Summary
우리는 신경 터미널에서 시 냅 스 소포 분포의 형태학 적 분석을 위한 고해상도 전자 현미경을 얻기 위해 신생아 쥐 뇌 조직을 처리 하는 절차를 설명 합니다. 이러한 방법으로 얻은 마이크로 그래프는 다양 한 세포 구성 요소와 그 차원 구조적 관계의 형태를 연구 하는 데에도 사용 될 수 있습니다.
Abstract
우리의 실험실 및 많은 다른 사람 시 냅 스 소포의 형태와 공간 조직을 연구 하는 전송 전자 현미경의 높은 해결 능력을 착취 했다. 시 냅 스 소포 분포의 정량적 분석에 필요한 형태학 적 디테일의 정도를 얻을 수 있는 고품질 전자 현미경을 얻기 위해서는 최적의 시 편 준비가 중요 하다. 화학 고정은 표본 준비 과정의 첫 번째 단계 이며 미세한 미세 구조를 유지 하는 데 가장 중요 합니다. 알데하이드 포 름 알 데히드 용액을 사용한 혈관 고정, 오 스미 눔과 함께 구조 단면 시 편을 처리 한 후, 분자의 최대 수, 특히 단백질과 지질을 안정화 하 고 우수한 보존 효과를 냅니다. 구조입니다. 조직은 반대 염색, 순차 탈수 및 수 지 임베딩으로 처리 됩니다. Uranyl 아세테이트를 사용한 En 블록 염색 (즉, 수 지 매 립 전에 진동-절편 된 조직의 염색)은 내 인 성 대비를 강화 하 고 표본 처리 시 추출에 대 한 세포 성분을 안정화 시킵니다. 우 라 아세테이트를 초박형 단면에 후 얼룩으로 적용 하 여 콘트라스트를 더욱 높일 수 있습니다. 우 라 닐 아세테이트 처리 후에 리드 구 연산 염을 가진 극 박 단면의 이중 염색은 또한 이미지 해상도를 향상 시키며, 우 라 닐 아세테이트에 대 한 리드의 선택적 결합을 통해 핵 산 함유 구조의 전자 불투명도를 심화 시킨다. 투과 전자 현미경은 시 냅 스 소포의 형태학 적 세부 분석 및 터미널 bouton의 크기 및 공간 조직의 정량화를 위한 강력한 도구입니다. 그러나, 그것은 고정 조직을 사용 하기 때문에, 전송 전자 현미경은 살아있는 또는 발전 프로세스에 관하여 간접적인 정보를 제공할 수 있습니다. 따라서, 주요 목적이 시 냅 스 소포 매매 및 해충 증의 동적인 또는 기능적인 양상을 공부 하는 때 그밖 기술은 고려 되어야 합니다.
Introduction
우리는 신경 말단1,2에서 시 냅 스 소포 공간 분포의 심층 형태학 적 분석을 위한 고품질 전자 현미경을 얻기 위해 신생 쥐 뇌 조직의 준비를 위한 방법을 설명 합니다. 이러한 방법에 따라 시 편을 처리 하 여 얻을 수 있는 고 콘트라스트 마이크로 그래프는 또한 다 수의 세포 성분 및 그들의 치수 구조 관계3,4의 상세한 형태학을 연구 하는데 사용 될 수 있다.
투과 전자 현미경 (TEM)은 세포 소기관 및 다른 세포 구조의 형태를 정량적으로 연구 하는 강력한 도구입니다. 이 10 년의 기준으로, 고압 동결에의 한 저온 고정을 제외 하 고는 면역 태그 추가 없이 지질 막과 소기관의 동일한 분해능을 제공할 수 있는 다른 조사 방법이 없습니다. 그러나, 동결 대체 기술은 널리 사용 되지 않고, 일반적으로 고가의 장비 및 긴 준비 시간을 필요로 한다.
TEM의 높은 분해 력을 이용 하기 위해서는 최적의 시 편 준비가 가장 중요 합니다. 표본 준비의 주요 목표는 살아있는 상태에서 최소한의 변경을 가진 조직 구조를 보전 하 고, 표본 대조를 강화 하 고, 처리 도중 세포 성분의 추출에 대하여 조직을 안정 시키고 전자에 노출 하기 위한 것입니다 빔. TEM 조직 준비를 위한 수많은 프로토콜이 수년간 여러 실험실에 의해 도입 되 고 완성 되었습니다. 그들 중 상당수는 시 냅 스 소포5,6,7,8,11의 최적의 시각화를 위한 방법에 초점을 맞추고 있다. 현재 사용 중인 여러 가지 잘 확립 된 금 표준 방법 중에서, 우리는 최적의 조직 구조를 보존 하는 것을 목표로 화학 고정, 사후 고정, en 블록 염색, 순차적 탈수, 수 지 매 립 및 사후 염색을 위한 절차를 선택 했습니다. 뛰어난 이미지 콘트라스트를 실현 합니다. 주의, 미세 울트라 구조의 보존 신생아 쥐 뇌 조직으로 작업 할 때 특히 어려울 수 있습니다. 사실, 매우 젊은 동물의 중추 신 경계는 성인 뇌 보다 더 높은 수 분 함량, 세포 외 공간의 눈에 띄는 확대, 셀 간 패자 연결을 특징으로 합니다12. 이것은 신생 쥐 두뇌 조직은 오 스몰 농도에 있는 변화에 깊이 과민 하 게 하 고, 다른 탄력성12의 순차 해결책을 통해 처리 될 때 정교 하 게 아 티의 수축 및/또는 팽 윤에 경향이 있습니다. 따라서, 우리의 방법은 쥐 신생 두뇌의 그것에 가능한 가까운 오 스몰 농도의 표본 처리를 위한 해결책을 채택 했습니다. 우리의 목표는 신경 말단에서 시 냅 스 소포 공간 분포의 정량적 평가를 위한 고품질, 고 분해능 전자 현미경 이미지를 얻는 것 이었습니다. 구체적으로, 우리는 신경 말단 내 소포 수, 시 냅 스 전 혈장 막 으로부터의 시 냅 스 소포의 거리를 측정 하기 위해 모색 하 고 시 냅 스 전 막에 도킹 된 소 낭의 수 및 간 소포 거리1.
