Summary
Nós descrevemos procedimentos para processar o tecido recém-nascido do cérebro do rato para obter micrografias de elétron high-resolution para a Análise morfométrica da distribuição sináptica do vesícula em terminais do nervo. As micrografias obtidas com esses métodos também podem ser utilizadas para estudar a morfologia de uma série de outros componentes celulares e suas relações estruturais dimensionais.
Abstract
Nosso laboratório e muitos outros exploraram o alto poder de resolução da microscopia eletrônica de transmissão para estudar a morfologia e a organização espacial das vesículas sinápticas. A fim de obter micrografias de elétrons de alta qualidade que podem produzir o grau de detalhe morfológico necessário para a análise quantitativa da distribuição de vesículas pré-sinápticas, a preparação ideal do espécime é crítica. A fixação química é o primeiro passo no processo de preparação de amostras, e de extrema importância para preservar a ultraestrutura fina. A fixação vascular com uma solução de glutaraldeído-formaldeído, seguida pelo tratamento de espécimes seccionados com vibratoma com tetroxida de ósmio, estabiliza o número máximo de moléculas, especialmente proteínas e lipídios, e resulta em conservação superior de ultrastructure. O tecido é então processado com a contrcoloração, desidratação sequencial e incorporação de resina. A coloração do bloco de en com acetato de uranilo (isto é, coloração do tecido vibratome-seccionado antes da incorporação da resina) realça o contraste endógeno e estabiliza componentes da pilha de encontro à extração durante o processamento do espécime. O contraste pode ser aumentado ainda mais aplicando o acetato do uranilo como uma borne-mancha em seções ultrafinos. A coloração dupla de secções ultrafinos com citrato de chumbo após o tratamento com acetato de uranilo também melhora a resolução da imagem, intensificando a opacidade de elétrons de estruturas contendo ácidos nucleicos através de ligação seletiva de chumbo ao acetato de uranilo. A microscopia eletrônica de transmissão é uma ferramenta poderosa para caracterização dos detalhes morfológicos das vesículas sinápticas e quantificação de seu tamanho e organização espacial no Bouton terminal. No entanto, por usar tecido fixo, a microscopia eletrônica de transmissão só pode fornecer informações indiretas sobre os processos de vida ou evolução. Portanto, outras técnicas devem ser consideradas quando o objetivo principal é estudar aspectos dinâmicos ou funcionais do tráfico de vesículas sinápticas e da exocitose.
Introduction
Nós descrevemos métodos para a preparação do tecido de cérebro recém-nascido do rato para obter micrografias de elétron de alta qualidade para a Análise morfométrica detalhada da distribuição espacial do vesícula sináptica em terminais do nervo1,2. As micrografias de alto contraste que podem ser obtidas pelo processamento de espécimes seguindo esses métodos também podem ser utilizadas para estudar a morfologia detalhada de um número de componentes celulares e suas relações estruturais dimensionais3,4.
O microscópio eletrônico de transmissão (TEM) é uma ferramenta poderosa para estudar a morfologia das organelas e outras estruturas celulares quantitativamente. A partir desta década, não existem outros métodos de investigação que podem fornecer o mesmo grau de resolução de membranas lipídicas e organelas sem imuno-tagging, com exceção da criofixação por congelamento de alta pressão. No entanto, as técnicas de substituição de congelamento não são amplamente utilizadas, e normalmente exigem equipamentos caros e longos tempos de preparação.
A fim de aproveitar o alto poder de resolução do TEM, a preparação ideal do espécime é de suma importância. Os principais objetivos da preparação de amostras são preservar a estrutura do tecido com alteração mínima do estado de vida, aumentar o contraste da amostra e estabilizar o tecido contra a extração de componentes celulares durante o processamento e a exposição ao elétron Feixe. Numerosos protocolos para a preparação do tecido tem foram introduzidos e aperfeiçoados por vários laboratórios ao longo dos anos. Muitos deles se concentraram em métodos para visualização ideal de vesículas sinápticas5,6,7,8,9,10,11. Entre um número de métodos bem estabelecidos, padrão do ouro atualmente em uso, nós escolhemos procedimentos para a fixação química, a fixação do borne, a mancha do en Bloc, a desidratação seqüencial, a incorporação da resina e a mancha do borne que visam preservar a estrutura óptima do tecido e alcançar excelente contraste de imagem. Da nota, a preservação do ultraestrutura fino pode ser particularmente desafiante ao trabalhar com tecido recém-nascido do cérebro do rato. De fato, o sistema nervoso central de animais muito jovens caracteriza-se por um maior teor de água do que o cérebro adulto, ampliação mais proeminente dos espaços extracelulares e conexões mais soltas entre as células12. Isto faz o tecido de cérebro recém-nascido do rato profundamente sensível às mudanças na osmolaridade, e requintadamente propenso ao encolhimento vesícula e/ou ao inchamento quando processado com as soluções seqüenciais da tonicidade diferente12. Conseqüentemente, nossos métodos empregaram soluções para o processamento do espécime que são da osmolaridade tão perto como possível àquele do cérebro recém-nascido do rato. Nosso objetivo foi obter imagens de alta qualidade de microscopia eletrônica de alta resolução para avaliação quantitativa da distribuição espacial das vesículas sinápticas nos terminais nervosos. Especificamente, procurou-se medir o número de vesículas dentro do terminal nervoso, a distância das vesículas sinápticas da membrana plasmática pré-sináptica, o número de vesículas ancoradas na membrana pré-sináptica, o tamanho das vesículas sinápticas e a distâncias inter-vesicle1.
