Summary
Vi beskriver procedurer for behandling af nyfødte rotte hjernevæv for at opnå højopløsnings elektron mikrografer til morfometrisk analyse af synaptisk vesikel fordeling ved nerve terminaler. Mikrograferne opnået med disse metoder kan også bruges til at studere morfologien af en række andre cellulære komponenter og deres dimensionale strukturelle relationer.
Abstract
Vores laboratorium og mange andre har udnyttet den høje løsning magt transmission elektronmikroskopi til at studere morfologi og rumlig organisering af synaptiske vesikler. For at opnå høj kvalitet elektron mikrografer, der kan give den grad af morfologiske detaljer er nødvendige for kvantitativ analyse af præ-synaptisk vesikel fordeling, optimal præparat præparat er kritisk. Kemisk fiksering er det første skridt i processen med præparat forberedelse, og af allerstørste betydning for at bevare fine ultrastruktur. Vaskulær fiksering med en glutaraldehyd-formaldehyd opløsning, efterfulgt af behandling af vibratome-sekerede prøver med osmium tetroxid, stabiliserer det maksimale antal molekyler, især proteiner og lipider, og resulterer i overlegen bevaring af ultrastruktur. Væv bliver derefter behandlet med modfarvning, sekventiel dehydrering og harpiks-Embedding. En bloc farvning med uranylnitrat acetat (dvs. farvning af vibratome-sekeret væv før harpiks indlejring) forbedrer endogene kontrast og stabiliserer celle komponenter mod ekstraktion under præparat behandling. Kontrasten kan øges yderligere ved at anvende uranylnitrat acetat som post pletten på ultratynde sektioner. Dobbelt farvning af ultratynde sektioner med bly citrat efter uranylnitrat acetat behandling forbedrer også billedopløsningen ved at intensivere elektron-opacitet af nukleinsyre-holdige strukturer gennem selektiv binding af bly til uranylnitrat acetat. Transmission elektronmikroskopi er et kraftfuldt værktøj til karakterisering af de morfologiske detaljer i synaptiske vesikler og kvantificering af deres størrelse og rumlige organisation i terminalens Bouton. Men, fordi det bruger fast væv, transmission elektronmikroskopi kan kun give indirekte oplysninger om levende eller udviklende processer. Derfor bør andre teknikker overvejes, når Hovedformålet er at studere dynamiske eller funktionelle aspekter af synaptisk blære handel og ekocytose.
Introduction
Vi beskriver metoder til fremstilling af nyfødte rotte hjernevæv for at opnå højkvalitets elektron mikrografer til dybdegående morfometrisk analyse af synaptisk vesikel rumlig fordeling ved nerve terminaler1,2. De høj-kontrast mikrografer, der kan opnås ved at behandle prøver efter disse metoder kan også bruges til at studere den detaljerede morfologi af en række cellulære komponenter og deres dimensionale strukturelle relationer3,4.
Transmission elektronmikroskop (TEM) er et kraftfuldt værktøj til at studere morfologien af organeller og andre cellulære strukturer kvantitativt. Som i dette årti, er der ingen andre metoder til undersøgelse, der kan give den samme grad af opløsning af lipid membraner og organeller uden immuno-tagging, med undtagelse af kryofiksering ved højt tryk frysning. Dog, fryse substitutions teknikker er ikke almindeligt anvendt, og normalt kræver dyrt udstyr og lange tilberedningstider.
For at kunne udnytte TEM-systemets høje opløsnings effekt er det yderst vigtigt at have et optimalt præparat. De vigtigste mål for præparat præparatet er at bevare vævs struktur med minimal ændring fra den levende tilstand, forbedre præparatet kontrast, og stabilisere vævet mod udvinding af cellulære komponenter under behandling og eksponering for elektron Stråle. Talrige protokoller for TEM væv forberedelse er blevet indført og perfektioneret af flere laboratorier i årenes løb. Mange af dem har fokuseret på metoder til optimal visualisering af synaptiske vesikler5,6,7,8,9,10,11. Blandt en række veletablerede, guld standardmetoder, der i øjeblikket er i brug, valgte vi procedurer for kemisk fiksering, post fiksation, en bloc farvning, sekventiel dehydreringen, harpiks indlejringen og post farvning, der har til formål at bevare optimal vævs struktur og opnå fremragende billedkontrast. Bemærk, bevarelse af fin ultrastruktur kan være særligt udfordrende, når man arbejder med nyfødte rotte hjernevæv. Faktisk er det centrale nervesystem af meget unge dyr karakteriseret ved et højere vandindhold end den voksne hjerne, mere fremtrædende udvidelse af ekstracellulære rum, og løsere forbindelser mellem cellerne12. Dette gør nyfødte rotte hjernevæv dybt følsom over for ændringer i osmolaritet, og udsøgt tilbøjelige til artifaktivt svind og/eller hævelse, når de behandles gennem sekventielle opløsninger af forskellige tonicitet12. Derfor, vores metoder anvendes løsninger til præparat behandling, der er af osmolaritet så tæt som muligt på, at af rotte nyfødte hjernen. Vores mål var at opnå højkvalitets højopløsnings elektronmikroskopi billeder til kvantitativ vurdering af den synaptiske vesikel rumlige fordeling ved nerve terminaler. Specifikt, vi forsøgte at måle antallet af vesikler i nerve terminalen, afstanden af synaptiske vesikler fra den præ-synaptiske plasma membran, antallet af vesikler forankret i den præ-synaptiske membran, størrelsen af synaptiske vesikler og mellem vesikel afstande1.
