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Neuroscience

Quantificare l'attività subcellulare ubiquitina-proteasoma nel cervello del roditore

Published: May 21, 2019 doi: 10.3791/59695
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Questo protocollo è progettato per quantificare in modo efficiente l'attività del sistema upS (Ubiquitin-proteasome System) in diversi compartimenti cellulari del cervello dei roditori. Gli utenti sono in grado di esaminare il funzionamento dell'UPS nelle frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche nello stesso animale, riducendo il tempo e il numero di animali necessari per eseguire queste complesse analisi.

Abstract

Il sistema ubiquitina-proteasoma è un regolatore chiave della degradazione delle proteine e una varietà di altri processi cellulari negli eucarioti. Nel cervello, gli aumenti dell'attività onniquitina-proteasomico sono fondamentali per la plasticità sinaptica e la formazione della memoria e i cambiamenti aberranti in questo sistema sono associati a una varietà di disturbi neurologici, neurodegenerativi e psichiatrici. Uno dei problemi nello studio del funzionamento dell'ubiquitina-proteasoma nel cervello è che è presente in tutti i compartimenti cellulari, in cui i bersagli proteici, il ruolo funzionale e i meccanismi di regolazione possono variare ampiamente. Di conseguenza, la capacità di confrontare direttamente il targeting delle proteine dell'ubiquitina cerebrale e l'attività catalitica proteasosa in diversi compartimenti subcellulari all'interno dello stesso animale è fondamentale per comprendere appieno come l'UPS contribuisce alla plasticità sinaptica, memoria e malattia. Il metodo qui descritto consente la raccolta di frazioni sinaptiche nucleari, citoplasmatiche e grezze dallo stesso cervello di roditore (ratto), seguite dalla quantificazione simultanea dell'attività catalitica proteasome (indirettamente, fornendo attività del nucleo proteasome solo) e l'etichettatura della proteina ubiquitina specifica del collegamento. Così, il metodo può essere utilizzato per confrontare direttamente i cambiamenti subcellulari nell'attività ubiquitina-proteasomesome in diverse regioni del cervello nello stesso animale durante plasticità sinaptica, formazione della memoria e diversi stati di malattia. Questo metodo può essere utilizzato anche per valutare la distribuzione subcellulare e la funzione di altre proteine all'interno dello stesso animale.

Introduction

Il sistema onniquitina-proteasoso (UPS) è una complessa rete di strutture proteiche e legamenti interconnessi che controlla la degradazione della maggior parte delle proteine di breve durata nelle cellule1. In questo sistema, le proteine sono contrassegnate per la degradazione o altri processi cellulari / destini dal piccolo modificatore ubiquitin. Una proteina bersaglio può acquisire 1-7 modifiche dell'ubiquitina, che possono collegarsi in uno dei sette siti di lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63) o la methionina N-terminale (M1; come noto come lineare) nella precedente ubiquitina2. Alcuni di questi tag di poliubiquitina sono specifici per degradazione (K48)3, mentre altri sono in gran parte indipendenti dal processo di degradazione delle proteine (M1)4,5,6. Pertanto, il processo di ubiquitinazione delle proteine è incredibilmente complesso e la capacità di quantificare i cambiamenti in un tag poliubiquitin specifico è fondamentale per comprendere in ultima analisi il ruolo di quella data modifica nel funzionamento cellulare. Complicando ulteriormente lo studio di questo sistema, il proteasome, cheè la struttura catalitica dell'UPS 7, degrada le proteine ma può anche essere coinvolto in altri processi non proteolitici8,9. Non sorprende quindi, dalla sua scoperta iniziale, l'attività ubiquitina-proteasosa normale e aberrante è stata implicata nella formazione della memoria a lungo termine e in una varietà di stati di malattia, tra cui molti disturbi10,11. Di conseguenza, i metodi in grado di quantificare in modo efficace ed efficiente l'attività dell'UPS nel cervello sono fondamentali per comprendere in ultima analisi come questo sistema è disregolato negli stati di malattia e l'eventuale sviluppo di opzioni di trattamento rivolte all'ubiquitina e/o funzionamento proteasome.

Ci sono una serie di problemi nella quantificazione dell'attività di ubiquitina-proteasososo nel tessuto cerebrale da ratti e topi, che sono i sistemi modello più comuni utilizzati per studiare la funzione UPS, tra cui 1) la diversità delle modifiche dell'ubiquitina, e 2) distribuzione e regolazione differenziale dell'UPS funzionante attraverso scomparti subcellulari12,13,14. Per esempio, molte delle prime dimostrazioni della funzione ubiquitina-proteasosomico nel cervello durante la formazione della memoria utilizzato lisato intere cellule e indicato aumenti dipendenti dal tempo in entrambi l'ubiquitinazione delle proteine e l'attività proteasomiana15, 16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19 del 12 , 20. Tuttavia, recentemente abbiamo scoperto che l'attività di ubiquitina-proteasososo variava ampiamente attraverso i compartimenti subcellulari in risposta all'apprendimento, con aumenti simultanei in alcune regioni e diminuzioni in altre, un modello che differiva in modo significativo da quanto descritto in precedenza in lisati intericellulari 21. Ciò è coerente con la limitazione di un approccio a tutta la cellula, in quanto non può dissociare il contributo dei cambiamenti nell'attività UPS in diversi compartimenti subcellulari. Anche se studi più recenti hanno impiegato protocolli di frazione sinaptica per studiare l'UPS specificamente nelle sinapsi in risposta all'apprendimento22,23,24, i metodi utilizzati occllude la capacità di misurare cambiamenti nucleari e citoplasmaici dell'ubiquitina-proteasososo nello stesso animale. Ciò si traduce in un bisogno inutile di ripetere gli esperimenti più volte, raccogliendo una frazione subcellulare diversa in ciascuno. Questo non solo comporta una maggiore perdita di vite umane, ma elimina la capacità di confrontare direttamente l'attività UPS attraverso diversi compartimenti subcellulari in risposta a un determinato evento o durante uno stato di malattia specifico. Considerando che gli obiettivi proteici dell'ubiquitina e del proteasoso variano ampiamente in tutta la cellula, comprendere come la segnalazione onniquitina-proteasome sia diversa nei compartimenti subcellulari distinti è fondamentale per identificare il ruolo funzionale dell'UPS neurologico durante la formazione della memoria e disturbi neurologici, neurodegenerativi e psichiatrici.

