Summary
Nous décrivons les procédures de traitement du tissu cérébral du rat nouveau-né afin d’obtenir des micrographies électroniques à haute résolution pour l’analyse morphométrique de la distribution des vésicules synaptiques aux terminaux nerveux. Les micrographies obtenues avec ces méthodes peuvent également être utilisées pour étudier la morphologie d’un certain nombre d’autres composants cellulaires et leurs relations structurelles dimensionnelles.
Abstract
Notre laboratoire et beaucoup d’autres ont exploité la haute puissance de résolution de la microscopie électronique à transmission pour étudier la morphologie et l’organisation spatiale des vésicules synaptiques. Afin d’obtenir des micrographies électroniques de haute qualité qui peuvent produire le degré de détail morphologique nécessaire à l’analyse quantitative de la distribution de vésicules présynaptiques, la préparation optimale des spécimens est essentielle. La fixation chimique est la première étape dans le processus de préparation des spécimens, et de la plus haute importance pour préserver l’ultrastructure fine. La fixation vasculaire avec une solution de glutaraldéhyde-formaldéhyde, suivie d’un traitement de spécimens coupés en vibratome avec du tétroxyde d’osmium, stabilise le nombre maximal de molécules, en particulier les protéines et les lipides, et entraîne une conservation supérieure de l’ultrastructure. Le tissu est ensuite traité avec une contre-coloration, une déshydratation séquentielle et une incorporation de résine. La coloration en bloc avec l’acétate d’uranyle (c.-à-d., coloration des tissus sectionnés par vibratome avant l’incorporation de résine) renforce le contraste endogène et stabilise les composants cellulaires contre l’extraction pendant le traitement des spécimens. Le contraste peut être augmenté davantage en appliquant l’acétate d’uranyle comme post-tache sur des sections ultrafines. La double coloration des coupes ultrafines avec le citrate de plomb après le traitement par l’acétate d’uranyle améliore également la résolution de l’image, en intensifiant l’opacité électronique des structures contenant de l’acide nucléique par liaison sélective du plomb à l’acétate d’uranyle. La microscopie électronique à transmission est un outil puissant pour caractériser les détails morphologiques des vésicules synaptiques et la quantification de leur taille et de leur organisation spatiale dans le bouton terminal. Cependant, parce qu’il utilise des tissus fixes, la microscopie électronique par transmission ne peut fournir que des informations indirectes sur les processus vivants ou en évolution. Par conséquent, d’autres techniques devraient être envisagées lorsque l’objectif principal est d’étudier les aspects dynamiques ou fonctionnels du trafic de vésicules synaptiques et de l’exocytose.
Introduction
Nous décrivons des méthodes pour la préparation du tissu cérébral nouveau-né de rat pour obtenir des micrographies électroniques de haute qualité pour l’analyse morphométrique en profondeur de la distribution spatiale des vésicules synaptiques aux bornes nerveuses1,2. Les micrographes à contraste élevé qui peuvent être obtenus en traitant des spécimens suivant ces méthodes peuvent également être utilisés pour étudier la morphologie détaillée d’un certain nombre de composants cellulaires et leurs relations structurelles dimensionnelles3,4.
Le microscope électronique à transmission (TEM) est un outil puissant pour étudier quantitativement la morphologie des organites et d’autres structures cellulaires. À partir de cette décennie, il n’y a pas d’autres méthodes d’investigation qui peuvent fournir le même degré de résolution des membranes lipidiques et des organites sans immuno-marquage, à l’exception de la cryofixation par congélation à haute pression. Cependant, les techniques de substitution de gel ne sont pas largement utilisées, et exigent normalement des équipements coûteux et des temps de préparation longs.
Afin de tirer parti de la haute puissance de résolution de TEM, la préparation optimale des spécimens est d’une importance primordiale. Les principaux objectifs de la préparation des spécimens sont de préserver la structure tissulaire avec une altération minimale de l’état vivant, d’améliorer le contraste des spécimens et de stabiliser le tissu contre l’extraction des composants cellulaires pendant la transformation et l’exposition à l’électron faisceau. De nombreux protocoles pour la préparation des tissus TEM ont été introduits et perfectionnés par plusieurs laboratoires au fil des ans. Beaucoup d’entre eux se sont concentrés sur des méthodes pour une visualisation optimale des vésicules synaptiques5,6,7,8,9,10,11. Parmi un certain nombre de méthodes bien établies d’étalon-or actuellement utilisées, nous avons choisi des procédures de fixation chimique, de post-fixation, de coloration en bloc, de déshydratation séquentielle, d’incorporation de résine et de post-coloration qui visent à préserver la structure tissulaire optimale et obtenir un excellent contraste d’image. Il est à noter que la préservation de l’ultrastructure fine peut être particulièrement difficile lorsque l’on travaille avec le tissu cérébral nouveau-né du rat. En fait, le système nerveux central des très jeunes animaux est caractérisé par une teneur en eau plus élevée que le cerveau adulte, un élargissement plus important des espaces extracellulaires et des connexions plus lâches entre les cellules12. Ceci rend le tissu nouveau-né de cerveau de rat profondément sensible aux changements dans l’osmolarité, et délicieusement sujettes au rétrécissement artifactuel et/ou au gonflement lorsqu’il est traité par des solutions séquentielles de différentes tonicité12. Par conséquent, nos méthodes employaient des solutions pour le traitement des spécimens qui sont d’osmolarité aussi proche que possible de celle du cerveau nouveau-né de rat. Notre objectif était d’obtenir des images de haute qualité en microscopie électronique à haute résolution pour l’évaluation quantitative de la distribution spatiale des vésicules synaptiques aux terminaux nerveux. Plus précisément, nous avons cherché à mesurer le nombre de vésicules dans la borne nerveuse, la distance des vésicules synaptiques de la membrane plasmatique présynaptique, le nombre de vésicules ancrées à la membrane pré-synaptique, la taille des vésicules synaptiques et la distances inter-vésicules1.