Tilfredsstillende kemisk fiksering er en forudsætning for at opnå højkvalitets elektron mikrografer, der kan give de morfologiske detaljer, der er nødvendige for at studere synaptisk blære morfologi og rumlig organisation. Selv om flere former for fiksering findes, fiksering af hjernevæv ved vaskulær perfusion er decideret overlegen i andre metoder. Da fiksering via vaskulær perfusion begynder umiddelbart efter anholdelsen af systemisk cirkulation, forkorter det intervallet mellem deoxygenering af hjernevæv og Cross-Linking af proteiner med fixativer, hvilket resulterer i minimum ændringer i celle Struktur. Desuden, det opnår hurtig og ensartet penetration, på grund af den hurtige strøm af fiksativ fra den vaskulære seng til ekstracellulære og cellulære rum12,13,14. Primær fiksering med glutaraldehyd, efterfulgt af sekundær fiksering (efter fiksering) med osmium tetroxid, giver fremragende bevarelse af den fine struktur15,16,17. En blanding af glutaraldehyd og PARAFORMALDEHYD har den yderligere fordel, at den hurtigere trænger ind i vævet12.
Da biologisk væv ikke er tilstrækkelig stift til at blive skåret i tynde sektioner uden støtte fra en harpiks matrix, skal de integreres i et medium før tynde skæring. Vand-immiscible epoxyharpiks er almindeligt anvendt som et indlejrings medium i TEM. Når denne type matrix anvendes, skal hele prøveemnets frie vand udskiftes med et organisk opløsningsmiddel før harpiks infiltration. Vand fjernes ved at passere prøven gennem en række opløsninger af stigende koncentrationer af ethanol og/eller acetone12. I denne protokol, er prøverne første flade indlejret mellem fleksible aklar ark, derefter indlejret i en kapsel. Det endelige resultat er væv placeret på spidsen af en cylindrisk harpiks blok, som har den ideelle geometri til at være mindst påvirket af vibrationer, der opstår under mikrotom skæring.
Farvning med tungmetaller til at forbedre endogene væv kontrast er et andet vigtigt aspekt af præparatet præparat. Billedkontrast i TEM skyldes elektron spredning af atomerne i vævet. Biologiske materialer består dog hovedsagelig af lavatomare molekyler (dvs. kulstof, brint, ilt og nitrogen). Derfor, dannelsen af tilstrækkelig spredning kontrast kræver inkorporering af høj atomare vægt atomer i cellulære komponenter i vævet. Dette opnås ved farvning af prøven med tungmetaller12,18,19. Osmium tetroxide, uran og bly, som binder stærkt til lipider, er de mest almindelige tungmetaller, der anvendes som elektron pletter.
Osmium (atomnummer 76) er en af de tætteste metaller i eksistens. Det er både en fiksativ og en plet, selv om dens primære rolle i tem er som en pålidelig fikativ12. Blandt de forskellige fikserings protokoller, der anvendes, er metoden med dobbelt fiksering med glutaraldehyd efterfulgt af osmium den mest effektive til at reducere udvindingen af cellebestanddele under præparat tilberedningen. Disse to aromastoffer bruges til at stabilisere det maksimale antal forskellige typer af molekyler, især proteiner og lipider, og resultere i overlegen bevaring af væv ultrastruktur12,14,15, 16 ud af , af 17.
Uran (atomnummer 92) er det tungeste metal, der anvendes som elektron pletter, oftest i form af uranylacetat. På samme måde som osmium, fungerer det som en plet og fikativ, selv om dets primære rolle i tem er som en plet20,21. Nukleinsyre-holdige og membranøse strukturer er stærkt og fortrinsvis farves med uranylnitrat salte i aldehyd-faste væv22,23. Behandling af væv med uranylnitrat acetat efter osmication og før dehydrering resulterer i stabilisering af membranøse og nukleinsyre-holdige strukturer, samt øget kontrast, og gør det muligt at identificere nogle strukturelle detaljer, der ikke ville let påvises i enheder plettet med osmium alene12,24,25. Det menes, at uranylnitrat acetat kan stabilisere den fine struktur ved at kombinere med reduceret osmium, der er blevet deponeret på lipid membraner under osmication24. Der opnås maksimal kontrast, når uranylnitrat acetat påføres før indlejring og som post pletten i tynde afsnit12.
Bly (atomnummer 82) er den mest almindelige plet, der anvendes til TEM og er hovedsagelig beskæftiget med efter farvning af tynde sektioner. Blysalte har høj elektron opacitet og viser affinitet for en bred vifte af cellulære strukturer, herunder membraner, nukleare og cytoplasmatiske proteiner, nukleinsyre og glykogen26,27. Når den dobbelte farvnings metode anvendes (dvs. farvning med uranylnitrat acetat efterfølges af behandling med bly), fungerer sidstnævnte som udvikler af uranylnitrat acetat farvning. For eksempel, bly post-farvning af kromatin fikseret med glutaraldehyd øger uranylnitrat acetat optagelse med en faktor på tre28,29,30,31,32. Bly også forbedrer farvning overført af andre metaller såsom osmium. Det menes, at bly salte bejdsede membraner af osmium-faste væv ved at binde sig til Polar gruppen af phosphatidylphosphatider i nærværelse af reduceret osmium33. En potentiel ulempe ved farvning med både uranylnitrat acetat og bly, især for længerevarende varigheder, er, at mange forskellige strukturelle elementer er plettet lige og ikke-specifikt, og derfor kan ikke let skelnes fra hinanden12 .
