Summary
Describimos procedimientos para el procesamiento de tejido cerebral de rata recién nacida para obtener micrografías electrónicas de alta resolución para el análisis morfolométrico de la distribución de vesículas sinápticas en los terminales nerviosos. Los micrográficos obtenidos con estos métodos también se pueden utilizar para estudiar la morfología de un número de otros componentes celulares y sus relaciones estructurales dimensionales.
Abstract
Nuestro laboratorio y muchos otros han explotado el alto poder resolutivo de la microscopía electrónica de transmisión para estudiar la morfología y la organización espacial de las vesículas sinápticas. Con el fin de obtener micrografías electrónicas de alta calidad que pueden producir el grado de detalle morfológico necesario para el análisis cuantitativo de la distribución de las vesículas presinápticas, la preparación óptima de la muestra es fundamental. La fijación química es el primer paso en el proceso de preparación de la muestra, y de máxima importancia para preservar la ultraestructura fina. La fijación vascular con una solución de glutaraldehído-formaldehído, seguida por el tratamiento de las muestras seccionadas por vibratome con tetroóxido de osmio, estabiliza el número máximo de moléculas, especialmente las proteínas y los lípidos, y resulta en una conservación superior de ultrestructure. A continuación, el tejido se procesa con antimanchas, deshidratación secuencial e incrustación de resina. La tinción en bloque con acetato de uranil (es decir, tinción de tejido seccionado con vibratome antes de la incrustación de resina) mejora el contraste endógeno y estabiliza los componentes celulares contra la extracción durante el procesamiento de muestras. El contraste se puede aumentar aún más aplicando el acetato de uranil como un post-mancha en las secciones ultrafinas. La doble tinción de secciones ultrafinas con citrato de plomo después del tratamiento con acetato de uranil también mejora la resolución de la imagen, intensificando la opacidad del electrón de las estructuras que contienen ácido nucleico mediante la Unión selectiva del plomo al acetato de uranil. La microscopía electrónica de transmisión es una poderosa herramienta para la caracterización de los detalles morfológicos de las vesículas sinápticas y la cuantificación de su tamaño y organización espacial en el Bouton terminal. Sin embargo, debido a que utiliza tejido fijo, la microscopía electrónica de transmisión solo puede proporcionar información indirecta con respecto a los procesos vivos o en evolución. Por lo tanto, deben tenerse en cuenta otras técnicas cuando el objetivo principal es estudiar aspectos dinámicos o funcionales del tráfico de vesículas sinápticas y la exocitosis.
Introduction
Describimos métodos para la preparación del tejido cerebral de rata recién nacida para obtener micrografías electrónicas de alta calidad para el análisis morfolométrico en profundidad de la distribución espacial de las vesículas sinápticas en las terminales nerviosas1,2. Los micrográficos de alto contraste que se pueden obtener mediante el procesamiento de especímenes siguiendo estos métodos también se pueden utilizar para estudiar la morfología detallada de una serie de componentes celulares y sus relaciones estructurales dimensionales3,4.
El microscopio electrónico de transmisión (TEM) es una poderosa herramienta para estudiar cuantitativamente la morfología de los organelos y otras estructuras celulares. A partir de esta década, no hay otros métodos de investigación que pueden proporcionar el mismo grado de resolución de las membranas lipídicas y organelos sin el etiquetado inmunológico, con la excepción de la criofixación por congelación a alta presión. Sin embargo, las técnicas de sustitución de congelación no se utilizan ampliamente, y normalmente requieren equipo costoso y largos tiempos de preparación.
Con el fin de aprovechar el alto poder de resolución de TEM, la preparación óptima de la muestra es de suma importancia. Los objetivos principales de la preparación de muestras son preservar la estructura del tejido con una alteración mínima del estado vivo, mejorar el contraste de la muestra y estabilizar el tejido contra la extracción de componentes celulares durante el procesamiento y la exposición al electrón rayo. Varios laboratorios han introducido y perfeccionado numerosos protocolos para la preparación de tejidos TEM a lo largo de los años. Muchos de ellos se han centrado en métodos para la visualización óptima de vesículas sinápticas5,6,7,8,9,10,11. Entre una serie de métodos estándar de oro bien establecidos actualmente en uso, elegimos procedimientos para la fijación de productos químicos, fijación posterior, tinción en bloque, deshidratación secuencial, incrustación de resina y tinción post que tienen como objetivo preservar la estructura del tejido óptimo y lograr un excelente contraste de imagen. Cabe destacar que la preservación de la ultraestructura fina puede ser particularmente difícil cuando se trabaja con tejido cerebral de rata recién nacida. De hecho, el sistema nervioso central de animales muy jóvenes se caracteriza por un mayor contenido de agua que el cerebro adulto, una ampliación más prominente de los espacios extracelulares y conexiones más sueltas entre las células12. Esto hace que el tejido cerebral de rata recién nacido profundamente sensible a los cambios en la osmolaridad, y exquisitamente propenso a la contracción artística y/o hinchazón cuando se procesa a través de soluciones secuenciales de diferentes tonicidad12. Por lo tanto, nuestros métodos emplearon soluciones para el procesamiento de muestras que son de osmolaridad lo más cerca posible a la del cerebro de rata recién nacido. Nuestro objetivo era obtener imágenes de microscopía electrónica de alta calidad y alta resolución para la evaluación cuantitativa de la distribución espacial de las vesículas sinápticas en los terminales nerviosos. Concretamente, procuramos medir el número de vesículas dentro del terminal nervioso, la distancia de las vesículas sinápticas de la membrana plasmática presináptica, el número de vesículas acopladas a la membrana presináptica, el tamaño de las vesículas sinápticas y el distancias entre las vesículas1.