Per rispondere a questa esigenza, abbiamo recentemente sviluppato una procedura in cui le frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche potrebbero essere raccolte per una determinata regione cerebrale dallo stesso animale21. Inoltre, per tenere conto della quantità limitata di proteine che si può ottenere raccogliendo più frazioni subcellulari dallo stesso campione, abbiamo ottimizzato protocolli stabiliti in precedenza per analisi dell'attività proteasome in vitro e proteine in cellule lisci raccolte dal tessuto cerebrale del roditore. Utilizzando questo protocollo, siamo stati in grado di raccogliere e confrontare direttamente i cambiamenti dipendenti dall'apprendimento nell'attività proteasosa, K48, K63, M1 e i livelli complessivi di poliubiquitinazione proteica nel nucleo e nel citoplasma e nelle sinapsi nell'amigdala laterale dei ratti. In questo articolo viene descritta in dettaglio la procedura (Figura 1), che potrebbe migliorare significativamente la nostra comprensione di come l'UPS è coinvolto nella formazione della memoria a lungo termine e in vari stati di malattia. Tuttavia, va notato che l'attività proteasome in vitro discussa nel nostro protocollo, anche se ampiamente utilizzata, non misura direttamente l'attività di complessi proteasome 26S completi. Piuttosto, questo saggio misura l'attività del nucleo 20S, il che significa che può servire solo come proxy per comprendere l'attività del nucleo stesso rispetto all'intero complesso proteasome 26S.

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Protocol

Tutte le procedure, comprese le materie animali, sono state approvate dal Virginia Polytechnic Institute e dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della State University (IACUC).

1. Raccolta e dissezione del tessuto cerebrale del roditore

NOT: Questo protocollo può essere applicato a una varietà di regioni del cervello e utilizzato con varie procedure di raccolta dei tessuti. Di seguito è riportata la procedura utilizzata nel nostro laboratorio per la subcellulare del tessuto cerebrale del ratto, usando ratti Sprague Dawley maschi di 8-9 settimane. Per elaborare tutti i compartimenti cellulari nello stesso animale, sezione 1.3. deve essere seguita indipendentemente dalla procedura di raccolta dei tessuti utilizzata.

  1. Estrarre il cervello del ratto e metterlo in una tazza criogenica pre-raffreddata sul ghiaccio secco. Congelare il cervello sul ghiaccio secco, o utilizzare azoto liquido, se disponibile, e trasferire in un congelatore -80 . I cervelli possono essere sezionati lo stesso giorno o in un secondo momento.
  2. Rimuovere il cervello congelato dalla tazza criogenica e mettere in una matrice cerebrale ratto raffreddato con ghiaccio secco. Ogni slot sulla matrice corrisponde a 0,5 mm, che può essere utilizzato per determinare la posizione approssimativa della regione di interesse (ROI).
    1. Utilizzando un Atlante cervello di ratto, inserire una lama di rasoio nella matrice immediatamente davanti (anteriore) dell'inizio previsto del ROI. Successivamente, inserire una lama di rasoio immediatamente all'estremità prevista (posteriore) del ROI.
    2. Rimuovere la fetta tra le lame del rasoio utilizzando un bisturi e posizionare su un vetrino al microscopio raffreddato sul ghiaccio secco. In genere, le sezioni sono spesse 2-3 mm, ma questo varia in base al ROI.
  3. Utilizzando un bisturi, sezionare il ROI un emisfero alla volta. Collocare ogni emisfero in tubi di microcentrifuga da 1,5 mL separati preraffreddamentati su ghiaccio secco. Il tessuto congelato può essere immediatamente utilizzato per la frazione subcellulare o elaborato in un secondo momento se conservato a -80 gradi centigradi.

2. Estrazione nucleare e citoplasmatica

NOT: Questo protocollo utilizza soluzioni stock predefinite di sostanze chimiche di laboratorio comuni, tra cui 0,1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 M Dithiothreitol (DTT), 0,5 M di acido etilenoniaminetraceacetico (EDTA), 5 M NaCl, 10% NP-40 (IGEPAL) e 50% glicerolo. Se l'endpoint viene utilizzato nei saggi di attività proteasome, glicerolo e ATP possono essere aggiunti a tutti i buffer per evitare lo smontaggio di complessi proteasome durante la lisi.