Den nylige indførelse af alternative lyskilder, såsom i optisk super-opløsning foto-aktiveret lokalisering mikroskopi, har væsentligt forbedret lys mikroskopi opløsning34. Men fordi let mikroskopi er afhængig af histokemiske og immun-cytokemiske metoder til at visualisere individuelt mærkede proteiner eller enzymer, er kraften i TEM til at vise alle strukturelle elementer på én gang stadig uovertruffen til dybtgående undersøgelse af morfologi og dimensionelle relationer af vævs strukturer. Især kan ingen anden teknik give de morfologiske detaljer, der er nødvendige for at udføre morfometrisk analyse af synaptisk vesikel fordeling på præ-synaptiske nerve boutoner. Ikke desto mindre er det vigtigt at bemærke, at elektron mikrografer fanger vævs strukturen, efter at organismen dør, og de kan derfor ikke give oplysninger om dynamikken i den præ-synaptiske vesikel-Handel og ekocytose. Derfor bør andre værktøjer, såsom FM Dye-levende billeddannelse og patch-klemme Elektrofysiologi, overvejes, når Hovedformålet er at studere dynamiske og/eller funktionelle aspekter af synaptisk vesikel Handel og exocytose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle undersøgelser blev godkendt af Institut for dyrepasning og-brug på University of Virginia (Charlottesville, VA) og gennemført i overensstemmelse med de nationale Institut for sundhed retningslinjer.
1. fiksering af vaskulær perfusion
Bemærk: En generel beskrivelse af metoden for rotte hjerne vaskulær perfusion er allerede beskrevet i denne tidsskrift13 og ligger uden for denne protokols anvendelsesområde. Men følgende trin er specifikke for forberedelsen af nyfødte rotte hjernevæv for at opnå høj kvalitet elektron mikrografer til kvantitativ analyse af synaptiske vesikler fordeling på præ-Synaptic terminaler.
-
Klargøring af 4% PARAFORMALDEHYD
- Der anbringes 800 mL 0,1 M fosfat buffer (PB) i et 2 L glasbæger på en omrørings plade under en stinkhætte. Opvarmes til ca. 60 °C uden at koge bufferen.
- Tilsæt 40 g PARAFORMALDEHYD pulver. Rør kontinuerligt
- Mens du måler pH, tilsættes små dråber 10 N NaOH, indtil opløsningen ryddes. Den endelige pH-værdi bør være 7,2-7,4.
- Tilsæt det resterende 0,1 M PB til et endeligt volumen på 1 L. Lad det køle af, Filtrer med en 0,45 μm membran og opbevar ved 4 °C natten over.
Bemærk: Forbered frisk PARAFORMALDEHYD dagen før perfusion.
Forsigtig: Indånding af aldehyddampe kan forårsage næse symptomer og luftvejsirritation. Hudkontakt forårsager dermatitis. Aldehyder skal håndteres i en stinkhætte, mens der bæres handsker, en beskyttende kjole og beskyttelsesbriller
-
Forbered Tyrode-løsning
- Der anbringes 1 L destilleret vand i et glasbæger på en omrørings plade. Tilsæt NaCl (8 g), KCl (0,15 g), CaCl2 (0,1 g), mgcl2 (0,006 g), Nah2po4 (0,055 g), NaHCO3 (1 g) og dextrose (1 g) i bægerglasset.
- Rør kontinuerligt og mål pH. Hold pH mellem 7,2 og 7,4.
Bemærk: Tyrode løsning er også kommercielt tilgængelig.
- 4% PARAFORMALDEHYD blandes med glutaraldehyd i en slutkoncentration på 2%. Der tilsættes 40 mL elektronmikroskopi-grade 50% glutaraldehyd til 1 L 4% PARAFORMALDEHYD. Bland godt i en omrørings plade
Bemærk: Ca. 100 mL af PARAFORMALDEHYD-glutaraldehyd fikativ opløsning er nødvendig for at performe kroppen af en nyfødt rotte. Derfor kan mindst 10 nyfødte rotter perfektes med 1 L fixative. Du må ikke blande PARAFORMALDEHYD og glutaraldehyd indtil umiddelbart før brug. Bring alle opløsninger til stuetemperatur før perfusion. - Når der er opnået adgang til venstre ventrikel (Se hele dyre perfusion-protokol13), skal det vaskulære system skylles med tyrode-opløsning i 30 s ved et perfusions tryk på 120 mmHg.
Bemærk: Perfusion's succes afhænger delvis af den fuldstændige udelukkelse af blod fra det vaskulære - Skyl med PARAFORMALDEHYD-glutaraldehyd opløsning med samme tryk i 10 min.
Bemærk: Opretholdelse af konstant perfusion tryk er afgørende for at undgå indførelse af artefakter. Desuden bør perfusattemperaturen ikke være under rottets kropstemperatur for at undgå vasokonstriktion - Fjern den faste hjerne fra kraniet og sted i frisk PARAFORMALDEHYD-glutaraldehyd fiksativ ved 4 °c natten over.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her.
2. hjerne udskæring
- Integrer den faste hjerne i 4% agopstod og lim hjernen-agopstået blok på en vibratome fase
Bemærk: Andre laboratorier har opnået gode kvalitets sektioner ved at opnå en stabil blok på vibratome uden agar støtte - Snit skiver 50 μm tykkelse. Indstil mikrotomen til lav frekvens og hastighed.
Bemærk: Sektioner kan opbevares i 0,1 M PB med 0,05% natrium Azid ved 4 °C i flere år. - Anbring sektionerne i 0,1 M PB i en Petri skål, Undersøg afsnittene under et dissektions mikroskop, og vælg prøver til indlejring
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her.
3. skylning
Bemærk: Det er vigtigt at skylle præparatet efter fiksering med aldehyder og før post fiksation med osmium, da rester af fixativer kan fremkalde osmium-bundfald
- Pipette 0,1 M PB ind i et kort, bredt mund hætteglas med hætte. Anbring et eksemplar pr. hætteglas. Prøven skal være helt dækket, så den ikke tørrer.
Bemærk: Opbevar prøverne i det samme hætteglas fra dette trin gennem alle opløsningens ændringer af fiksering, udtørring og infiltration, indtil de er klar til flad integrering. - Præparatet skylles i 0,1 M PB i 3 min x 2, hvorefter PB fjernes med en mikropipette.