La fijación química satisfactoria es un prerrequisito para la obtención de micrografías electrónicas de alta calidad que pueden proporcionar el detalle morfológico necesario para estudiar la morfología de las vesículas sinápticas y la organización espacial. Aunque existen varios modos de fijación, la fijación del tejido cerebral por perfusión vascular es decididamente superior a otros métodos. Dado que la fijación a través de la perfusión vascular comienza inmediatamente después de la detención de la circulación sistémica, acorta el intervalo entre la desoxigenación del tejido cerebral y el reticulamiento de proteínas con fijadores, resultando en alteraciones mínimas en la célula Estructura. Además, logra una penetración rápida y uniforme, debido al rápido flujo del fijador desde el lecho vascular hasta los compartimentos extracelulares y celulares12,13,14. La fijación primaria con glutaraldehído, seguida de una fijación secundaria (post-fijación) con tetroóxido de osmio, produce una excelente preservación de la estructura fina15,16,17. Una mezcla de glutaraldehído y paraformaldehído tiene la ventaja adicional de una penetración más rápida en el tejido12.
Dado que los tejidos biológicos no son lo suficientemente rígidos para ser cortados en secciones delgadas sin el apoyo de una matriz de resina, necesitan ser incrustados en un medio antes de seccionar delgadas. Las resinas epoxi inmiscibles en agua se utilizan comúnmente como medio de incrustación en TEM. Cuando se utiliza este tipo de matriz, el agua libre de todas las muestras debe sustituirse por un disolvente orgánico antes de la infiltración de resina. El agua se retira pasando la muestra a través de una serie de soluciones de concentraciones ascendentes de etanol y/o acetona12. En este protocolo, los especímenes son primero planos incrustados entre láminas flexibles de Aclar, y luego se incrustan en una cápsula. El resultado final es el tejido situado en la punta de un bloque de resina cilíndrica, que tiene la geometría ideal para ser menos afectada por las vibraciones que surgen durante la seccionamiento del microtomo.
La tinción con metales pesados para mejorar el contraste de tejido endógeno es otro aspecto importante de la preparación de muestras. El contraste de la imagen en TEM se debe a la dispersión de electrones por los átomos en el tejido. Sin embargo, los materiales biológicos consisten en gran parte de moléculas de bajo peso atómico (es decir, carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno). Por lo tanto, la generación de suficiente contraste de dispersión requiere la incorporación de átomos de alto peso atómico en los componentes celulares del tejido. Esto se logra a través de la tinción de la muestra con metales pesados12,18,19. El tetroóxido de osmio, el uranio y el plomo, que se unen fuertemente a los lípidos, son los metales pesados más comunes utilizados como manchas de electrones.
El osmio (número atómico 76) es uno de los metales más densos que existen. Es un fijador y una mancha, aunque su papel principal en TEM es como un fijador confiable12. Entre los diversos protocolos de fijación en uso, el método de doble fijación con glutaraldehído seguido de osmio es el más eficaz en la reducción de la extracción de componentes celulares durante la preparación de la muestra. Estos dos fijadores se utilizan para estabilizar el número máximo de diferentes tipos de moléculas, especialmente proteínas y lípidos, y resultan en una preservación superior de la ultraestructura de los tejidos12,14,15, 16 , 17.
El uranio (número atómico 92) es el metal más pesado utilizado como mancha de electrones, más típicamente en forma de acetato de uranil. Al igual que el osmio, actúa como una mancha y fijador, aunque su papel principal en TEM es como una mancha20,21. Las estructuras membranosas y que contienen ácido nucleico están fuertemente y preferentemente manchadas con sales de uranil en los tejidos de aldehído fijo22,23. El tratamiento de los tejidos con acetato de uranil después de la osmicación y antes de la deshidratación da como resultado la estabilización de estructuras que contienen ácido membranoso y nucleico, así como un mayor contraste, y permite la identificación de algunos detalles estructurales que no ser detectado fácilmente en especímenes manchados con osmio solo12,24,25. Se cree que el acetato de uranil puede estabilizar la estructura fina combinando con el osmio reducido que se ha depositado en las membranas lipídicas durante la osmication24. El contraste máximo se logra cuando el acetato de uranil se aplica antes de la incrustación y como una mancha posterior en las secciones delgadas12.
El plomo (número atómico 82) es la mancha más común utilizada para TEM y se emplea principalmente para la posttinción de secciones delgadas. Las sales de plomo tienen una alta opacidad de electrones y muestran afinidad por una amplia gama de estructuras celulares, incluyendo membranas, proteínas nucleares y citoplasmáticas, ácidos nucleicos y glucógeno26,27. Cuando se emplea el método de tinción doble (es decir, la tinción con acetato de uranil es seguida por el tratamiento con plomo), este último actúa como un desarrollador de tinción de acetato de uranil. Por ejemplo, el plomo después de la coloración de la cromatina fijada con glutaraldehído incrementa la captación de acetato de uranil por un factor de tres28,29,30,31,32. El plomo también mejora la coloración que imparten otros metales como el osmio. Se cree que las sales de plomo mancha las membranas de los tejidos fijos de osmio al unirse al grupo polar de fosfatos en presencia de un reducido osmio33. Una posible desventaja de la tinción con el acetato de uranil y el plomo, especialmente para las duraciones prolongadas, es que muchos elementos estructurales diferentes se tiñen por igual y no específicamente, y por lo tanto no pueden distinguirse fácilmente unos de otros12 .