Une fixation chimique satisfaisante est une condition préalable à l’obtention de micrographies électroniques de haute qualité qui peuvent fournir le détail morphologique nécessaire à l’étude de la morphologie et de l’organisation spatiale des vésicules synaptiques. Bien que plusieurs modes de fixation existent, la fixation du tissu cérébral par perfusion vasculaire est décidément supérieure à d’autres méthodes. Depuis la fixation par perfusion vasculaire commence immédiatement après l’arrestation de la circulation systémique, il raccourcit l’intervalle entre la désoxygénation du tissu cérébral et la réticulation des protéines avec des fixatifs, entraînant des altérations minimales dans les cellules structure. En outre, il accomplit une pénétration rapide et uniforme, en raison du débit rapide du fixatif du lit vasculaire aux compartiments extracellulaires et cellulaires12,13,14. La fixation primaire avec le glutaraldéhyde, suivie d’une fixation secondaire (post-fixation) avec le tétroxyde d’osmium, donne une excellente préservation de la structure fine15,16,17. Un mélange de glutaraldéhyde et de paraformaldéhyde a l’avantage supplémentaire d’une pénétration plus rapide dans le tissu12.
Étant donné que les tissus biologiques ne sont pas suffisamment rigides pour être coupés en sections minces sans le soutien d’une matrice de résine, ils doivent être incorporés dans un milieu avant une coupe mince. Les résines époxy immiscibles à l’eau sont couramment utilisées comme milieu d’incorporation dans TEM. Lorsque ce type de matrice est utilisé, l’eau libre de tous les spécimens doit être remplacée par un solvant organique avant l’infiltration de résine. L’eau est enlevée en passant l’échantillon à travers une série de solutions de concentrations ascendantes d’éthanol et/ou d’acétone12. Dans ce protocole, les spécimens sont d’abord encastrés à plat entre les feuilles Aclar flexibles, puis incorporés dans une capsule. Le résultat final est le tissu situé à l’extrémité d’un bloc de résine cylindrique, qui a la géométrie idéale pour être le moins affecté par les vibrations survenant lors de la sectionnement du microtome.
La coloration avec des métaux lourds pour améliorer le contraste des tissus endogènes est un autre aspect important de la préparation des spécimens. Le contraste d’image dans le TEM est dû à la diffusion d’électrons par les atomes dans le tissu. Cependant, les matériaux biologiques consistent en grande partie en de faibles molécules de poids atomique (c.-à-d. le carbone, l’hydrogène, l’oxygène et l’azote). Par conséquent, la génération d’un contraste de diffusion suffisant nécessite l’incorporation d’atomes de poids atomique élevés dans les composants cellulaires du tissu. Ceci est obtenu par coloration de l’échantillon avec des métaux lourds12,18,19. Le tétroxyde d’osmium, l’uranium et le plomb, qui se lient fortement aux lipides, sont les métaux lourds les plus couramment utilisés comme taches d’électrons.
L’osmium (numéro atomique 76) est l’un des métaux les plus denses de l’existence. Il est à la fois un fixatif et une tache, bien que son rôle principal dans TEM est comme un fixatif fiable12. Parmi les différents protocoles de fixation utilisés, la méthode de double fixation avec le glutaraldéhyde suivie de l’osmium est la plus efficace pour réduire l’extraction des constituants cellulaires lors de la préparation des spécimens. Ces deux fixatifs sont utilisés pour stabiliser le nombre maximal de différents types de molécules, en particulier les protéines et les lipides, et entraîner une préservation supérieure de l’ultrastructure tissulaire12,14,15, le 16 , le 17.
L’uranium (numéro atomique 92) est le métal le plus lourd utilisé comme tache d’électrons, le plus souvent sous la forme d’acétate d’uranyle. De même que l’osmium, il agit comme une tache et fixatif, bien que son rôle principal dans TEM est comme une tache20,21. Les structures contenant des acides nucléiques et membraneuses sont fortement et préférentiellement colorées avec des sels d’uranyle dans des tissus d’aldéhyde-fixes22,23. Le traitement des tissus avec l’acétate d’uranyle après osmication et avant la déshydratation entraîne la stabilisation des structures membraneuses et acides nucléiques, ainsi qu’un contraste accru, et permet l’identification de certains détails structurels qui ne seraient pas être facilement décelés dans des spécimens colorés avec de l’osmium seul12,24,25. On pense que l’acétate d’uranyle peut stabiliser la structure fine en combinant avec l’osmium réduit qui a été déposé sur les membranes lipidiques pendant l’osmication24. Le contraste maximal est atteint lorsque l’acétate d’uranyle est appliqué avant l’incorporation et comme un post-tache dans les sections minces12.
Le plomb (numéro atomique 82) est la tache la plus courante utilisée pour le TEM et est principalement employée pour la post-coloration des coupes minces. Les sels de plomb ont une opacité élevée des électrons et montrent une affinité pour un large éventail de structures cellulaires, y compris les membranes, les protéines nucléaires et cytoplasmiques, les acides nucléiques et le glycogène26,27. Lorsque la méthode de coloration double est employée (c.-à-d., la coloration avec l’acétate d’uranyle est suivie par le traitement avec le plomb), ce dernier agit comme un révélateur de coloration de l’acétate d’uranyle. Par exemple, le plomb post-coloration de la chromatine fixée avec le glutaraldéhyde augmente l’absorption de l’acétate d’uranyle par un facteur de trois28,29,30,31,32. Le plomb améliore également la coloration transmise par d’autres métaux tels que l’osmium. On pense que les sels de plomb tachent les membranes des tissus osmium-fixés par attachement au groupe polaire des phosphatures en présence de l’osmium33réduit. Un inconvénient potentiel de coloration avec l’acétate d’uranyle et le plomb, en particulier pour les durées prolongées, est que de nombreux éléments structuraux différents sont colorés de manière égale et non-spécifique, et ne peuvent donc pas être facilement distingués les uns des autres12 .