Bemærk: Da hjernen hos den nyfødte rotte er dybt følsom over for ændringer i osmolaritet12,35,36,37, skal du udføre vaskningerne i samme køretøj som det, der anvendes i den fiktivt blanding
4. efter fiksering med osmium
-
Fremstilling af osmium dinitrogentetraoxid (OsO4)
Bemærk: Denne forfatters laboratorium udnytter OsO4 4% leveres i en vandig opløsning i glas ampuller (5 ml OsO4 4% i H2O). Andre laboratorier har brugt OsO4 krystaller med succes. Men, flere timer er nødvendige for at opløse OsO4 krystaller i et køretøj.- Tag 5 mL (en ampul) med 4% OsO4/H2O, Åbn den, og anbring den i en brun glas flaske
Bemærk: OsO4 er et stærkt oxidationsmiddel og let reduceret ved udsættelse for lys. Reduktion kan undgås under tilberedning ved at placere OsO4 i en brun glas flaske - Der tilsættes 5 mL 0,2 M PB. Dette vil give 10 mL 2% OsO4/0,1 M PB.
Bemærk: Da hjernen hos den nyfødte rotte er dybt følsom over for ændringer i osmolaritet, brug den samme buffer til at forberede aldehyd fikseringer og OsO4 løsning12,35,36,37 - Der tilsættes yderligere 10 mL 0,1 M PB. Dette vil give en endelig opløsning på 20 mL 1% OsO4 i 0,1 m PB.
- Brug en 20 mL sprøjte med en lang nål til at trække 1% OsO4 og læg den i en brun glas flaske eller et scint hætteglas dækket med aluminiumsfolie.
Forsigtig: OsO4 er ekstremt flygtige og dens dampe er giftige for næse, øjne og hals. Alt arbejde skal udføres i en røg-hætte ved hjælp af handsker og beskyttende beklædning, og ingen kropsdel bør udsættes for OsO4. Håndtering og bortskaffelse af affald bør ske i henhold til din institutions retningslinjer. Opbevar den ubrugte OsO4 i en tætsluttende brun glas flaske med Teflon foring på glas proppen, Pak flasken i dobbelt aluminiumsfolie og opbevar den i en dessicator. I nærvær af utætte dampe kan OsO4 misfarve indvendige overflader og indholdet i køleskabet. Under de ovennævnte opbevaringsforhold er OsO4 -opløsningen stabil i flere måneder. Når løsningerne bliver oxideret under opbevaring, bliver de grå, og i så fald skal de bortskaffes.
- Tag 5 mL (en ampul) med 4% OsO4/H2O, Åbn den, og anbring den i en brun glas flaske
- Tilsæt 1% OsO4 i 0,1 M PB i hætteglasset med præparatet, og lad det sidde i 1 time. udtræk OsO4 efter 1 h med en mikropipette.
Bemærk: Før du anvender OsO4 til afsnittet, er det vigtigt at folde og flade prøven. Undgå påføring direkte oven på præparatet, brug i stedet hætteglassets vægge til forsigtigt at dryppe OsO4 til bunden af hætteglasset. Prøven bliver brun og stiv kort efter OsO4 ansøgning. Håndtag forsigtigt fra nu af for at undgå vævsskade
5. skylning
Bemærk: Det er vigtigt at skylle præparatet efter post fiksation med OsO4 og før dehydrering, da rester af fixativer kan reagere med dehydre rings midler37.
- Skyl med 0,1 M PB i 3 min x 3.
Bemærk: Da hjernen hos den nyfødte rotte er dybt følsom over for ændringer i osmolaritet, skal du udføre vaskningerne i samme køretøj som det, der anvendes i den fikse ende blanding12,35,36,37. - Placer osmium opløsningen og de første to PB skylninger i OsO4 affald og kassér den i henhold til din institutions retningslinjer.
6. sekventiel dehydrering og farvning med uranyl acetat
Bemærk: Denne forfatters laboratorium bruger vand-immiscible epoxyharpiks til indlejring. Når der anvendes epoxyharpiks, skal hele prøveemnets frie vand udskiftes med et organisk opløsningsmiddel, før det indlejrede medium infiltrerede det. Vand fjernes ved, at præparatet passerer gennem en række opløsninger af opstigende koncentrationer af ethanol og acetone12.
-
Klargøring af uranylnitrat acetat (UA)
- En 200 mL målekolbe indeholdende 100 mL EtOH 70% anbringes på en omrørings plade.
- Der tilsættes 4 g UA til kolben. Wrap i aluminiumsfolie (UA udfældet når de udsættes for lys) og røre kontinuerligt.
Bemærk: UA opløses langsomt og ufuldstændigt i 70% EtOH. Lad uopløste krystaller falde til ro, før opløsningen anvendes. UA-opløsningen skal filtreres med et 0,45 μm filter før brug. UA kan forberedes før tid og opbevares i en brun flaske pakket i aluminiumsfolie ved 4 °C i månedsvis.
Forsigtig: UA er mildt radioaktivt og meget giftigt. Indånding af UA pulver kan forårsage øvre luftvejssygdomme og sygdom i lungerne, leveren og nyrerne. UA er farlig, når det indtages, eller når det kommer i direkte kontakt med hud og slimhinder. Alt arbejde skal udføres i en stinkhætte ved hjælp af handsker og beskyttelsestøj. Håndtering og bortskaffelse af affald bør ske i henhold til din institutions retningslinjer.
- Dehydrat i 50% EtOH i 1 min. Fjern 50% EtOH før tilsætning af UA.
-
Tilsæt 4% UA i 70% EtOH. Lad sidde i 1 t eller natten over. Hvis du er natten over, anbringes i køleskabet ved 4 °C.