만족 스러운 화학 고정은 시 냅 스 소포 형태학과 공간 조직을 연구 하는 데 필요한 형태학 적 세부 사항을 제공 할 수 있는 고품질 전자 현미경을 얻기 위한 전제 조건입니다. 고정의 여러 모드가 존재 하지만, 혈관 관류에의 한 뇌 조직의 고정은 다른 방법 보다 확실히 우수 하다. 혈관 관류를 통한 고정은 전신 순환의 체포 직후에 시작 되기 때문에 뇌 조직의 탈 산소 및 고정과 단백질의 가교 사이의 간격을 단축 하 여 세포에서 최소 변형을 초래 합니다. 구조. 더욱이, 세포 외 및 세포 구획12,14에 대 한 혈관 내에서의 급속 한 고착의 흐름 때문에 빠르고 균일 한 침투를 수행 한다. 알데하이드로 1 차 고정 후 2 차 고정 (사후 고정)을 사용 하 여 미세 구조15,16,17의 우수한 보존을 산출 합니다. 알데하이드 및 파라 포름알데히드의 혼합물은 조직 (12) 내로의 보다 빠른 침투의 추가적인 이점을 가진다.
생물학적 조직은 수 지 매트릭스의 지지 없이 얇은 부분으로 절단 될 정도로 강성이 충분 하지 않기 때문에, 얇은 절편 전에 매 질에 포함 시켜야 합니다. 물-비 혼 화성 에폭시 수 지는 TEM에 있는 매 립 매체로 일반적으로 사용 됩니다. 이 유형의 매트릭스를 사용 하는 경우, 모든 시 편의 무료 물은 수 지 침투 전에 유기 용 매로 교체 해야 합니다. 물은 상승 된 농도의 에탄올 및/또는 아세톤 (12)의 일련의 용액을 통해 시 편을 통과 시 킴으로써 제거 된다. 이 프로토콜에서 표본은 플 렉 시 블 한 aclar 시트 사이에 먼저 평평 하 게 삽입 된 다음 캡슐에 포함 됩니다. 최종 결과는 원통형 수 지 블록의 끝에 위치한 조직으로, 마이크로 톰 절편 중에 발생 하는 진동의 영향을 최소한으로 받는 이상적인 형상을가지고 있습니다.
내 인 성 조직 대비를 향상 시키기 위해 중 금속으로 염색 하는 것은 표본 준비의 또 다른 중요 한 측면입니다. TEM에서의 이미지 콘트라스트는 조직의 원자에의 한 전자 산란에 기인한 것 이다. 그러나, 생물학적 물질은 주로 낮은 원자 무게 분자 (즉, 탄소, 수소, 산소 및 질소)로 구성 됩니다. 따라서, 충분 한 산란 대비의 생성은 조직의 세포 성분에 높은 원자 무게 원자의 혼 입이 필요 하다. 이는 중 금속12,18,19로 시 편의 얼룩을 통해 달성 된다. 오 스미 늄은 지질에 강하게 결합 하는 우라늄 및 납, 전자 얼룩으로 사용 되는 가장 일반적인 중 금속입니다.
오 스미 (원자 번호 76)는 현존 하는 가장 흔한 금속 중 하나 이다. TEM에서 주요 역할은 신뢰할 수 있는 픽스 쳐12이지만, 그것은 모두 고착과 얼룩입니다. 사용 중인 다양 한 고정 프로토콜 중에서 알데하이드가 뒤 따른 이중 고정 방법은 표본 준비 중에 세포 성분의 추출을 줄이는 데 가장 효과적입니다. 이러한 두 개의 고정 제가 분자의 상이한 종류의 최대 수를 안정화 시키는데 사용 되 고, 특히 단백질과 지질은, 조직 초고 구조 12,14,15의 우수한 보존 결과 16 , 17.
우라늄 (원자 번호 92)은 전자 얼룩으로 사용 되는 가장 무거운 금속으로, 가장 전형적으로는 우르 닐 아세테이트의 형태 이다. 오 스미와 마찬가지로, 그것은 얼룩과 고정의 역할을 하지만 TEM에서의 주된 역할은 얼룩20,21입니다. 핵 산-함유 및 막 모양 궁 구조는 명백 하 게 알데하이드-고정 조직22,23의 우르 라 염으로 우선적으로 염색 된다. 우 라 닐 아세테이트를 사용한 조직의 치료 및 탈수 전에 막 모양 궁 및 핵 산 함유 구조물의 안정화를 초래 하 고, 콘트라스트를 향상 시키고, 일부 구조적 세부 사항을 식별 하 여 만12,24,25의 오 스미로 얼룩진 표본에서 쉽게 검출할 수 있습니다. 요로 닐 아세테이트는 오 스 설 하24시 지질 막에 증 착 되어 있는 환 원 질과 결합 하 여 미세 구조를 안정화 시킬 수 있다고 생각 된다. Uranyl 아세테이트를 포함 하기 전에 적용 하 고 얇은 섹션12에서 얼룩을 발생 시키면 최대 콘트라스트가 달성 됩니다.
납 (원자 번호 82)은 TEM에 사용 되는 가장 흔한 얼룩 이며 주로 얇은 단면의 후 염색에 채택 됩니다. 납 염은 높은 전자 불투명도를 가지 며 멤브레인, 핵 및 세포질 단백질, 핵 산 및 글 리 코겐26,27을 포함 한 광범위 한 세포 구조에 대 한 친화도를 보여줍니다. 이중 염색 방법이 채용 되는 경우 (즉, 우르 라 아세테이트로 염색 하 여 납으로 처리 한 후), 후자는 우르 라 아세테이트 염색의 현상 액으로 작용 한다. 예를 들면, 알데하이드로 결정 된 염색 질의 납 후 염색 질은 3 개의28,29,30,31의 인자에 의해 우 라 닐 아세테이트 흡수를 증가32. 납은 또한 오 스미 움과 같은 그밖 금속에 의해 부여 된 얼룩을 강화 합니다. 인지질의 존재 하에의 극성 기에 부착 하 여 고정 된 조직-오 스미 움의 막으로의 납 염의 얼룩을 감소 시키는 것으로 생각 된다33. Uranyl 아세테이트와 납 모두로 염색의 잠재적인 단점은 특히 장기간 지속 되는 경우, 많은 다른 구조적 요소가 동등 하 게 그리고 비 특이 적으로 염색 되 고, 따라서 서로 쉽게 구별 되지 않을 수 있다는 것입니다12 .