L’introduction récente de sources lumineuses alternatives, telles que la microscopie optique de localisation photo-activée à Super résolution, a considérablement amélioré la résolution34de la microscopie photonique. Cependant, parce que la microscopie photonique repose sur des méthodes histochimiques et immuno-cytochimiques pour visualiser des protéines ou des enzymes marquées individuellement, la puissance de TEM pour afficher tous les éléments structurels à la fois reste inégalée pour une étude approfondie de la morphologiques et les relations dimensionnelles des structures tissulaires. En particulier, aucune autre technique ne peut fournir le détail morphologique nécessaire pour effectuer une analyse morphométrique de la distribution de vésicules synaptiques à des boutons nerveuses pré-synaptiques. Néanmoins, il est important de noter que les micrographies électroniques capturent la structure du tissu après la mort de l’organisme, et qu’ils ne peuvent donc pas fournir d’informations sur la dynamique du trafic de vésicules présynaptiques et de l’exocytose. Par conséquent, d’autres outils, tels que l’imagerie en direct de la teinture FM et l’électrophysiologie à pinces, doivent être pris en considération lorsque l’objectif principal est d’étudier les aspects dynamiques et/ou fonctionnels du trafic de vésicules synaptiques et de l’exocytose.
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Protocol
Toutes les études ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Virginie (Charlottesville, Virginie) et menées conformément aux lignes directrices des instituts nationaux de la santé.
1. fixation par perfusion vasculaire
Remarque: Une description générale de la méthode de perfusion vasculaire du cerveau de rat a déjà été décrite dans le présent journal13 et dépasse le cadre de ce protocole. Cependant, les étapes suivantes sont spécifiques pour la préparation du tissu cérébral nouveau-né de rat pour obtenir des micrographies électroniques de haute qualité pour l’analyse quantitative de la distribution des vésicules synaptiques aux terminaux pré-synaptiques.
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Préparer 4% de paraformaldéhyde
- Placer 800 mL de tampon de phosphate de 0,1 M (PB) dans un bécher en verre de 2 L sur une plaque d’agitation sous une hotte. Chauffer à environ 60 ° c sans faire bouillir le tampon.
- Ajouter 40 g de poudre de paraformaldéhyde. Remuer continuellement
- Pendant la mesure du pH, ajouter de petites gouttes de NaOH 10 N jusqu’à ce que la solution s’efface. Le pH final doit être de 7,2 à 7,4.
- Ajouter le reste 0,1 M PB à un volume final de 1 L. Laisser refroidir, filtrer avec une membrane de 0,45 μm et conserver à 4 ° c pendant la nuit.
Remarque: Préparer le paraformaldéhyde frais la veille de la perfusion.
Attention: L’inhalation de vapeurs d’aldéhyde peut provoquer des symptômes nasaux et une irritation des voies respiratoires. Le contact avec la peau provoque une dermatite. Les aldéhydes doivent être manipulés dans une hotte tout en portant des gants, une robe de protection et des lunettes de sécurité
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Préparez la solution Tyrode
- Placer 1 L d’eau distillée dans un gobelet en verre sur une plaque d’agitation. Ajouter NaCl (8 g), KCl (0,15 g), CaCl2 (0,1 g), MgCl2 (0,006 g), Nah2po4 (0,055 g), NaHCO3 (1 g) et dextrose (1 g) dans le bécher.
- Remuer continuellement et mesurer le pH. Conserver le pH entre 7,2 et 7,4.
Remarque: La solution Tyrode est également disponible dans le commerce.
- Mélanger 4% de paraformaldéhyde avec le glutaraldéhyde à une concentration finale de 2%. Ajouter 40 mL de microscopie électronique-grade 50% de glutaraldéhyde à 1 L de 4% de paraformaldéhyde. Bien mélanger dans une assiette en remuant
Remarque: Environ 100 ml de la solution fixateur de paraformaldéhyde-glutaraldéhyde est nécessaire pour perfuser le corps d’un rat nouveau-né. Par conséquent, au moins 10 rats nouveau-nés peuvent être perfusés avec 1 L de fixatif. Ne mélangez pas le paraformaldéhyde et le glutaraldéhyde avant de l’utiliser immédiatement. Apportez toutes les solutions à la température ambiante avant la perfusion. - Une fois que l’accès au ventricule gauche a été obtenu (voir protocole de perfusion de l’animal entier13), rincer le système vasculaire avec la solution de Tyrode pendant 30 s à une pression de perfusion de 120 mmHg.
Remarque: Le succès de la perfusion dépend en partie de l’exclusion complète du sang du lit vasculaire - Rincer avec de la solution de paraformaldéhyde-glutaraldéhyde à la même pression pendant 10 min.
Remarque: Le maintien d’une pression de perfusion constante est essentiel pour éviter l’introduction d’artefacts. En outre, la température du perfusat ne doit pas être inférieure à la température corporelle du rat pour éviter la vasoconstriction - Retirer le cerveau fixe du crâne et le placer dans un fixatif de paraformaldéhyde-glutaraldéhyde frais à 4 ° c pendant la nuit.
Remarque: le protocole peut être suspendu ici.
2. tranchage du cerveau
- Incorporer le cerveau fixe dans 4% d’d’agarose et coller le bloc cerveau-d’agarose sur un stade de vibratome
Remarque: D’autres laboratoires ont obtenu des sections de bonne qualité en réalisant un bloc stable sur le vibratome sans support de gélose - Tranches de section de 50 μM d’épaisseur. Réglez le microtome sur basse fréquence et vitesse.
Remarque: Les sections peuvent être entreposées en 0,1 M PB avec 0,05% d’azide de sodium à 4 ° c pendant plusieurs années. - Placer les profilés en 0,1 M PB dans une boîte de Petri, examiner les sections sous un microscope de dissection et sélectionner des spécimens pour l’incorporation
Remarque: Le protocole peut être suspendu ici.