La reciente introducción de fuentes de luz alternativas, como la microscopía óptica de localización fotográfica de superresolución, ha mejorado significativamente la resolución34de microscopía de luz. Sin embargo, debido a que la microscopía ligera se basa en métodos histoquímicos e inmunes-citoquímicos para visualizar proteínas o enzimas etiquetadas individualmente, la potencia de TEM para mostrar todos los elementos estructurales a la vez sigue siendo insuperable para el estudio en profundidad de la morfología y las relaciones dimensionales de las estructuras tisulares. En particular, ninguna otra técnica puede proporcionar el detalle morfológico necesario para realizar análisis morfológicos de la distribución de las vesículas sinápticas en los Boutons del nervio presináptico. Sin embargo, es importante señalar que los micrográficos electrónicos capturan la estructura del tejido después de que el organismo muere, y por lo tanto no pueden proporcionar información sobre la dinámica del tráfico de vesículas pre-sináptica y la exocitosis. Por lo tanto, otras herramientas, tales como el tinte FM-imágenes en vivo y electrofisiología patch-Clamp, deben tenerse en cuenta cuando el objetivo principal es estudiar los aspectos dinámicos y/o funcionales del tráfico de vesículas sinápticas y la exocitosis.
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Protocol
Todos los estudios fueron aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales en la Universidad de Virginia (Charlottesville, VA) y llevados a cabo de acuerdo con las pautas de los institutos nacionales de salud.
1. fijación por perfusión vascular
Nota: Una descripción general del método para la perfusión vascular cerebral de rata ya se ha detallado en esta revista13 y está fuera del alcance de este protocolo. Sin embargo, los siguientes pasos son específicos para la preparación de tejido cerebral de rata recién nacida para obtener micrografías electrónicas de alta calidad para el análisis cuantitativo de la distribución de vesículas sinápticas en terminales presinápticas.
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Prepare un 4% de paraformaldehído
- Colocar 800 mL de tampón de fosfato de 0,1 M (PB) en un vaso de precipitado de vidrio de 2 litros en una placa de agitación bajo una campana extractora. Calentar a aproximadamente 60 ° c sin hervir el tampón.
- Añadir 40 g de polvo de paraformaldehído. Remover continuamente
- Mientras mide el pH, agregue pequeñas gotas de 10 N NaOH hasta que la solución desaparezca. El pH final debe ser 7.2-7.4.
- Añadir 0,1 M PB restante a un volumen final de 1 L. Deje enfriar, filtre con una membrana de 0,45 μm y almacene a 4 ° c durante la noche.
Nota: Prepare paraformaldehído fresco el día antes de la perfusión.
PRECAUCIÓN: La inhalación de vapores de aldehído puede causar síntomas nasales e irritación de las vías respiratorias. El contacto con la piel causa dermatitis. Los aldehídos deben manipularse con un extractor de humos mientras llevan guantes, una bata protectora y gafas de seguridad
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Prepare la solución Tyrode
- Colocar 1 L de agua destilada en un vaso de precipitados de vidrio en una placa de agitación. Añadir NaCl (8 g), KCl (0,15 g), CaCl2 (0,1 g), MgCl2 (0,006 g), Nah2po4 (0,055 g), NaHCO3 (1 g) y dextrosa (1 g) en el vaso de precipitados.
- Remover continuamente y medir el pH. Mantenga el pH entre 7,2 y 7,4.
Nota: La solución de Tyrode también está disponible comercialmente.
- Mezclar el 4% de paraformaldehído con glutaraldehído a una concentración final del 2%. Añadir 40 mL de microscopía electrónica de grado 50% glutaraldehído a 1 L de 4% de paraformaldehído. Mezclar bien en una placa de agitación
Nota: Se necesitan aproximadamente 100 mL de la solución fijadora paraformaldehído-glutaraldehído para perfulizar el cuerpo de una rata recién nacida. Por lo tanto, al menos 10 ratas recién nacidos se pueden perfundir con 1 L de fijador. No mezcle paraformaldehído y glutaraldehído hasta inmediatamente antes de su uso. Lleve todas las soluciones a la temperatura ambiente antes de la perfusión. - Una vez que se ha obtenido el acceso al ventrículo izquierdo (ver el protocolo de perfusión de animales enteros13), lave el sistema vascular con la solución de Tyrode durante 30 s a una presión de perfusión de 120 mmHg.
Nota: El éxito de la perfusión depende en parte de la exclusión total de la sangre del lecho vascular - Enjuague con solución de paraformaldehído-glutaraldehído a la misma presión durante 10 min.
Nota: El mantenimiento de la presión de perfusión constante es esencial para evitar la introducción de artefactos. Además, la temperatura del perfusato no debe estar por debajo de la temperatura corporal de la rata para evitar la vasoconstricción - Retire el cerebro fijo del cráneo y colóquelo en fijador de paraformaldehído-glutaraldehído fresco a 4 ° c durante la noche.
Nota: el protocolo se puede pausar aquí.
2. rebanado cerebral
- Inserte el cerebro fijo en un 4% de agarosa y pegue el bloque cerebro-agarosa en una etapa de vibratomo
Nota: Otros laboratorios han obtenido secciones de buena calidad logrando un bloqueo estable en el vibratomo sin soporte de agar - Rebanadas de sección de 50 μm de espesor. Ajuste el microtomo a baja frecuencia y velocidad.
Nota: Las secciones se pueden almacenar en 0,1 M PB con un 0,05% de azida sódica a 4 ° c durante varios años. - Colocar las secciones en 0,1 M PB en una placa de Petri, examinar las secciones bajo un microscopio de disección y seleccionar especímenes para incrustar
Nota: El protocolo se puede pausar aquí.