A fixação química satisfatória é um pré-requisito para a obtenção de micrografias de elétrons de alta qualidade que podem fornecer os detalhes morfológicos necessários para estudar a morfologia da vesícula sináptica e a organização espacial. Embora vários modos de fixação existam, a fixação do tecido cerebral por perfusão vascular é decididamente superior a outros métodos. Uma vez que a fixação via perfusão vascular começa imediatamente após a detenção da circulação sistêmica, encurta o intervalo entre a Desoxigenação do tecido cerebral e a reticulação de proteínas com fixadores, resultando em alterações mínimas na célula Estrutura. Além disso, realiza penetração rápida e uniforme, por causa do rápido fluxo do fixador do leito vascular para os compartimentos extracelulares e celulares12,13,14. A fixação primária com glutaraldeído, seguida de fixação secundária (pós-fixação) com tetroxida de ósmio, produz excelente preservação da estrutura fina15,16,17. Uma mistura de glutaraldeído e paraformaldeído tem a vantagem adicional de uma penetração mais rápida no tecido12.
Uma vez que os tecidos biológicos não são suficientemente rígidos para serem cortados em secções finas sem o apoio de uma matriz de resina, precisam de ser incorporados num meio antes de seccionamento fino. Resinas epóxi immiscible de água são comumente usadas como um meio de incorporação em TEM. Quando este tipo de matriz é usado, toda a água livre do espécime deve ser substituída com um solvente orgânico antes da infiltração da resina. A água é removida passando a amostra através de uma série de soluções de concentrações ascendentes de etanol e/ou acetona12. Neste protocolo, os espécimes são primeiro plano incorporado entre folhas ACLAR flexíveis, em seguida, incorporado em uma cápsula. O resultado final é o tecido situado na ponta de um bloco de resina cilíndrica, que tem a geometria ideal para ser menos afetada por vibrações que surgem durante o corte de micrótomo.
Manchar com metais pesados para realçar o contraste endógeno do tecido é um outro aspecto importante da preparação do espécime. O contraste da imagem em TEM é devido à dispersão do elétron pelos átomos no tecido. No entanto, materiais biológicos consistem em grande parte de moléculas de baixo peso atômico (i.e., carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio). Portanto, a geração de contraste de espalhamento suficiente requer a incorporação de átomos de alto peso atômico nos componentes celulares do tecido. Isso é conseguido através da coloração do espécime com metais pesados12,18,19. O tetroxide do ósmio, o urânio e a ligação, que ligam fortemente aos lipídios, são os metais pesados os mais comuns usados como manchas do elétron.
Ósmio (número atômico 76) é um dos metais os mais mais densas na existência. É um fixador e uma mancha, embora seu papel preliminar em tem seja como um fixador de confiança12. Entre os vários protocolos de fixação em uso, o método de dupla fixação com glutaraldeído seguido de ósmio é o mais efetivo na redução da extração de constituintes celulares durante a preparação do espécime. Estes dois fixadores são usados para estabilizar o número máximo de tipos diferentes de moléculas, especial proteínas e lipídios, e resultam na preservação superior do ultraestrutura12,14,15do tecido, 16 anos de , a 17.
O urânio (número atômico 92) é o metal o mais pesado usado como a mancha do elétron, o mais tipicamente no formulário do acetato do uranilo. Similarmente ao ósmio, atua como uma mancha e fixative, embora seu papel preliminar no tem seja como uma mancha20,21. As estruturas contendo ácidos nucleicos e membranosos são fortemente e preferencialmente coradas com sais de uranilo em tecidos fixos de aldeído22,23. O tratamento de tecidos com acetato de uranilo após osmicação e antes da desidratação resulta em estabilização de estruturas contendo ácido membranoso e nucleico, bem como contraste melhorado, e permite a identificação de alguns detalhes estruturais que não ser facilmente detectado em espécimes corados com ósmio sozinho12,24,25. Pensa-se que o acetato de uranilo pode estabilizar a estrutura fina combinando com o ósmio reduzido que foi depositado em membranas do lipido durante o osmication24. O contraste máximo é conseguido quando o acetato do uranilo é aplicado antes de incorporar e como uma borne-mancha em seções finas12.
A ligação (número atômico 82) é a mancha a mais comum usada para o TEM e é empregada principalmente para a borne-mancha de seções finas. Os sais de chumbo têm alta opacidade de elétrons e mostram afinidade para uma ampla gama de estruturas celulares, incluindo membranas, proteínas nucleares e citoplasmáticas, ácidos nucleicos e glicogénio26,27. Quando o método de coloração dupla é empregado (ou seja, a coloração com acetato de uranilo é seguida pelo tratamento com chumbo), este último atua como um desenvolvedor de coloração acetato de uranilo. Por exemplo, o chumbo pós-coloração da cromatina fixada com glutaraldeído aumenta a captação de acetato de uranilo por um fator de três28,29,30,31,32. A ligação igualmente realça a mancha transmitida por outros metais tais como o ósmio. Pensa-se que os sais de chumbo mancham as membranas de tecidos fixos de ósmio, anexando ao grupo polar de fosfatides na presença de ósmio reduzido33. Uma desvantagem potencial da mancha com o acetato e a ligação do uranilo, especial para durações prolongadas, é que muitos elementos estruturais diferentes são manchados ingualmente e não-especificamente, e assim não podem fàcilmente ser distinguidos de um outro12 .