Bemærk: Cap hætteglas for at undgå EtOH fordampning og dække med aluminiumsfolie for at undgå udsættelse for lys. Protokollen kan sættes på pause her.- Bortskaf affald fra UA og de to følgende skylninger i henhold til din institutions retningslinjer
- Dehydrat i 70% EtOH i 1 min.
- Dehydrat i 90% EtOH i 5 min.
- Dehydrat i 100% EtOH i 5 min x 2.
- Prøven skylles i acetone i 2 min x 3.
7. infiltration og integrering
Bemærk: Væv er ikke tilstrækkeligt stift til at blive skåret i tynde sektioner uden yderligere støtte fra en harpiks matrix. Derfor skal infiltration og indlejring gå forud for sektionering af12.
-
Fremstilling af EPON harpiks
- Brug en 60 mL sprøjte med sonde. Fjern sprøjtens stempel, og hætte sprøjten med en sikkerhedskanyle.
- Anbring sprøjten med den åbne side opad og tilsæt volumenet af hver ingrediens i harpiks blandingen trinvist. Tilsæt 22 mL Embed-812 (harpiks). Tilføj DDSA (hærder) til et samlet volumen på 37 mL. Tilsæt NMA (hærder) til et samlet rumfang på 50,5 mL. Der tilsættes 525 μL DMP-30 (Accelerator) med en pipette. Bevæg pipettens stempel meget langsomt, da DMP er meget viskøs.
Bemærk: det er vigtigt at tilføje de indlejrings reagenser i den angivne rækkefølge. Speederen (DMP-30) skal tilføjes sidst. For at opnå en hærdet blok, der har de ønskede egenskaber, er det afgørende at bruge den nøjagtige mængde af hærder og speederen. Frisk tilberedte integrerings blandinger foretrækkes. - Sæt stemplet tilbage, og Anbring sprøjten på en rocker med kontinuerlig omrystning i mindst 30 min. farve vil skifte fra gul til rav.
Bemærk: Alle ingredienser skal blandes meget grundigt. Undladelse af at gøre dette resulterer i ujævn imprægnering af vævsprøven og en blok af ujævn hårdhed
- Bland 1 volumen EPON harpiks med 1 volumen acetone i et scint hætteglas og ryste at blande. Påfør 1:1 EPON: acetone blandingen på vævet efter fjernelse af den sidste acetone skylning. Hold dækket for at undgå acetone fordampning. Fjern 1:1 blandingen af harpiks og acetone efter 2-4 h eller holde natten over.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. - Udskift blandingen af harpiks og acetone med fuld harpiks. Lad det sidde i 4 timer eller natten over. Sæt alt EPON-affald i en opsamlingsbeholder under kølerhjelmen for at blive polymeriseret og bortskaffet senere.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her.
8. flad-indlejring
Bemærk: Prøverne er flade-indlejret mellem to aclar film i en sandwich-lignende måde.
- Skær to rektangulære stykker af klart aclar ark. Tør filmene ren med EtOH 70%. Trim arkene, så der er mindst 1,5 cm af tissue-fri plastik på hver side af sektionen. Aclar ark på toppen skal have samme bredde som bunden, og dens højde bør være ca. to tredjedele af det nederste ark.
- VIP hætteglasset langsomt med præparatet, og løft forsigtigt vævet fra bunden af hætteglasset.
- Brug en mikro fleksibel spatel og en fin børste til forsigtigt at flytte sektionen langs hætteglassets vægge og Overfør på aclar ark.
Bemærk: Håndtér sektioner med forsigtighed for at undgå beskadigelse af præparatet. - Anbring forsigtigt arket oven på præparatet.
Bemærk: Sørg for, at der er nok harpiks mellem de to ark til at forsegle sandwich - Skub forsigtigt eventuelle indelukkede luftbobler ud uden at lægge direkte pres på sektionen. Tør overskydende EPON ud.
Bemærk: Eliminationen af luftbobler er vigtig, da deres tilstedeværelse gør visualisering af præparatet vanskelig og svækker stabiliteten af harpiks obligationerne. - Mærk arkene med en solvent resistent pen og anbring den i ovnen ved 60 ͦC i 2-3 dage til polymerisering.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her.
9. integrering af kapsel
Bemærk: Ultramikrotomer leveres med spændeenheder til at holde cylindriske blokke opnået fra indlejring af prøver i kapsler. Cylindriske blokke har den ideelle geometri til at være mindst påvirket af vibrationer, der opstår under skæring.
- Åbn forsigtigt de klemt aklar film. Prøven vil holde sig til en af de to aclar ark.
- Brug en solvens bestandig pen til at markere den side af aclar arket, der indeholder sektionen. Mark i nærheden af vævet.
Bemærk: Det er afgørende at udføre dette trin, før stansning ud væv af interesse. - Brug en disk punch til at få en cirkeludsnit af sektionen. Pennens mærke skal være en del af det udstansede væv.
- Forbered hætten på en indkapslet kapsel side op på en kapsel holder. Anbring en dråbe harpiks på hætten.
- Anbring den udstansede skive inde i hætten med vævs sektionen opad. Pennens mærke vil glimte, når lyset er skinnede på præparatet.
- Indsæt en kapsel i hætten og bruge fine pincet til at indsætte mærkning. Rul og sænk et trykt 2 cm langt stykke papir ind i kapslen. Gør etiketten til at passe til krumningen af sidevæggene i kapslen. Vent, indtil Polymeriseringen er færdig, så etiketten bliver permanent indlejret i harpiks.
- Hæld indkapslet harpiks inde i kapslen og fyld indtil kanten af kapslen.
- Vævsprøven skubbes ned til bunden af kapslen ved hjælp af en spidse træpind og anbringes i ovnen ved 60 °C i 2-3 dage.