3. le rinçage
Remarque: Il est important de rincer l’échantillon après fixation avec des aldéhydes et avant la post-fixation avec de l’osmium, puisque les fixatifs résiduels peuvent produire des précipités d’osmium
- Pipetter 0,1 M PB dans un flacon en verre court et large avec capuchon. Placer un spécimen par flacon. Recouvrir complètement l’échantillon afin qu’il ne sèche pas.
Remarque: Conserver les spécimens dans le même flacon à partir de cette étape à travers toutes les modifications de la solution de fixation, de déshydratation et d’infiltration, jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’incorporation à plat. - Rincer l’échantillon en 0,1 M PB pendant 3 min x 2, puis retirer le PB avec une micropipette.
Remarque: Puisque le cerveau du rat nouveau-né est profondément sensible aux changements dans l’osmolarité12,35,36,37, effectuer les lavages dans le même véhicule que celui utilisé dans le mélange fixatif
4. post-fixation avec osmium
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Préparation du tétroxyde d’osmium (OsO4)
Remarque: Ce laboratoire d’auteur utilise OsO4 4% fourni dans une solution aqueuse dans des ampoules de verre (5 ml d’OSO4 4% en H2O). D’autres laboratoires ont utilisé avec succès les cristaux OsO4 . Cependant, plusieurs heures sont nécessaires pour dissoudre des cristaux OsO4 dans un véhicule.- Prendre 5 mL (une ampoule) de 4% OsO4/H2O, l’ouvrir et le placer dans une bouteille en verre brun
Remarque: OsO4 est un agent oxydant fort et facilement réduit par l’exposition à la lumière. La réduction peut être évitée lors de la préparation en plaçant OsO4 dans une bouteille en verre brun - Ajouter 5 mL de 0,2 M PB. Cela produira 10 mL de 2% OsO4/0,1 M PB.
Remarque: Puisque le cerveau du rat nouveau-né est profondément sensible aux changements dans l’osmolarité, utilisez la même mémoire tampon pour préparer les fixatifs d’aldéhyde et l’OSO4 solution12,35,36,37 - Ajouter 10 mL supplémentaires de 0,1 M PB. Ceci produira une solution finale de 20 mL de 1% OsO4 en 0,1 m PB.
- Utiliser une seringue de 20 mL munie d’une longue aiguille pour tirer 1% OsO4 et la placer dans une bouteille en verre brun ou un flacon de scint recouvert d’une feuille d’aluminium.
Attention: OsO4 est extrêmement volatile et ses fumées sont toxiques pour le nez, les yeux et la gorge. Tous les travaux doivent être effectués dans une hotte à l’aide de gants et de vêtements de protection, et aucune partie du corps ne doit être exposée à l’OsO4. La manutention et l’élimination des déchets doivent être effectuées conformément aux directives de votre institution. Rangez l’OsO4 inutilisé dans une bouteille en verre brun hermétiquement stoppé avec une doublure en téflon sur le bouchon en verre, enveloppez la bouteille en double feuille d’aluminium et rangez-la dans un dessiccateur. En présence de fuites de fumées, l’OsO4 peut décolorer les surfaces internes et le contenu du réfrigérateur. Dans les conditions de stockage mentionnées ci-dessus, la solution OsO4 est stable pendant plusieurs mois. Lorsque les solutions sont oxydées pendant le stockage, elles tournent en gris, auquel cas elles doivent être éliminées.
- Prendre 5 mL (une ampoule) de 4% OsO4/H2O, l’ouvrir et le placer dans une bouteille en verre brun
- Ajouter 1% OsO4 en 0,1 M PB dans le flacon spécimen et laisser reposer pendant 1 h. extraire OSO4 après 1 h avec une micropipette.
Remarque: Avant d’appliquer l’OsO4 à la section, il est essentiel de déplier et d’aplatir l’échantillon. Évitez l’application directement sur le dessus de l’échantillon, utilisez plutôt les parois du flacon pour égoutter doucement l’OsO4 au fond du flacon. Le spécimen devient brun et rigide peu après l’application de l’OsO4 . Manipulez doucement à partir de maintenant pour éviter les dommages tissulaires
5. le rinçage
Remarque: Il est important de rincer l’échantillon après la fixation avec OsO4 et avant la déshydratation, car les fixatifs résiduels peuvent réagir avec les agents de déshydratation37.
- Rincer avec 0,1 M PB pendant 3 min x 3.
Remarque: Puisque le cerveau du rat nouveau-né est profondément sensible aux changements d’osmolarité, effectuer les lavages dans le même véhicule que celui utilisé dans le mélange fixatif12,35,36,37. - Placez la solution d’osmium et les deux premières rinçages de PB dans les déchets d’OsO4 et éliminez-les selon les directives de votre établissement.
6. déshydratation séquentielle et coloration avec l’acétate d’uranyl
Remarque: Le laboratoire de cet auteur utilise des résines époxydiques à l’eau non miscibles pour l’incorporation. Lorsque des résines époxy sont utilisées, l’eau libre de l’échantillon doit être remplacée par un solvant organique avant l’infiltration par le milieu d’enrobage. L’eau est enlevée en passant l’échantillon à travers une série de solutions de concentrations ascendantes d’éthanol et d’acétone12.
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Préparation de l’acétate d’uranyle (UA)
- Placer une fiole en verre volumétrique de 200 mL contenant 100 mL d’EtOH 70% sur une plaque d’agitation.
- Ajouter 4 g d’UA au flacon. Envelopper dans une feuille d’aluminium (l’UA précipite lorsqu’il est exposé à la lumière) et remuer continuellement.
Remarque: L’UA se dissout lentement et incomplètement en 70% EtOH. Laisser les cristaux non dissous s’installer avant d’utiliser la solution. La solution UA doit être filtrée avec un filtre de 0,45 μm avant utilisation. L’UA peut être préparée à l’avance et conservée dans une bouteille brune enveloppée dans une feuille d’aluminium à 4 ° c pendant des mois.