A introdução recente de fontes luminosas alternativas, tais como na microscopia foto-ativada óptica da localização da super-definição, melhorou significativamente a definição34da microscopia de luz. No entanto, como a microscopia de luz depende de métodos histoquímicos e imuno-citoquímicos para visualizar proteínas ou enzimas rotuladas individualmente, o poder do TEM para exibir todos os elementos estruturais ao mesmo tempo permanece insuperável para estudo aprofundado do morfologia e relações dimensionais de estruturas teciduais. Em particular, nenhuma outra técnica pode fornecer o detalhe morfológico necessário para executar a Análise morfométrica da distribuição de vesículas sinápticas em boutons pré-sinápticos do nervo. No entanto, é importante notar que as micrografias de elétrons capturam a estrutura do tecido após a morte do organismo e, portanto, não podem fornecer informações sobre a dinâmica do tráfico de vesículas pré-sinápticas e da exocitose. Assim, outras ferramentas, como a imagem de FM corante-Live e a eletrofisiologia de remendo-braçadeira, devem ser consideradas quando o objetivo principal é estudar aspectos dinâmicos e/ou funcionais do tráfico de vesículas sinápticas e da exocitose.
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Protocol
Todos os estudos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Virginia (Charlottesville, VA) e conduzidos de acordo com as diretrizes dos institutos nacionais de saúde.
1. fixação por perfusão vascular
Nota: Uma descrição geral do método de perfusão vascular cerebral de ratos já foi detalhada nesta revista13 e está além do escopo deste protocolo. No entanto, as etapas a seguir são específicas para a preparação do tecido cerebral de ratos recém-nascidos para obter micrografias de elétrons de alta qualidade para análise quantitativa da distribuição de vesículas sinápticas em terminais pré-sinápticos.
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Prepare 4% paraformaldeído
- Coloque 800 mL de tampão fosfato de 0,1 M (PB) em uma taça de vidro de 2 L em uma placa de agitação um exaustor. Aqueça a aproximadamente 60 ° c sem ferver o amortecedor.
- Adicionar 40 g de paraformaldeído em pó. Mexa continuamente
- Ao medir o pH, adicione gotas pequenas de NaOH de 10 N até que a solução limpe. O pH final deve ser 7,2-7,4.
- Adicione o restante 0,1 M PB a um volume final de 1 L. Deixe esfriar, filtre com uma membrana de 0,45 μm e armazene a 4 ° c durante a noite.
Nota: Prepare o paraformaldeído fresco no dia anterior à perfusão.
Atenção: A inalação de vapores de aldeído pode causar sintomas nasais e irritação das vias respiratórias. Contato com a pele provoca dermatite. Os aldeídos devem ser manuseados em um exaustor enquanto usam luvas, um vestido de proteção e óculos de segurança
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Prepare a solução de Tyrode
- Coloque 1 L de água destilada em uma taça de vidro em uma placa de agitação. Adicionar NaCl (8 g), KCl (0,15 g), CaCl2 (0,1 g), MgCl2 (0, 6 g), NaH2po4 (0, 55 g), NaHCO3 (1 g) e dextrose (1 g) na taça.
- Mexa continuamente e medir o pH. Mantenha o pH entre 7,2 e 7,4.
Nota: A solução de Tyrode também está disponível comercialmente.
- Misture o paraformaldeído de 4% com o glutaraldeído em uma concentração final de 2%. Adicionar 40 mL de microscopia eletrônica-grau 50% glutaraldeído a 1 L de paraformaldeído a 4%. Misture bem em uma placa de agitação
Nota: Aproximadamente 100 mL da solução fixativa paraformaldeído-glutaraldeído é necessário para perfuse o corpo de um rato recém-nascido. Portanto, pelo menos 10 ratos recém-nascidos podem ser perfundidos com 1 L de fixative. Não misture paraformaldeído e glutaraldeído até imediatamente antes do uso. Traga todas as soluções à temperatura ambiente antes da perfusão. - Uma vez que o acesso ao ventrículo esquerdo foi adquirido (ver o protocolo de perfusão animal inteiro13), lave o sistema vascular com a solução de Tyrode para 30 s em uma pressão de perfusão de 120 mmHg.
Nota: O sucesso da perfusão depende, em parte, da exclusão completa do sangue do leito vascular - Lave com solução paraformaldeído-glutaraldeído com a mesma pressão durante 10 min.
Nota: A manutenção da pressão de perfusão constante é essencial para evitar a introdução de artefatos. Além disso, a temperatura do perfusato não deve estar abaixo da temperatura corporal do rato para evitar a vasoconstrição - Retire o cérebro fixo do crânio e coloque em paraformaldeído fresco-glutaraldeído fixador a 4 ° c durante a noite.
Observação: o protocolo pode ser pausado aqui.
2. corte cerebral
- Incorpore o cérebro fixo no agarose de 4% e cole o bloco do cérebro-agarose em um estágio do do
Nota: Outros laboratórios obtiveram seções de boa qualidade conseguindo um bloco estável no do sem sustentação do agar - Fatias de seção de 50 μm de espessura. Ajuste o micrótomo à baixa freqüência e à velocidade.
Nota: As secções podem ser armazenadas em 0,1 M PB com 0, 5% de azida sódica a 4 ° c durante vários anos. - Coloc as seções no PB de 0,1 M em uma placa de Petri, examine as seções um microscópio da dissecção e selecione espécimes para incorporar
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
3. a enxaguadela
Nota: É importante enxaguar o espécime após a fixação com aldeídos e antes da pós-fixação com ósmio, uma vez que os fixadores residuais podem produzir precipitados do ósmio
- Pipeta 0,1 M PB em um frasco de vidro curto, largo-boca com tampão. Coloque um espécime por cada frasco. Cubra totalmente a amostra para que não seque.