최근의 광학 슈퍼 해상도 사진 활성화 국 소화 현미경과 같은 대체 광원의 도입은 현저 하 게 개선 된 광 현미경 해상도34을 갖는다. 그러나, 가벼운 현미경 검사 법은 개별적인 라벨링 한 단백질 또는 효소를 구상 하기 위하여 조직학 및 면역 세포 화학 방법에 의존 하기 때문에, 한 번에 모든 구조상 요소를 표시 하는 TEM의 힘은의 깊이 있는 연구를 위해 타의 추종을 불허 남아 있습니다 조직 구조의 형태학 및 차원 관계. 특히 시 냅 시스 신경 boutons 시 냅 스 소포 분포의 형태학 적 분석을 수행 하는 데 필요한 형태학 적 세부 사항을 제공할 수 있는 다른 기술은 없습니다. 그럼에도 불구 하 고, 전자 현미경은 유기 체가 죽으면 조직의 구조를 포착 하는 것이 중요 합니다, 따라서 그들은 전 시 냅 스 소포 매매 및 exocytosis의 역학에 관하여 정보를 제공할 수 없습니다. 따라서, FM 염료-라이브 이미징 및 패치 클램프 전기 생리학 등의 다른 도구는 주요 목적이 시 냅 스 소포 매매 및 배설의 동적 및/또는 기능적 측면을 연구 하는 것입니다 때 고려해 야 합니다.
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Protocol
모든 연구는 버지니아 대학에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 (샬러츠빌, 버지니아) 건강 지침의 국가 학회에 따라 실시.
1. 혈관 관류에의 한 고정
참고: 랫 트 뇌 혈관 관류를 위한 방법에 대 한 일반적인 설명은이 학술지 (13 )에서 이미 상세히 기술 되어 왔으며이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 그러나, 다음의 단계는 시 냅 스 전 터미널에서의 지 냅 스 소포 분포의 정량적 분석을 위한 고품질 전자 현미경을 얻기 위해 신생 쥐 뇌 조직의 제조에 특이 적 이다.
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4% 파라 포름알데히드를 준비 하십시오
- 흄 후드 아래에 있는 교 반 플레이트에 2l 유리 비 커에 0.1 M 인산 완충 (PB) 800 mL를 넣습니다. 완충 액을 끓이는 것 없이 약 60 ° c로가 열 합니다.
- 파라 포름알데히드 분말 40 g을 추가 합니다. 지속적으로 저 어 주세요
- PH를 측정 하는 동안 용액이 지워질 때까지 10 N NaOH의 작은 방울을 추가 하십시오. 최종 pH는 7.2-7.4 여야 합니다.
- 나머지 0.1를 1l의 최종 볼륨에 추가 합니다. 0.45 μ m 멤브레인으로 식힌 후 필터링 하 여 밤새 4°c에서 보관 하십시오.
참고: 관류 전날 신선한 파라 포 름 알 데히드를 준비 하십시오.
주의: 알데하이드 증기를 흡입 하면 비 강 증상과 기도 자극이 발생할 수 있습니다. 피부에 접촉 하면 피부염이 발생 합니다. 알 데히드는 장갑, 보호 가운 및 안전 고글을 착용 하는 동안 흄 후드에서 처리 해야 합니다.
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Tyrode 솔루션 준비
- 1 리터의 증류수를 유리 비 커에 넣고 교 반 플레이트에 넣습니다. 0.15의 염화 나트륨 (8g), cacl2(0.006 0.1), na2po4(1g(0.055 그램) 및 비 커내에 1 그램의 덱 스트로 스를 첨가 한다.
- 지속적으로 저 어 서 pH를 측정 하십시오. PH를 7.2에서 7.4 사이로 유지 하십시오.
참고: Tyrode 솔루션은 상업적으로도 이용 가능 하다.
- 4% 파라 포름알데히드를 알데하이드와 혼합 하 여 최종 농도 2%로 섞어 줍니다. 40 mL의 전자 현미경-등급 50% 알데하이드에 1l의 4% 파라 포름알데히드를 추가 합니다. 교 반 판에 잘 섞어 주세요
참고: 신생아 쥐의 몸을 관류 하기 위해 파라 포 름 알데하이드 고정 용액의 약 100 mL이 필요 합니다. 따라서 최소 10 마리의 신생아 쥐를 1 L의 고정과 함께 사용할 수 있습니다. 파라 포름알데히드와 알데하이드를 사용 직전까지 혼합 하지 마십시오. 관류 전에 모든 용액을 실 온에 가져온다. - 좌 심 실에 대 한 접근이 얻어 졌으 면 (전체 동물 관류 프로토콜13참조), 120 mmHg의 관류 압력에서 30 초 동안 Tyrode 용액으로 혈관 시스템을 세척 한다.
참고: 관류의 성공은 혈관 침대에서 혈액의 완전 한 배제에 부분적으로 달려 있습니다. - 10 분 동안 동일한 압력에서 파라 포 름 알데하이드 용액으로 씻어 내십시오.
참고: 일정 한 관류 압력의 유지는 유물의 도입을 피하기 위해 필수적입니다. 또한, 관류 물의 온도는 혈관 수 축을 피하기 위해 쥐의 체온 이하로 되어서는 안됩니다. - 두개골에서 고정 된 뇌를 제거 하 고 신선한 파라 포 름 알 데히드-알데하이드에서 밤새 4 ° c에서 정착 시킵니다.
참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
2. 뇌 슬 라이 싱
- 4% 아가 로스에 고정 된 뇌를 삽입 하 고 진동 단계에 뇌 아가 로스 블록을 붙입니다.
참고: 다른 실험실은 한 천 지원을 하지 않고 진동에 안정적인 블록을 달성 하 여 좋은 품질의 섹션을 얻었다 - 섹션 50 μ m 두께의 슬라이스. 마이크로 톰을 저주파 수와 속도를 설정 합니다.
참고: 섹션은 0.1에서 몇 년 동안 4°c에서 0.05% 나트륨 아 지 드으로 저장 될 수 있다. - 0.1 M PB의 섹션을 페 트리 접시에 놓고, 해 부 현미경의 섹션을 검사 하 고 포함 시 편을 선택 하십시오.