Attention: L’UA est légèrement radioactive et hautement toxique. L’inhalation de poudre d’UA peut causer des troubles des voies respiratoires supérieures et des maladies des poumons, du foie et des reins. L’UA est dangereuse lorsqu’elle est ingéré ou lorsqu’elle est en contact direct avec la peau et les muqueuses. Tous les travaux doivent être effectués dans une hotte à l’aide de gants et de vêtements de protection. La manutention et l’élimination des déchets doivent être effectuées conformément aux directives de votre institution.
- Déshydrater en 50% EtOH pendant 1 min. Retirer 50% EtOH avant d’ajouter UA.
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Ajouter 4% d’UA dans 70% EtOH. Laisser reposer pendant 1 h ou la nuit. Si vous passez la nuit, placez-le au réfrigérateur à 4 ° c.
Remarque: flacon Cap pour éviter l’évaporation EtOH et couvrir avec du papier d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière. Le protocole peut être suspendu ici.- Éliminez les déchets d’UA et les deux rinçages suivants selon les directives de votre établissement
- Déshydrater en 70% EtOH pendant 1 min.
- Déshydrater en 90% EtOH pendant 5 min.
- Déshydrater en 100% EtOH pendant 5 min x 2.
- Rincer l’échantillon à l’acétone pendant 2 min x 3.
7. infiltration et incorporation
Remarque: Les tissus ne sont pas suffisamment rigides pour être coupés en fines sections sans le soutien supplémentaire d’une matrice de résine. Par conséquent, l’infiltration et l’incorporation doivent précéder la sectionnement12.
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Préparation de la résine EPON
- Utiliser une seringue de gavage de 60 mL. Retirez le piston de la seringue et le capuchon de la seringue avec une aiguille de sécurité.
- Placez la seringue avec le côté ouvert vers le haut et ajoutez le volume de chaque ingrédient du mélange de résine incrémentalement. Ajouter 22 mL d’embed-812 (résine). Ajouter DDSA (durcisseur) à un volume total de 37 mL. Ajouter NMA (durcisseur) à un volume total de 50,5 mL. Ajouter 525 μL de DMP-30 (Accélérateur) avec une pipette. Déplacez le piston de la pipette très lentement car le DMP est très visqueux.
Remarque: il est important d’ajouter les réactifs d’incorporation dans l’ordre indiqué. L’accélérateur (DMP-30) doit être ajouté en dernier. Pour obtenir un bloc durci qui a les caractéristiques souhaitées, il est essentiel d’utiliser la quantité exacte du durcisseur et de l’accélérateur. Les mélanges d’enrobage fraîchement préparés sont préférés. - Remettre le piston et placer la seringue sur un rocker avec agitation continue pendant au moins 30 min. la couleur passe du jaune à l’ambre.
Remarque: Tous les ingrédients doivent être mélangés très soigneusement. Le non-respect des résultats entraîne une imprégnation inégale de l’échantillon tissulaire et un bloc de dureté inégale
- Mélanger 1 volume de résine EPON avec 1 volume d’acétone dans un flacon de scint et agiter pour mélanger. Appliquez le mélange EPON: acétone 1:1 sur le tissu après avoir enlevé le dernier rinçage à l’acétone. Garder couvert pour éviter l’évaporation de l’acétone. Retirer le mélange 1:1 de résine et d’acétone après 2-4 h ou garder la nuit.
Remarque: le protocole peut être suspendu ici. - Remplacez le mélange de résine et d’acétone par de la résine pleine. Laisser reposer pendant 4 h ou la nuit. Mettre tous les déchets d’EPON dans un récipient de collecte sous le capot pour être polymérisés et éliminés ultérieurement.
Remarque: le protocole peut être suspendu ici.
8. enrobage à plat
Remarque: Les spécimens sont encastrés à plat entre deux films d’Aclar d’une manière semblable à un sandwich.
- Coupez deux morceaux rectangulaires de feuille d’Aclar clair. Nettoyez les films avec EtOH 70%. Coupez les feuilles de façon à ce qu’il y ait au moins 1,5 cm de plastique sans tissu de chaque côté de la section. La feuille d’Aclar sur le dessus devrait avoir la même largeur que le fond, et sa hauteur devrait être approximativement deux tiers de la feuille inférieure.
- Inclinez doucement le flacon avec l’échantillon et soulevez doucement le tissu du fond du flacon.
- Utilisez une spatule micro-flexible et une brosse fine pour déplacer délicatement la section le long des parois du flacon et la transférer sur la feuille d’Aclar.
Remarque: Manipulez les sections avec précaution pour éviter les dommages de spécimen. - Placez délicatement la feuille d’Aclar sur le dessus de l’échantillon.
Remarque: Assurez-vous qu’il y a assez de résine entre les deux feuilles pour sceller le sandwich - Poussez délicatement les bulles d’air emprisonnées sans exercer de pression directe sur la section. Essuyez l’excès d’EPON.
Remarque: L’élimination des bulles d’air est importante, car leur présence rend difficile la visualisation de l’échantillon et affaiblit la stabilité des liaisons de résine. - Étiqueter les feuilles avec un stylo résistant aux solvants et les placer dans le four à 60 ͦC pendant 2-3 jours pour les polymériser.
Remarque: le protocole peut être suspendu ici.
9. incorporation de capsules
Remarque: Les ultramicrotomes sont livrés avec des mandrins pour contenir des blocs cylindriques obtenus à partir d’échantillons d’incorporation dans des capsules. Les blocs cylindriques ont la géométrie idéale pour être les moins touchés par les vibrations survenant lors de la coupe.
- Ouvrez doucement les films d’Aclar en sandwich. Le spécimen adhérera à l’une des deux feuilles Aclar.
- Utilisez un stylo résistant aux solvants pour marquer le côté de la feuille d’Aclar qui contient la section. Marque près du tissu.