Nota: Manter espécimes no mesmo frasco a partir deste passo através de todas as mudanças de solução de fixação, desidratação e infiltração, até que eles estão prontos para a incorporação plana. - Enxague a amostra em 0,1 M PB durante 3 min x 2 e, em seguida, retire o PB com uma micropipeta.
Nota: Uma vez que o cérebro do rato recém-nascido é profundamente sensível a alterações na osmolaridade12,35,36,37, realizar as lavagens no mesmo veículo que o utilizado na mistura fixativa
4. pós-fixação com ósmio
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Preparação de tetroxida de ósmio (OsO4)
Nota: O laboratório deste autor utiliza OsO4 4% fornecido em solução aquosa em ampolas de vidro (5 ml de Oso4 4% em H2O). Outros laboratórios usaram OsO4 cristais com sucesso. No entanto, várias horas são necessárias para dissolver o OsO4 cristais em um veículo.- Tomar 5 mL (uma ampola) de 4% OsO4/H2O, abri-lo e colocá-lo em uma garrafa de vidro marrom
Nota: OsO4 é um agente oxidante forte e prontamente reduzido pela exposição à luz. A redução pode ser evitada durante a preparação colocando OsO4 em uma garrafa de vidro marrom - Adicionar 5 mL de 0,2 M PB. Isto produzirá 10 mL de 2% OsO4/0,1 M PB.
Nota: Uma vez que o cérebro do rato recém-nascido é profundamente sensível a alterações na osmolaridade, use o mesmo tampão para preparar fixadores de aldeído e Oso4 solução12,35,36,37 - Adicionar 10 mL adicionais de 0,1 M PB. Isso produzirá uma solução final de 20 mL de 1% OsO4 em 0,1 m PB.
- Utilize uma seringa de 20 mL equipada com uma agulha comprida para desenhar 1% OsO4 e coloque-a num frasco de vidro castanho ou num frasco para injetáveis de scint coberto com folha de alumínio.
Atenção: OsO4 é extremamente volátil e seus fumos são tóxicos para o nariz, olhos e garganta. Todo o trabalho deve ser realizado em um exaustor usando luvas e roupas protetoras, e nenhuma parte do corpo deve ser exposta ao OsO4. Manuseio e descarte de resíduos devem ser feitos de acordo com as diretrizes da sua instituição. Armazene o OSO4 não utilizado em uma garrafa de vidro marrom firmemente rolha com forro do Teflon na rolha de vidro, enrole o frasco na folha de alumínio dobro e armazene-o em um dessicator. Na presença de vapores vazantes, o OsO4 pode descolorir as superfícies internas e o conteúdo do refrigerador. Nas condições de armazenagem acima mencionadas, a solução OsO4 é estável durante vários meses. Quando as soluções se oxidado durante o armazenamento, eles ficam cinza, caso em que eles precisam ser eliminados.
- Tomar 5 mL (uma ampola) de 4% OsO4/H2O, abri-lo e colocá-lo em uma garrafa de vidro marrom
- Adicionar 1% OsO4 em 0,1 M PB no frasco para injetáveis de amostra e deixar descansar durante 1 h. Extraia o OSO4 após 1 h com uma micropipeta.
Nota: Antes de aplicar o OsO4 à seção, é crítico desdobrar-se e aplainar o espécime. Evite a aplicação diretamente na parte superior da amostra, em vez disso, use as paredes do frasco para pingando suavemente OsO4 para a parte inferior do frasco. A amostra torna-se castanha e rígida logo após a aplicação do OsO4 . Manuseie suavemente a partir de agora para evitar danos nos tecidos
5. a enxaguadela
Nota: É importante enxaguar a amostra após a pós-fixação com OsO4 e antes da desidratação, uma vez que os fixadores residuais podem reagir com agentes de desidratação37.
- Enxaguar com 0,1 M PB durante 3 min x 3.
Nota: Uma vez que o cérebro do rato recém-nascido é profundamente sensível às mudanças na osmolaridade, realizar as lavagens no mesmo veículo que o utilizado na mistura fixativa12,35,36,37. - Coloque a solução de ósmio e as duas primeiras enxaguamentos de PB no resíduo OsO4 e descarte-a de acordo com as diretrizes da sua instituição.
6. desidratação sequencial e coloração com acetato de Uranyl
Nota: O laboratório deste autor utiliza resinas epóxi immiscible de água para incorporação. Quando são utilizadas resinas epóxi, a água livre de todos os espécimes deve ser substituída por um solvente orgânico antes da infiltração pelo meio de incorporação. A água é removida passando a amostra através de uma série de soluções de concentrações crescentes de etanol e acetona12.
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Preparação de acetato de uranilo (UA)
- Coloque um frasco de vidro volumétrico de 200 mL contendo 100 mL de EtOH 70% numa placa de agitação.
- Adicionar 4 g de UA ao balão. Enrole na folha de alumínio (UA precipitados quando exposto à luz) e mexa continuamente.
Nota: UA dissolve-se lentamente e incompletamente em 70% EtOH. Permita que os cristais não dissolvidos se acalmem antes de usar a solução. A solução de UA deve ser filtrada com um filtro de 0,45 μm antes de usar. UA pode ser preparada antes do tempo e mantido em um frasco marrom envolvido na folha de alumínio em 4 ° c por meses.
