Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

בדיקת כימות משנית אוביקוויאין-פעילות פרוטאסדום במוח מכרסם

Published: May 21, 2019 doi: 10.3791/59695
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

פרוטוקול זה נועד ביעילות לכמת אוביקוויב-פרוטאסדום מערכת (UPS) פעילות בתאים סלולריים שונים של המוח מכרסם. משתמשים יכולים לבחון את התפקוד UPS בתוך שברים גרעיניים, cytoplasmic וסינפטית באותו בעל חיים, הפחתת כמות הזמן ומספר בעלי החיים הדרושים כדי לבצע ניתוחים אלה מורכבים.

Abstract

מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין היא מווסת מפתח של השפלה חלבון ומגוון של תהליכים סלולריים אחרים eukaryotes. במוח, מגביר את הפעילות אוביקוויב-פרוטאספראט הם קריטיים לפלסטיות הסינפטית והיווצרות הזיכרון והשינויים החריגה במערכת זו משויכים למגוון של הפרעות נוירולוגיות, ניווניות ופסיכיאטריות. אחד הנושאים ללמוד אוביקוויב-פרוטאסאט התפקוד במוח הוא שהוא קיים בכל התאים הסלולריים, שבו מטרות החלבון, התפקיד הפונקציונלי ומנגנונים של רגולציה יכול להשתנות באופן נרחב. כתוצאה מכך, היכולת להשוות במישרין את המוח אוביקוויב חלבון מיקוד ופעילות מיקרוביאלית בתאי משנה שונים בתוך אותה חיה היא קריטית להבנה מלאה כיצד UPS תורמת לפלסטיות הסינפטית, זיכרון ומחלות. השיטה המתוארת כאן מאפשרת איסוף של גרעיני, cytoplasmic ושברים סינפטית גולמיים מן מכרסם אותו (עכברוש) המוח, ואחריו כימות בו של פעילות מיקרוביאלית של הפרוטאסאט (בעקיפין, מתן פעילות של הליבה פרוטאסדום בלבד) ותיוג חלבונים אוביקוויב ספציפי לקישור. כך, ניתן להשתמש בשיטה כדי להשוות ישירות שינויים משניים בפעילות אוביקוויב-פרוטאסאין באזורי מוח שונים באותה חיה במהלך הפלסטיות הסינפטית, היווצרות הזיכרון ומצבי מחלה שונים. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך את ההתפלגות והתפקוד התת-תאית של חלבונים אחרים בתוך אותה חיה.

Introduction

מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין (UPS) היא רשת מורכבת של מבני חלבון מחוברים וליגסים השולטים בהשפלה של רוב החלבונים הקצרי-החיים בתאים1. במערכת זו, חלבונים מסומנים עבור השפלה או תהליכים סלולריים אחרים/גורלות על ידי משנה קטן אוביקוויב. חלבון היעד יכול לרכוש 1-7 אוביקוויב שינויים, אשר יכול לקשר יחד באחד 7 ליזין (K) אתרים (K6, K11, K27, K29, K33, K48 ו-K63) או מתיונין N-טרמינל (M1; הידוע בשם ליניארי) ב אוביקווילין הקודם2. חלק מתגי polyubiquitin אלה הם ספציפיים להשפלה (K48)3, בעוד אחרים הם עצמאיים במידה רבה של תהליך השפלה חלבון (M1)4,5,6. כך, תהליך החלבון אוביקווינציה מורכב מאוד ואת היכולת לכמת שינויים תג polyubiquitin מסוים הוא קריטי בסופו של דבר להבין את התפקיד של שינוי נתון בתפקוד הסלולר. עוד מסבך את המחקר של מערכת זו, פרוטאסדום, שהוא מבנה קטליטי של UPS7, שניהם מואפים חלבונים אבל יכול גם להיות מעורב בתהליכים אחרים שאינם נגד הפרוטחרדה8,9. לא באופן מפתיע אז, מאז התגלית הראשונית שלה, הפעילות הרגילה אוביקוויב-פרוטאסאין מעורבים היווצרות זיכרון ארוך טווח ומגוון של מצבי מחלה, כולל הרבה נוירולוגי, נוירוניווניות ופסיכיאטרי הפרעות10,11. כתוצאה מכך, שיטות שיכולות ביעילות וביעילות לכמת UPS פעילות במוח הם קריטיים להבנת בסופו של דבר כיצד מערכת זו אינה מוסדרת במצבי מחלה ופיתוח בסופו של דבר אפשרויות טיפול מיקוד אוביקוויב ו/או . התפקוד הפרוטאלי

ישנם מספר סוגיות בתחום הפעילות אוביקוויטים-פרוטאסאין ברקמת המוח מחולדות ועכברים, שהם מערכות המודל הנפוצות ביותר המשמשות לחקר הפונקציה UPS, כולל 1) המגוון של אוביקוויטים שינויים, ו 2) הפצה ו הוויסות הדיפרנציאלי של UPS מתפקד על פני תאים תת-סלולריים12,13,14. למשל, רבים של ההפגנות המוקדמות של הפונקציה אוביקוויב-פרוטאסאט במוח במהלך היווצרות הזיכרון השתמשו לוחות תא שלם והצביעו עליות הזמן התלויות הן אוביקוויציה חלבונים ופעילות פרוטסאין15, מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , 20. עם זאת, מצאנו לאחרונה כי פעילות אוביקוויב-פרוטאסאין מגוונת באופן נרחב על פני תאים subcellular בתגובה ללמידה, עם עליות בו באזורים מסוימים ופוחתת באחרים, דפוס שונה באופן משמעותי ממה שדווח בעבר בתא שלם21. זה תואם את המגבלה של גישה שלמה התא, כפי שהוא אינו יכול לנתק את התרומה של שינויים בפעילות ה-UPS על פני תאים משניים שונים. למרות מחקרים שנעשו לאחרונה השתמשו בפרוטוקולים השבר הסינפטית כדי לחקור את UPS במיוחד על הסינפסות בתגובה ללמידה22,23,24, השיטות בשימוש סגר את היכולת למדוד . שינויים באותה החיה התוצאה היא צורך מיותר לחזור על ניסויים מספר פעמים, איסוף שבר שונה הסלולר בכל אחד. לא רק תוצאה זו היא הפסד גדול יותר של חיי בעלי חיים, אבל זה מבטל את היכולת להשוות במישרין את פעילות ה-UPS על פני תאים תת תאיים שונים בתגובה לאירוע נתון או במהלך מצב מחלה מסוים. בהתחשב בכך מטרות החלבון של אוביקוויב ו-פרוטאסאט משתנים באופן נרחב ברחבי התא, הבנה כיצד אוביקוויב-פרוטאסאט איתות שונה בתאי subcellular נפרדים הוא קריטי לזיהוי התפקיד הפונקציונלי של ה-UPS ב מוח בזמן היווצרות הזיכרון והפרעות נוירולוגיות, ניווניות ופסיכיאטריות.