Remarque: Il est essentiel d’effectuer cette étape avant de poinçonner le tissu d’intérêt. - Utilisez un poinçon de disque pour obtenir un échantillon de cercle de la section. La marque de stylo doit faire partie du tissu perforé.
- Préparez le capuchon d’un côté de capsule d’incorporation vers le haut sur un support de capsule. Placez une goutte de résine sur le capuchon.
- Placez le disque perforé à l’intérieur du capuchon avec la section tissulaire orientée vers le haut. La marque de stylo brillera lorsque la lumière est brillé sur l’échantillon.
- Insérez une capsule dans le capuchon et utilisez des pinces fines pour insérer l’étiquetage. Rouler et abaisser une feuille imprimée de 2 cm de long dans la capsule. Faire l’étiquette pour s’adapter à la courbure des parois latérales de la capsule. Attendez que la polymérisation soit complète, de sorte que l’étiquette devienne définitivement incorporée dans la résine.
- Versez la résine d’enrobage à l’intérieur de la capsule et remplissez jusqu’au bord de la capsule.
- Poussez l’échantillon de tissu vers le bas de la capsule à l’aide d’un bâton pointu en bois et placez-le dans le four à 60 ° c pendant 2-3 jours.
Remarque: Prendre soin de ne pas presser le tissu trop dur, au lieu de laisser reposer souplement de sorte qu’une couche mince du milieu d’incorporation est présente entre le tissu et la surface de la capsule. Le protocole peut être suspendu ici.
10. rognage de la face du bloc
Remarque: La petite taille et la forme appropriée de la face de bloc sont des prérequis pour une coupe satisfaisante. Par conséquent, le découpage du bloc de spécimen est une nécessité.
- Utilisez une lame de rasoir à un bord tranchant. Nettoyez avec de l’acétone immédiatement avant utilisation.
- Montez le bloc-capsule dans un porte-bloc et placez le porte-bloc sur la platine d’un stéréomicroscope.
Remarque: La procédure de rognage doit être effectuée sous des jumelles de microscope et un éclairage oblique. - Retirez la feuille d’Aclar de la pointe de la capsule à l’aide d’une lame de rasoir. La feuille d’Aclar apparaît sous la forme d’une couche brillante sous la lumière de la portée de disséction.
- Tenez la lame de rasoir à un angle de 45 degrés et faites des coupes vers le bas quatre côtés du bloc de capsule.
Remarque: Un meilleur contrôle de l’ajustement est obtenu si la lame est maintenue avec les deux mains. - Faire des coupes courtes de sorte que le bloc prend la forme d’une pyramide courte avec des angles de paroi d’environ 45 °.
Remarque: La face de l’échantillon est soutenue beaucoup mieux si les côtés menant à lui sont maintenus courts. Si le bout de bloc est trop mince et long, il vibrera pendant la coupe mince. Idéalement, la zone d’intérêt doit être centrée dans la face du bloc. - Coupez la pointe de la capsule pour jeter les tissus superflue et ne Préservez que la zone d’intérêt.
Remarque: Aucune partie de la section ne doit être sans tissu, car les variations de la densité de la face du bloc sont une cause majeure de difficulté dans la coupe. Idéalement, la surface de la face de la capsule ne doit pas dépasser 1 mm2. - Coupez la face de la capsule en forme de trapèze scalène. Parce que dans un trapèze scalène aucun côté n’est égal, cette forme est préférable d’orienter la zone d’intérêt par rapport au reste de l’échantillon.
Remarque: Pendant la coupe, le visage en forme de trapèze est supporté beaucoup mieux que celui de n’importe quelle autre forme.
11. sectionnement du microtome
Remarque: La majorité des spécimens biologiques sont trop épais dans leur état naturel pour être pénétrés par un faisceau d’électrons. Par conséquent, le matériau doit être découpé dans des sections minces qui peuvent être pénétrées par le faisceau d’électrons.
- Coupez les coupes minces (couleur d’interférence argentée, 600-900 Å) sur un innovions aux plans parallèles à la surface.
- Placez les sections sur les grilles. Le laboratoire de cet auteur utilise des grilles en cuivre de 3,05 mm de diamètre extérieur.
Remarque: Le protocole peut être suspendu ici.
12. post-coloration avec l’acétate d’uranyl
- Préparer 2% d’UA dans l’eau distillée. Placer une fiole en verre volumétrique de 200 mL contenant 100 mL d’eau distillée sur une plaque d’agitation. Ajouter 2 g d’UA au flacon. Envelopper dans une feuille d’aluminium (l’UA précipite lorsqu’il est exposé à la lumière) et remuer continuellement.
Remarque: Pour plus de détails sur la préparation de l’UA, voir la section 6 du présent protocole. - Placer plusieurs gouttes individuelles de 2% UA sur une feuille propre de cire dentaire dans une boîte de Petri.
- Faire flotter la grille avec l’échantillon (côté section vers le bas) sur une goutte d’UA pendant 25 min.
Remarque: Flottez chaque grille sur une goutte séparée d’UA. - Tenez la grille à son bord avec des pinces et rincez-la deux fois sous un jet doux d’eau distillée bouillie à température ambiante à partir d’un flacon de lavage en plastique.
Remarque: Ne pas laisser sécher la grille avant de la colorer avec du plomb.
13. post-coloration avec le plomb
- Préparer une chambre exempte de CO2(co2 dans l’air est la principale source de précipitation de plomb). Placez un morceau de papier filtre imbibé de NaOH 1 N dans une boîte de Petri. Placez une petite feuille de cire dentaire propre sur le dessus du papier filtre et placez plusieurs pastilles de NaOH sur un côté du plat. Couvrez le plat.
Remarque: Préparez cette configuration avant que les grilles soient colorées avec l’UA, de sorte que l’atmosphère dans la chambre soit exempte de CO2 et prête pour la coloration de plomb au moment où la coloration d’UA est terminée. - Faire 4% de NaOH. Ajouter 0,2 g de NaOH à 5 mL d’eau distillée.
