilassante, rimuovere il farmaco da ogni camera e riempire con tampone Krebs fresco. Lavare accuratamente la camera con tampone Krebs e lasciare che l'arteria si stabilizzi per almeno 45 minuti prima di eseguire ulteriori esperimenti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esame delle relazioni di lunghezza/tensione per ottenere il fattore di normalizzazione k
La quantità di tratto applicato a un segmento di vaso influenza l'entità dell'interazione actina-miosina e quindi la forza attiva massima sviluppata. Così, per ogni tipo di vaso sanguigno, determinare la quantità di tratto necessario per la massima forza attiva è necessaria per gli studi di Miografia corretta. Qui, la normalizzazione della relazione lunghezza/tensione viene eseguita per le arterie mesenteriche isolate dai modelli murini (Figura 2). I segmenti arteriosi sono stati sospesi in un sistema di miografo a quattro camere (Vedi tabella dei materiali) su perni in acciaio inox (diametro 40 μm). La tensione isometrica è stata registrata utilizzando un convertitore analogico-digitale collegato a un computer con un programma di registrazione. Chambers conteneva 5 mL di tampone Krebs, mantenuto a 37 ° c e aerato con 95% O2 e 5% Co2 per mantenere il pH a 7,4 durante tutto l'esperimento. Una relazione di lunghezza/tensione passiva è stata stabilita mediante stiramento incrementale dei segmenti dell'arteria fino a quando è stata ottenuta la circonferenza interna corrispondente a 100 mmHg di pressione transmurale (IC100). Dopo ogni tratto (frecce blu), 115 mM KCl è stato applicato per stimolare le contrazioni (frecce verdi). Le curve di lunghezza/tensione attive (rosse) sono state tracciate estraendo i dati della forza attiva (sottraendo la forza passiva ad ogni tratto dalla forza attivata da KCl) sull'asse Y e poi un grafico è stato creato manualmente con i valori IC calcolati dal micrometro dati sull'asse X. Un valore IC che giace all'interno del plateau di picco è IC1 (linee rosse tratteggiate). Il fattore di normalizzazione k è stato calcolato come rapporti IC1/IC100, che potevano quindi essere applicati a campioni dello stesso tipo di imbarcazione nell'esperimento successivo.
Presentazione e calcolo delle curve di concentrazione-risposta
La maggior parte delle curve di concentrazione-risposta vengono eseguite in modo cumulativo. Una bassa concentrazione dell'agonista viene aggiunta al bagno (preferibilmente iniziando con una concentrazione al di sotto della soglia per la risposta). Dopo aver permesso un tempo sufficiente per una possibile risposta (3-5 min), viene aggiunta la concentrazione successiva. Quando si osserva una risposta, è consentito raggiungere un altopiano prima che venga ottenuta la successiva risposta massima. Gli incrementi di Half-log (media 3,16 volte) nella concentrazione di fenilfrina sono applicati qui per studiare le contrazioni indotte dall'agonista (Figura 3 e Figura 4).
Nella maggior parte dei casi, le curve di contrazione-risposta non sono espresse come valori grezzi di tensione/forza, ma come percentuale della risposta di riferimento al KCl ottenuta nel punto ottimale della curva di lunghezza/tensione del singolo segmento dei vasi sanguigni. Questo si adatta per la variabilità delle dimensioni o del contenuto muscolare liscio del vaso sanguigno e corregge i cambiamenti di rimodellamento dovuti all'invecchiamento o alla patologia. Qui, le contrazioni massime indotte da 115 mM di KCl sono ottenute all'inizio dell'esperimento e utilizzate per il calcolo delle contrazioni stimolate da fenilfrina delle arterie mesenteriche con o senza PVAT, in assenza o presenza di L-NAME (Figura 3 e Figura 4).
Per studiare gli agonisti che producono rilassamento, i vasi sono solitamente contratti a un livello uniforme — circa 50-80% della risposta contrattile massima di quel tessuto. Poiché le risposte alle contrazioni indotte da fenilfrina sono diverse tra i gruppi sperimentali, il presente protocollo utilizza U46619 per stimolare le contrazioni stabili prima di applicare le concentrazioni cumulative di acetilcolina. Il rilassamento muscolare liscio è espresso come percentuale della contrazione iniziale indotta da U46619 (Figura 5).