  1. Preparare il buffer di lisi. Aggiungere 8,63 mL di acqua ultrapura (deionizzata e distillata) a un tubo conico sterile da 15 mL.
    1. Al tubo conico, aggiungere 1.000 .L di 0,1 M HEPES, 15 L di 1 M MgCl, 100 L di 1 M DTT e 50 -L del 10% NP-40.
    2. Aggiungete 100 l di cocktail inibitore della proteasi e 100-L di inibitore al fosfosi. Vorticare brevemente la soluzione da mescolare e posizionare sul ghiaccio bagnato per raffreddare. Si noti che la soluzione può avere una tinta gialla dall'inibitore del fosfosi.
      NOT: L'uso di inibitori della proteasi è essenziale per preservare le proteine e garantire la specificità dell'attività proteasomica in vitro. Tuttavia, questi inibitori possono anche comportare una leggera riduzione dell'attività proteasosa, il che significa che l'attività misurata sul saggio in vitro può essere una sottovalutazione dei livelli di attività effettivi.
  2. Preparare il buffer di estrazione. Aggiungere 5.925 mL di acqua ultrapura (deionizzata e distillata) ad un tubo conico sterile da 15 mL.
    1. Al tubo conico, aggiungere 2.000 'L di 0,1 M HEPES, 1250 'L del 50% glicerolo, 15 L di 1 M MgCl2, 5 L di 1 M DTT, 5 -L di 0,5 M EDTA e 600 -L di 5 M NaCl.
    2. Aggiungete 100 l di cocktail inibitore della proteasi e 100-L di inibitore al fosfosi. Vorticare brevemente la soluzione da mescolare e posizionare sul ghiaccio bagnato per raffreddare. Si noti che la soluzione può avere una tinta gialla dall'inibitore del fosfosi.
  3. Rimuovere il microtubo di centrifuga di 1,5 mL contenente un emisfero del ROI dal congelatore -80 . Assicurarsi che l'emisfero utilizzato sia controbilanciato tra le condizioni di estrazione per ogni gruppo sperimentale. Ad esempio, in un esperimento a due gruppi, utilizzare l'emisfero sinistro per i primi due animali in ogni gruppo e l'emisfero destro per i due campioni successivi, ecc.
  4. Utilizzando un bisturi, trasferire il tessuto cerebrale congelato a un omogenizzatore Teflon di vetro da 2 mL. Aggiungere 500 l di tampone di lis al tubo di Teflon.
    1. Utilizzando pestello B, omogeneizzare lo stesso tessuto utilizzando 15 tratti fino a quando non è presente alcuna quantità visibile di materiale solido. Utilizzare un movimento di tornitura (in senso orario o antiorario) durante ogni colpo.
  5. Utilizzando una pipetta da 1.000 luna, trasferire il campione omogeneizzato in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Mettere il tubo sul ghiaccio bagnato e incubare per 30 min.
  6. Mettere il tubo in microcentrismo e girare per 10 min a 845 x g e 4 gradi centigradi. Dopo il completamento, rimuovere con attenzione il supernatante con il pipetting e metterlo in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml; questa è la Frazione Citoplasmatica, che può essere conservata sul ghiaccio o a 4 gradi centigradi fino alla Sezione 2.9.
  7. Aggiungere 50 l buffer di estrazione al pellet risultante e risospendere con il pipettaggio. Non vorticare il pellet. Posizionare il tubo contenente il pellet risospeso sul ghiaccio e incubare per 30 min.
  8. Mettere il tubo in microcentrifuga e girare per 20 min a 21.456 x g, 4 gradi centigradi. Dopo il completamento, rimuovere con attenzione il supernatante con il pipetting e metterlo in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml; questa è la Frazione Nucleare. Il pellet può ora essere scartato.
  9. Misurare la concentrazione proteica delle estrazioni citoplasmatiche e nucleari utilizzando il saggio di proteine Dc (secondo le istruzioni del produttore), o qualsiasi saggio equivalente per i campioni raccolti utilizzando detergenti non ionici. Procedere immediatamente al saggio di attività proteasosa (Sezione 4) o al gonfiore occidentale (Sezione 5). In alternativa, i campioni possono essere conservati a -80 gradi fino a quando necessario.

3. Collezione frazione sinaptica

NOT: Questo protocollo utilizza soluzioni stock predefinite di sostanze chimiche di laboratorio comuni, tra cui 1 M Tris (pH 7.5), 0.5 M EDTA, 5 M NaCl e 10% SDS. Se l'endpoint viene utilizzato nei saggi di attività proteasome, glicerolo e ATP possono essere aggiunti a tutti i buffer per aiutare a prevenire lo smontaggio di complessi proteasomi durante la lisi