כדי לטפל בצורך זה, פיתחנו לאחרונה הליך שבו ניתן היה לאסוף שברים גרעיניים, cytoplasmic וסינפטית עבור אזור מוחי נתון מאותה חיה21. בנוסף, כדי להסביר את כמות החלבון המוגבלת שניתן להשיג מאיסוף שברים תת-תאיים מרובים מאותה דוגמית, אנו ממוטבים פרוטוקולים שהוקמו בעבר לצורך שיטת הפעולה של מחוץ לפעילות והצמדה בתאי חלבון שנאספו מרקמת מוח מכרסמים. באמצעות פרוטוקול זה, היינו מסוגלים לאסוף ולהשוות ישירות שינויים תלויי למידה בפעילות פרוטאספראט, K48, K63, M1 והכולל חלבון polyubiquitination רמות בגרעין הציטופלסמה ו ב הסינפסות באמיגדלה לרוחב של חולדות. כאן, אנו מתארים בפירוט ההליך שלנו (איור 1), אשר יכול לשפר באופן משמעותי את ההבנה שלנו כיצד UPS מעורב ביצירת זיכרון ארוך טווח ומצבים מחלות שונות. עם זאת, יש לציין כי בפעילות החוץ בלתי מתורבת הנדונה בפרוטוקול שלנו, תוך שימוש נרחב, לא ישירות למדוד את הפעילות של השלם מתחמים 26 של המלא. ליתר דיוק, שיטת הפעולה הזו מודדת את הפעילות של הליבה של 20, כלומר היא יכולה לשמש רק כפרוקסי כדי להבין את הפעילות של הליבה עצמה בניגוד למכלול כולו 26 של מורכבות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים, כולל נושאי בעלי חיים אושרו על ידי המכון הפוליטכני של וירג והמדינה אוניברסיטת מוסדיים טיפול בעלי חיים והשתמש הוועדה (IACUC).

1. איסוף וחיתוך של רקמת המוח מכרסם

הערה: פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של מוחות המוח בשימוש עם הליכים שונים אוסף הרקמה. להלן ההליך המשמש במעבדה שלנו עבור תת הסלולר של רקמת המוח חולדה, באמצעות שבוע 8-9 הזקן הגברי של הגברים ספראג. על מנת לעבד את כל התאים הסלולריים באותה חיה, סעיף 1.3. חייב להיות בעקבותיו ללא קשר לתהליך איסוף רקמה בשימוש.

  1. לחלץ את מוח העכברוש ומקום לתוך ספל קריוגני מראש על קרח יבש. הקפא את המוח על קרח יבש, או השתמש בחנקן נוזלי אם הוא זמין, והעבר ל-80 מקפיא ° c. אפשר לגזור את המוח באותו. היום או במועד מאוחר יותר
  2. להסיר את המוח הקפוא מן הספל הקריוגני ומקום לתוך מטריצה המוח חולדה מקורר עם קרח יבש. כל חריץ במטריצה מקביל ל-0.5 מ"מ, שניתן להשתמש בו כדי לקבוע את המיקום המשוער של אזור הריבית (ROI).
    1. באמצעות עכברוש מוח אטלס, להכניס סכין גילוח לתוך המטריצה מיד מול (קדמי) של ההתחלה החזוי של ROI. לאחר מכן, הכנס סכין גילוח מיד בקצה החזוי (אחורי) של ROI.
    2. להסיר את הפרוסה בין סכיני גילוח באמצעות אזמל ומקום על שקופית מיקרוסקופ מקורר על קרח יבש. בדרך כלל, סעיפים הם 2-3 מ"מ עבה אך זה משתנה בהתאם ל-ROI.
  3. משתמש באזמל, מנתח את ההחזר. של כל חצי-הכדור בכל פעם מניחים כל האונה לתוך שונים 1.5 mL צינורות מיקרוצנטריפוגה לפני מקורר על קרח יבש. ניתן להשתמש ברקמה קפואה באופן מיידי עבור משבר הסלולר או מעובד במועד מאוחר יותר אם מאוחסן ב-80 ° c.

2. הוצאת גרעיני וcytoplasmic

הערה: פרוטוקול זה משתמש בפתרונות מלאי מראש של כימיקלים מעבדה משותפים, כולל 0.1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 m Dithioitol (dtt), 0.5 M אתיליאדידהחומצה (edta), 5 m הנאל, 10% NP-40 (IGEPAL) ו 50% גליצרול. אם נקודת הקצה נעשה שימוש asasome פעילות מוסר, גליצרול ו-ATP ניתן להוסיף לכל המאגרים כדי לסייע למנוע פירוק של מכלולי פרוטאסדום במהלך הליזה.