- Préparez la solution de triple Lead de SATO. Pour préparer 10 mL, ajouter 0,1 g de nitrate de plomb, 0,1 g de citrate de plomb, 0,1 g d’acétate de plomb et 0,2 g de citrate de sodium dans une bouteille en verre. Ajouter 8,2 mL d’eau distillée et agiter vigoureusement pendant 5 min. Sonicate pendant 30 s, puis ajouter 1,8 mL de NaOH 4% fraîchement fait.
- Placez plusieurs gouttes de plomb de SATO sur la cire dans la boîte de Petri.
- Placez la grille tachée d’UA (côté de section vers le bas) sur la goutte de plomb.
Remarque: Chaque grille doit être flottée sur une goutte de plomb distincte. Chaque goutte doit être assez petite pour permettre à la grille de flotter sur le dessus du dôme de la goutte au lieu de glisser vers le bas sur les côtés. - Couvrir le plat et laisser la tache pendant 5 min.
- Tenez la grille à son bord avec des pinces et lavez-la soigneusement sous un jet doux d’eau distillée bouillie à température ambiante à partir d’un flacon de lavage en plastique.
- Essuyez la grille sur du papier filtre et stockez la grille.
Remarque: Assurez-vous que la section n’entre pas en contact direct avec le papier filtre.
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Representative Results
Des critères généraux qui sont généralement acceptés comme indicatifs de préservation satisfaisante ou défectueuse de l’échantillon pour TEM ont été établis. Ces critères sont illustrés par quatre micrographies d’électrons choisies (deux exemples de préparation optimale, deux exemples de préparation défectueuse) qui ont été obtenus en traitant les jeunes tissus cérébraux de rat suivant les méthodes décrites dans ce protocole.
En général, un Micrographe électronique de bonne qualité apparaît comme une image ordonnée, distincte et globalement grisâtre. Dans un spécimen préparé de manière satisfaisante, les espaces entre les membranes doivent être remplis de matière granulaire et ne doivent pas être vides. De même, aucun espace vide ne doit être trouvé dans la substance au sol cytoplasmique ou dans les organites (comparer la figure 1a et la figure 2a avec la figure 3 et la figure 4). Néanmoins, il est important de noter que le système nerveux central des très jeunes animaux montre un certain degré d’élargissement des espaces extracellulaires par rapport au cerveau adulte, avec des connexions plus lâches entre les cellules et un blanc global, moins aspect dense aux électrons. Les membranes doivent être continues, sans distorsion ni rupture (figure 1a et figure 2a). Le stroma des mitochondries devrait paraître uniforme et dense, sans espaces vides. Cristae doit être intact et non gonflé, et la membrane double externe mitochondriale doit être ininterrompue (comparer la figure 1a avec la figure 3). Pour faciliter l’analyse morphométrique de l’Organisation des vésicules pré-synaptiques, les membranes pré-et post-synaptiques doivent être intactes et essentiellement parallèles les unes aux autres (voir la figure 1). Les vésicules synaptiques doivent être traçables et reliées par une seule membrane continue (voir figure 2).
Surtout, même lorsque les meilleures pratiques sont suivies, le traitement de l’échantillon avec des fixatifs, des taches et des résines introduit des artefacts. Étant donné que les artefacts ne peuvent pas être éliminés, il est essentiel de comprendre quel processus les origines, de sorte que l’apparence de l’échantillon peut être interprété en ce qui concerne le traitement qu’il a subi12. Un exemple d’artefact — parmi plusieurs qui peuvent être générés lors de la préparation des spécimens pour le TEM — est une figure de myéline, une inclusion lamellaire membraneuse qui ressemble à des gaines de myéline. Bien que les figures de la myéline puissent être observées dans les conditions pathologiques12, elles résultent le plus souvent de l’extraction des lipides membranaires lors de la fixation avec des aldéhydes (voir figure 4).
Figure 1: Micrographe électronique représentatif de la préservation satisfaisante de la structure cellulaire (exemple 1). (A) les membranes cellulaires neuronales sont stratifiées et sans ruptures. Le cytoplasme est finement granulaire et sans espaces vides. Les mitochondries ne sont ni enflées ni rétrécis. Leur double membrane externe est conservée et les crêtes internes sont intacts. B) détail du tableau A, illustrant une méthode permettant de mesurer la distance des vésicules synaptiques de la membrane présynaptique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Micrographe électronique représentatif de la préservation satisfaisante de la structure cellulaire (exemple 2). (A) les vésicules synaptiques sont distinctes et doublées par une membrane unique ininterrompue. Pour permettre l’analyse morphométrique de la distribution des vésicules synaptiques, les membranes pré-synaptiques et post-synaptiques doivent être parallèles et leur continuité préservée. B) détail du tableau A, illustrant le comptage des vésicules synaptiques dans le terminal pré-synaptique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Micrographe électronique représentant la préservation défectueuse de la structure tissulaire (exemple 1). Notez la distorsion et la rupture des membranes cellulaires neuronales et la présence d’espaces extracellulaires nettement élargis (marqués avec *). Les mitochondrias semblent distendu et ont des crêtes gonflés (marqués d’une flèche). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Micrographe électronique représentant la préservation défectueuse de la structure tissulaire (exemple 2). Notez la présence de grands espaces vides blancs dans le cytoplasme (marqués de ǂ), à la place de la substance cytoplasmique finement granulaire. Les espaces extracellulaires apparaissent élargis. Un verticille membraneux artifactuel (figure de myéline), probablement issu de la mobilisation des lipides pendant la fixation avec le glutaraldéhyde, est marqué par l’acronyme MF. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La manipulation des sections tissulaires pendant la préparation des échantillons pour TEM nécessite un degré considérable de finesse, de concentration et de patience. Lors de l’utilisation d’une micropipette pour ajouter et enlever des solutions, les spécimens peuvent être aspirés dans l’embout de la pipette par tension de surface, il faut donc prendre soin d’éviter les lésions tissulaires par la pipette. En outre, certaines étapes de la séquence de déshydratation peuvent être aussi rapides que 1 min, d’où l’opérateur doit travailler rapidement pour s’assurer que la prochaine étape de déshydratation est commencée à l’heure et l’échantillon ne sèche pas ou Ride. Une procédure nécessitant une attention particulière est la post-fixation avec l’osmium. Les sections deviennent rigides après traitement à l’osmium et peuvent être facilement endommagées. Avant d’ajouter de l’osmium, il est impératif que les sections soient aplaties au fond du flacon, sinon tout pli entraînera une fracture tissulaire. La manipulation des tissus osmicés est particulièrement difficile lors du transfert de sections sur des films Aclar pour l’enrobage plat. Un soin particulier est nécessaire lorsque vous soulevez l’échantillon du fond du flacon pour éviter la fragmentation, et lorsque vous poussez des bulles d’air hors du Sandwich du film. Bien qu’il soit important de repousser tout air emprisonné, car il rend la visualisation de l’échantillon difficile et affaiblit la stabilité des liaisons de résine, la pression directe sur les tissus osmicés peut facilement infliger des dommages. Une autre étape qui nécessite un soin supplémentaire est la préparation du mélange de résine pour l’infiltration et l’incorporation des spécimens. EPON, la résine d’incorporation la plus utilisée, peut être durcie avec l’addition d’un durcisseur et d’un accélérateur. Il est impératif d’utiliser la quantité exacte de durcisseur et d’accélérateur afin d’obtenir un bloc durci avec les caractéristiques souhaitées. Des méthodes gravimétriques et volumétriques ont été décrites pour mesurer les résines visqueuses. Bien que les méthodes gravimétriques aient été traditionnellement considérées comme plus précises12, ce laboratoire de l’auteur a eu un bon succès avec les modes volumétriques (c.-à-d., en ajoutant le volume de chaque ingrédient du mélange de résine incrémentalement au moyen d’une seringue gavage) . Après que les composants de résine ont été soigneusement mesurés, ils doivent être mélangés très soigneusement pour accomplir l’imprégnation uniforme, puisqu’ils possèdent des viscosités différentes et des taux de polymérisation. La non-réalisation d’un mélange complet entraînera un bloc de dureté inégale qui n’est pas adapté à une coupe mince.
Des changements marqués dans la tonicité des solutions utilisées pour traiter des sections du jeune cerveau de rat peuvent provoquer un rétrécissement et/ou un gonflement de l’espace extracellulaire et des composants cellulaires12,35,36,37 . Lors de la fixation, les meilleurs résultats sont obtenus lorsque la pression osmotique du perfusat est maintenue aussi semblable que possible à celle du tissu à l’étude. L’osmolalité du cerveau de rat est d’environ 330 mOsm. Un glutaraldéhyde à 2% dans la solution de 0,1 M PB est seulement légèrement hypertonique (400-450 mOsm) et minimise l’expansion de l’espace extravasculaire12. En particulier, les membranes demeurent sensibles aux changements de la pression osmotique des solutions de rinçage et de déshydratation après fixation avec des aldéhydes. Par conséquent, il est également important de minimiser les différences entre l’osmolarité du fixatif et les solutions utilisées ultérieurement12,35,36,37. Pour cette raison, le même véhicule (0,1 M PB, osmolarité approximative 440 mOsM) est utilisé comme solvant pour toutes les solutions de ce protocole. Cependant, il convient de noter que plusieurs tampons différents ont été utilisés avec succès lors de la préparation du spécimen pour TEM et aucun tampon unique ne peut revendiquer la supériorité universelle sur les autres. Lorsque les tampons de tonicité inférieure sont préférés, d’autres laboratoires ont choisi d’augmenter l’osmolarité avec des électrolytes ou des non-électrolytes12.
Plusieurs étapes de ce protocole exigent l’utilisation de produits chimiques qui peuvent être toxiques lorsqu’ils ne sont pas manipulés correctement. L’importance de travailler sous une hotte et de porter un équipement de protection personnelle tout en manipulant des aldéhydes, de l’osmium, de l’uranium et des composés de plomb ne peut être suressié. Alors que les systèmes automatisés contrastants peuvent aider à atténuer certains des risques et sont disponibles dans le commerce, ils peuvent être assez coûteux et peuvent ne pas être abordables par les laboratoires qui ne font pas l’utilisation courante de TEM. Bien que le laboratoire de microscope électronique peut potentiellement être un endroit dangereux, le traitement des échantillons pour TEM est globalement sécuritaire lorsqu’il est exécuté rigoureusement.
Récemment, l’introduction de la microscopie photonique de Super-résolution a augmenté l’imagerie optique résolvant la puissance à environ 15 nm34. Cependant, lorsque l’objectif est d’effectuer une analyse morphométrique de l’organisation spatiale des vésicules synaptiques aux terminaux pré-synaptiques, aucune technique ne fournit le même degré de détail morphologique. Il est important de noter que le TEM est limité par la nécessité de la mort du spécimen avant qu’il ne puisse être traité et visualisé. Par conséquent, lorsque l’objectif de l’étude est d’enquêter sur les aspects dynamiques ou fonctionnels du trafic de vésicules synaptiques et de l’exocytose, des outils autres que le TEM doivent être envisagés.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce manuscrit a été appuyé par NIH/NIGMS K08 123321 (à N.L.) et par des fonds du département d’anesthésiologie de l’Université de Virginie. Les auteurs souhaitent remercier alev Erisir (département de biologie, Université de Virginie, Charlottesville, VA) pour l’excellente formation et l’assistance technique avec TEM, et pour sa critique inestimable de manuscrit. Les auteurs remercient également l’installation de microscopie électronique avancée à l’Université de Virginie pour l’assistance technique avec les échantillons de coupe et de post-coloration.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | "size 00, flat (cut bottom)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
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