  1. Preparare il buffer TEVP con saccarosio a 320 mM. Aggiungere 60 mL di acqua ultrapura (deionizzata e distillata) a un becher pulito da 100 mL.
    1. Al becher, aggiungete 1.300 l'l di 1 M Tris (pH 7,5), 260 l di 0,5 M EDTA, 100 l di cocktail inibitore della proteasi, 100 L di cocktail inibitore di fosforo e 10,944 g di saccarosio. Mescolare con una barra di agitazione fino a quando il saccarosio è completamente sciolto.
    2. Portare il pH a 7,4 dollari aggiungendo gocciolamento di acido cloridrico (HCl) alla soluzione utilizzando una pipetta.
    3. Trasferire la soluzione in un pallone volumetrico da 100 ml. Portare il volume a 100 mL aggiungendo acqua ultrapura. Raffreddare la soluzione finale sul ghiaccio fino a quando necessario.
  2. Preparare il buffer di omogenesi. Aggiungere 60 mL di acqua ultrapura (deionizzata e distillata) a un becher pulito da 100 mL.
    1. Al becher, aggiungere 5.000'L di 1 M Tris (pH 7,5), 3.000 l'l di 5 M NaCl, 100 l di cocktail inibitore della proteasi, 100L di cocktail inibitore del fosfosi e 2.000 .L di 10% SDS. Mescolare con una barra di agitazione.
      NOT: I detergenti ionici possono interferire con i saggi di attività proteasomici con conseguente decondimento del complesso proteasome. Il volume di SDS potrebbe essere abbassato per aiutare a preservare la funzione proteasomese, se lo si desidera.
    2. Portare il pH a 7,4 aumentando il dropwise HCl alla soluzione utilizzando una pipetta.
    3. Trasferire la soluzione in un pallone volumetrico da 100 ml. Portare il volume a 100 mL aggiungendo acqua ultrapura. Conservare la soluzione finale a temperatura ambiente; non raffreddare come SDS precipiterà fuori soluzione.
  3. Rimuovere la centrifuga di 1,5 mL contenente un emisfero del ROI dal congelatore -80 . Assicurarsi che l'emisfero utilizzato sia controbilanciato tra le condizioni di estrazione per ogni gruppo sperimentale. Ad esempio, in un esperimento a due gruppi, utilizzare l'emisfero sinistro per i primi due animali in ogni gruppo e l'emisfero destro per i due campioni successivi, ecc.
  4. Utilizzando un bisturi, trasferire il tessuto cerebrale congelato a un omogenizzatore Teflon di vetro da 2 mL. Aggiungere 500 l di tampone TEVP al tubo di Teflon.
    1. Utilizzando pestello B, omogeneizzare lo stesso tessuto utilizzando 15 tratti fino a quando non sono presenti trasferimenti visibili di materiale solido. Utilizzare un movimento di tornitura (in senso orario o antiorario) durante ogni colpo.
  5. Utilizzando una pipetta da 1.000 luna, trasferire il campione omogeneizzato in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Centrifugare il campione a 1.000 x g per 10 min, 4 gradi centigradi.
  6. Raccogliere il supernatante e trasferirlo in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml utilizzando una pipetta da 1.000 l.l. Centrifugare il campione a 10.000 x g per 10 min, 4 gradi centigradi. Il pellet originale (P1) contiene nuclei e grandi detriti e può essere scartato.
  7. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Questa è una Frazione Citosolica. Aggiungere 50 L di buffer di omogenesi al pellet (P2) e sospendere nuovamente con la pipettatura fino a quando non è visibile alcun materiale solido.
  8. Centrifugare il campione a 20.000 x g per 10 min, 4 gradi centigradi. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 mL; questa è la Frazione di Membrana Synaptosomica grezza (sinaptica). Il pellet può essere scartato.
  9. Misurare la concentrazione proteica della frazione sinaptica utilizzando il saggio di proteina Dc (secondo le istruzioni del produttore), o qualsiasi saggio equivalente per i campioni raccolti utilizzando detergenti ionici. Procedere immediatamente al saggio di attività proteasosa (Sezione 4) o al gonfiore occidentale (Sezione 5). In alternativa, i campioni possono essere conservati a -80 gradi fino a quando necessario.

4. Saggio di attività proteasoso

NOT: L'attività proteasomesina può essere misurata nel tessuto cerebrale omogeneizzato utilizzando una versione leggermente modificata del 20S Proteasome Activity Kit. Questo test non misura direttamente l'attività di complessi proteasosi 26S completi. Piuttosto, misura l'attività del nucleo 20S, il che significa che può servire solo come proxy per comprendere l'attività del nucleo stesso rispetto all'intero complesso proteasome 26S. Il successo di questo saggio diminuisce con cicli di congelamento-disgelo ripetuti e/o livelli crescenti di detergenti, in particolare ionico, e richiede l'uso di un lettore di lamiere con un set di filtri 360/460 (eccitazione/emissione) e capacità di riscaldamento fino a 37 gradi centigradi.