  1. הכינו את מאגר הליזה. הוסף 8.63 mL של מים באולטרה-סאונד (מזוקקים ומזוקק) לצינור מעוקר של 15 מ"ל.
    1. לצינור החרוט, להוסיף 1,000 μL של 0.1 M HEPES, 15 μL של 1 M MgCl, 100 μL של 1 M DTT ו 50 μL של 10% NP-40.
    2. הוסף 100 μL של קוקטייל פרוטאז מעכבי ו 100 μL של קוקטייל מעכב פוספספטאז. בקצרה מערבולת הפתרון כדי לערבב ולמקם על קרח רטוב להתקרר. שים לב כי הפתרון עשוי להיות צבע צהוב מעכב פוספספטאז.
      הערה: השימוש במעכבי הפרוטאז חיוני כדי לשמר את החלבון ולהבטיח את הספציפיות של הפעילות של מחוץ לגופית בתוך מבחנה. עם זאת, מעכבי אלה עשויים גם לגרום לירידה קלה בפעילות פרוטאסדום, כלומר הפעילות הנמדדת על שיטת החוץ הגופית עשוי להיות בלתי מזלזל של רמות הפעילות בפועל.
  2. . הכן את מאגר החילוץ הוסף 5.925 mL של מים באולטרה-סאונד (מזוקקים ומזוקק) לצינור מעוקר של 15 מ"ל.
    1. לצינור החרוט, להוסיף 2,000 μL של 0.1 M HEPES, 1250 μL של 50% גליצרול, 15 μL של 1 M MgCl2, 5 μl של 1 m dtt, 5 μl של 0.5 m edta ו 600 μl של 5 m הנאל.
    2. הוסף 100 μL של קוקטייל פרוטאז מעכבי ו 100 μL של קוקטייל מעכב פוספספטאז. בקצרה מערבולת הפתרון כדי לערבב ולמקם על קרח רטוב להתקרר. שים לב כי הפתרון עשוי להיות צבע צהוב מעכב פוספספטאז.
  3. להסיר את 1.5 mL צנטריפוגה מיקרוצינורית המכילה את האונה האחת של התשואה מ-80 ° c מקפיא. ודא שהאונה שבשימוש מאוזנת בתנאי החילוץ בכל קבוצה ניסיונית. לדוגמה, בניסוי של שתי קבוצות, השתמש באונה השמאלית של שתי החיות הראשונות בכל קבוצה ובאונה הימנית של שתי הדגימות הבאות, וכו '.
  4. באמצעות אזמל, להעביר את רקמת המוח קפוא ל 2 מ ל טפלון זכוכית ההומובית. הוסף 500 μL של מאגר ליזה לצינור טפלון.
    1. באמצעות כתש B, המגון לסדר את הרקמה באמצעות 15 משיכות עד שלא ניתן לראות כמות מוצקה של חומר מוצק. השתמש בתנועה מפנה (בכיוון השעון או נגד כיוון השעון) במהלך כל שבץ.
  5. באמצעות הפיפטה 1,000 μL, העבר את דגימת המגון לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 mL. מניחים את הצינור על קרח רטוב ו דגירה עבור 30 דקות.
  6. מניחים צינור במיקרוצנטריפוגה ו ספין עבור 10 דקות ב 845 x ו 4 ° c. לאחר סיום, להסיר בזהירות את supernatant על ידי ליטוף ומקום לתוך צינור חדש 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה; זהו שבר Cytoplasmic, אשר ניתן לאחסן בקרח או בשעה 4 ° צ' עד סעיף 2.9.
  7. הוסף 50 μL של מאגר החילוץ לגלולה המתקבלת ולהשעות מחדש על ידי ליטוף. . אל תעשה מערבולת על הגלולה מניחים את הצינור המכיל את הגלולה מחדש על הקרח ו דגירה עבור 30 דקות.
  8. מניחים את הצינור ב microcentrifuge ו ספין עבור 20 דקות ב 21,456 x g, 4 ° c. לאחר סיום, להסיר בזהירות את supernatant על ידי ליטוף ומקום לתוך צינור חדש 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה; . זה השבר הגרעיני הגלולה יכולה עכשיו להיות מושלך.
  9. מדידת ריכוז החלבון של Cytoplasmic ואת החילוץ הגרעיני באמצעות שיטת חלבון Dc (על פי הוראות היצרן), או כל שווי שווה לדגימות שנאספו באמצעות חומרי ניקוי לא יוניים. המשך באופן מיידי לתוך שיטת הפעילות הפרוטסטנטית (סעיף 4) או הכתמים המערביים (סעיף 5). לחילופין, ניתן לאחסן דגימות ב-80 ° צ' עד לצורך.

3. אוסף של שבר סינפטית

הערה: פרוטוקול זה משתמש בפתרונות מלאי שנעשו מראש של כימיקלים מעבדה נפוצים, כולל 1 M Tris (pH 7.5), 0.5 M EDTA, 5 M הנאקל ו 10% SDS. אם נקודת הקצה משמש asasome פעילות מוסר, גליצרול ו-ATP ניתן להוסיף לכל המאגרים כדי לסייע במניעת פירוק של מכלולי פרוטאסיום במהלך הליזה