Bemærk: Pas på ikke at trykke vævet for hårdt, i stedet lade det ligge løst, så et tyndt lag af indlejrings mediet er til stede mellem vævet og kapsel overfladen. Protokollen kan sættes på pause her.
10. beskæring af blok ansigt
Bemærk: Lille størrelse og passende form af blokken ansigt er forudsætninger for tilfredsstillende skæring. Derfor er det nødvendigt at beskære objekt blokken.
- Brug et skarpt knivblad med ét skær. Rengør med acetone umiddelbart før brug.
- Monter kapsel blokken i en blok holder, og Anbring blok holderen på scenen af et stereo mikroskopi.
Bemærk: Trimnings proceduren skal udføres under mikroskop kikkerter og skrå belysning. - Fjern aclar-arket fra kapslens spids ved hjælp af et barberblad. Aclar arket fremstår som et skinnende lag under hensyntagen til det dissekere område.
- Hold barberbladet i en vinkel på 45 grader, og foretag nedskæringer på fire sider af kapsel blokken.
Bemærk: Bedre kontrol af trimning opnås, hvis klingen holdes med begge hænder. - Lav korte nedskæringer, så blokken tager form af en kort pyramide med vægvinkler på ca. 45 °.
Bemærk: Objekt ansigtet understøttes meget bedre, hvis siderne, der fører til det, holdes korte. Hvis blok spidsen er for tynd og lang, vil den vibrere under tynde skæring. Ideelt set bør det område af interesse være centreret i blokken ansigt. - Trim spidsen af kapslen for at kassere overflødigt væv og kun bevare det område af interesse.
Bemærk: Ingen del af sektionen skal være uden væv, da variationer i blokkens tæthed er en væsentlig årsag til vanskeligheder i sektionering. Ideelt set bør overfladearealet af kapsel ansigtet ikke være mere end 1 mm2. - Trim kapslen ansigt i form af en scalen trapezoid. Fordi i en scalen trapez ingen side er lig, denne form er bedst at orientere området af interesse i forhold til resten af prøven.
Bemærk: Under skæring, er trapezoid-formet ansigt understøttet meget bedre end nogen anden form.
11. mikrotom skæring
Bemærk: De fleste biologiske prøver er for tykke i deres naturlige tilstand til at blive gennemtrængt af en elektronstråle. Derfor skal materialet skæres i tynde sektioner, der kan gennemtrænges af elektronstrålen.
- Skær tynde sektioner (sølv interferens farve, 600-900 Å) på en ultramicrotome på planer parallelt med overfladen.
- Placer sektionerne på gitre. Denne forfatters laboratorium bruger kobber gitre på 3,05 mm i udvendig diameter.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her.
12. post-farvning med uranyl acetat
- Forbered 2% UA i destilleret vand. En 200 mL målekolbe med 100 mL destilleret vand anbringes på en omrørings plade. Der tilsættes 2 g UA til kolben. Wrap i aluminiumsfolie (UA udfældet når de udsættes for lys) og røre kontinuerligt.
Bemærk: Nærmere oplysninger om forberedelse af UA findes i afsnit 6 i denne protokol. - Placer flere individuelle dråber på 2% UA på et rent ark dentalvoks i en Petri skål.
- Flyde gitteret med præparatet (sektions side nedad) på en dråbe UA i 25 min.
Bemærk: Float hvert gitter på en separat dråbe UA. - Hold gitteret på kanten med pincet og skyl to gange under en blid stråle af kogt destilleret vand ved stuetemperatur fra en plastik vaske flaske.
Bemærk: Lad ikke gitteret tørre før farvning med bly.
13. post-farvning med bly
- Forbered en CO2-fri KAMMER (co2 i luften er den primære kilde til bly nedbør). Anbring et stykke filtrerpapir, der er gennemblødt med 1 N NaOH, i en Petri skål. Anbring en lille plade af ren dentalvoks på toppen af filtrerpapiret og læg flere NaOH pellets på den ene side af skålen. Dæk skålen.
Bemærk: Forbered denne opsætning, før gitrene er farves med UA, således at atmosfæren i kammeret er fri for CO2 og klar til bly farvning af tiden UA farvning er afsluttet. - Gør 4% NaOH. Der tilsættes 0,2 g NaOH til 5 mL destilleret vand.
- Forbered Sato tredobbelt bly løsning. Til tilberedning af 10 mL tilsættes 0,1 g blynitrat, 0,1 g blycitrat, 0,1 g blyacetat og 0,2 g natriumcitrat i en glas flaske. Der tilsættes 8,2 mL destilleret vand, og der rystes kraftigt i 5 min. der sonikeres i 30 s, hvorefter der tilsættes 1,8 mL frisklavet 4% NaOH.
- Anbring flere dråber af Sato bly på voks i Petri skålen.
- Placer gitteret plettet med UA (sektions side ned) på dråbe bly.
Bemærk: Hvert gitter skal fleres på en separat dråbe bly. Hver dråbe skal være lille nok til at lade gitteret flyde på toppen af kuplen af drop i stedet for at glide ned på siderne. - Dæk skålen og lad pletten i 5 min.
- Hold gitteret på kanten med pincet og vask grundigt under en blid stråle af kogt destilleret vand ved stuetemperatur fra en plastik vaske flaske.
- Blot tør gitteret på filtrerpapir og opbevar gitteret.
Bemærk: Sørg for, at sektionen ikke kommer i direkte kontakt med filter papiret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der er fastlagt generelle kriterier, som for det meste accepteres som tegn på tilfredsstillende eller mangelfuld konservering af enheden for TEM. Disse kriterier er eksemplificeret i fire udvalgte elektron mikrografer (to eksempler på optimal tilberedning, to eksempler på defekt præparat), som blev opnået ved at behandle unge rotte hjernevæv efter de metoder, der er beskrevet i denne protokol.