  1. Impostazioni del lettore di lamiere: Pre-caldo a 37 gradi centigradi e tenere premuto durante la corsa.
    1. Impostare l'eccitazione su 360 ed emissione a 460. Se la piastra 96 bene utilizzata è chiara, impostare la posizione ottica su Bottom. Se viene utilizzata una piastra di ben essere scuri/neri 96, impostare la posizione dell'ottica su Superiore.
    2. Impostare i vecchi modelli di lettore di lamiere ad Auto-Gain sotto le opzioni di lettura fluorescente; modelli più recenti sono preimpostati per questo. Programmare una corsa cinetica con un tempo di 2 h, la scansione (lettura) ogni 30 min.
  2. Ricostituire il buffer di prova 10x fornito nel kit con 13,5 mL di acqua ultrapura. Aggiungere 14 l-L di 100 mM ATP al buffer ora 1x; questo migliora significativamente l'attività proteasosa nei campioni e migliora l'affidabilità del saggio. Il buffer di prova 20S finale può essere conservato sul ghiaccio o a 4 gradi centigradi fino a quando necessario ed è stabile per diversi mesi.
  3. Ricostituire lo standard AMC fornito in kit con 100 L di DMSO. Eseguire questo passaggio al buio o in condizioni di scarsa illuminazione, in quanto lo standard è sensibile alla luce.
  4. Creare una curva di supporto di AMC utilizzando lo standard ricostituito, al buio o in condizioni di scarsa illuminazione.
    1. In tubi separati da 0,5 mL di microcentrismo, aggiungere 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 e 0 l dello standard AMC, che corrisponde alla concentrazione a 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0 M AMC.
    2. A questi tubi, nello stesso ordine, aggiungere 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 e 100 . Questo crea una serie di concentrazioni di AMC da alto a basso, che verranno utilizzate per la calibrazione del lettore di lastre e l'analisi dell'attività proteasomico nei campioni omogeneizzati.
    3. Conservare tutti gli standard diluiti sul ghiaccio al buio fino a quando necessario.
  5. Ricostituire il substrato proteasoso (Suc-LLVY-AMC) fornito in kit con 65 -L di DMSO. Eseguire questo passaggio al buio o in condizioni di scarsa illuminazione, in quanto il substrato è sensibile alla luce. Creare una diluizione 1:20 del substrato proteasoso in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml utilizzando un buffer di analisi 20S. Conservare il substrato diluito sul ghiaccio al buio fino a quando necessario.
    NOT: Ad esempio, se la piastra avrà 10 campioni e 1 vuoto, sarà necessario un substrato diluito sufficiente per 22 pozzetti (con duplicati) a 10 l per pozzo. Ciò equivale a 220 , è necessario 30 - L per gli errori di pipettaggio, che richiedono 12,5 l di substrato e 237,5 l di buffer di assione 20S.
  6. Scongelare i campioni desiderati (se congelati) e aggiungere una quantità normalizzata a una piastra di 96 pozze. Eseguire ogni campione in duplicati. La quantità di campione necessaria varia in base alla preparazione dei tessuti. In genere, 10-20 g è sufficiente per qualsiasi frazione subcellulare.
  7. Portare il volume del pozzo del campione a 80 oL con acqua ultrapura. La quantità aggiunta dipende dal volume del campione aggiunto. Ad esempio, se il campione 1 era di 4,5 litri di proteine e il campione 2 era di 8,7 l, la quantità di acqua necessaria sarà rispettivamente di 75,5 e 71,3 l. In due pozze separate, aggiungere 80 l di acqua da solo; questi sarà il saggio Blanks.
    NOT: Al fine di limitare i cambiamenti nel volume delle proteine dovuti a errori di pipettaggio, le concentrazioni di proteine possono essere normalizzate al campione meno concentrato. Ciò consentirà l'uso dello stesso volume campione in tutte le condizioni.
  8. Aggiungete 10 l di 20S Assay buffer in ogni pozzo, incluso Assay Blanks. Un ripetitore/pipetta automatizzato è consigliato qui per garantire un volume di analisi coerente tra i pozzi.
  9. Facoltativo: In questa fase, introdurre manipolazioni in vitro, se lo si desidera; questo richiederà che ogni campione abbia altri 2 pozzi per trattamento, compreso il veicolo. In caso affermativo, aggiungere 5-10 l of drug/compound di interesse a 2 dei pozze campione e un volume equivalente di controllo/veicolo ad altri 2 pozze. Posizionare la piastra sul lettore di piastre preriscaldato o in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 30 min.
  10. Spegnere le luci o entrare in una stanza buia. Aggiungere tutti i 100 l di standard AMC diluiti a un nuovo pozzo; ogni standard avrà un unico pozzo.
  11. Al buio, aggiungere 10 L di substrato proteasoso diluito ai pozzi contenenti campione e Assay Blanks, ma non allo standard AMC. Un ripetitore/pipetta automatizzato è consigliato qui per garantire un volume di analisi coerente tra i pozzi.
  12. Posizionare la piastra nel lettore di piastre e avviare la corsa cinetica.
    NOT: La piastra non deve essere in costante agitazione durante la corsa cinetica, tuttavia, l'utente può scegliere di se lo si desidera
  13. Al termine della corsa cinetica, esportare i valori fluorescenti 360/460 non elaborati in Microsoft Excel.
    1. Media insieme pozze duplicate per ogni standard, ogni campione e il Vuoto di prova per tutte e 5 le scansioni. I valori fluorescenti grezzi dovrebbero aumentare tra le scansioni dei campioni, ma rimangono stabili (o diminuiscono leggermente) per gli standard e Assay Blanks.
    2. Prendere la media del pozzo standard AMC più alta e dividere per la concentrazione nota (20 M). Dividere questo valore per la concentrazione del campione utilizzata nel saggio per ottenere il valore AMC standardizzato. Per ogni campione e Media vuota, dividere per il valore AMC standardizzato.
    3. Prendere questo valore finale e dividere per la concentrazione del campione utilizzato nel saggio per ottenere il valore normalizzato per ogni campione e il vuoto di analisi. Eseguire questa operazione per tutte e 5 le scansioni.
    4. Sottrarre il valore vuoto del campione normalizzato da ogni valore di campione normalizzato per tutte e 5 le scansioni.

5. Quantificazione dell'Ubiquitinazione proteica specifica del collegamento

  1. La quantificazione di diversi tag di poliubiquitina in diverse frazioni subcellulari raccolte dal tessuto cerebrale del roditore dovrebbe essere effettuata utilizzando una varietà di protocolli standard occidentali di gonfiore in combinazione con anticorpi di poliiquitina unici e specifici del collegamento.
    1. Per la denotazione, mescolare i campioni normalizzati con un volume uguale di buffer di campione Laemmli integrato con il buffer del campione di z-mercaptoetanolo a una percentuale del 5% in volume, secondo le istruzioni del produttore.
    2. Per la quantificazione di tutte le modifiche di monoubiquitinazione e poliubiquitination indipendentemente dal collegamento, utilizzare un anticorpo pan-ubiquitina.
    3. Per riconoscere tutte le proteine poliubizzate, utilizzare un anticorpo di ubiquitina che non reagisce in modo incrociato con la monoubiquitinazione.
    4. Per la poliubiquitinazione specifica del collegamento, utilizzare anticorpi in grado di rilevare lisina-27, lisina-48, lisina-63 e poliubiquitinazione lineare (M1).
  2. Per evitare la contaminazione incrociata tra gli sviluppi, che potrebbe provocare un falso positivo o interferire con l'imaging di una diversa modifica dell'ubiquitina, striscia membrane tra gli sviluppi utilizzando 0.1 M NaOH per 10 min.
    1. Lavare le membrane in TBS con 0,1% interpolazione due volte per 10 min e ribloccare (utilizzando qualsiasi agente di bloccante è preferito nel protocollo Western blot utilizzato).
    2. Incubare la membrana con l'anticorpo secondario e riqualificare per confermare che la membrana è stata correttamente spogliata di anticorpi primari e secondari.
    3. Consigliato: Per lo sviluppo di successo di diversi anticorpi dell'ubiquitina senza contaminazione, utilizzare sistemi di imaging fluorescente o vicino all'infrarosso. Questo spesso può impedire il riporto tra anticorpi.
  3. Alcune immagini di ubiquitin Western blot forniranno colonne di bande distinte (come M1) mentre altre producono un modello simile a una sbavatura con poche o nessuna linea chiara (comune con K48). Per la quantificazione delle macchie occidentali di ubiquitina imaged, disegna una casella intorno alla colonna che estende l'intera scala di standard molecolari.
    1. Regolare la casella verso l'alto (o verso il basso) se l'ubiquitina colorazione si estende attraverso l'intera scala; questo è comune per le modifiche della lisina-48 e varia ampiamente tra i compartimenti subcellulari.
    2. Sottrarre lo sfondo, che viene calcolato come la densità ottica media dello sfondo immediatamente che circonda la colonna su tutti i lati.