  1. הכן את מאגר ה-TEVP עם סוכרוז 320 מ"מ. הוסף 60 mL של מים באולטרטהור (מזוקק ומזוקקים) לגביע נקי 100 mL.
    1. אל הגביע, להוסיף 1,300 μL של 1 M טריס (pH 7.5), 260 μL של 0.5 M EDTA, 100 μL של קוקטייל פרוטאז מעכבי, 100 μL של קוקטייל מעכבי פוספספטאז ו-10 גרם של סוכרוז. ערבבו עם בר מהומה עד שסוכרוז התפרקה לחלוטין.
    2. הביאי ל-pH ~ 7.4 על ידי הוספת חומצה הידרוכלורית (HCl) dropwise לפתרון באמצעות פיפטה.
    3. העבר את הפתרון לבקבוקון נפחי 100 mL. הביאו נפח ל 100 mL על ידי הוספת מים באולטרטהורים. לצנן את הפתרון הסופי על הקרח עד הצורך.
  2. . הכן את מאגר המגון הוסף 60 mL של מים באולטרטהור (מזוקק ומזוקקים) לגביע נקי 100 mL.
    1. אל הגביע, להוסיף 5,000 μL של 1 מ ' טריס (pH 7.5), 3,000 μL של 5 M הנאל, 100 μL של קוקטייל מעכב פרוטאז, 100 μL של קוקטייל מעכבי פוספאטאז ו 2,000 μL של 10% SDS. מערבבים עם בר מהומה.
      הערה: חומרי ניקוי יוניים יכולים להפריע לפעילות פרוטאסדום מוסר על ידי התוצאה של הרפתקאות המתחם פרוטאסדום. הנפח של SDS יכול להיות הוריד כדי לסייע לשמר את הפונקציה פרוטאסדום אם תרצה.
    2. להביא את ה-pH כדי ~ 7.4 על ידי הוספת הדראט HCl לפתרון באמצעות פיפטה.
    3. העבר את הפתרון לבקבוקון נפחי 100 mL. הביאו את עוצמת הקול ל 100 mL על ידי הוספת מים באולטרטהורים. אחסן את הפתרון הסופי בטמפרטורת החדר; לא להתקרר כמו SDS יהיה לזרז את הפתרון.
  3. הסר את הצנטריפוגה 1.5 mL המכילה את האונה האחת של התשואה מ-80 ° c מקפיא. ודא שהאונה שבשימוש מאוזנת בתנאי החילוץ בכל קבוצה ניסיונית. לדוגמה, בניסוי של שתי קבוצות, השתמש באונה השמאלית של שתי החיות הראשונות בכל קבוצה ובאונה הימנית של שתי הדגימות הבאות, וכו '.
  4. באמצעות אזמל, להעביר את רקמת המוח קפוא ל 2 מ ל טפלון זכוכית ההומובית. הוסף 500 μL של TEVP מאגר לצינור טפלון.
    1. באמצעות כתש B, המגון לשאת את הרקמה באמצעות 15 משיכות עד שלא ניתן לראות העברות של חומר מוצק. השתמש בתנועה מפנה (בכיוון השעון או נגד כיוון השעון) במהלך כל שבץ.
  5. באמצעות הפיפטה 1,000 μL, העבר את דגימת המגון לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 mL. צנטריפוגה את המדגם ב 1,000 x g עבור 10 דקות, 4 ° c.
  6. לאסוף את supernatant ולהעביר לצינור חדש 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה באמצעות ה1,000 μL הצינורות. צנטריפוגה את המדגם ב 10,000 x g עבור 10 דקות, 4 ° c. הגלולה המקורית (P1) מכילה גרעינים ופסולת גדולה ניתן להיפטר.
  7. העבר את הסופרנטאנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש 1.5 mL. . זה שבר ציטוסולסי הוסף 50 μL של מאגר המגון אל הגלולה (P2) והשהה מחדש באמצעות ליטוף עד שלא יוצג חומר מוצק.
  8. צנטריפוגה את המדגם ב 20,000 x g עבור 10 דקות, 4 ° c. העבר את הסופרנטאנט לשפופרת מיקרוצנטריפוגה חדשה 1.5 mL; זהו קרום Synaptosomal גסה (סינפטית) שבר. . הגלולה יכולה להיות מושלך
  9. למדוד את ריכוז החלבון של שבר סינפטית באמצעות שיטת החלבון Dc (על פי הוראות היצרן), או כל שווי שווה לדגימות שנאספו באמצעות חומרי ניקוי יוניים. המשך באופן מיידי לתוך שיטת הפעילות הפרוטסטנטית (סעיף 4) או הכתמים המערביים (סעיף 5). לחילופין, ניתן לאחסן דגימות ב-80 ° צ' עד לצורך.

4. שיטת הפעילות הפרוטאספלי

הערה: פעילות proteasome ניתן למדוד ברקמת המוח הומוגניים באמצעות גרסה שונה מעט של ערכת פעילות Proteasome 20 s. שיטת הפעולה אינה מודדת באופן ישיר את הפעילות של מתחמים מלאים של 26 שנות המשך. ליתר דיוק, זה מודד את הפעילות של הליבה של 20, כלומר זה יכול לשמש רק פרוקסי כדי להבין את הפעילות של הליבה עצמה בניגוד למכלול 26 s פרוטאסדום. הצלחת ההתמדה הזאת יורדת עם מחזורי הקפאת ההקפאה חוזרים ו/או הגדלת רמות חומרי הניקוי, במיוחד יונית, ודורשת שימוש בקורא לוחית עם מסנני מסננים 360/460 (עירור/פליטה) ויכולות הסקה של עד 37 ° c.