참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
3. 헹 굼
참고: 알 데히드로 고정 한 후에는 시 편을 헹 구는 것이 중요 하 고, 잔류 고정 제가 오 스미 침전 물을 생성 할 수 있기 때문에, 오 스미와의 사후 정착 전에
- 캡이 있는 짧고 넓은 입 유리 바이 알에 0.1 피 펫을 넣습니다. 각 유리병 당 하나의 표본을 배치 합니다. 건조 하지 않도록 시 편을 완전히 덮습니다.
참고: 고정, 탈수 및 침투의 모든 솔루션 변경을 통해이 단계에서 동일한 유리병에 표본을 유지, 그들은 편평한 포함에 대 한 준비가 될 때까지. - 시 편을 0.1 M PB에서 3 분 x2로 헹 구 고, 마이크로 피 펫으로 PB를 제거 합니다.
참고: 신생아 쥐의 뇌는 오 스몰 농도12,35,36,37의 변화에 깊이 민감 하기 때문에 고정 혼합물에서 사용 되는 것과 같은 차량에서 세척을 수행 합니다.
4. 사후 고정
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오 스미 움 테 트로 시더 (소4)의 준비
참고: 이 저자의 연구실은 오 소 4%를 유리 앰 플의 수 용액에 공급 하 고 있습니다 (H2o 의 5 mL 4%). 다른 랩은 오 소4 결정을 성공적으로 사용 했다. 그러나, 몇 시간 자동차에 오 소4 결정을 분해 할 필요가 있다.- 오 소4%의 5 mL (1 개의 앰 플)을 넣고 갈색 유리병에 넣습니다.
참고: 오 소4 강한 산화 제 이며 빛에 노출에 의해 쉽게 감소. 갈색 유리병에 오 소4 를 배치 하 여 준비 하는 동안 감소를 피할 수 있다 - 0.2의 5 mL를 추가 합니다. 오 소4/0.1 M PB의 10ml를 얻을 수 있습니다.
참고: 신생아 쥐의 뇌는 오 스몰 농도의 변화에 깊이 민감 하기 때문에, 알데하이드 픽스와 오 소4 용액을 준비 하기 위해 동일한 완충 제를 사용 하 여35,36,37 - 10 mL의 0.1를 추가로 추가 합니다. 이것은 0.1 m PB의 1% 오 소4 의 20 mL의 최종 용액을 얻을 것 이다.
- 긴 바늘이 장착 된 20ml 주사기를 사용 하 여 1% 오 소4 를 그린 후 갈색 유리병 또는 알루미늄 호 일로 덮인 scint 유리병에 넣습니다.
주의: 오 소4 는 매우 휘발성 이며, 그것의 연기는 코, 눈 및 목에 유독 합니다. 모든 작업은 장갑과 보호 복을 사용 하 여 연기 후드에서 수행 되어야 하며, 어떤 신체 부분은 오 소4에 노출 되어야 한다. 취급 및 폐기물 처리는 교육 기관의 지침에 따라 수행 해야 합니다. 사용 하지 않은 오 소4 를 유리 스 토퍼에 테 프 론 라이너가 있는 단단히 stoppered 갈색 유리병에 보관 하 고, 병을 이중 알루미늄 호 일에 싸서 dessicator에 보관 하십시오. 누출 된 연기의 존재에서, 오 소4 내부 표면과 냉장고의 내용물을 변색 할 수 있다. 위에서 언급 한 저장 조건 하에서 오 소4 용액은 몇 개월 동안 안정 하다. 저장 중에 용액이 산화 되 면 회색으로 켜지 고,이 경우 폐기 해야 합니다.
- 오 소4%의 5 mL (1 개의 앰 플)을 넣고 갈색 유리병에 넣습니다.
- 시 편 바이 알에 0.1의 1% 오 소4 를 추가 하 고 1 시간 동안 앉으 세요. 오 쏘4 를 마이크로 피 펫으로 1 시간 후에 추출 하십시오.
참고: 섹션에 소4 를 적용 하기 전에, 시 편을 전개 하 고 평평 하 게 하는 것이 중요 합니다. 시 편의 상단에 직접 적용 하지 말고 바이 알의 벽을 사용 하 여 병4 를 바이 알의 바닥에 부드럽게 떨어 뜨 렸 습니다. 시 편은 오 소4 응용 프로그램 직후 갈색 및 강성이 된다. 조직 손상을 방지 하기 위해 지금부터 부드럽게 처리
5. 헹 굼
참고: 잔류 하는 고정 제가 탈수 제37과 반응할 수 있기 때문에 소 (4 )와 탈수 전에 후 시 편을 헹 구는 것이 중요 합니다.
- 3 분 x 3에 대해 0.1 M PB로 헹 궈 냅니다.
참고: 신생아 쥐의 뇌는 오 스몰 농도의 변화에 깊이 민감 하기 때문에, 고정 혼합물12,35,36,37에 사용 되는 것과 같은 차량에서 세척을 수행 합니다. - 오스뮴 솔루션을 배치 하 고 처음 두 PB에 씻어 오 소4 쓰레기와 기관의 지침에 따라 처분.
6. 우 라 닐 아세테이트로 순차적 탈수 및 염색
참고: 이 저자의 실험실은 포함을 위한 물 비 혼 화성 에폭시 수 지를 사용 합니다. 에폭시 수 지가 사용 될 때, 모든 시 편의 자유 물은 매 립 매 질에 의해 침 윤 되기 전에 유기 용 제로 대체 되어야 한다. 물은 오름차순 에탄올 및 아세톤12의 일련의 용액을 통해 시 편을 통과 시 킴으로써 제거 된다.
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우르 닐 아세테이트 (UA)의 제조
- 200 mL 용량 유리 플라스 크를 넣고 교 반 플레이트에 토 에이치 70%의 100 mL를 넣습니다.
- 4 g의 UA를 플라스 크에 추가 합니다. 알루미늄 호 일에 싸서 (빛에 노출 되 면 UA 석 출) 연속적으로 저 어.
참고: UA는 70%에 토에 천천히 그리고 불완전 하 게 녹 습니다. 용액을 사용 하기 전에 용 해 되지 않은 결정이 정착 되도록 하십시오. UA 용액은 사용 전에 0.45 μ m 필터로 여과 해야 합니다. UA는 미리 준비 하 여 수개월 동안 4 ° c에서 알루미늄 호 일로 포장 된 갈색 병에 보관할 수 있다.