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Representative Results

Utilizzando la procedura qui descritta, sono state raccolte frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche dall'amigdala laterale del cervello del ratto (Figura 1). La purezza delle singole frazioni è stata confermata attraverso il gonfiore occidentale, sondando con anticorpi contro le proteine che dovrebbero essere arricchiti o esauriti nel lisato. Nel primo emisfero in cui è stata raccolta una frazione sinaptica grezza, la proteina di densità post-sinaptica 95 (PSD95) era presente nella frazione sinaptica, ma non nucleare, con livelli più bassi nel citoplasma (Figura 2A). Questo è coerente con il lavoro precedente che dimostra che la preparazione della frazione sinaptica isola sia i componenti pressinaptici che post-sinaptici25. Al contrario, la proteina nucleare istone H3 era presente nel nucleare, ma non nella frazione sinaptica, con livelli più bassi nel citoplasma (Figura 2B). La presenza di PSD95 e H3 nel citoplasma è coerente con la loro traduzione citoplastica. La proteina citoplasmatica della tubulina era presente nella nostra frazione citoplasmatica, ma era in gran parte assente dal lisato nucleare (Figura 2C), con livelli più bassi nella regione sinaptica. Ciò suggerisce che siamo stati in grado di produrre una frazione nucleare che era in gran parte assente di proteine citoplasmiche. La presenza di tubulina nella regione sinaptica è coerente con studi precedenti26. Tutte e tre le frazioni hanno mostrato livellisimili di proteine dell'alloggiamento, mantenendo la proteina , che è stata utilizzata come controllo del carico. Collettivamente, questi risultati confermano che la purezza delle frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche raccolte da un singolo ratto amigdala laterale.

Successivamente, tutti i lismi sono stati confermati per l'attività proteasosous funzionale utilizzando la versione modificata descritta del saggio di attività proteasome in vitro 20S. In tutti i lismi, il successo dell'analisi è stato definito come un aumento delle unità fluorescenti grezze (RFU) rilevato dalla prima scansione (0 min) alla quinta/ultima scansione (120 min). Per tutte queste analisi, è stato utilizzato 10 AMC come standard più elevato per la normalizzazione delle unità fluorescenti grezze (RFU). Nella frazione sinaptica grezza, RFU ha raggiunto il picco alla scansione 5 (Figura 3A), con conseguente RFU normalizzato di poco inferiore a 0,1 (Figura 3B). Nella frazione citoplasmatica, RFU è aumentato tra le scansioni (Figura 3C) con un RFU normalizzato finale di 1,6 dollari (Figura 3D). La frazione nucleare mostrava anche variazioni dipendenti dal tempo in RFU (Figura 3E), con un RFU normalizzato finale di 0,3 (Figura 3F). Le differenze nell'attività proteasoso tra i compartimenti riflettono probabilmente la disponibilità di proteasomi nella frazione, che sono generalmente più abbondanti nel citoplasma e nel nucleo27, i compartimenti che hanno il più alto livello di attività nel nostro preparazione. Il più basso livello di attività nella regione sinaptica è coerente con l'essere l'unico lisato che è stato raccolto utilizzando detergenti ionici, che può ridurre l'attività proteasomici a causa della condizione di denatura più dura. È importante sottolineare che la RFU non è aumentata nel tempo nel Saggio Blanks o in lisati (sinaptici) incubati con l'inibitore proteasoso altamente specifico e potente dell'inibitore del proteasome clasto-lactacystin --lactone (Figura3G, 0,01 e 0,001, rispettivamente (Figura 3H). Ciò suggerisce che il cambiamento osservato nella RFU era dovuto specificamente all'attività del proteasome e non di altre proteasi. Inoltre, se analizzati in condizioni sperimentali, si è verificato un aumento dell'attività nucleare, ma non citoplasmasmica, proteasomica nell'amigdala laterale dopo l'apprendimento, che si è verificato contemporaneamente con una diminuzione dell'attività protuittrice sinaptica confronto con gli animali di controllo (Figura 4). Collettivamente, questi risultati confermano che l'attività proteasomica potrebbe essere misurata con precisione in tutte e tre le frazioni subcellulari raccolte da un singolo amigdala laterale del ratto.

Uno dei vantaggi dell'analisi dell'attività proteasosa è che le manipolazioni in vitro possono essere introdotte nei campioni immediatamente prima dell'aggiunta del substrato proteasome, che consente l'identificazione di molecole specifiche che possono regolare il proteasome quella particolare frazione subcellulare. Come esempio, il ruolo del CaMKII (proteina dipendona cazo/calformn chinasi II) è stato valutato nella frazione sinaptica, la lisata denaturata più dura raccolta, dal momento che si pensa che CaMKII regolasse la funzione proteasomeso alle sinapsi. Un'incubazione di 30 min con l'inibitore di CaMKII myr-AIP (miristolayted autocamtide-2 peptide inibitorio correlato) ha provocato un aumento significativamente diminuito dell'attività proteasome sul saggio, che ha raggiunto solo i livelli che erano il 61% del non trattato (Figura5A). Al contrario, la stessa manipolazione applicata alla citoplasma non ha comportato un cambiamento dell'attività proteasomica dai pozzi trattati con veicoli (Figura 5B). Questi risultati confermano che l'attività proteasoma può essere ulteriormente manipolata in vitro e che questa manipolazione può avere effetti diversi a seconda della frazione subcellulare raccolta.