  1. הגדרות קורא הצלחות: לפני שתחמם עד 37 ° c והחזק את הריצה.
    1. הגדר עירור על 360 ו פליטה כדי 460. אם 96 צלחת הבאר בשימוש ברור, להגדיר את מיקום האופטיקה למטה. אם משתמשים בצלחת הבאר 96 כהה/שחור, להגדיר מיקום אופטיקה למעלה.
    2. הגדר מודלים של קורא צלחות בוגרים לרווח אוטומטי תחת אפשרויות קריאת הפלורסנט; דגמים חדשים יותר מוגדרים מראש עבור זה. תוכנית קינטי לרוץ עם זמן של 2 h, סריקה (קריאה) כל 30 דקות.
  2. מהווים מחדש את מאגר הספק 10x המסופק בערכה עם 13.5 mL של מים אלקטרופורזה. הוסף 14 μL של 100 mM ATP למאגר עכשיו 1x; הדבר מגביר באופן משמעותי את הפעילות בדגימות ומשפר את אמינות היכולת. ניתן לאחסן את המאגר הסופי של 20 שבועות בקרח או בארבע מעלות צלזיוס עד הצורך והוא יציב למשך מספר חודשים.
  3. מרכיבים מחדש את תקן AMC המסופק בערכה עם 100 μL של DMSO. בצע שלב זה בחשיכה או בתנאי תאורה חלשה, כאשר התקן רגיש לאור.
  4. צור עקומת מעמד של AMC באמצעות תקן מחדש, בחושך או בתנאי תאורה נמוכה.
    1. בנפרד 0.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות, להוסיף 16, 8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4 ו -0 μL של תקן AMC, אשר מתאים 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0.5 ו -0 μM AMC הריכוז.
    2. לצינורות אלה, באותו סדר, להוסיף 84, 92, 93.6, 96.8, 98.4, 99.2, 99.6 ו-100 μL של מאגר שינוי בשנות ה -20. זה יוצר סדרה של ריכוז גבוה עד נמוך AMC, אשר ישמשו עבור כיול קורא לוחית ניתוח של פעילות פרוטאסדום בדגימות הומוגניים.
    3. אחסן את כל התקנים מדולל על קרח בחשכה עד הצורך.
  5. מהווים מחדש את המצע פרוטאסאט (Suc-LLVY-AMC) סיפק בערכה עם 65 μL של DMSO. בצע שלב זה בחושך או בתנאי תאורה נמוכה, כמו המצע הוא רגיש באור. צור 1:20 דילול של המצע פרוטאסדום ב חדש 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה באמצעות מאגר שימוש 20 s. אחסן את המצע מדולל על קרח בחשכה עד הצורך.
    הערה: לדוגמה, אם הצלחת יהיו 10 דגימות ו 1 ריק, תצטרך המצע מדולל מספיק עבור 22 בארות (עם כפילויות) ב 10 μL לכל טוב. זה משווה ל 220 μL צריך + 30 μL עבור שגיאות ליטוף, דרישת 12.5 μL של מצע ו 237.5 μL של מאגר שימוש בשנות ה -20.
  6. הפשרת דגימות רצויות (אם קפואות) והוסף סכום מנורמל ל-96 צלחת טובה. הפעל כל דוגמה בכפילויות. כמות המדגם הדרוש משתנה על בסיס הכנת רקמות. באופן כללי, 10-20 μg מספיקה עבור כל שבר הסלולר.
  7. הביאו את נפח הדגימה היטב ל-80 μL עם מים באולטרטהורים. הסכום שנוסף תלוי בעוצמת הדגימה שנוספה. לדוגמה, אם מדגם 1 היה 4.5 μL של חלבון ומדגם 2 היה 8.7 μL, אז כמות המים הדרושים יהיה 75.5 μL ו 71.3 μL, בהתאמה. בשתי בארות נפרדות, להוסיף 80 μL של מים בלבד; אלה יהיו התאים הריקים.
    הערה: כדי להגביל את השינויים בנפח החלבון עקב שגיאות מצטברות, ריכוזי חלבונים יכולים להיות מנורמל למדגם הפחות מרוכז. פעולה זו תאפשר שימוש באותו נפח דגימה בכל התנאים.
  8. הוסף 10 μL של מאגר שיטת המשך 20S לכל היותר, כולל שיטת ' כדורי סרק '. מומלץ להגיע לכאן כדי להבטיח נפח שינון עקבי לאורך הבארות.
  9. אופציונלי: בשלב זה, הציגו מניפולציות חוץ גופית אם תרצו; הדבר ידרוש שכל דגימה תהיה בעלת 2 בארות נוספות לכל טיפול, כולל הרכב. אם כן, להוסיף 5-10 μL של סמים/תרכובת של עניין 2 של בארות לדוגמה וכמות שווה ערך של שליטה/רכב על 2 בארות אחרות. מניחים את הצלחת על פני הקורא לוחית מחומם מראש או לתוך חממה 37 ° c עבור 30 דקות.
  10. כבו את האורות או היכנסו לחדר חשוך. הוסף את כל 100 μL של תקני AMC מדולל לבאר חדשה; לכל תקן יהיה באר אחת.
  11. בחשכה, להוסיף 10 μL של מצע פרוטאסאט מדולל לבארות המכילים דגימה וכלי שיטת סרק, אך לא לתקן AMC. מומלץ להגיע לכאן כדי להבטיח נפח שינון עקבי לאורך הבארות.
  12. מניחים את הצלחת לתוך הקורא לוחית ולהתחיל לרוץ קינטי.
    הערה: הצלחת לא צריך להיות תחת עצבנות מתמדת במהלך לרוץ קינטי, עם זאת, המשתמש יכול לבחור אם הצורך
  13. בסופו של הפעלה קינטית, ייצוא raw 360/460 ערכי פלורסנט ל-Microsoft Excel.
    1. ממוצע יחד בארות כפולות עבור כל תקן, כל מדגם ואת שיטת הפעולה ריק עבור כל 5 סריקות. ערכי פלורסנט גולמיים צריכים להגדיל את הסריקות עבור הדגימות אך להישאר יציבים (או להקטין מעט) עבור תקנים וכדורי שינוי.
    2. קח את תקן AMC הגבוהה ביותר ממוצע וחילוק לפי הריכוז הידוע (20 μM). חלק ערך זה על-ידי הריכוז לדוגמה המשמש ביכולת לקבל ערך AMC מתוקננת. עבור כל דוגמה וממוצע של שיטת האפס, חלק לפי ערך AMC הסטנדרטי.
    3. קח את הערך הסופי הזה וחלק באמצעות הריכוז לדוגמה המשמש באותו הסדר כדי לקבל את הערך המנורמל עבור כל מדגם ושיטת הפעולה Blank. . תעשה את זה עבור כל 5 הסריקות
    4. הפחת את הערך המנורמל של הערכה הריקה מכל ערך מדגם מנורמל עבור כל 5 הסריקות.