주의: UA는 약간 방사성이 고 독성이 매우 높은 것 이다. UA 분말의 흡입은 위 호흡 기관 무질서 및 폐, 간 및 신장의 질병을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. UA는 섭취 할 때 또는 피부와 점 막과 직접 접촉할 때 위험 합니다. 모든 작업은 장갑과 보호복을 사용 하 여 연기 두건에서 수행 해야 합니다. 취급 및 폐기물 처리는 교육 기관의 지침에 따라 수행 해야 합니다.
- 50%에 토에의 탈수를 1 분 동안 제거 합니다. UA를 추가 하기 전에 50%의에 토.
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에 토에 70%에 4% UA를 추가 합니다. 1 시간 또는 밤새 앉아 보자. 하룻밤 이면 4 ° c에서 냉장고에 두십시오.
참고: 에 토 h 증발을 방지 하 고 빛에 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일로 커버 하는 캡 바이 알. 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.- 귀하의 교육 기관 지침에 따라 UA 폐기물 및 다음 두 가지 헹 굼을 처분 하십시오.
- 1 분 동안에 토에 70%의 탈수.
- 5 분간에 토에 90%의 탈수.
- 5 분 동안에 토에 100%의 탈수.
- 시료를 아세톤에 2 분 x 3으로 헹 구 십시오.
7. 침투 및 임베딩
참고: 조직은 수 지 매트릭스의 추가 지원 없이 얇은 섹션으로 절단 될 정도로 강성이 충분 하지 않습니다. 따라서 침 윤 및 포함은 절편12에 선행 해야 합니다.
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EPON 수 지의 제조
- 60 mL가 위 주사기를 사용 합니다. 주사기 플런저를 제거 하 고 주사기를 안전 바늘로 캡을 합니다.
- 주사기를 열린 면 위로 올려 놓고 수 지 믹스의 각 성분의 부피를 점진적으로 추가 합니다. 812 (수 지) 22 mL를 추가 합니다. 37의 총 부피에 DDSA (경화제)를 추가 합니다. 총 부피 50.5 mL의 NMA (경화제)를 첨가 합니다. 525 μ l의 DMP-30(가속기)를 파이 펫과 함께 첨가 하십시오. DMP가 매우 점성이 있기 때문에 파이 펫의 플런저를 매우 느리게 움직입니다.
참고: 포함 시 약을 나열 된 순서 대로 추가 하는 것이 중요 합니다. 가속기 (DMP-30)를 마지막에 추가 해야 합니다. 원하는 특성을 갖는 경화 된 블록을 얻기 위해, 경화제 및 가속기의 정확한 양을 사용 하는 것이 중요 하다. 갓 준비 된 매 립 혼합물이 바람직하다. - 플런저를 뒤에 넣고 적어도 30 분 동안 연속 흔들어와 로커에 주사기를 놓습니다. 색상은 노란색에서 황색으로 변경 됩니다.
참고: 모든 성분은 매우 철저히 혼합 해야 합니다. 그렇게 하지 않으면 조직 표본의 고르지 않은 함 침과 고르지 못한 경도의 블록이 발생 합니다.
- 1 부피의 EPON 수 지를 혼합 하 고 1 부피의 아세톤을 scint 바이 알에 넣고 섞어 흔들어 주세요. 1:1 EPON 적용: 마지막 아세톤 린스를 제거한 후 조직 상의 아세톤 혼합물. 아세톤 증발을 방지 하기 위해 덮여 유지. 2-4 h 후에 수 지 및 아세톤의 1:1 혼합물을 제거 하거나 하룻밤 유지.
참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. - 수 지와 아세톤의 혼합물을 전체 수 지로 교체 하십시오. 4 시간 또는 밤새 앉아 보자. 모든 EPON 폐기물을 후드 아래의 컬렉션 컨테이너에 넣어 중 합 하 고 나중에 폐기 한다.
참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
8. 플랫 임베딩
참고: 표본은 샌드위치 같은 방식으로 두 개의 aclar 필름 사이에 평평 하 게 삽입 됩니다.
- 투명 한 아실 시트의 직사각형 조각 2 개를 자릅니다. 70%로 필름을 깨끗 하 게 닦습니다. 섹션의 모든 측면에 최소한 1.5 cm의 티슈 프리 플라스틱이 되도록 시트를 자릅니다. 상단에 있는 aclar 시트는 바닥과 동일한 폭을 가져야 하며 높이는 하단 시트의 약 2/3 여야 합니다.
- 표본으로 유리병을 천천히 기울이고 유리병의 바닥에서 조직을 부드럽게 들어올립니다.
- 미세 유연한 주걱 및 미세 브러시를 사용 하 여 조심 스럽게 바이 알 벽을 따라 섹션을 이동 하 고 aclar 시트로 이동 합니다.
참고: 시 편이 손상 되지 않도록 조심 스럽게 섹션을 다루십시오. - 액 슬 시트를 시 편 위에 부드럽게 놓습니다.
참고: 샌드위치를 봉인 하기 위해 두 시트 사이에 수 지가 충분 한지 확인 하십시오. - 섹션에 직접 압력을가 하지 않고 갇힌 기포를 부드럽게 밀어 냅니다. 여분의 EPON을 닦아.
참고: 기포의 제거는 그 존재가 시 편의 가시화가 어렵고 수 지 결합의 안정성을 약화 시키기 때문에 중요 합니다. - 솔벤트 내성 펜으로 시트에 라벨을 부착 하 고 오븐에 60 ͦC 2-3 일 동안 중 합 할 수 있습니다.
참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
9. 캡슐 내장
참고: 울트라 아미로 토 메스는 캡슐에 포함 된 표본에서 얻은 원통형 블록을 고정 하는 척과 함께 제공 됩니다. 원통형 블록은 절편 중에 발생 하는 진동의 영향을 최소한으로 받는 이상적인 형상을가지고 있습니다.
- 끼워 넣어진 aclar 필름을 부드럽게 여십시오. 표본은 두 개의 aclar 시트 중 하나에 부착 됩니다.
- 섹션을 포함 하는 aclar 시트의 측면을 표시 하는 솔벤트 내성 펜을 사용 합니다. 조직 근처에 표시.
참고: 관심 있는 조직을 펀칭 하기 전에이 단계를 수행 하는 것이 중요 합니다. - 디스크 펀치를 사용 하 여 단면의 원 샘플을 얻습니다. 펜 마크는 펀칭 아웃 된 조직의 일부 여야 합니다.
- 캡슐 홀더에 포함 된 캡슐 면의 뚜껑을 위쪽으로 준비 합니다. 캡에 수 지 한 방울을 놓습니다.