Atenção: UA é levemente radioativa e altamente tóxica. A inalação de pó de UA pode causar distúrbios do trato respiratório superior e doença dos pulmões, fígado e rins. UA é perigosa quando ingerida ou quando vem em contato direto com a pele e membranas mucosas. Todo o trabalho deve ser realizado em um exaustor usando luvas e roupas de proteção. Manuseio e descarte de resíduos devem ser feitos de acordo com as diretrizes da sua instituição.
- Desidrata em 50% EtOH por 1 min. remover 50% EtOH antes de adicionar UA.
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Adicionar 4% UA em 70% EtOH. Deixe descansar por 1 h ou durante a noite. Se durante a noite, coloque no frigorífico a 4 ° c.
Nota: frasco para injetáveis de tampão para evitar a evaporação de EtOH e cubra com folha de alumínio para evitar a exposição à luz. O protocolo pode ser pausado aqui.- Descarte os resíduos de UA e os dois seguintes enxaguamentos de acordo com as diretrizes da sua instituição
- Desidrata em 70% EtOH por 1 min.
- Desidrata em 90% EtOH por 5 min.
- Desidrata em 100% EtOH por 5 min x 2.
- Enxague a amostra em acetona durante 2 min x 3.
7. infiltração e incorporação
Nota: Os tecidos não são suficientemente rígidos para serem cortados em secções finas sem o apoio adicional de uma matriz de resina. Portanto, a infiltração e a incorporação devem preceder a seccionamento12.
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Preparação da resina EPON
- Utilize uma seringa de gavagem de 60 mL. Retire o êmbolo da seringa e tampe a seringa com uma agulha de segurança.
- Coloque a seringa com o lado aberto para cima e adicione o volume de cada ingrediente da mistura de resina incrementalmente. Adicionar 22 mL de embed-812 (resina). Adicione DDSA (endurecedor) a um volume total de 37 mL. Adicionar NMA (endurecedor) a um volume total de 50,5 mL. Adicionar 525 μL de DMP-30 (acelerador) com uma pipeta. Mova o êmbolo da pipeta muito lentamente, pois a DMP é muito viscosa.
Nota: é importante adicionar os reagentes de incorporação na ordem listada. O acelerador (DMP-30) deve ser adicionado por último. Para obter um bloco curado que tenha as características desejadas, é crítico usar a quantidade exata do endurecedor e do acelerador. As misturas de incorporação preparadas na hora são preferidas. - Coloque o êmbolo para trás e coloque a seringa num balancim com agitação contínua durante pelo menos 30 min. a cor mudará de amarelo para âmbar.
Nota: Todos os ingredientes devem ser misturados muito completamente. Não fazer isso resulta em impregnação desigual do espécime do tecido e um bloco de dureza desigual
- Misture 1 volume de resina EPON com 1 volume de acetona num frasco para injetáveis de scint e agitar para misturar. Aplique a mistura 1:1 EPON: acetona no tecido após a remoção da última enxaguadura de acetona. Mantenha-se coberto para evitar a evaporação da acetona. Retire a mistura 1:1 de resina e acetona após 2-4 h ou manter durante a noite.
Nota: o protocolo pode ser pausado aqui. - Substitua a mistura de resina e acetona com resina completa. Deixe descansar por 4 h ou durante a noite. Põr todo o desperdício de EPON em um recipiente da coleção o capô a ser polimerizado e eliminado mais tarde.
Nota: o protocolo pode ser pausado aqui.
8. Flat-incorporação
Nota: Os espécimes são lisos-encaixados entre dois filmes ACLAR em uma sanduíche-como a forma.
- Corte duas partes retangulares da folha ACLAR desobstruída. Limpe os filmes limpos com EtOH 70%. Aparar as folhas de modo que haja pelo menos 1,5 cm de plástico sem tecido em todos os lados da seção. A folha ACLAR na parte superior deve ter a mesma largura que a parte inferior, e sua altura deve ser aproximadamente dois terços da folha inferior.
- Incline lentamente o frasco para injetáveis com a amostra e levante suavemente o tecido da parte inferior do frasco para injetáveis.
- Use uma espátula micro flexível e uma escova fina para mover cuidadosamente a seção ao longo das paredes do frasco e transferir para a folha ACLAR.
Nota: Manuseie as secções com precaução para evitar danos na amostra. - Coloque suavemente a folha ACLAR em cima da amostra.
Nota: Certifique-se de que há resina suficiente entre as duas folhas para selar o sanduíche - Empurre delicadamente para fora todas as bolhas de ar prendidas sem exercer a pressão direta na seção. Limpe o excesso de EPON.
Nota: A eliminação de bolhas de ar é importante, porque sua presença faz a visualização do espécime difícil e enfraquece a estabilidade das ligações da resina. - Rotule as folhas com uma caneta resistente a solventes e coloque no forno a 60 ͦC por 2-3 dias para polimerizar.
Nota: o protocolo pode ser pausado aqui.
9. incorporação da cápsula
Nota: Os ultramicrotomes são fornecidos com mandris para prender os blocos cilíndricos obtidos de incorporar espécimes nas cápsulas. Os blocos cilíndricos têm a geometria ideal para ser menos afetado pelas vibrações que surgem durante o corte.
- Abra suavemente os filmes de ACLAR imprensados. O espécime vai aderir a uma das duas folhas ACLAR.
- Use uma caneta resistente a solventes para marcar o lado da folha de ACLAR que contém a seção. Mark perto do tecido.