5. קוונפיקציה של הצמדה-חלבון ספציפי אוביקווינציה

  1. כימות של תגי polyubiquitin מגוונות שברים subcellular שונים שנאספו מרקמת המוח מכרסם צריך להיעשות באמצעות מגוון של פרוטוקולים בלוק סטנדרטי מערבי בשילוב עם ייחודי, הצמדה ספציפי polyubiquitin נוגדנים.
    1. עבור הרפתקאות, לערבב את הדגימות מנורמל עם נפח שווה של מאגר לדוגמה Laemmli בתוספת עם β-mercaptoethanol לאחוז של 5% על ידי נפח, לכל הוראה של היצרן.
    2. לקוונפיקציה של כל השינויים הpolyubiquitination ושינויים מבלי להתחשב בהצמדה, השתמש בנוגדן פאן-אוביקוויב.
    3. כדי לזהות את כל polyubiquitinated חלבונים, השתמש בנוגדן אוביקוויב שאינו מגיב באמצעות משקפיים.
    4. עבור polyubiquitination ספציפי הצמדה, השתמש נוגדנים שיכולים לזהות ליזין-27, ליזין-48, ליזין-63 ו ליניארי (M1) polyubiquitination.
  2. כדי למנוע זיהום בין התפתחויות, אשר יכול לגרום חיובית שווא או להפריע הדמיה של שינוי אוביקוויב שונים, ממברנות הרצועה בין התפתחויות באמצעות 0.1 M NaOH עבור 10 דקות.
    1. לשטוף את הקרומים ב-TBS עם 0.1% יצירת רצף פעמיים עבור 10 דקות ולחסום מחדש (באמצעות כל סוכן חוסם הוא המועדף בפרוטוקול הכתם המערבי בשימוש).
    2. דגירה את הקרום עם הנוגדן המשני ולהתפתח מחדש כדי לאשר כי הקרום היה הסיר של נוגדנים הראשי והמשני כראוי.
    3. מומלץ: להתפתחות מוצלחת של נוגדנים אוביקוויב שונים ללא זיהום, השתמש פלורסנט או קרוב אינפרא אדום מערכות הדמיה. לעתים קרובות, זה יכול למנוע. הרבה מקרים בין נוגדנים
  3. כמה אוביקוויב מערבי למחוק תמונות תספק עמודות של להקות נפרדות (כגון M1) בעוד אחרים לייצר דפוס כמו כתם עם כמה קווים ברורים או לא (משותף עם K48). עבור כימות של התמונה בלוק מערבי, לצייר תיבת סביב הטור המשתרע את כל סולם התקנים המולקולריים.
    1. כוונן את התיבה למעלה (או למטה) אם הצביעת אוביקוויב מאריכה את הסולם כולו; זה נפוץ עבור ליזין-48 שינויים ומשתנה באופן נרחב על פני תאים subcellular.
    2. הפחת את הרקע, המחושב כדחיסות האופטית הממוצע של הרקע המקיף את העמודה בכל הצדדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות ההליך המתואר כאן, גרעיני, cytoplasmic ושברים סינפטית נאספו מן האמיגדלה לרוחב של המוח עכברוש (איור 1). טוהר השברים הבודדים אושרו באמצעות הכתמים המערביים, בודק עם נוגדנים נגד חלבונים שצריכים להיות מועשרים או מרוקנים את הליפוסט. בחצי הכדור הראשון שבו שבר סינפטית גולמי נאסף, דחיסות פוסט סינפטית חלבון 95 (PSD95) היה נוכח סינפטית, אבל לא גרעיני, שבר, עם רמות נמוכות יותר בציטופלסמה (איור 2A). זה עקבי עם העבודה הקודמת להפגין כי הכנת שבר סינפטיות מבודד הן רכיבים טרום סינפטיות ו postsynaptic25. לעומת זאת, החלבון הגרעיני היסטון H3 היה נוכח גרעיני, אבל לא סינפטית, שבר, עם רמות נמוכות יותר בציטופלסמה (איור 2b). הנוכחות של PSD95 ו H3 בציטופלסמה הוא עקבי עם תרגום cytoplasmic שלהם. חלבון cytoplasmic β-טובולין היה נוכח שבר cytoplasmic שלנו, אבל היה נעדר במידה רבה מן הגרעין הגרעיני (איור 2C), עם רמות נמוכות יותר באזור סינפטית. זה מרמז כי הצלחנו לייצר שבר גרעיני שהיה ברובו נעדר חלבונים cytoplasmic. הנוכחות של טובולין באזור סינפטית היא עקבית עם מחקרים קודמים26. כל שלושת השברים הראו רמות דומות של הדיור שמירה על חלבון β-actin (איור 2D), אשר שימש כבקרת טעינה. באופן קולקטיבי, תוצאות אלה לאשר את הטוהר של גרעיני, cytoplasmic שברים סינפטית שנאספו מתוך האמיגדלה אחת לרוחב החולדה.

לאחר מכן, כל lysates אושרו עבור פעילות פרוטאסדום פונקציונלי באמצעות הגירסה המתוארת שונה של הפעילות בתוך מחוץ לגופית 20 s בתוך מבחנה. בכל lysates, הצלחת הבדיקה הוגדרה כגידול ביחידות פלורסנט raw (RFU) זוהה מן הסריקה הראשונה (0 דקות) לסריקה החמישית/סופית (120 דקות). עבור כל הניתוחים האלה, 10 μM AMC שימש כסטנדרט הגבוה ביותר עבור נרמול יחידות פלורסנט raw (RFU). בשבריר סינפטית גסה, RFU לשיאה בסריקה 5 (איור 3A), וכתוצאה מכך rfu מנורמל של רק תחת 0.1 (איור 3a). בחלק cytoplasmic, RFU גדל על פני סריקות (איור 3C) עם rfu מנורמל הסופי של ~ 1.6 (איור 3c). השבר הגרעיני גם הציג שינויים תלויי זמן RFU (איור 3E), עם rfu מנורמל הסופי של 0.3 (איור 3e). ההבדלים בפעילות פרוטאסדום על פני התאים כנראה משקף את הזמינות של פרוטאסמס בשבר, אשר בדרך כלל הנפוץ ביותר בציטופלסמה וגרעין27, תאים אשר יש את הרמה הגבוהה ביותר של פעילות ב כנה. הרמה הנמוכה ביותר של פעילות באזור סינפטיות הוא עקבי עם זה להיות להיות היחיד שנאסף באמצעות חומרי ניקוי יוניים, אשר יכול להפחית את פעילות פרוטאסדום בשל המצב מעיק יותר. חשוב מכך, RFU לא להגדיל את הזמן בתוך שיטת הסרק או ב lysates (סינפטית) מודעם עם מאוד ספציפי וחזק מאוד מעכב מעכבי-lactacystin-β-lactone (איור 3G, β-lac), הצגת רמות rfu מנורמל הסופי של 0.01 ו 0.001, בהתאמה (איור 3H). זה מרמז כי השינוי שנצפה RFU היה בשל במיוחד פעילות של פרוטאסדום ולא הפרוטסים אחרים. יתר על כן, כאשר מנותח בתנאים ניסיוניים, היתה עלייה בגרעין, אך לא cytoplasmic, הפעילות פרוטאסדום ב אמיגדלה לרוחב לאחר למידה, אשר התרחשה בו עם ירידה בפעילות פרוטאסטיות סינפטית ב השוואה לבעלי חיים (איור 4). באופן קולקטיבי, תוצאות אלה מאשרים כי פעילות פרוטאסדום יכול להיות נמדד באופן מדויק בכל שלושת שברים subcellular שנאספו מתוך האמיגדלה אחת לרוחב החולדה.