Le curve di concentrazione-risposta possono essere confrontate con la presenza di uno spostamento verso sinistra o verso destra (ad esempio, tra una curva di controllo e una ottenuta in presenza di un antagonista) determinando le concentrazioni che producono risposte uguali, ad esempio il 30% o il 50% del massimo. Questi sono definiti rispettivamente EC30 e EC50(Figura 3B). Il confronto statistico dei valori medi CE50 deve essere eseguito sul logaritmo dei loro valori. La depressione delle curve viene esaminata confrontando le rispettive risposte massime (Emax) (Figura 3B). Negli esempi mostrati, le contrazioni indotte da fenilfrina nelle arterie mesenteriche sono state migliorate da L-NAME e le curve di concentrazione-risposta hanno mostrato uno spostamento verso sinistra, nonché un'elevazione nelle contrazioni massime (Figura 4B). I rilassanti indotti dall'acetilcolina nelle arterie mesenteriche sono stati inibiti da L-NAME, e la curva di concentrazione-risposta ha mostrato uno spostamento verso destra e la riduzione del rilassamento massimo (Figura 5b).
Le risposte vascolari a vari agenti farmacologici possono essere calcolate come l'area-sotto-la-contrazione-curva (AUCC) per le contrazioni e area-sopra-il-rilassamento-curva (AARC) per le rilassazioni, rispettivamente, utilizzando la regressione logistica non lineare analisi per confronto10 (Figura 3C, Figura 4c e Figura 5C). L'effetto di L-NAME può essere confrontato con i valori dell'AUCC/AARC per determinare la biodisponibilità NO (Figura 6). Il rilascio basale e stimolato di NO nelle arterie mesenteriche con o senza PVAT può essere espresso come le differenze nelle curve di concentrazione-risposta della contrazione stimolata da fenilfrina (DAUCC) e rilassamento indotto dall'acetilcolina (DAARC), rispettivamente, in presenza o assenza di L-NAME (Figura 6a e Figura 6b). Nell'esempio mostrato, la presenza di PVAT ha ridotto la biodisponibilità di NO nelle arterie mesenteriche raccolte da topi alimentati con dieta ad alto contenuto di grassi (Figura 6C).
Figura 1: diagramma schematico della struttura della parete delle arterie. Le cellule endoteliali nella tunica intima mediano il rilassamento/la contrazione dell'endotelio-dipendente del muscolo liscio vascolare, mentre i segnali rilasciati dal tessuto adiposo perivascolare modulano i colloqui incrociati tra diversi strati della parete arteriosa . Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2: tracce rappresentative che illustrano un esperimento per determinare le tensioni iniziali ottimali per le arterie mesenteriche del topo. I segmenti dei vasi sanguigni sono stati preparati da arterie mesenteriche raccolte dai topi di 16 settimane di età alimentati con Chow standard (A) o dieta ad alto contenuto di grassi (B). Dopo il montaggio, le curve di lunghezza/tensione passiva e attiva sono state ottenute mediante stretching graduale e stimolazione sequenziale con 115 mM KCl (pannelli a sinistra). La contrazione attiva generata con ogni stimolazione dovrebbe aumentare quando la nave viene progressivamente allungata, fino a raggiungere un altopiano alla lunghezza ottimale. Ulteriore allungamento porterà ad una diminuzione della contrazione attiva. I IC100 e IC1 sono stati determinati tracciando le curve di lunghezza/tensioni attive e passive, rispettivamente (pannelli a destra). Si noti che la curva di lunghezza/tensione passiva è stata generata dal modulo di normalizzazione dopo l'inserimento manuale dei valori del micrometro, mentre le curve di lunghezza/tensioni attive tracciate manualmente dopo il calcolo della tensione e dei valori IC in ogni fase del KCl stimolazione. I rapporti IC1/IC100 sono stati calcolati come fattore k di normalizzazione (pannelli a destra). ). Si noti inoltre che solo gli ultimi quattro punti della curva di lunghezza/tensione attiva sono stati mostrati nelle figure nel pannello (B). STC: l'arteria del mouse standard Chow alimentato; HFD: dieta ad alto contenuto di grassi alimentato arteria del mouse. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3: registrazioni in uscita delle risposte vasocostrittori a fenilfrina nelle arterie mesenteriche con o senza la PVAT circostante. Gli studi di contrattilità vengono eseguiti su preparazioni di arterie mesenteriche da topi transgenici adipo-SIRT1 di 16 settimane di età, in cui il SIRT1 umano è sovraespresso selettivamente nei tessuti adiposi29. Le concentrazioni cumulative di fenilfrina sono state applicate per stimolare le contrazioni delle arterie mesenteriche senza (-PVAT) o con (+ PVAT), (A). Le risposte contrattili sono state registrate e calcolate in percentuale di 115 mM di contrazione massima indotta da KCl (B). Le curve di contrazione dell'area (AUCC) sono state tracciate per il confronto (C). Si noti che PVAT da adipo-SIRT1 topi ha suscitato un effetto anti-contrattile sulla risposta alla fenilfrina. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4: registrazioni in uscita delle risposte vasocostrittori a fenilfrina nelle arterie mesenteriche con o senza il PVAT circostante, e in assenza o presenza di L-Name. Le arterie mesenteriche sono state raccolte da topi di tipo selvaggio di 16 settimane alimentati con una dieta ad alto contenuto di grassi. Trenta minuti dopo l'aggiunta di 10-4 M L-nome o controllo del veicolo, le concentrazioni cumulative di fenilfrina sono state applicate per stimolare le contrazioni delle arterie mesenteriche (a). Le risposte contrattili sono state registrate e calcolate in percentuale di 115 mM di contrazione massima indotta da KCl (B). Le curve di contrazione dell'area (AUCC) sono state tracciate per il confronto (C). Si noti che PVAT da topi obesi dietetico non ha suscitato effetti anti-contrattile sulla risposta alla fenilfrina. – PVAT: anelli arteriosi preparati senza PVAT; + PVAT: anelli arteriosi preparati con il PVAT circostante; -L-NAME: anelli arteriosi non incubati con L-NAME; + L-NAME: anelli arteriosi incubati con L-NAME. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 5: registrazioni in uscita delle risposte vasodilatatori all'acetilcolina nelle arterie mesenteriche con o senza la PVAT circostante, e in assenza o presenza di L-Name. Le arterie mesenteriche sono state raccolte da topi di 16 settimane alimentati con una dieta ad alto contenuto di grassi. A 30 minuti dopo l'aggiunta di 10-4 M L-Name o controllo del veicolo, i segmenti dei vasi sanguigni con o senza pvat sono pre-contrattati con U46619 (1-3 x 10-8 m; Tabella dei materiali), un agonista del recettore a2 del trombossano, per indurre contrazioni muscolari lisce stabili e sostenute. Concentrazioni cumulative di acetilcolina sono stati poi applicati per stimolare il rilassamento delle arterie mesenteriche con o senza la circostante PVAT (A). Le risposte di rilassamento sono state registrate e calcolate come percentuale della contrazione indotta da U46619 (B). L'area-sopra-le curve di rilassamento (AARC) sono state tracciate per il confronto (C). Si noti che solo il segmento arterioso con PVAT circostante è mostrato nel pannello A. – PVAT: anelli arteriosi preparati senza PVAT; + PVAT: anelli arteriosi preparati con il PVAT circostante; -L-NAME: anelli arteriosi non incubati con L-NAME; + L-NAME: anelli arteriosi incubati con L-NAME. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 6: illustrazione della procedura per calcolare la biodisponibilità. L'area-under-the-contrazione-curve (AUCC) e l'area-sopra-il-rilassamento-curve (AARC) sono stati calcolati sulla base delle risposte alle concentrazioni cumulative di fenilfrina (A) e acetilcolina (B), rispettivamente. Le differenze tra i preparati pretrattati senza e con L-NAME sono state definite come ∆ AUCC (a) e ∆ AARC (B) per rappresentare il contributo non basale e non hanno stimolato il rilascio, rispettivamente. Di conseguenza, il ∆ AUCC (calcolato dalla Figura 4c), ∆ AARC (calcolato dalla Figura 5C), e la somma di entrambi (biodisponibilità totale No) sono stati presentati per il confronto della biodisponibilità no nelle arterie mesenteriche senza e con l'ambiente circostante PVAT (C). – PVAT: anelli arteriosi preparati senza PVAT; + PVAT: anelli arteriosi preparati con il PVAT circostante; -L-NAME: anelli arteriosi non incubati con L-NAME; + L-NAME: anelli arteriosi incubati con L-NAME. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oltre alle cellule endoteliali, i segnali derivati da PVAT giocano un ruolo importante nella regolazione della reattività del tono muscolare liscio30. Sana pvat rilascia No e anti-infiammatori adiponectina per esercitare un effetto anti-contrattile sulle arterie, che si perde in condizioni patologiche come l'obesità e la sindrome metabolica31,32. Negli Stati di malattia, la pvat contribuisce allo sviluppo della disfunzione endoteliale e di altre anomalie cardiovascolari33,34. L'espressione e la funzione di Enos anormale sono state segnalate in pvat delle arterie da animali obesi35,36. Poiché entrambe le disfunzioni endoteliali e pvat contribuiscono allo sviluppo di anomalie cardiovascolari e metaboliche23,37, quando si eseguono esperimenti vascolari ex vivo, il loro ruolo deve essere considerato includendo in o rimuoverli dai preparati.
Il sistema Andersen Wire fornisce una comoda piattaforma per dissezionare i segnali vasoattivi rilasciati da pvat utilizzando diverse sonde farmacologiche10,38. Tuttavia, le composizioni in PVAT di diversi tipi di arterie, o le stesse arterie da animali di diverso background genetico, non sono uguali39. Pertanto, i risultati della Miografia dei fili che coinvolgono il PVAT non devono essere confrontati tra i diversi tipi di arterie o lo stesso tipo di arterie da topi di diversi ceppi. L'età e gli Stati di malattia di base influenzano anche le composizioni cellulari in PVAT. Qui, i topi dello stesso background genetico, ma con diverse modificazioni genetiche nel loro tessuto adiposo sono stati utilizzati per confrontare l'attività vasomodulante di PVAT.
Come principale fonte di resistenza al flusso sanguigno, le arterie mesenteriche sono scelte per il presente studio. La tensione a riposo determina la quantità di reattività vasomotore40. La tensione iniziale ottimale del vaso sanguigno è influenzata dal tipo di arteria, età, dieta, trattamento e background genetico degli animali, quindi deve essere determinata individualmente prima di esaminare le curve di rilassamento/contrazione-risposta. Per la dimostrazione attuale, le arterie mesenteriche superiori sono state raccolte da topi di 16 settimane, alimentati con Chow standard o con una dieta ad alto contenuto di grassi a partire dall'età di quattro settimane. Il presente protocollo sottolinea la creazione di impostazioni ottimali per la massima produzione di forza attiva dei segmenti arteriosi prima di valutare le risposte farmacologiche. Le relazioni di lunghezza/tensione sia passive che attive sono studiate per le arterie mesenteriche raccolte da modelli murini interni. È stato stabilito un fattore k di normalizzazione di 1 per i preparati degli animali di 16 settimane, che è diverso dal valore predefinito di 0,9 o quelli utilizzati dalle precedenti pubblicazioni41. È necessaria cautela quando si confrontano i rapporti di normalizzazione nella letteratura a causa di possibili differenze nella tecnica, nella composizione del buffer e nei modelli di strumenti, ecc. In particolare, età, dieta e altre condizioni patofisiologiche influenzano la tensione passiva e attiva, nonché le caratteristiche farmacodinamiche delle arterie42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalle sovvenzioni del Research Grant Council di Hong Kong [17124718 e 17121714], dal fondo di ricerca sanitaria e medica di Hong Kong [13142651 e 13142641], dal fondo di ricerca collaborativa di Hong Kong [C7055-14G] e dal National Basic Programma di ricerca della Cina [973 programma 2015CB553603].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 | Stock concentration: 10-1 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester) | Sigma-Aldrich | N5751 | Stock concentration: 3 x 10-2 M Working concentration: 10-4 M |