- 티슈 섹션이 위로 향하게 하 여 펀치 디스크를 캡 내부에 놓습니다. 빛이 시 편으로 빛나고 있을 때 펜 마크가 반짝입니다.
- 캡슐을 캡에 넣고 미세 핀셋을 사용 하 여 라벨을 삽입 합니다. 인쇄 된 2cm 길이의 종이를 캡슐에 넣고 아래쪽으로 롤 합니다. 캡슐의 측면 벽의 곡률에 맞도록 라벨을 만듭니다. 중 합이 완료 될 때까지 기다린 후 라벨이 수 지에 영구적으로 삽입 됩니다.
- 캡슐 내부에 포함 수 지를 붓고 캡슐의 가장자리까지 채우십시오.
- 뾰족한 나무 막대기의 도움으로 캡슐의 바닥에 조직 표본을 밀어 넣고 2-3 일 동안 60 ° c에서 오븐에 놓습니다.
참고: 너무 열심히 조직을 누르지 않도록 주의 하십시오, 대신에 매 립 배지의 얇은 층이 조직과 캡슐 표면 사이에 존재 하도록 느슨하게 거짓말을 하자. 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
10. 블록 면 트리밍
참고: 작은 크기와 적절 한 형태의 블록 면은 만족 스러운 절편을 위한 전제 조건입니다. 따라서 시 편 블록의 트리밍이 필요 하다.
- 날카로운 한 쪽 면도날을 사용 하십시오. 사용 직전에 아세톤으로 닦아 내 세요.
- 블록 홀더에 캡슐 블록을 장착 하 고 블록 홀더를 실체 현미경의 스테이지에 놓습니다.
참고: 트리밍 절차는 현미경 쌍안경 및 비스듬한 조명 하에서 수행 되어야 합니다. - 면도기 블레이드를 사용 하 여 캡슐의 끝에서 aclar 시트를 제거 하십시오. Aclar 시트는 하 부 범위의 빛 아래에 반짝이는 레이어로 나타납니다.
- 면도기 블레이드를 45도 각도로 잡고 캡슐 블록의 네 면을 아래로 자릅니다.
참고: 블레이드가 양손으로 고정 되어 있으면 트리밍 제어가 더 잘 이루어집니다. - 블록이 약 45 °의 벽 각도와 짧은 피라미드의 형태를 취하는 있도록 짧은 절단을 합니다.
참고: 그것으로 이어지는 측면이 짧게 유지 하는 경우 시 편 얼굴은 훨씬 더 지원 됩니다. 블록 팁이 너무 얇고 길면 얇은 절편 중에 진동 합니다. 이상적으로, 관심 영역은 블록 면의 중심에 있어야 합니다. - 불필요 한 조직을 버리고 관심 영역을 보존 하기 위해 캡슐의 끝부분을 자릅니다.
참고: 섹션의 어떤 부분도 조직 없이 해야, 블록 면의 밀도의 변화는 절편에 어려움의 주요 원인. 이상적으로, 캡슐 면의 표면적은 1mm이 하 이어야 한다2. - 부 등변 사다리꼴 모양으로 캡슐 면을 자릅니다. 부 등변 사다리꼴에는 측면이 동일 하기 때문에,이 모양은 시 편의 나머지 부분에 상대적인 관심 영역을 방향으로 하는 것이 가장 좋습니다.
참고: 절편 중에 사다리꼴 모양의 면은 다른 형상의 것 보다 훨씬 더 잘 지원 됩니다.
11. 마이크로 톰 절편
참고: 대부분의 생물학적 시 편은 전자 빔에 의해 침투 되는 자연 상태에서 너무 두 껍 습니다. 따라서, 재료는 전자 빔에 의해 침투 될 수 있는 얇은 섹션으로 절단 되어야 한다.
- 표면에 평행한 평면에서 극 세 (은 간섭 색상, 600-900 Å) 얇은 부분을 잘라냅니다.
- 그리드에 단면을 배치 합니다. 이 저자의 연구실은 외경 3.05 mm의 구리 그리드를 사용 합니다.
참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
12. 우 라 닐 아세테이트를 사용한 후 염색
- 증류수에 2% UA를 준비 합니다. 100 mL의 증류수를 함유한 200 mL 부피 유리 플라스 크를 교 반 플레이트에 넣습니다. 2 g의 UA를 플라스 크에 추가 합니다. 알루미늄 호 일에 싸서 (빛에 노출 되 면 UA 석 출) 연속적으로 저 어.
참고: UA 준비에 대 한 자세한 내용은이 프로토콜의 섹션 6을 참조 하십시오. - 페 트리 디쉬에 깨끗 한 치아 왁 스에 2% UA의 여러 개별 방울을 놓습니다.
- 25 분 동안 UA 한 방울에 표본 (단면 면 아래로)을 사용 하 여 그리드를 플 로트 합니다.
참고: 각 그리드를 별도의 UA 드롭에 띄워 놓습니다. - 핀셋으로 가장자리에 있는 격자를 잡고 플라스틱 세척 병에서 상 온에서 끓인 증류수의 부드러운 제트 아래에 두 번 헹 궈 냅니다.
참고: 납으로 염색 하기 전에 그리드가 건조 되는 것을 허용 하지 마십시오.
13. 납을 사용한 후 염색
- CO2 없는 챔버를 준비 합니다 (공중에서 co2는 납 침전의 주요 원인입니다). 1 N NaOH를 사용 하 여 담가 놓은 여과 지를 페 트리 접시에 넣습니다. 필터 페이퍼 위에 깨끗 한 치과 용 왁 스의 작은 시트를 놓고 접시의 한쪽에 몇 NaOH 펠 릿을 놓습니다. 접시를 덮으 십시오.
참고: 그리드가 UA로 염색 되기 전에이 설정을 준비 하 여 챔버의 대기는 CO2가 없고 UA 염색이 완료 될 때까지 납 염색을 준비 합니다. - 4% NaOH를 만드십시오. 0.2 g의 NaOH를 증류수 5 mL에 첨가 하십시오.
- 사토의 트리플 리드 솔루션을 준비 합니다. 10ml의 납 질 산 0.1 g, 납 시트르산 0.1 g, 납 아세테이트 0.1 g, 구 연산 나트륨의 0.2 g을 유리병에 첨가 한다. 증류수 8.2 mL를 넣고 5 분간 힘차게 흔들어 30 초 동안 초음파 처리 한 다음 갓 만든 4% NaOH의 1.8 mL를 추가 하십시오.