Oltre a quantificare l'attività proteasomica, il protocollo descritto può essere utilizzato per misurare le differenze subcellulari nelle diverse modifiche dell'ubiquitina utilizzando procedure occidentali di macchie. È importante notare che i tag di ubiquitina che possono essere rilevati sono limitati dalla disponibilità di anticorpi specifici del collegamento, che attualmente includono K48, K63 e M1 per i ratti (nota: è disponibile un anticorpo K27, anche se non ha prodotto un'immagine rilevabile in frazione di amigdala laterale o listi a cellule intere in una varietà di condizioni). In tutte le frazioni subcellulari sono stati rilevati l'ubiquitinazione complessiva di poliubiquitinazione, l'ubiquitinazione lineare/M1 e K63 specifica della degradazione. È importante sottolineare che, se analizzate in diverse condizioni sperimentali, si è verificato un aumento della poliubiquitina complessiva (Figura 6A), lineare (Figura 6B), K63 (Figura 6C) e K48 (Figura 6D) nell'amigdala laterale frazione nucleare dopo aver imparato a controllare gli animali. Allo stesso tempo, nella regione citoplasmica, la poliubiquitinazione generale è diminuita e l'ubiquitazione K48 è aumentata dopo l'apprendimento, mentre l'ubiquitinazione sinaptica K63 è stata ridotta. Collettivamente, questi risultati indicano che all'interno dello stesso animale le differenze subcellulari nell'ubiquitinazione proteica specifica del collegamento possono essere rilevate con precisione.

Figure 1
Figura 1 : Schema per frazionamento subcellulare del tessuto cerebrale del ratto. Il cervello del roditore viene estratto, la regione del cervello sezionata e gli emisferi divisi. Utilizzando una serie di tamponi e fasi di centrifuga, le frazioni nucleari e citoplasmatiche vengono raccolte da un emisfero, mentre una frazione sinaptica grezza viene raccolta dall'altro. Entrambe le frazioni vengono poi utilizzate per i saggi di attività proteasomica e il gonfiore occidentale, per formulare i livelli di poliasiquitinazione proteica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Conferma della purezza della frazione grezza, nucleare e citoplasmatica. (A) La proteina di densità postsinaptica della proteina postsinaptica 95 (PSD95; 1:1.000) della proteina sinaptica, ma non la frazione nucleare con livelli più bassi nel citoplasma. (B) L'istone H3 (1:500) era presente nella frazione nucleare, ma non sinaptica, con espressione inferiore nel citoplasma. (C) La tubulina (1:1,000) era presente nel citoplasma, ma in gran parte assente dal nucleare, frazione con espressione inferiore nel lisato sinaptico. (D) La proteina di pulizia della proteina z-actin (1:1.000) era presente in tutti i compartimenti subcellulari. Le aree indicano le dimensioni previste della proteina bersaglio. Questa cifra è stata modificata da Orsi, S.A. et al.21. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Quantificazione dell'attività proteasomica nelle frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche raccolte dall'amigdala laterale dello stesso animale. Durante l'attività protentuale in vitro, le unità fluorescenti relative (RFU) rilevate sono aumentate dall'inizio (Scan 1) alla fine (Scan 5) del saggio nelle frazioni sinaptiche (A), citoplasmiche (C) e nucleari (E). La quantificazione di questa variazione dalla linea di base indicava un valore RFU normalizzato (relativo a 10 M AMC) di 0,1 nelle frazioni sinaptiche (B), 1,6 nella citoplasma (D) e 0,3 nelle frazioni nucleari (F). L'inibitore proteasoso zlac ha impedito alle RfU di cambiare durante la sessione (G-H). Questa cifra è stata modificata da Orsi, S.A. et al.21. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : differenze subcellulari nell'attività proteasomica nell'amigdala laterale dello stesso animale. È stato rilevato un aumento dell'attività proteasosa nucleare negli animali addestrati (con conditioned) rispetto ai controlli, che corrispondevano a una diminuzione dell'attività all'interno della frazione sinaptica. L'attività proteasomica citoplasmatica è rimasta al basale. P < 0,05 da Controllo. Questa cifra è stata modificata da Orsi, S.A. et al.21. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Manipolazione in vitro dell'attività proteasomica nelle frazioni sinaptiche e citoplasmatiche raccolte. La manipolazione in vitro della segnalazione CaMKII tramite l'inibitore AIP ha ridotto l'attività proteasomica nel sinaptico (A), ma non la citoplasmatica (B), frazione dall'amigdala laterale del ratto. Questa cifra è stata modificata da Jarome, T.J. et al.23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : differenze subcellulari nell'ubiquitinazione proteica specifica del collegamento nell'amigdala laterale dello stesso animale dopo l'apprendimento. (A) Dopo l'apprendimento si è verificato un aumento dell'ubiquitinazione complessiva nella frazione nucleare, che era correlata a una diminuzione della frazione citoplasmatica. (B) C'è stato un aumento dell'ubiquitinazione lineare nel nucleare, ma non citoplasmica o sinaptica, frazione successiva all'apprendimento. (C) C'è stato un aumento dell'ubiquitinazione K63 nella frazione nucleare dopo l'apprendimento, che era correlata a una diminuzione della frazione sinaptica. (D) L'ubiquitazione K48 è aumentata nel nucleare e nel citoplasma, ma non sinaptica, frazione successiva all'apprendimento. P < 0,05 da Controllo. Tutte le densità ottiche di ubiquitina sono state normalizzate a livelli di actina (immagini di macchie occidentali rappresentative inferiori in A), che sono state utilizzate come controllo del carico. Questa cifra è stata modificata da Orsi, S.A. et al.21. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui, dimostriamo un metodo efficiente per quantificare i cambiamenti nell'attività onniquitina-proteasoma attraverso diversi compartimenti subcellulari nello stesso animale. Attualmente, la maggior parte dei tentativi di misurare i cambiamenti subcellulari nell'attività del sistema ubiquitina-proteasoma sono stati limitati a un singolo compartimento per campione, con conseguente necessità di ripetere gli esperimenti. Questo porta a costi significativi e perdita di vita animale. Il nostro protocollo allevia questo problema dividendo gli emisferi, consentendo di raccogliere diverse frazioni cellulari da ogni emisfero dello stesso animale. Utilizzando questo protocollo, siamo stati in grado di dimostrare per la prima volta che nella stessa attività animale ubiquitina-proteasososa differenze nei cambiamenti nucleari, citoplasmatici e sinaptici in risposta all'apprendimento21.