3. Enjuague
Nota: Es importante enjuagar la muestra después de la fijación con aldehídos y antes de la fijación posterior con osmio, ya que los fijadores residuales pueden producir precipitados de osmio
- Pipetear 0,1 M PB en un vial de vidrio de boca corta y ancha con tapón. Coloque un espécimen por cada vial. Cubra completamente la muestra para que no se seque.
Nota: Mantenga los especímenes en el mismo vial desde este paso a través de todos los cambios de solución de fijación, deshidratación e infiltración, hasta que estén listos para la incrustación plana. - Enjuague la muestra en 0,1 M PB durante 3 min x 2, luego extraiga el PB con una Micropipetas.
Nota: Dado que el cerebro de la rata recién nacida es profundamente sensible a los cambios en la osmolaridad12,35,36,37, llevar a cabo los lavados en el mismo vehículo que el utilizado en la mezcla fijadora
4. después de la fijación con osmio
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Preparación del tetroóxido de osmio (OsO4)
Nota: El laboratorio de este autor utiliza OsO4 4% suministrado en una solución acuosa en ampollas de vidrio (5 ml de OsO4 4% en H2O). Otros laboratorios han utilizado OsO4 cristales con éxito. Sin embargo, varias horas son necesarias para disolver OsO4 cristales en un vehículo.- Tomar 5 mL (una ampolla) de 4% OsO4/H2O, abrirlo y colocarlo en una botella de vidrio marrón
Nota: OsO4 es un agente oxidante fuerte y fácilmente reducido por la exposición a la luz. La reducción se puede evitar durante la preparación colocando OsO4 en una botella de vidrio marrón - Añadir 5 mL de 0,2 M PB. Esto producirá 10 mL de 2% OsO4/0,1 M PB.
Nota: Dado que el cerebro de la rata recién nacida es profundamente sensible a los cambios en la osmolaridad, utilice el mismo tampón para preparar los fijadores aldehído y OsO4 solución12,35,36,37 - Añadir 10 mL adicionales de 0,1 M PB. Se producirá una solución final de 20 mL de 1% de OsO4 en 0,1 m PB.
- Utilice una jeringa de 20 mL equipada con una aguja larga para extraer un 1% de OsO4 y colóquelo en una botella de vidrio marrón o en un vial de SCINT cubierto con papel de aluminio.
PRECAUCIÓN: OsO4 es extremadamente volátil y sus humos son tóxicos para la nariz, los ojos y la garganta. Todo el trabajo debe realizarse en una campana de humo usando guantes y ropa protectora, y ninguna parte del cuerpo debe estar expuesta a OsO4. El manejo y la eliminación de desechos deben realizarse de acuerdo con las pautas de su institución. Almacene el OsO4 no utilizado en una botella de vidrio marrón con cierre hermético con forro de teflón en el tapón de vidrio, envuelva la botella en papel de aluminio doble y guárdela en un desecador. En presencia de humos con fugas, OsO4 puede descolorear las superficies internas y el contenido del refrigerador. En las condiciones de almacenamiento mencionadas anteriormente, la solución OsO4 es estable durante varios meses. Cuando las soluciones se oxidan durante el almacenamiento, se vuelven grises, en cuyo caso necesitan ser desechados.
- Tomar 5 mL (una ampolla) de 4% OsO4/H2O, abrirlo y colocarlo en una botella de vidrio marrón
- Añadir 1% OsO4 en 0,1 M PB en el vial de la muestra y dejar reposar durante 1 h. extraer OsO4 después de 1 h con una Micropipetas.
Nota: Antes de aplicar OsO4 a la sección, es fundamental desplegar y aplanar la muestra. Evitar la aplicación directamente en la parte superior de la muestra, en lugar de utilizar las paredes del vial para suavemente goteo OsO4 en la parte inferior del vial. El espécimen se vuelve marrón y rígido poco después de la aplicación OsO4 . Manipule suavemente a partir de ahora para evitar daños en los tejidos
5. Enjuague
Nota: Es importante enjuagar la muestra después de la fijación posterior con OsO4 y antes de la deshidratación, ya que los fijadores residuales pueden reaccionar con los agentes de deshidratación37.
- Enjuagar con 0,1 M PB durante 3 min x 3.
Nota: Dado que el cerebro de la rata recién nacida es profundamente sensible a los cambios en la osmolaridad, llevar a cabo los lavados en el mismo vehículo que el utilizado en la mezcla fijadora12,35,36,37. - Coloque la solución de osmio y los dos primeros enjuagues de PB en los desechos de OsO4 y deshágase de él de acuerdo con las pautas de su institución.
6. deshidratación secuencial y tinción con acetato de uranyl
Nota: El laboratorio de este autor utiliza resinas epoxi inmiscibles en agua para su incrustación. Cuando se utilizan resinas epoxi, el agua libre de todas las muestras debe sustituirse por un disolvente orgánico antes de la infiltración por el medio de incrustación. El agua se retira pasando la muestra a través de una serie de soluciones de concentraciones ascendentes de etanol y acetona12.
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Preparación del acetato de uranilo (UA)
- Colocar un matraz de vidrio volumétrico de 200 mL que contenga 100 mL de EtOH al 70% en una placa de agitación.
- Añadir 4 g de UA al matraz. Envolver en papel de aluminio (UA precipata cuando se expone a la luz) y remover continuamente.
Nota: UA se disuelve lenta e incompletamente en 70% EtOH. Permita que los cristales no disueltos se asientan antes de usar la solución. La solución UA debe filtrarse con un filtro de 0,45 μm antes de su uso. UA se puede preparar antes de tiempo y se mantiene en una botella de color marrón envuelto en papel de aluminio a 4 ° c durante meses.