- 배양 접시의 왁 스에 사토 리드의 몇 방울을 놓습니다.
- 리드 방울에 UA (단면 면 아래로)로 얼룩진 격자를 놓습니다.
참고: 각 그리드는 별도의 잠재 고객 드롭에 떠 있어야 합니다. 각 드롭은 그리드를 측면에서 아래로 슬라이딩 하는 대신 드롭 돔의 상단에 떠 있게 할 수 있을 정도로 작습니다. - 접시를 덮고 5 분간 얼룩을 주세요.
- 집게와의 가장자리에 격자를 잡고 플라스틱 세척 병에서 상 온에서 끓인 증류수의 부드러운 제트에서 철저히 씻으십시오.
- 여과 지의 그리드를 건조 하 고 그리드를 보관 하십시오.
참고: 단면이 필터 용지와 직접 접촉 하지 않는지 확인 하십시오.
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Representative Results
TEM에 대 한 시 편의 만족 또는 결함 보전을 나타내는 것으로 대부분 인정 되는 일반 기준이 확립 되었다. 이러한 기준은 4 개의 선택 된 전자 현미경 (최적의 제제의 두 가지 예, 결함 있는 제제의 두 가지 예)에서 예시 되는데,이는이 프로토콜에 기재 된 방법에 따라 젊은 쥐 뇌 조직을 치료 함으로써 얻어진 다.
일반적으로, 상 질 전자 현미경 사진은 질서 있는, 독특하고 전반적인 회색 빛 이미지로 나타납니다. 만족 스럽게 준비 된 표본에서 멤브레인 사이의 공백은 세분화 된 물질로 채워져 있어야 하며 비워 둘 수 없습니다. 마찬가지로, 세포질 지상 물질 또는 소기관 내에서 빈 공간을 찾을 수 없습니다 (도 1a 와도 2a 를도 3 및도 4와 비교). 그럼에도 불구 하 고, 매우 젊은 동물의 중추 신 경계가 성인 뇌와 비교 했을 때 세포 외 공간의 어느 정도 확대를 보여주고 있으며, 셀과 전반적으로 더 하얀 사이에 패자 연결을 사용 한다는 것을 주의 하는 것이 중요 합니다. 전자 밀도가 높은 외관. 멤브레인은 왜곡 또는 파손 없이 연속적 이어야 한다 (도 1a 및 도 2a). 미토 콘 드리 아의 기질는 빈 공간 없이 균일 하 고 조밀 하 게 나타나야 합니다. Cristae는 온전 하 고 부 어 지지 않아야 하며 미토 콘 드리 아 외부의 이중 막은 깨지지 않아야 합니다 (그림 1a 와도 3비교). 시 냅 스 소포 조직에 대 한 형태학 적 분석을 용이 하 게 하기 위해, 시 냅 스 전과 후 막의 손상 없이 본질적으로 서로 평행 해야 합니다 ( 그림 1참조). 시 냅 스 소포는 연속적인 단일 멤브레인에 의해 추적 및 결속 되어야 합니다 ( 그림 2참조).
중요 한 것은, 베스트 프 랙 티 스를 따르는 경우에도, 픽스 쳐, 얼룩 및 수 지가 있는 표본의 치료는 유물을 소개 합니다. 유물을 제거할 수 없기 때문에, 공정이 발생 하는 과정을 이해 하는 것이 중요 하기 때문에 표본 모양이12를 겪은 치료에 대하여 해석 될 수 있습니다. TEM에 대 한 표본 준비 중에 생성 될 수 있는 여러 아티팩트 중 한 가지 예는 myelin 그림 이며,이는 마이 엘 린 막 모양 궁 유사 합니다. Myelin 수치는 병리학 적 조건12에서 볼 수 있지만, 가장 흔히 알 데히드로 고정 하는 동안 멤브레인 지질을 추출 하 여 발생 합니다 ( 그림 4참조).
도 1: 전자 현미경 사진은 세포 구조의 만족 스러운 보존을 대표 한다 (실시 예 1). (A) 신경 세포 막 층 및 휴식 없이. 세포질은 잘게 세분화 하 고 빈 공간 없이. 미토 콘 드리 아 부 어도 축소 되지 않습니다. 외부의 이중 막은 보존 되 고 내부 cristae는 손상 되지 않습니다. (B) 패널 A의 세부 사항, 시 냅 스 전 막 으로부터의 시 냅 스 소포의 거리를 측정 하는 하나의 방법을 예시 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 2: 전자 현미경 사진은 세포 구조의 만족 스러운 보존을 대표 한다 (실시 예 2). (A) 시 냅 스 소포는 분리 되 고 끊어지지 않는 단일 막에 의해 일렬로 세워진. 시 냅 스 소포 분포의 형태학 적 분석을 허용 하기 위해, 시 냅 시스 및 시 냅 스 후 막이 평행 하 고 연속성을 유지 해야 합니다. (B) 패널 A의 세부 사항, 시 냅 스 전 터미널 내에서 지 중 소포를 계산 하는 예시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 3: 전자 현미경 사진은 조직 재생용 구조체의 결함 보존을 대표 한다 (실시 예 1). 신경 세포 막의 왜곡과 파손 및 현저 하 게 확대 된 세포 외 공간의 존재 (*로 표시 됨)에 유의 하십시오. 미토 콘 드리 아는 팽창 하 고 부 어 있는 cristae (화살표로 표시)가 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 4: 전자 현미경 사진은 조직 재생용 구조체의 결함 보존을 대표 한다 (실시 예 2). 미세 하 게 세분화 된 세포질 물질 대신에 세포질 내에 있는 큰 흰색 빈 공간의 존재 (ǂ로 표시 됨)를 참고 하십시오. 세포 외 공간은 확대 나타납니다. 알데하이드로 고정 하는 동안 지질을 동원 하 여 야기 될 수 있는 artifactual 판가름 (myelin 그림)은 약어 MF로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