Generelt fremstår en elektron Mikrograf af god kvalitet som en velordnet, tydelig og overordnet grålig afbildning. I en tilfredsstillende forberedt prøve skal mellemrum mellem membraner fyldes med granulært materiale og må ikke være tomme. På samme måde må der ikke findes tomme rum i det cytoplasmatiske grundstof eller i organeller (Sammenlign figur 1a og figur 2a med figur 3 og figur 4). Ikke desto mindre er det vigtigt at bemærke, at det centrale nervesystem af meget unge dyr viser en vis grad af udvidelse af ekstracellulære rum i forhold til den voksne hjerne, med løsere forbindelser mellem cellerne og en samlet hikke, mindre elektron-tætte udseende. Membraner skal være kontinuerlige, uden forvrængning eller brud (figur 1a og figur 2a). Den stroma af mitokondrier bør fremstå ensartet og tæt, uden tomme rum. Cristae skal være intakt og ikke opsvulmet, og den mitokondrie ydre dobbelt membran skal være ubrudt (Sammenlign figur 1a med figur 3). For at lette morfometrisk analyse af præ-synaptisk vesikel organisation skal præ-og post synaptiske membraner være intakte og i det væsentlige parallelle med hinanden (Se figur 1). Synaptiske vesikler skal kunne spores og bindes af en kontinuerlig enkelt membran (Se figur 2).
Vigtigere, selv når bedste praksis følges, behandling af prøven med fixativer, pletter og harpiks introducerer artefakter. Da artefakter ikke kan elimineres, er det afgørende at forstå, hvad proces stammer dem, således at udseendet af præparatet kan fortolkes med hensyn til den behandling, det gennemgik12. Et eksempel på en artefakt-blandt flere, der kan genereres under præparat forberedelse til TEM-er en myelin figur, en membranøs lamel inklusion, der ligner myelin sheaths. Selv om myelin tal kan ses i patologiske forhold12, de oftest skyldes ekstraktion af membran lipider under fiksering med aldehyder (Se figur 4).
Figur 1: elektron Mikrograf, der er repræsentativ for tilfredsstillende konservering af cellestrukturen (eksempel 1). (A) neuronale cellemembraner er lagdelt og uden pauser. Cytoplasma er fint granuleret og uden tomme mellemrum. Mitokondrier er hverken hævede eller skrumpet. Deres ydre dobbelt membran er bevaret, og indre cristae er intakt. (B) detalje af panel A, eksemptificere en metode til måling af afstanden af synaptiske vesikler fra den præ-synaptiske membran. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: elektron Mikrograf, der er repræsentativ for tilfredsstillende konservering af cellestrukturen (eksempel 2). (A) synaptiske vesikler er adskilte og foret med en ubrudt enkelt membran. For at tillade morfometrisk analyse af synaptisk vesikel fordeling, præ-synaptiske og post synaptiske membraner skal være parallelle og deres kontinuitet bevaret. (B) detalje af panel A, eksemptificere optælling af synaptiske vesikler i den præ-synaptiske terminal. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: elektron Mikrograf, der er repræsentativ for defekt opbevaring af vævs struktur (eksempel 1). Bemærk forvrængning og brud af neuronal cellemembraner og tilstedeværelsen af markant forstørrede ekstracellulære rum (markeret med *). Mitochondrier vises udspilet og har hævede cristae (markeret med pil). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: elektron Mikrograf, der er repræsentativ for defekt opbevaring af vævs struktur (eksempel 2). Bemærk tilstedeværelsen af store hvide tomme rum i cytoplasma (mærket med ǂ), i stedet for fint granulært cytoplasmatiske stof. Ekstracellulære rum vises forstørret. En artifaktuel membranøs hvirvler (myelin-figur), som sandsynligvis skyldes mobilisering af lipider under fiksering med glutaraldehyd, er mærket med forkortelsen MF. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Håndtering af vævs sektioner under præparat forberedelsen til TEM kræver en betydelig grad af finesse, koncentration og tålmodighed. Når der anvendes en mikropipette til at tilføje og fjerne opløsninger, kan prøverne suges ind i pipettespidsen med overfladespænding, så der skal udvises stor omhu for at undgå vævsbeskadigelse af pipetten. Også, visse trin af dehydrering sekvens kan være så hurtig som 1 min, derfor operatøren har brug for at arbejde hurtigt for at sikre, at den næste dehydrering trin startes til tiden, og prøven ikke tør eller rynke. En procedure, der kræver særlig opmærksomhed er post-fiksering med osmium. Sektioner bliver stive efter behandling med osmium og kan let beskadiges. Før du tilføjer osmium, er det bydende nødvendigt, at sektionerne er fladtrykt i bunden af hætteglasset, ellers enhver fold vil resultere i vævs fraktur. Håndtering af vævet væv er særlig udfordrende, når man overfører sektioner til aclar film til flad indlejring. Der skal udvises særlig forsigtighed, når præparatet løftes fra bunden af hætteglasset for at undgå fragmentering, og når der skubbes luftbobler ud af film sandwichen. Mens det er vigtigt at skubbe enhver fanget luft, da det gør visualisering af præparatet vanskeligt og svækker stabiliteten af harpiks obligationer, direkte pres på osmiurt væv kan nemt påføre skade. Et andet skridt, der kræver ekstra omhu er forberedelse af harpiks blandingen for præparat infiltration og indlejring. EPON, som er den mest udbredte indlejrings harpiks, kan hærdes med tilsætning af en hærder og en accelerator. Det er bydende nødvendigt at bruge den nøjagtige mængde af hærder og Accelerator for at opnå en hærdet blok med de ønskede egenskaber. Både gravimetriske og volumetriske metoder er blevet beskrevet til måling af viskøse harpiks. Selv om gravimetriske metoder traditionelt er blevet betragtet som mere præcise12, har denne forfatters laboratorium haft god succes med volumetriske tilstande (dvs. at tilføje mængden af hver ingrediens i harpiks blandingen trinvist ved hjælp af en sonde sprøjte) . Efter at harpiks komponenterne er blevet omhyggeligt målt, skal de blandes meget grundigt for at opnå ensartet imprægnering, da de besidder forskellige viskositeter og satser for polymerisering. Hvis der ikke opnås fuldstændig blanding, vil det resultere i en blok af ujævn hårdhed, der er uegnet til tynde skæring.