אחד היתרונות של שיטת הפעילות הפרוטאסתית היא כי במניפולציות מחוץ לבית ניתן להציג את הדגימות מיד לפני תוספת של המצע פרוטאסאט, אשר מאפשר זיהוי של מולקולות ספציפיות אשר יכול לווסת את הפרוטאסדום ב שבר הסלולר המסוים הזה. כדוגמה לכך, את התפקיד של CaMKII (סידן/calmodulin התלוי חלבון קינאז II) הוערך בשבר סינפטית, את הקשים ביותר מאוד אסף, מאז CaMKII הוא חשב לווסת פרוטאסדום פונקציה ב הסינפסות. הדגירה של 30 דקות עם מעכב CaMKII myr-AIP (myristolayted אוטוקמד-2 פפטיד מעכבות הקשורות) הביא לעלייה פחתה משמעותית בפעילות פרוטאסדום על הטיפול, אשר הגיע רק רמות שהיו ~ 61% של מטופל שולטת (איור 5a). לעומת זאת, את אותו מניפולציה להחיל cytoplasmic לא התוצאה שינוי בפעילות פרוטאסדום מפני הרכב מטופלים בארות (איור 5B). תוצאות אלה מאשרים כי פעילות פרוטאסדום יכול להיות מניפולציות נוספת בתוך החוץ, כי מניפולציה זו יכולה להיות השפעות שונות בהתאם שבר הסלולר שנאסף.

בנוסף לפעילות פרוטסומאט, ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כדי למדוד הבדלים בין-תאיים בשינויים אוביקוויביים שונים באמצעות הליכי כתמי מערביות. חשוב לציין כי תגי אוביקוויב כי ניתן לזהות מוגבלים על ידי הזמינות של נוגדנים ספציפיים הצמדה, אשר כיום כוללים K48, K63 ו M1 עבור חולדות (הערה: נוגדן K27 זמין, אף לא לייצר תמונה לזיהוי בכל שבר האמיגדלה או תא שלם ליסביטים תחת מגוון של תנאים). Polyubiquitination הכולל, השפלה עצמאית ליניארי/M1 ו K63 אוביקווינציה ו-השפלה ספציפיים K48 אוביקווינציה זוהו בכל שברים subcellular. חשוב מכך, כאשר מנותח בתנאים ניסיוניים שונים, חלה עלייה באופן כללי (איור 6A), ליניארי (איור 6A), K63 (איור 6a) ו K48 (איור 6a) polyubiquitination באמיגדלה לרוחב שבר גרעיני לאחר למידה בהשוואה לבעלי חיים. באותו זמן, באזור cytoplasmic, הכולל polyubiquitination ירד ו K48 אוביקווינציה גדל לאחר למידה, בעוד הסינפטית K63 אוביקווינציה היה מופחת. באופן קולקטיבי, התוצאות הללו מצביעות על כך בתוך הבדלים באותו בעלי חיים באותו הקשר באמצעות הקשר הספציפי של חלבון אוביקווינציה ניתן לזהות במדויק.

Figure 1
איור 1 : סכימטי לשבר הסלולר של רקמת מוח חולדה. המוח מכרסם מופק, אזור המוח גזור האונות הפיצול. באמצעות סדרה של מאגרי ושלבים תפרידו, שברים גרעיניים cytoplasmic נאספים מאונה אחת בעוד שבר סינפטיות גולמי נאסף מהשני. שני השברים משמשים לאחר מכן עבור הפעילות פרוטאסאט ומוסר המערבי, כדי שיטת החלבון polyubiquitination רמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : אישור של סינפטיות גולמי, שבריר של הגרעין הגרעיני cytoplasmic. (A) חלבון סינפטיות בצפיפות הסינפטית של חלבון 95 (PSD95; 1:1000) היה נוכח סינפטיות, אבל לא שבר גרעיני עם רמות נמוכות יותר בציטופלסמה. (ב) Histone H3 (1:500) היה נוכח גרעיני, אבל לא סינפטית, שבר עם ביטוי נמוך בציטופלסמה. (ג) β-טובולין (1:1000) היה נוכח cytoplasmic, אבל נעדר במידה רבה מן הגרעין, שבר עם ביטוי נמוך יותר ליפוסט סינפטית. (ד) β חלבון משק הבית-actin (1:1000) היה נוכח בכל התאים subcellular. אזורים מציינים את הגודל הצפוי של חלבון היעד. דמות זו השתנתה מ Orsi, דרום אמריקה ואח '21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : הקוונפיקציה של פעילות פרוטאסדום ב גרעיני, cytoplasmic שברים סינפטית שנאספו האמיגדלה לרוחב של אותו בעל חיים. במהלך בדיקת הפעילות מחוץ לגופית, יחידות פלורסנט יחסית (RFU) זיהה גדל מההתחלה (סריקה 1) עד הסוף (סריקה 5) של השיטת הסינפטיות (א), Cytoplasmic (C) ו גרעיני (E) שברים. הכמת של שינוי זה מתוך הבסיס מציין ערך RFU מנורמל (ביחס ל-10 μM AMC) של 0.1 בסינפטיות (ב), 1.6 ב cytoplasmic (D) ו 0.3 בשברים גרעיניים (F) שברים. מניעת הβlac מונעת מ-RFUs לשנות את ההפעלה (G-H). דמות זו השתנתה מ Orsi, דרום אמריקה ואח '21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : הבדלים Subcellular בפעילות פרוטאסדום ב האמיגדלה לרוחב של אותו בעל חיים. גידול בפעילות פרוטאסדום גרעינית זוהה הכשרה (פחד ממוזג) בעלי חיים יחסית פקדים, אשר התכתב ירידה בפעילות בתוך השבר סינפטיות. פעילות פרוטטופלמיק הפרוטסטנטית נותרה בבסיס. *P < 0.05 מפקד. דמות זו השתנתה מ Orsi, דרום אמריקה ואח '21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : בטיפול חוץ גופית של פעילות פרוטסומאט בתוך שברים סינפטיות שנאספו ו cytoplasmic. בטיפול בלתי מתורבת של האיתות camkii דרך ה-aip המדכא מופחת פעילות פרוטאסדום ב סינפטיות (א), אבל לא cytoplasmic (ב), שבר מן האמיגדלה לרוחב החולדה. דמות זו שונתה מ Jarome, טי-ג'יי ואח '23. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6 : הבדלים Subcellular בחלבון ספציפי הצמדה אוביקווילינציה באמיגדלה לרוחב של אותה חיה בעקבות למידה. (א) היתה עלייה של אוביקווינציה הכללית בשבר גרעיני אחרי למידה, אשר מתואם עם ירידה בשבר cytoplasmic. (ב) היתה עלייה ב אוביקוויטיות לינארית ב גרעין, אך לא cytoplasmic או סינפטית, שבר לאחר למידה. (ג) היתה עלייה ב K63 אוביקווינציה בשבר גרעיני אחרי למידה, אשר מתואם עם ירידה בשבר סינפטיות. (ד) K48 אוביקווינציה גדל ב גרעיני cytoplasmic, אבל לא סינפטית, שבר לאחר למידה. *P < 0.05 מפקד. כל המתקבלים אוביקוויטים אופטיים מנורמטים לרמות β-actin (הנציגה הנמוכה ביותר של תמונות האבן המערבית ב-A), ששימש כבקרת טעינה. דמות זו השתנתה מ Orsi, דרום אמריקה ואח '21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו להדגים שיטה יעילה לכמת שינויים בפעילות אוביקוויב-פרוטאסאט באמצעות תאים שונים subcellular באותה חיה. כיום, רוב הנסיונות למדידת שינויי הסלולר בפעילות של מערכת אוביקוויב-פרוטאסביט הוגבלה לתא אחד לכל מדגם, והתוצאה היא צורך לחזור על ניסויים. זה מוביל לעלויות משמעותיות ולאובדן חיי בעלי חיים. הפרוטוקול שלנו מקל על בעיה זו על ידי פיצול האונות, המאפשר שברים סלולריים שונים לאסוף מכל האונה של אותה חיה. באמצעות פרוטוקול זה, היינו מסוגלים להראות בפעם הראשונה כי באותו בעל חיים אוביקוויב-פרוטסאין פעילות באופן מכריע שינויים גרעיניים, cytoplasmic ושברים סינפטית בתגובה ללמוד21.