Nota: É crítico para executar esta etapa antes de perfurar para fora o tecido do interesse. - Use um perfurador de disco para obter uma amostra de círculo da seção. A marca da caneta deve ser parte do tecido perfurado.
- Prepare a tampa de um lado da cápsula de incorporação para cima em um suporte da cápsula. Coloque uma gota de resina na tampa.
- Coloque o disco perfurado dentro da tampa com a seção de tecido voltada para cima. A marca de caneta brilhas quando a luz é brilhada na amostra.
- Insira uma cápsula na tampa e use pinças finas para inserir a rotulagem. Role e abaixe um pedaço de papel impresso de 2 cm de comprimento na cápsula. Faça a etiqueta para caber à curvatura das paredes laterais da cápsula. Aguarde que a polimerização seja concluída, de modo que a etiqueta se torne permanentemente incorporada na resina.
- Despeje a resina de incorporação dentro da cápsula e encha até a borda da cápsula.
- Empurre o espécime do tecido para baixo à parte inferior da cápsula com o auxílio de uma vara de madeira pointed e coloc no forno em 60 ° c por 2-3 dias.
Nota: Tome cuidado para não pressionar o tecido muito duro, em vez deixá-lo mentir frouxamente para que uma fina camada do meio de incorporação está presente entre o tecido ea superfície da cápsula. O protocolo pode ser pausado aqui.
10. corte da face do bloco
Nota: O tamanho pequeno e a forma adequada da face do bloco são pré-requisitos para o corte satisfatório. Portanto, o corte do bloco de amostra é uma necessidade.
- Use uma lâmina de barbear afiada de uma aresta. Limpe com acetona imediatamente antes de usar.
- Monte o bloco da cápsula em um suporte do bloco e coloc o suporte do bloco no estágio de um stereomicroscope.
Nota: O procedimento do aparamento deve ser realizado binóculos do microscópio e iluminação oblíqua. - Retire a folha ACLAR da ponta da cápsula usando uma lâmina de barbear. A folha ACLAR aparece como uma camada brilhante a luz do espaço de dissecação.
- Segure a lâmina de barbear em um ângulo de 45 graus e fazer cortes para baixo quatro lados do bloco da cápsula.
Nota: O melhor controle do aparamento é conseguido se a lâmina é prendida com ambas as mãos. - Faça cortes curtos para que o bloco assume a forma de uma pequena pirâmide com ângulos de parede de aproximadamente 45 °.
Nota: A face do espécime é suportada muito melhor se os lados que conduzem a ele são mantidos curtos. Se a ponta do bloco for muito fina e longa, ela vibrará durante o corte fino. Idealmente, a área de interesse deve ser centrada na face do bloco. - Aparar a ponta da cápsula para descartar tecido supérfluo e apenas preservar a área de interesse.
Nota: Nenhuma parte da seção deve ser sem tecido, como as variações na densidade da face do bloco são uma das principais causas de dificuldade em seccionamento. Idealmente, a superfície da face da cápsula não deve ser superior a 1 mm2. - Aparar a face da cápsula na forma de um trapezoide scaleno. Porque em um trapezoide escaleno nenhum lado é igual, esta forma é melhor para orientar a área de interesse em relação ao resto da amostra.
Nota: Durante o corte, a face trapezoid-shaped é suportada muito melhor do que aquela de toda a outra forma.
11. seccionamento de micrótomo
Nota: A maioria de espécimes biológicos é demasiado grossa em seu estado natural a ser penetrada por um feixe de elétron. Portanto, o material deve ser cortado em seções finas que podem ser penetrado pelo feixe de elétrons.
- Corte seções finas (cor da interferência de prata, 600-900 Å) em um ultramicrotome em aviões paralelos à superfície.
- Coloque as secções nas grelhas. O laboratório deste autor utiliza grades de cobre de 3, 5 mm de diâmetro exterior.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
12. pós-coloração com acetato de Uranyl
- Prepare 2% UA em água destilada. Coloque um frasco de vidro volumétrico de 200 mL contendo 100 mL de água destilada numa placa de agitação. Adicionar 2 g de UA ao balão. Enrole na folha de alumínio (UA precipitados quando exposto à luz) e mexa continuamente.
Nota: Para obter detalhes sobre a preparação da UA, consulte a seção 6 deste protocolo. - Coloc diversas gotas individuais de 2% UA em uma folha limpa da cera dental em um prato de Petri.
- Flutue a grade com a amostra (lado da seção para baixo) em uma gota de UA por 25 min.
Nota: Flutue cada grade em uma gota separada de UA. - Segure a grade em sua borda com fórceps e enxague duas vezes um jato suave de água destilada fervida à temperatura ambiente de um frasco de lavagem de plástico.
Nota: Não permita que a grelha seque antes de manchar com chumbo.
13. pós-coloração com chumbo
- Prepare uma câmara livre de CO2(co2 no ar é a principal fonte de precipitação de chumbo). Coloque um pedaço de papel de filtro embebido com 1 N NaOH em um prato de Petri. Coloque uma pequena folha de cera dental limpa em cima do papel de filtro e coloque várias pelotas NaOH em um lado do prato. Cubra o prato.
Nota: Prepare esta instalação antes que as grades estejam manchadas com UA, de modo que a atmosfera na câmara esteja livre do CO2 e apronte para a mancha da ligação pela mancha do tempo UA está completa. - Faça 4% de NaOH. Adicionar 0,2 g de NaOH a 5 mL de água destilada.