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 | Stock concentration: 10-2 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α) | Enzo | BML-PG023-0001 | Stock concentration: 10-5 M Working concentration: 1-3 x 10-8 M |
| Multiwire myograph | Danish MyoTechnology (DMT) | 620M | |
| PowerLab 4/26 | ADInstruments | ML848 | |
| Labchart7 | ADInstruments | - | |
| Adipo-SIRT1 wild type mice | Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong | CULATR NO.: 4085-16 | |
| Silicon-coated Petri dishes | Danish MyoTechnology (DMT) | ||
| Tungsten wires | Danish MyoTechnology (DMT) | 300331 | |
| Surgical tools |
References
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
- Furchgott, R. F., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. The FASEB Journal. 3 (9), 2007-2018 (1989).
- Feletou, M., Kohler, R., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived vasoactive factors and hypertension: possible roles in pathogenesis and as treatment targets. Current Hypertension Reports. 12 (4), 267-275 (2010).
- Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction: the first step toward coronary arteriosclerosis. Circulation Journal. 73 (4), 595-601 (2009).
- Feletou, M., Huang, Y., Vanhoutte, P. M. Endothelium-mediated control of vascular tone: COX-1 and COX-2 products. British Journal of Pharmacology. 164 (3), 894-912 (2011).
- Harrison, D. G. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 100 (9), 2153 (1997).
- Vanhoutte, P. M., Shimokawa, H., Tang, E. H., Feletou, M. Endothelial dysfunction and vascular disease. Acta physiologica. 196 (2), 193-222 (2009).
- Klöß, S., Bouloumié, A., Mülsch, A. Aging and chronic hypertension decrease expression of rat aortic soluble guanylyl cyclase. Hypertension. 35 (1), 43-47 (2000).
- Csiszar, A., et al. Aging-induced phenotypic changes and oxidative stress impair coronary arteriolar function. Circulation Research. 90 (11), 1159-1166 (2002).
- Guo, Y., et al. Endothelial SIRT1 prevents age-induced impairment of vasodilator responses by enhancing the expression and activity of soluble guanylyl cyclase in smooth muscle cells. Cardiovascular Research. , (2018).
- Auch-Schwelk, W., Katusic, Z. S., Vanhoutte, P. M. Nitric oxide inactivates endothelium-derived contracting factor in the rat aorta. Hypertension. 19 (5), 442-445 (1992).
- Tang, E. H., Feletou, M., Huang, Y., Man, R. Y., Vanhoutte, P. M. Acetylcholine and sodium nitroprusside cause long-term inhibition of EDCF-mediated contractions. American Journal of Physiology - Heart and Circulation Physiology. 289 (6), H2434-H2440 (2005).
- Ghiadoni, L., et al. Endothelial function and common carotid artery wall thickening in patients with essential hypertension. Hypertension. 32 (1), 25-32 (1998).
- Xu, X., et al. Age-related Impairment of Vascular Structure and Functions. Aging and Disease. 8 (5), 590-610 (2017).
- Tabit, C. E., Chung, W. B., Hamburg, N. M., Vita, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus: Molecular mechanisms and clinical implications. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 11 (1), 61-74 (2010).
- Tanaka, K., Sata, M. Roles of perivascular adipose tissue in the pathogenesis of atherosclerosis. Frontiers in Physiology. 9, 3 (2018).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. The FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
- Gálvez-Prieto, B., et al. A reduction in the amount and anti-contractile effect of periadventitial mesenteric adipose tissue precedes hypertension development in spontaneously hypertensive rats. Hypertension research. 31 (7), 1415 (2008).