PRECAUCIÓN: La UA es ligeramente radioactiva y altamente tóxica. La inhalación de polvo de UA puede causar trastornos de las vías respiratorias superiores y enfermedades de los pulmones, hígado y riñones. La UA es peligrosa cuando se ingiere o cuando está en contacto directo con la piel y las membranas mucosas. Todo el trabajo debe ser realizado en una campana de humo usando guantes y ropa protectora. El manejo y la eliminación de desechos deben realizarse de acuerdo con las pautas de su institución.
- Deshidratar en 50% EtOH durante 1 min. Retire 50% EtOH antes de añadir UA.
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Añadir 4% UA en 70% EtOH. Deje reposar durante 1 h o durante la noche. Si durante la noche, colóquelo en el refrigerador a 4 ° c.
Nota: tapón vial para evitar la evaporación EtOH y cubrir con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. El protocolo se puede pausar aquí.- Deseche los desechos de UA y los dos siguientes enjuagues de acuerdo con las pautas de su institución
- Deshidratar en 70% EtOH durante 1 min.
- Deshidratar en 90% EtOH durante 5 min.
- Deshidratar en 100% EtOH durante 5 min x 2.
- Enjuagar la muestra en acetona durante 2 min x 3.
7. infiltración e incrustación
Nota: Los tejidos no son lo suficientemente rígidos para ser cortados en secciones delgadas sin el apoyo adicional de una matriz de resina. Por lo tanto, la infiltración e incrustación deben preceder a la sección12.
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Preparación de resina EPON
- Utilice una jeringa de gavaje de 60 ml. Retire el émbolo de la jeringa y tapa la jeringa con una aguja de seguridad.
- Coloque la jeringa con la cara abierta hacia arriba y agregue el volumen de cada ingrediente de la mezcla de resina de forma incremental. Añadir 22 mL de embed-812 (resina). Añadir DDSA (endurecedor) a un volumen total de 37 mL. Añadir NMA (endurecedor) a un volumen total de 50,5 mL. Añadir 525 μL de DMP-30 (acelerador) con una picada. Mueva el émbolo de la pildera muy lentamente, ya que DMP es muy viscoso.
Nota: es importante añadir los reactivos de incrustación en el orden indicado. El acelerador (DMP-30) debe añadirse en último. Para obtener un bloque curado que tenga las características deseadas, es fundamental utilizar la cantidad exacta del endurecedor y el acelerador. Se prefiere mezclas de incrustación recién preparadas. - Coloque el émbolo hacia atrás y coloque la jeringa en un balancín con agitación continua durante al menos 30 minutos. el color cambiará de amarillo a ámbar.
Nota: Todos los ingredientes deben mezclarse muy bien. El hecho de no hacerlo resulta en una impregnación desigual de la muestra de tejido y un bloque de dureza desigual
- Mezclar 1 volumen de resina EPON con 1 volumen de acetona en un vial de SCINT y agitar para mezclar. Aplicar el EPON 1:1: mezcla de acetona en el tejido después de extraer el último enjuague de acetona. Manténgase cubierto para evitar la evaporación de acetona. Retire la mezcla 1:1 de resina y acetona después de 2-4 h o manténla durante la noche.
Nota: el protocolo se puede pausar aquí. - Reemplace la mezcla de resina y acetona con resina completa. Deje reposar durante 4 h o durante la noche. Poner todos los residuos de EPON en un recipiente de recogida bajo el capó para ser polimerizado y desechado más tarde.
Nota: el protocolo se puede pausar aquí.
8. incrustación plana
Nota: Las muestras son planas-incrustadas entre dos películas aclares en forma de sandwich-like.
- Corte dos piezas rectangulares de hoja de Aclar transparente. Limpie las películas con EtOH 70%. Recorte las láminas de forma que haya al menos 1,5 cm de plástico libre de tejido en todos los lados de la sección. La hoja Aclar en la parte superior debe tener la misma anchura que la parte inferior, y su altura debe ser aproximadamente dos tercios de la hoja inferior.
- Incline lentamente el vial con la muestra y levante suavemente el tejido de la parte inferior del vial.
- Utilice una espátula micro flexible y un cepillo fino para mover cuidadosamente la sección a lo largo de las paredes del vial y transferirla a la lámina Aclar.
Nota: Manipule las secciones con precaución para evitar daños en las muestras. - Coloque suavemente la lámina Aclar encima de la muestra.
Nota: Asegúrese de que haya suficiente resina entre las dos láminas para sellar el sándwich - Empuje suavemente las burbujas de aire atrapadas sin ejercer presión directa sobre la sección. Limpie el exceso de EPON.
Nota: La eliminación de las burbujas de aire es importante, ya que su presencia hace difícil la visualización de la muestra y debilita la estabilidad de los enlaces de resina. - Etiquete las láminas con una pluma resistente a los disolventes y colóquelo en el horno a 60 ͦC durante 2-3 días para polimerizar.
Nota: el protocolo se puede pausar aquí.
9. incrustación de la cápsula
Nota: Los ultramicrotomos se suministran con mandriles para sujetar bloques cilíndricos obtenidos de la incrustación de especímenes en cápsulas. Los bloques cilíndricos tienen la geometría ideal para ser menos afectados por las vibraciones que surgen durante la seccionamiento.
- Abra suavemente las películas aclares intercaladas. El espécimen se adherirá a una de las dos láminas aclares.
- Utilice una pluma resistente a los disolventes para marcar el lado de la lámina Aclar que contiene la sección. Marca cerca del pañuelo.
Nota: Es fundamental realizar este paso antes de perforar el tejido de interés. - Utilice un punzón de disco para obtener una muestra de círculo de la sección. La marca de la pluma debe formar parte del tejido perforado.