- Prepare a solução tripla de chumbo de Sato. Para preparar 10 mL, adicione 0,1 g de nitrato de chumbo, 0,1 g de citrato de chumbo, 0,1 g de acetato de chumbo e 0,2 g de citrato de sódio em um frasco de vidro. Adicionar 8,2 mL de água destilada e agitar vigorosamente durante 5 min. SONICATE para 30 s, em seguida, adicione 1,8 mL de recém-feito 4% NaOH.
- Coloque várias gotas de chumbo de Sato sobre a cera no prato de Petri.
- Coloque a grelha manchada com UA (lado da secção para baixo) na gota de chumbo.
Nota: Cada grade deve ser flutuada em uma gota separada de chumbo. Cada gota deve ser suficientemente pequena para permitir que a grelha flutue em cima da cúpula da gota em vez de deslizar para baixo nos lados. - Cubra o prato e deixe manchar por 5 min.
- Segure a grade em sua borda com fórceps e lave bem um jato suave de água destilada fervida à temperatura ambiente de um frasco de lavagem de plástico.
- Blot secar a grade no papel de filtro e armazenar a grade.
Nota: Certifique-se de que a seção não entra em contato direto com o papel de filtro.
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Representative Results
Os critérios gerais que são aceitados na maior parte como indicativos da preservação satisfatória ou defeituosa do espécime para o tem foram estabelecidos. Estes critérios são exemplificados em quatro micrografias de elétron selecionados (dois exemplos da preparação óptima, dois exemplos da preparação defeituosa) que foram obtidos tratando o tecido de cérebro novo do rato que segue os métodos descritos neste protocolo.
Em geral, uma micrografia eletrônica de boa qualidade aparece como uma imagem ordenada, distinta e em geral acinzentada. Em um espécime satisfatoriamente preparado, os espaços entre as membranas devem ser preenchidos com material granular, e não devem estar vazios. Da mesma forma, nenhum espaço vazio deve ser encontrado na substância do solo citoplasmático ou dentro das organelas (comparar a figura 1a e a Figura 2a com a Figura 3 e a Figura 4). No entanto, é importante notar que o sistema nervoso central de animais muito jovens mostra um certo grau de alargamento dos espaços extracelulares quando comparado com o cérebro adulto, com conexões mais frouxas entre as células e um total mais branco, menos aparência elétron-densa. As membranas devem ser contínuas, sem distorção ou ruptura (Figura 1a e Figura 2a). O estroma das mitocôndrias deve parecer uniforme e denso, sem espaços vazios. As cristae devem estar intactas e não inchadas, e a membrana dupla externa mitocondrial deve ser ininterrupta (comparar a Figura 1a com a Figura 3). Para facilitar a Análise morfométrica da organização das vesículas pré-sinápticas, as membranas pré e pós-sinápticas precisam estar intactas e essencialmente paralelas entre si (ver Figura 1). As vesículas sinápticas devem ser rastreáveis e ligadas por uma membrana única contínua (ver Figura 2).
Importante, mesmo quando as melhores práticas são seguidas, o tratamento do espécime com fixatives, manchas e resinas introduz artefatos. Como os artefatos não podem ser eliminados, é fundamental entender o processo que os origina, de modo que a aparência do espécime possa ser interpretada em relação ao tratamento que foi submetido a12. Um exemplo de um artefato — entre vários que podem ser gerados durante a preparação da amostra para o TEM — é uma figura de mielina, uma inclusão lamelar membranosa que se assemelha a bainhas de mielina. Embora as figuras de mielina possam ser observadas em condições patológicas12, muitas vezes resultam da extração de lipídios da membrana durante a fixação com aldeídos (ver Figura 4).
Figura 1: micrografia eletrônica representativa da preservação satisfatória da estrutura celular (exemplo 1). (A) as membranas celulares neuronais são mergulhadas e sem quebras. O citoplasma é finamente granular e sem espaços vazios. As mitocôndrias não são inchadas nem encolhidos. Sua membrana dupla exterior é conservada, e os cristas internos são intactos. (B) detalhe do painel a, exemplificando um método para medir a distância das vesículas sinápticas da membrana pré-sináptica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: micrografia eletrônica representativa da preservação satisfatória da estrutura celular (exemplo 2). (A) as vesículas sinápticas são distintas e revestidas por uma única membrana ininterrupta. Para permitir a Análise morfométrica da distribuição das vesículas sinápticas, as membranas pré-sinápticas e pós-sinápticas precisam ser paralelas e sua continuidade preservada. (B) detalhe do painel a, exemplificando a contagem de vesículas sinápticas dentro do terminal pré-sináptico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: micrografia eletrônica representativa da preservação defeituosa da estrutura tecidual (exemplo 1). Observe a distorção e a ruptura das membranas celulares neuronais e a presença de espaços extracelulares acentuadamente aumentados (marcados com *). As mitocôndrias aparecem distendido e têm cristas inchados (marcados com seta). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: micrografia eletrônica representativa da preservação defeituosa da estrutura tecidual (exemplo 2). Anote a presença de grandes espaços vazios brancos dentro do citoplasma (marcado com ǂ), no lugar da substância cytoplasmic finamente granulada. Os espaços extracelulares aparecem ampliados. Um whorl membranous vesícula (figura de myelin), provavelmente resultando da mobilização dos lipídios durante a fixação com glutaraldehyde, é marcado com o acrônimo MF. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A manipulação de seções do tecido durante a preparação do espécime para o TEM exige um grau considerável de finesse, de concentração e de paciência. Ao usar uma micropipeta para adicionar e remover soluções, os espécimes podem ser sugados na ponta da pipeta pela tensão de superfície, tão grande cuidado deve ser tomado para evitar dano de tecido pela pipeta. Também, determinadas etapas da seqüência da desidratação podem ser tão rápidas quanto 1 minuto, daqui o operador precisa de trabalhar rapidamente para assegurar-se de que a etapa seguinte da desidratação esteja começada no tempo e o espécime não seque ou enrugamento. Um procedimento que requer atenção especial é a pós-fixação com ósmio. As seções tornam-se rígidas após o tratamento com ósmio e podem facilmente ser danificadas. Antes de adicionar o ósmio, é imperativo que as seções estejam aplaadas na parte inferior do frasco, mais toda a dobra conduzirá à fratura do tecido. A manipulação do tecido osmicated é particularmente desafiante ao transferir seções em películas ACLAR para a incorporação Lisa. O cuidado especial é necessário ao levantar o espécime da parte inferior do frasco para evitar a fragmentação, e ao empurrar bolhas de ar fora do sanduíche da película. Quando for importante empurrar para fora todo o ar prendido, porque faz o visualização do espécime difícil e enfraquece a estabilidade das ligações da resina, a pressão direta no tecido osmicated pode facilmente infligir dano. Uma outra etapa que necessite o cuidado extra é preparação da mistura da resina para a infiltração e a incorporação do espécime. EPON, a resina de incorporação a mais extensamente usada, pode ser endurecido com a adição de um endurecedor e de um acelerador. É imperativo usar a quantidade exata de endurecedor e acelerador, a fim de obter um bloco curado com as características desejadas. Ambos os métodos gravimétricos e volumétricos foram descritos para medir resinas viscosas. Embora os métodos gravimétricos tenham sido tradicionalmente considerados mais precisos12, o laboratório deste autor teve bom sucesso com modos volumétricos (ou seja, acrescentando o volume de cada ingrediente da mistura de resina incrementalmente por meio de uma seringa de gavagem) . Depois que os componentes da resina foram medidos com cuidado, devem ser misturados muito completamente para realizar a impregnação uniforme, desde que possuem viscosidades e taxas diferentes da polimerização. A falha conseguir a mistura completa conduzirá a um bloco da dureza desigual que é inadequado para o corte fino.
Alterações marcadas na tonicidade das soluções usadas para processar seções de cérebro de rato jovem podem causar encolhimento e/ou inchaço do espaço extracelular e componentes celulares12,35,36,37 . Durante a fixação, os melhores resultados são obtidos quando a pressão osmótica do perfusato é mantida tão similar como possível àquela do tecido o estudo. O osmolalidade do cérebro do rato é aproximadamente 330 mOsm. Um glutaraldeído a 2% na solução de 0,1 M PB é apenas ligeiramente hipertónico (400-450 mOsm) e minimiza a expansão do espaço extravascular12. Notavelmente, as membranas permanecem sensíveis às alterações na pressão osmótica das soluções de enxaguamento e desidratação após a fixação com aldeídos. Portanto, também é importante minimizar as diferenças entre a osmolaridade do fixador e as soluções utilizadas subseqüentemente12,35,36,37. Por esta razão, o mesmo veículo (0,1 M PB, osmolaridade aproximado 440 mOsm) é usado como um solvente para todas as soluções neste protocolo. No entanto, deve-se notar que vários buffers diferentes têm sido usados com êxito durante a preparação da amostra para o TEM e nenhum buffer único pode reivindicar superioridade universal sobre os outros. Quando os buffers de tonicidade inferior são preferidos, outros laboratórios optaram por aumentar a osmolaridade com eletrólitos ou não-eletrólitos12.
Várias etapas neste protocolo exigem o uso de produtos químicos que podem ser tóxicos quando não manuseados corretamente. A importância de trabalhar um exaustor e de usar o equipamento protetor pessoal ao segurar aldeídos, ósmio, urânio e compostos da ligação não pode ser exagerado. Enquanto sistemas automatizados contrastantes podem ajudar a atenuar alguns dos riscos e estão disponíveis comercialmente, eles podem ser bastante caros e podem não ser acessíveis por laboratórios que não fazem uso rotineiro de TEM. Embora o laboratório do microscópio de elétron possa potencial ser um lugar perigoso, o processamento do espécime para TEM é seguro total quando executado rigorosamente.
Recentemente, a introdução de microscopia de luz de superresolução aumentou a capacidade de solução de imagem óptica para cerca de 15 Nm34. No entanto, quando o objetivo é realizar a Análise morfométrica da organização espacial das vesículas sinápticas em terminais pré-sinápticos, nenhuma técnica fornece o mesmo grau de detalhe morfológico. Importante, o TEM é limitado pela necessidade para que o espécime esteja inoperante antes que possa ser processado e visualizado. Portanto, quando o objetivo do estudo é investigar aspectos dinâmicos ou funcionais do tráfico de vesículas sinápticas e da exocitose, ferramentas que não sejam a TEM devem ser consideradas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este manuscrito foi apoiado por NIH/NIGMS K08 123321 (para a) e por fundos do departamento de Anestesiologia da Universidade da Virgínia. Os autores desejam agradecer a alev Erisir (departamento de biologia, Universidade da Virgínia, Charlottesville, VA) por excelente treinamento e assistência técnica com a TEM, e por sua inestimável crítica manuscrita. Os autores igualmente agradecem a facilidade avançada da microscopia de elétron na Universidade de Virgínia para a assistência técnica com seccionamento do espécime e borne-mancha.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | "size 00, flat (cut bottom)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
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