La principale limitazione del protocollo qui descritto è che si basa sulla quantità di tessuto cerebrale (campione) ottenuto. Ad esempio, come descritto in precedenza, questo protocollo richiede la divisione degli emisferi di una determinata regione del cervello. Tuttavia, ciò potrebbe non essere sempre possibile, come nel caso di alcune aree che sono presenti solo in un emisfero. In questi casi, il protocollo potrebbe essere modificato innanzitutto omogeneizzando l'intera area del cervello nel buffer TEVP utilizzato nella fase della frazione sinaptica (Sezione 3.1), poiché questo buffer è privo di tutti gli agenti di denatura. Il campione può quindi essere suddiviso in due parti uguali per volume. La prima parte può essere utilizzata per la frazione sinaptica, seguendo il protocollo come descritto. Per la seconda metà del campione, il detergente non igienico NP-40 può essere aggiunto a una concentrazione finale dello 0,05%, seguito dalla centrifuga come descritto nella sezione 2.6. Ciò consentirà la separazione delle proteine citoplasmiche nelle proteine supernatali e nucleari nel pellet, che possono essere ulteriormente isolate seguendo le restanti fasi della Sezione 2. Un'altra preoccupazione per la quantità di tessuto è che alcune regioni del cervello sono di dimensioni molto piccole, come la corteccia prelimbica. Tuttavia, in questi casi, il protocollo di cui sopra può ancora essere utilizzato riducendo i volumi dei buffer utilizzati, che dovrebbero essere determinati empiricamente in base alle dimensioni della regione del cervello raccolti. Così, questo protocollo può essere modificato anche per le regioni cerebrali più difficili in cui è disponibile meno tessuto.

Uno dei principali vantaggi del protocollo qui delineato è che utilizza attrezzature di laboratorio comuni e reagenti che possono essere trovati nella maggior parte delle strutture, consentendo a questa metodologia di essere modificato a coloro che hanno anche un budget limitato o con risorse limitate. Inoltre, mentre illustreremo questo protocollo come un modo per misurare i cambiamenti subcellulari nella segnalazione onniquitina-proteasoso, questa metodologia può essere applicata anche a qualsiasi altra proteina o processo cellulare in cui la comprensione della localizzazione cellulare e della funzione è importante. Pertanto, questo protocollo potrebbe avere ampie applicazioni per comprendere le funzioni subcellulari di specifiche proteine o complessi durante l'apprendimento e la memoria o diversi stati di malattia.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avvio del College of Agricultural and Life Sciences e il College of Science di Virginia Tech.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Fisher 15575020 Various other vendors
20S Proteasome Activity Kit Millipore Sigma APT280 Other vendors carry different versions
ATP Fisher FERR1441 Various other vendors
Beta-actin antibody Cell signaling 4967S Various other vendors
Beta-tubulin antibody Cell signaling 2128T Various other vendors
BioTek Synergy H1 plate reader BioTek VATECHH1MT3 Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanol Fisher ICN19024280 Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactone Millipore Sigma L7035 Various other vendors
Cryogenic cup Fisher 033377B Various other vendors
DMSO DMSO D8418 Varous other vendors
DTT Millipore Sigma D0632 Various other vendors
Glycerol Millipore Sigma G5516 Various other vendors
H3 antibody Abcam ab1791 Various other vendors
HEPES Millipore Sigma H3375 Various other vendors
Hydrochloric acid Fisher SA48 Various other vendors
IGEPAL (NP-40) Millipore Sigma I3021 Various other vendors
K48 Ubiquitin Antibody Abcam ab140601 Various other vendors
K63 Ubiquitin Antibody Abcam ab179434 Various other vendors
KCl Millipore Sigma P9541 Various other vendors
KONTES tissue grinder VWR KT885300-0002 Various other vendors
Laemmli sample buffer Bio-rad 161-0737 Various other vendors
Linear Ubiquitin Antibody Life Sensors AB-0130-0100 Only M1 antibody
MgCl Millipore Sigma 442611 Various other vendors
Microcentrifuge Eppendorf 2231000213 Various other manufacturers/models
myr-AIP Enzo Life Sciences BML-P212-0500 Carried by Millipore-Sigma
NaCl Millipore Sigma S3014 Various other vendors
Odyssey Fc Imaging System LiCor 2800-02 Other vendors carry different versions
Phosphatase Inhibitor Millipore Sigma 524625 Various other vendors
Precision Plus Protein Standard Bio-rad 161-0373 Various other vendors
Protease Inhibitor Millipore Sigma P8340 Various other vendors
PSD95 antibody Cell signaling 3450T Various other vendors
SDS Millipore Sigma L3771 Various other vendors
Sodium hydroxide Fisher SS255 Various other vendors
Sucrose Millipore Sigma S0389 Various other vendors
TBS Alfa Aesar J62938 Varous other vendors
Tris Millipore Sigma T1503 Various other vendors
Tween-20 Fisher BP337-100 Various other vendors
Ubiquitin Antibody Enzo Life Sciences BML-PW8810 Various other vendors

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References

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McFadden, T., Devulapalli, R. K., Jarome, T. J. Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59695, doi:10.3791/59695 (2019).

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