- Prepare el tapón de un lado de la cápsula de incrustación en un soporte de cápsula. Coloque una gota de resina en la tapa.
- Coloque el disco perforado dentro de la tapa con la sección de tejido hacia arriba. La marca de la pluma brillará cuando la luz esté brillada en la muestra.
- Inserte una cápsula en la tapa y utilice pinzas finas para insertar el etiquetado. Enrolle y baje un trozo de papel impreso de 2 cm de largo en la cápsula. Haga que la etiqueta se ajuste a la curvatura de las paredes laterales de la cápsula. Espere a que la polimerización esté completa, para que la etiqueta quede permanentemente incrustada en la resina.
- Vierta la resina de incrustación dentro de la cápsula y llene hasta el borde de la cápsula.
- Empuje la muestra de tejido hasta la parte inferior de la cápsula con la ayuda de un palo de madera puntiagudo y colóquelo en el horno a 60 ° c durante 2-3 días.
Nota: Tenga cuidado de no presionar el tejido demasiado duro, en su lugar, dejar que se recueste libremente para que una capa delgada del medio de incrustación esté presente entre el tejido y la superficie de la cápsula. El protocolo se puede pausar aquí.
10. recorte de la cara del bloque
Nota: El tamaño pequeño y la forma apropiada de la cara de bloque son requisitos previos para la corte satisfactoria. Por lo tanto, el recorte del bloque de muestras es una necesidad.
- Usa una cuchilla afilada de un filo. Limpie con acetona inmediatamente antes de su uso.
- Monte el bloque de cápsulas en un soporte de bloque y coloque el soporte del bloque en el escenario de un estereomicroscopio.
Nota: El procedimiento de recorte debe llevarse a cabo bajo los binoculares de microscopio y la iluminación oblicua. - Retire la lámina Aclar de la punta de la cápsula con una cuchilla de afeitar. La lámina Aclar aparece como una capa brillante bajo la luz del ámbito de disección.
- Sostenga la cuchilla de afeitar en un ángulo de 45 grados y haga cortes por cuatro lados del bloque de la cápsula.
Nota: Se consigue un mejor control del recorte si la cuchilla se mantiene con ambas manos. - Hacer cortes cortos para que el bloque tome la forma de una pirámide corta con ángulos de pared de aproximadamente 45 °.
Nota: La cara de la muestra se apoya mucho mejor si los lados que conducen a él se mantienen cortos. Si la punta del bloque es demasiado delgada y larga, vibrará durante la seccionadora delgada. Idealmente, el área de interés debe centrarse en la cara de bloque. - Recortar la punta de la cápsula para descartar el tejido superfluo y sólo preservar el área de interés.
Nota: Ninguna parte de la sección debe estar sin tejido, ya que las variaciones en la densidad de la cara del bloque son una causa importante de dificultad en la seccionamiento. Idealmente, el área superficial de la cara de la cápsula no debe ser superior a 1 mm2. - Recortar la cara de la cápsula en forma de un trapecio de scaleno. Debido a que en un trapecio escaleno ningún lado es igual, esta forma es mejor orientar el área de interés en relación con el resto de la muestra.
Nota: Durante la sección, la cara en forma de trapezoide se apoya mucho mejor que la de cualquier otra forma.
11. microtomo Seccionando
Nota: La mayoría de los especímenes biológicos son demasiado gruesos en su estado natural para ser penetrados por un rayo de electrones. Por lo tanto, el material debe ser cortado en secciones delgadas que pueden ser penetrados por el haz de electrones.
- Cortar secciones delgadas (color de la interferencia de plata, 600-900 Å) en un ultramicrotomo en planos paralelos a la superficie.
- Coloque las secciones en las cuadrículas. El laboratorio de este autor utiliza rejillas de cobre de 3,05 mm de diámetro exterior.
Nota: El protocolo se puede pausar aquí.
12. post-tinción con acetato de uranyl
- Preparar 2% UA en agua destilada. Colocar un matraz de vidrio volumétrico de 200 mL que contenga 100 mL de agua destilada en una placa de agitación. Añadir 2 g de UA al matraz. Envolver en papel de aluminio (UA precipata cuando se expone a la luz) y remover continuamente.
Nota: Para obtener más información sobre la preparación de UA, consulte la sección 6 de este protocolo. - Colocar varias gotas individuales de 2% UA en una hoja limpia de cera dental en una placa de Petri.
- Flote la rejilla con la muestra (lado de la sección hacia abajo) en una gota de UA durante 25 min.
Nota: Flote cada rejilla en una gota separada de UA. - Sostenga la rejilla en su borde con fórceps y enjuague dos veces bajo un suave chorro de agua destilada a temperatura ambiente de una botella de lavado de plástico.
Nota: No permita que la rejilla se seque antes de teñir con plomo.
13. post-tinción con plomo
- Prepare una cámara sin CO2(co2 en el aire es la principal fuente de precipitación de plomo). Coloque un trozo de papel de filtro empapado con 1 N NaOH en una placa de Petri. Coloque una pequeña hoja de cera dental limpia en la parte superior del papel de filtro y coloque varios pellets de NaOH en un lado del plato. Cubra el plato.
Nota: Prepare esta configuración antes de que las rejillas se tiñen con UA, de modo que la atmósfera de la cámara esté libre de CO2 y preparada para la tinción de plomo en el momento en que se haya completado la tinción UA. - Hacer un 4% de NaOH. Añadir 0,2 g de NaOH a 5 mL de agua destilada.