TEM에 대 한 표본 준비 중 조직 섹션의 처리는 상당한 기교, 집중력 및 인내심을 필요로 합니다. 마이크로 파이 펫을 사용 하 여 용액을 추가 하 고 제거 하는 경우, 시 편은 표면 장력에 의해 피 펫 팁으로 빨려 들어갈 수 있으므로 파이 펫에의 한 조직 손상을 방지 하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 또한, 탈수 서 열의 특정 단계는 1 분으로 빨리 할 수 있으므로 작업자는 다음 탈수 단계가 시간에 시작 되 고 시 편이 건조 하거나 주름이 되지 않도록 신속 하 게 작업 해야 합니다. 특별 한 주의가 요구 되는 한 가지 절차는 오 스미의 사후 고정입니다. 단면도는 오 스미와 처리 후에 단단 해지고 쉽게 손상 될 수 있습니다. 오 스미를 추가 하기 전에, 단면이 바이 알의 바닥에 평평 하 고, 다른 어떤 배는 조직 골절을 초래할 것이 필수적 이다. 평형 된 조직의 취급은 평면 임베딩을 위한 aclar 필름에 섹션을 전송할 때 특히 어렵습니다. 파편을 피하기 위해 바이 알의 바닥에서 시 편을 들어 올릴 때, 그리고 필름 샌드위치에서 기포를 밀어내 면 특별 한 주의가 필요 합니다. 갇힌 공기를 밀어내는 것이 중요 하지만, 시 편의 가시화가 어렵고 수 지 결합의 안정성이 약화 되기 때문에, 체 내에 직접 압력을가 하면 쉽게 손상을 입힐 수 있습니다. 여분의 주의를 필요로 하는 또 다른 단계는 표본 침투 및 포함을 위한 수 지 혼합물의 준비입니다. 가장 널리 사용 되는 임베딩 수 지 EPON은 경화제와 가속기를 첨가 하 여 경화 시킬 수 있습니다. 원하는 특성을 갖는 경화 된 블록을 얻기 위해서는 정확한 양의 경화제 및 촉진제를 사용 하는 것이 필수적 이다. 중량 측정 및 체적 방법 모두 점성 수 지 측정용으로 설명 되었습니다. 중량 측정 방법이 전통적으로 더 정확한12로 간주 되었지만,이 저자의 연구실은 체적 모드 (즉, 수 지의 각 성분의 부피를가 위 주사기를 사용 하 여 점차적으로 혼합 하는 것)로 좋은 성공을 거두었습니다 . 수 지 성분이 주의깊게 측정 된 후에, 그들은 다른 점도 및 중 합 속도를가지고 있기 때문에, 균일 함 침을 달성 하기 위해 매우 철저 하 게 혼합 해야 합니다. 완전 한 혼합을 달성 하지 못하면 얇은 절편에 부적합 한 고르지 않은 경도의 블록이 생성 됩니다.
젊은 쥐 뇌의 섹션을 처리 하는 데 사용 되는 용액의 음조에 표시 된 변화는 세포 외 공간 및 세포 성분의 수축 및/또는 팽 윤을 유발할 수 있다12,35,36,37 . 고정 하는 동안, 최상의 결과는 관류 물의 삼 투 압이 연구 중인 조직과 최대한 유사 하 게 유지 될 때 얻어진 다. 쥐 뇌 삼 투 압 약 330 mOsm. 0.1 M PB 솔루션의 2% 알데하이드 400-450은 extravascular 공간12의 확장을 최소화 합니다. 특히, 멤브레인은 알 데히드로 고정 한 후 헹 굼 및 탈수 용액의 삼 투 압의 변화에 민감 하다. 따라서 오 스몰 농도12,35,36,37에서 사용 되는 픽스 쳐와 용액의 차이를 최소화 하는 것도 중요 하다. 이러한 이유로 동일한 차량 (0.1, 근사 오 스몰 농도 440 mOsM)은이 프로토콜의 모든 솔루션에 대 한 용 매로 사용 됩니다. 그러나, 몇 가지 다른 버퍼가 TEM에 대 한 표본 준비 중에 성공적으로 사용 되었고, 하나의 버퍼가 다른 사람에 대 한 보편적 우위를 주장할 수 있다는 점에 유의 해야 합니다. 더 낮은 음조도의 버퍼가 바람직 할 때, 다른 실험실은 전해질 또는 비 전해질 오 스몰 농도을 증가 하기로 결정 했다12.
이 프로토콜의 여러 단계는 제대로 처리 하지 않을 때 독성이 있을 수 있는 화학 물질을 사용 해야 합니다. 알 데히드, 오 스미, 우라늄 및 납 화합물을 처리 하는 동안 연기 두건에서 작업 하 고 개인 보호 장비를 착용 하는 것의 중요성은 과장 될 수 없습니다. 자동화 된 대조 시스템 위험 중 일부를 감쇠 하는 데 도움이 상업적으로 사용할 수 있지만, 그들은 매우 비쌀 수 있습니다 및 TEM의 일상적인 사용을 하지 않는 실험실에 의해 저렴 하지 않을 수 있습니다. 전자 현미경 실험실은 잠재적으로 위험한 장소가 될 수 있지만, TEM에 대 한 표본 처리는 엄격 하 게 수행 될 때 전반적으로 안전 합니다.
최근, 초 고해상도 광 현미경의 도입은 약 15 nm34의 광학 이미징 분해능을 증가 시켰다. 그러나, 시 냅 시스 전 말단에서 시 냅 스 소포 공간 조직에 대 한 형태학 적 분석을 수행 하는 것이 목표인 경우에는, 어떠한 기술도 형태학 적 세부의 동일한 정도를 제공 하지 않는다. 중요 한 것은, TEM이 처리 되 고 가시화 될 수 있기 전에 시 편이 죽은 것에 대 한 필요성에 의해 제한 된다. 따라서 연구 목표가 시 냅 스 소포 매매 및 배설의 동적인 또는 기능적인 양상을 조사 하는 경우에, TEM 이외의 공구는 고려 되어야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 원고는 NIH/니 치 K08 123321에 의해 지원 되었다 (N.L.에) 및 버지니아 대학의 마 취 학과에서 자금. 저자는 Alev Erisir에 게 감사를 기원 합니다 (생물학과 버지니아의 대학, 샤 러 츠 빌, VA)에 대 한 우수한 교육과 기술 지원을 위한 TEM, 그리고 그녀의 귀중 한 원고 비판. 저자는 또한 시 편 절편 및 사후 염색에 대 한 기술 지원을 위해 버지니아 대학의 고급 전자 현미경 검사 시설에 감사 드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | "size 00, flat (cut bottom)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
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