- Gao, Y. J., Lu, C., Su, L. Y., Sharma, A., Lee, R. Modulation of vascular function by perivascular adipose tissue: the role of endothelium and hydrogen peroxide. British Journal of Pharmacology. 151 (3), 323-331 (2007).
- Gao, Y. -J., et al. Perivascular adipose tissue promotes vasoconstriction: the role of superoxide anion. Cardiovascular Research. 71 (2), 363-373 (2006).
- Szasz, T., Webb, R. C. Perivascular adipose tissue: more than just structural support. Clinical Science (London). 122 (1), 1-12 (2012).
- Ramirez, J. G., O'Malley, E. J., Ho, W. S. V. Pro-contractile effects of perivascular fat in health and disease. Brish Journal of Pharmacology. 174 (20), 3482-3495 (2017).
- Hajer, G. R., van Haeften, T. W., Visseren, F. L. Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases. European Heart Journal. 29 (24), 2959-2971 (2008).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
- del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods in Molecular Biology. 1339, 255-276 (2015).
- Dobrin, P. B. Influence of initial length on length-tension relationship of vascular smooth muscle. American Journal of Physiology. 225 (3), 664-670 (1973).
- Xu, C., et al. Calorie restriction prevents metabolic aging caused by abnormal SIRT1 function in adipose tissues. Diabetes. 64 (5), 1576-1590 (2015).
- Sheykhzade, M., Nyborg, N. C. Caliber dependent calcitonin gene-related peptide-induced relaxation in rat coronary arteries: effect of K+ on the tachyphylaxis. European Journal of Pharmacology. 351 (1), 53-59 (1998).
- Soltis, E. E., Cassis, L. A. Influence of perivascular adipose tissue on rat aortic smooth muscle responsiveness. Clinical and Experimental Hypertension A. 13 (2), 277-296 (1991).
- Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
- Fesus, G., et al. Adiponectin is a novel humoral vasodilator. Cardiovascular Research. 75 (4), 719-727 (2007).
- Greenstein, A. S., et al. Local inflammation and hypoxia abolish the protective anticontractile properties of perivascular fat in obese patients. Circulation. 119 (12), 1661-1670 (2009).
- Yudkin, J. S., Eringa, E., Stehouwer, C. D. "Vasocrine" signalling from perivascular fat: a mechanism linking insulin resistance to vascular disease. Lancet. 365 (9473), 1817-1820 (2005).
- Xia, N., et al. Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase in perivascular adipose tissue of diet-induced obese mice. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 36 (1), 78-85 (2016).
- Xia, N., Forstermann, U., Li, H. Effects of resveratrol on eNOS in the endothelium and the perivascular adipose tissue. Annals of the New York Academy of Sciences. 1403 (1), 132-141 (2017).
- Schinzari, F., Tesauro, M., Cardillo, C. Endothelial and perivascular adipose tissue abnormalities in obesity-related vascular dysfunction: novel targets for treatment. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 69 (6), 360-368 (2017).
- Liu, J. T., et al. Lipocalin-2 deficiency prevents endothelial dysfunction associated with dietary obesity: role of cytochrome P450 2C inhibition. British Journal of Pharmacology. 165 (2), 520-531 (2012).
- Martinez-Quinones, P., et al. Hypertension induced morphological and physiological changes in cells of the arterial wall. American Journal of Hypertension. 31 (10), 1067-1078 (2018).
- Outzen, E. M., et al. Translational value of mechanical and vasomotor properties of mouse isolated mesenteric resistance-sized arteries. Pharmacology Research and Perspectives. 3 (6), e00200 (2015).
- Sheykhzade, M., Simonsen, A. H., Boonen, H. C., Outzen, E. M., Nyborg, N. C. Effect of ageing on the passive and active tension and pharmacodynamic characteristics of rat coronary arteries: age-dependent increase in sensitivity to 5-HT and K+. Pharmacology. 90 (3-4), 160-168 (2012).