- Prepare la solución de triple plomo de Sato. Para preparar 10 mL, Añadir 0,1 g de nitrato de plomo, 0,1 g de citrato de plomo, 0,1 g de acetato de plomo y 0,2 g de citrato de sodio en una botella de vidrio. Añadir 8,2 mL de agua destilada y agitar vigorosamente durante 5 min. Sonicar durante 30 s, a continuación, añadir 1,8 mL de recién hecho 4% NaOH.
- Coloque varias gotas de plomo de Sato sobre la cera en la placa de Petri.
- Coloque la rejilla manchada con UA (lado de la sección hacia abajo) en la gota de plomo.
Nota: Cada rejilla debe flotar en una gota separada de plomo. Cada gota debe ser lo suficientemente pequeña como para permitir que la rejilla flote en la parte superior de la cúpula de la gota en lugar de deslizarse hacia abajo en los lados. - Cubra el plato y deje que la mancha durante 5 min.
- Sostenga la rejilla en su borde con fórceps y lave a fondo bajo un suave chorro de agua destilada a temperatura ambiente de una botella de lavado de plástico.
- Seque la rejilla en el papel de filtro y almacene la rejilla.
Nota: Asegúrese de que la sección no entra en contacto directo con el papel de filtro.
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Representative Results
Se han establecido criterios generales que se aceptan en su mayoría como indicativos de preservación satisfactoria o defectuosa de la muestra para TEM. Estos criterios se ejemplifican en cuatro micrografías electrónicas seleccionadas (dos ejemplos de preparación óptima, dos ejemplos de preparación defectuosa) que se obtuvieron al tratar el tejido cerebral de rata joven siguiendo los métodos descritos en este protocolo.
En general, una micrografía electrónica de buena calidad aparece como una imagen ordenada, distinta y en general grisácea. En un espécimen preparado satisfactoriamente, los espacios entre las membranas deben llenarse con material granular, y no deben estar vacíos. Del mismo modo, no se deben encontrar espacios vacíos en la sustancia del suelo citoplásmico ni dentro de orgánulos (Compare la figura 1A y la figura 2A con la figura 3 y la figura 4). Sin embargo, es importante señalar que el sistema nervioso central de animales muy jóvenes muestra un cierto grado de ampliación de los espacios extracelulares en comparación con el cerebro adulto, con conexiones más sueltas entre las células y un blanco general, menos apariencia densa en electrones. Las membranas deben ser continuas, sin distorsión o rotura (figura 1A y figura 2A). El estroma de las mitocondrias debe aparecer uniforme y denso, sin espacios vacíos. Cristae debe estar intacto y no hinchado, y la doble membrana externa mitocondrial debe estar intacta (Compare la figura 1A con la figura 3). Para facilitar el análisis morfolométrico de la organización de las vesículas pre-sinápticas, las membranas pre y post-sinápticas deben estar intactas y esencialmente paralelas entre sí (ver figura 1). Las vesículas sinápticas deben ser trazables y estar ligadas por una sola membrana continua (ver figura 2).
Es importante destacar que, incluso cuando se siguen las mejores prácticas, el tratamiento de la muestra con fijadores, manchas y resinas introduce artefactos. Puesto que los artefactos no pueden eliminarse, es fundamental entender qué proceso los origina, de modo que la apariencia del espécimen se pueda interpretar con respecto al tratamiento que sufrió12. Un ejemplo de un artefacto, entre varios que se pueden generar durante la preparación de la muestra para TEM, es una figura de mielina, una inclusión laminar membranosa que se asemeja a las vainas de mielina. Aunque las figuras de mielina se pueden ver en condiciones patológicas12, a menudo resultan de la extracción de lípidos de membrana durante la fijación con aldehídos (ver figura 4).
Figura 1: micrografía electrónica representativa de la preservación satisfactoria de la estructura celular (ejemplo 1). (A) las membranas celulares neuronales están superpuestas y sin roturas. El citoplasma es finamente granular y sin espacios vacíos. Las mitocondrias no se hinchan ni se encogió. Su doble membrana externa se conserva, y las cristae internas están intactas. (B) detalle del panel a, ejemplificando un método para medir la distancia de las vesículas sinápticas de la membrana presináptica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: micrografo electrón representativo de la preservación satisfactoria de la estructura celular (ejemplo 2). (A) las vesículas sinápticas son distintas y están alineadas por una sola membrana sin romperse. Para permitir el análisis morfolométrico de la distribución de las vesículas sinápticas, las membranas pre-sinápticas y post-sinápticas deben ser paralelas y su continuidad preservada. (B) detalle del panel A, ejemplificando el conteo de vesículas sinápticas dentro del terminal presináptico. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: micrografía electrónica representativa de la preservación defectuosa de la estructura tisular (ejemplo 1). Nótese la distorsión y rotura de las membranas celulares neuronales y la presencia de espacios extracelulares marcadamente agrandados (marcados con *). Las mitocondrias aparecen distendidas y tienen la cristae hinchada (marcada con la flecha). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: micrografía electrónica representativa de la preservación defectuosa de la estructura tisular (ejemplo 2). Observe la presencia de grandes espacios vacíos blancos dentro del citoplasma (marcados con ǂ), en lugar de la sustancia citoplasmática finamente granular. Los espacios extracelulares aparecen agrandados. Un verticilo membranoso artístico (figura de mielina), probablemente resultante de la movilización de lípidos durante la fijación con glutaraldehído, se marca con el acrónimo MF. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El manejo de las secciones de tejido durante la preparación de la muestra para TEM requiere un grado considerable de delicadeza, concentración y paciencia. Cuando se utiliza una micropipeta para añadir y eliminar soluciones, las muestras se pueden succionar en la punta de la Piera por tensión superficial, por lo que se debe tener un gran cuidado para evitar daños tisulares por la picuta. Además, ciertos pasos de la secuencia de deshidratación pueden ser tan rápidos como 1 minuto, por lo tanto, el operador debe trabajar con rapidez para asegurarse de que el siguiente paso de deshidratación se inicia a tiempo y la muestra no se seca ni se arruga. Un procedimiento que requiere atención especial es después de la fijación con osmio. Las secciones se vuelven rígidas después del tratamiento con osmio y pueden dañarse fácilmente. Antes de añadir el osmio, es imperativo que las secciones se aplanen en la parte inferior del vial, de lo contrario cualquier pliegue resultará en fractura de tejido. El manejo del tejido osmicado es particularmente desafiante cuando se transfieren secciones a películas aclares para la incrustación plana. Se necesita un cuidado especial al levantar la muestra desde la parte inferior del vial para evitar la fragmentación, y al empujar las burbujas de aire fuera del sándwich de película. Si bien es importante empujar hacia fuera cualquier aire atrapado, ya que hace que la visualización de la muestra difícil y debilita la estabilidad de los enlaces de resina, la presión directa sobre el tejido osmicado puede infligir fácilmente daño. Otro paso que requiere un cuidado adicional es la preparación de la mezcla de resina para la infiltración e incrustación de muestras. EPON, la resina de incrustación más utilizada, se puede endurecer con la adición de un endurecedor y un acelerador. Es imprescindible utilizar la cantidad exacta de endurecedor y acelerador con el fin de obtener un bloque curado con las características deseadas. Se han descrito métodos gravimétricos y volumétricos para medir resinas viscosas. Aunque los métodos gravimétricos se han considerado tradicionalmente más precisos12, el laboratorio de este autor ha tenido un buen éxito con los modos volumétricos (es decir, añadiendo el volumen de cada ingrediente de la mezcla de resina incrementalmente por medio de una jeringa de gavaje) . Después de que los componentes de resina han sido cuidadosamente medidos, deben mezclarse muy a fondo para lograr una impregnación uniforme, ya que poseen diferentes viscosidades y tasas de polimerización. El hecho de no lograr una mezcla completa resultará en un bloque de dureza desigual que no es adecuado para la seccionamiento delgado.
Los cambios marcados en la tonicidad de las soluciones utilizadas para procesar secciones de cerebro de rata joven pueden causar contracción y/o hinchazón del espacio extracelular y componentes celulares12,35,36,37 . Durante la fijación, los mejores resultados se obtienen cuando la presión osmótica del perfusato se mantiene tan similar como sea posible a la del tejido en estudio. Osmolalidad de la rata del cerebro es aproximadamente 330 mOsm. Un 2% de glutaraldehído en 0,1 M PB solución es sólo ligeramente hipertónico (400-450 mOsm) y minimiza la expansión del espacio extravascular12. En particular, las membranas siguen siendo sensibles a los cambios en la presión osmótica de las soluciones de enjuague y deshidratación después de la fijación con aldehídos. Por lo tanto, también es importante minimizar las diferencias entre la osmolaridad del fijador y las soluciones utilizadas posteriormente12,35,36,37. Por esta razón, el mismo vehículo (0,1 M PB, osmolaridad aproximada 440 mOsM) se utiliza como solvente para todas las soluciones en este protocolo. Sin embargo, cabe señalar que varios buffers diferentes se han utilizado con éxito durante la preparación de la muestra para TEM y ningún buffer único puede reclamar superioridad universal sobre los demás. Cuando se prefiere amortiguadores de la tonicidad inferior, otros laboratorios han optado por aumentar la osmolaridad con electrolitos o no-electrolitos12.
Varios pasos en este protocolo requieren el uso de productos químicos que pueden ser tóxicos cuando no se manejan correctamente. No se puede exagerarse la importancia de trabajar bajo un extractor de humos y usar equipo de protección personal mientras se manipulan aldehídos, osmio, uranio y compuestos de plomo. Mientras que los sistemas de contraste automatizados pueden ayudar a atenuar parte del riesgo y están disponibles comercialmente, pueden ser bastante caros y pueden no ser asequibles por laboratorios que no hacen uso rutinario de TEM. Aunque el laboratorio de microscopios electrónicos puede ser potencialmente un lugar peligroso, el procesamiento de muestras para TEM es seguro general cuando se realiza rigurosamente.
Recientemente, la introducción de la microscopía de luz de superresolución ha incrementado la potencia de resolución de imágenes ópticas a unos 15 Nm34. Sin embargo, cuando el objetivo es realizar un análisis morfolométrico de la organización espacial de las vesículas sinápticas en los terminales presinápticos, ninguna técnica proporciona el mismo grado de detalle morfológico. Es importante destacar que TEM está limitado por la necesidad de que la muestra esté muerta antes de que pueda ser procesada y visualizada. Por lo tanto, cuando el objetivo del estudio es investigar los aspectos dinámicos o funcionales del tráfico de vesículas sinápticas y la exocitosis, se deben considerar herramientas que no sean TEM.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este manuscrito fue apoyado por NIH/NIGMS K08 123321 (a N.L.) y por fondos del Departamento de Anestesiología de la Universidad de Virginia. Los autores desean agradecer a Alev Erisir (Departamento de biología, Universidad de Virginia, Charlottesville, VA) por su excelente formación y asistencia técnica con TEM, y por su inestimable crítica manuscrita. Los autores también agradecen la instalación de microscopía electrónica avanzada en la Universidad de Virginia para obtener asistencia técnica con la sección de muestras y post-tinción.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | "size 00, flat (cut bottom)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
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