Markante ændringer i tonicitet af de løsninger, der anvendes til at behandle sektioner af unge rotte hjernen kan forårsage krympning og/eller hævelse af det ekstracellulære rum og cellulære komponenter12,35,36,37 . Under fiksering opnås de bedste resultater, når det osmotiske Tryk på perfusatet holdes så meget som muligt på det væv, der er under undersøgelse. Rotte hjernen osmolalitet er ca. 330 mOsm. En 2% glutaraldehyd i 0,1 M PB opløsning er kun lidt hypertonisk (400-450 mOsm) og minimerer udvidelsen af det ekstravaskulære rum12. Især er membraner fortsat følsomme over for ændringer i det osmotiske Tryk på skylle-og dehydre Rings opløsningerne efter fiksering med aldehyder. Derfor er det også vigtigt at minimere forskellene mellem den fiksativ og de opløsninger, der anvendes efterfølgende12,35,36,37. Af denne grund anvendes det samme køretøj (0,1 M PB, omtrentlig osmolaritet 440 mOsM) som opløsningsmiddel for alle opløsninger i denne protokol. Det skal dog bemærkes, at flere forskellige buffere har været anvendt med succes under præparat forberedelse til TEM og ingen enkelt buffer kan kræve universel overlegenhed over de andre. Når buffere af lavere tonicitet foretrækkes, har andre laboratorier valgt at øge osmolariteten med elektrolytter eller ikke-elektrolytter12.
Flere trin i denne protokol kræver brug af kemikalier, der kan være giftige, når de ikke håndteres korrekt. Betydningen af at arbejde under en røg-hætte og iført personlige værnemidler, mens håndtering af aldehyder, osmium, uran og bly forbindelser kan ikke overvurderes. Mens automatiserede kontrast systemer kan hjælpe med at dæmpe nogle af risikoen og er kommercielt tilgængelige, kan de være ret dyrt og kan ikke være overkommelige af laboratorier, der ikke gør rutinemæssig brug af TEM. Selv om elektronmikroskopet laboratoriet potentielt kan være et farligt sted, er præparat behandling for TEM generelt sikker, når det udføres stringent.
For nylig, indførelsen af super-opløsning lys mikroskopi har øget optisk Imaging løsning magt til omkring 15 nm34. Men når målet er at udføre morfometrisk analyse af synaptisk vesikel rumlig organisation på præ-Synaptic terminaler, ingen teknik giver den samme grad af morfologiske detaljer. Det er vigtigt, at TEM er begrænset af behovet for, at præparatet er dødt, før det kan behandles og visualiseres. Når undersøgelsens formål er at undersøge dynamiske eller funktionelle aspekter af den synaptiske blære handel og ekocytose, bør der derfor tages hensyn til andre værktøjer end TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette manuskript blev støttet af NIH/NIGMS K08 123321 (til N.L.) og af midler fra Institut for anæstesiologi ved University of Virginia. Forfatterne ønsker at takke Alev Erisir (Department of Biology, University of Virginia, Charlottesville, VA) for fremragende uddannelse og teknisk bistand med TEM, og for hendes uvurderlige manuskript kritik. Forfatterne også takke Advanced Electron Micro scopy facilitet på University of Virginia for teknisk bistand med præparat skæring og post-farvning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | "size 00, flat (cut bottom)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats. Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).
- Sanchez, V., et al. General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain. Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).
- Boscolo, A., et al. The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity. Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).
- Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study. Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).
- Akert, K., Sandri, C. Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses. Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. Santini, M. , Raven Press. NY. 387-399 (1975).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy. Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid. Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).
- Burry, R. W., Lasher, R. S. A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA. Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).
- Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique. Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).
- Pfenninger, K. H. The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method. Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).
- Hayat, M. A. Chemical fixation. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. Hayat, M. A. , Cambridge University Press. 4-84 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. Hayat, M. A. , Academic Press. San Diego. (1981).
- Behrman, E. J., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. Revel, J. P., et al. , Scanning Electron microscopy Inc, AMF. O’Hare, Chicago. 1-5 (1983).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins. Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).
- Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands. Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).
- Zobel, C. R., Beer, M. The use of heavy metal salts as electron stains. International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).
- Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy. Experientia. 24 (10), 1074 (1968).
- Terzakis, J. A. Uranyl acetate, a stain and a fixative. Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).
- Feldman, I., Jones, J., Cross, R. Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides. Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).
- Shah, D. O. Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer. Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).
- Daems, W. T., Persijn, J. P. Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue. Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&4), 199-201 (1963).
- Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).
- Derksen, J. W., Meekes, H. Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate. Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).
- Frasca, J. M., Parks, V. R. A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts. Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).
- Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. A stable lead by modification of Sato’s method. Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).
- Sato, T. A modified method for lead staining of thin sections. Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).
- Lever, J. D. A method of staining tissues with lead for electron microscopy. Nature. , 810-811 (1960).
- Derek, G., et al. Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy. Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).
- Richards, J. G. Ultrastructural histochemistry of nervous tissue. Techniques in Neuroanatomical Research. Heyn, C., Forssmann, W. G. , Springer. Berlin. 277-292 (1981).
- Wood, R. L., Luft, J. H. The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide. Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).
- Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer. Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).