המגבלה העיקרית של הפרוטוקול המתואר כאן היא שהיא תלויה בכמות רקמת המוח (המדגם) שהתקבל. לדוגמה, כמתואר לעיל, פרוטוקול זה דורש פיצול האונות של אזור מוחי נתון. אולם, זה לא תמיד אפשרי, כמו במקרה של אזורים מסוימים הנמצאים רק בחצי הכדור האחד. במקרים אלה, הפרוטוקול יכול להיות שונה על ידי הראשון הומוגניזציה באזור המוח כולו במאגר TEVP המשמש בשלב השבר סינפטית (סעיף 3.1), מאז מאגר זה הוא חופשי של כל סוכני הרפתקאות. לאחר מכן ניתן לפצל את המדגם לשני חלקים שווים בנפח. החלק הראשון ניתן להשתמש עבור השבר סינפטית, בעקבות הפרוטוקול כמתואר. עבור המחצית השנייה של המדגם, הניקוי הלא יונית NP-40 ניתן להוסיף לריכוז הסופי של 0.05%, ואחריו תפרידו כפי שמתואר בסעיף 2.6. זה יאפשר הפרדת חלבונים cytoplasmic לתוך החלבונים הסופר והגרעיני לתוך הגלולה, אשר יכול להיות מבודד יותר בעקבות השלבים הנותרים בסעיף 2. חשש נוסף בכמות הרקמה הוא שחלק מאזורי המוח קטנים מאוד, כמו הקליפה הלימבית. עם זאת, במקרים אלה, הפרוטוקול הנ ל עדיין ניתן להשתמש על ידי הפחתת הכרכים של המאגרים המשמשים, אשר צריך להיקבע באופן אמפירי על בסיס גודל של אזור המוח שנאסף. לפיכך, פרוטוקול זה ניתן לשנות גם את אזורי המוח קשה יותר שבו פחות רקמות זמין.

אחד היתרונות העיקריים של הפרוטוקול שאנו מתווה כאן הוא שהוא משתמש בציוד מעבדה משותף וריאגנטים שניתן למצוא ברוב המתקנים, המאפשר למתודולוגיה זו להיות amendable לאלה אפילו בתקציב מוגבל או עם משאבים מוגבלים. יתר על כן, בעוד אנו מתווה את הפרוטוקול הזה כדרך למדידת שינויים בתאי שינוי באיתות אוביקוויב-פרוטאסאט, מתודולוגיה זו יכולה גם להיות מוחלת על כל חלבון אחר או תהליך הסלולר שבו הבנת הלוקליזציה והפונקציה הסלולריים חשוב. לפיכך, פרוטוקול זה יכול להיות יישומים נרחבים כדי להבין את הפונקציות התת-תאית של חלבונים או מתחמים ספציפיים במהלך למידה וזיכרון או מצבי מחלה שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי כספי הפעלה מהמכללה למדעי החקלאות והחיים והמכללה למדעים ב-וירג טק. ט נתמכת על ידי תוכנית ג'ורג ' וושינגטון קארבר ב וירג טק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Fisher 15575020 Various other vendors
20S Proteasome Activity Kit Millipore Sigma APT280 Other vendors carry different versions
ATP Fisher FERR1441 Various other vendors
Beta-actin antibody Cell signaling 4967S Various other vendors
Beta-tubulin antibody Cell signaling 2128T Various other vendors
BioTek Synergy H1 plate reader BioTek VATECHH1MT3 Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanol Fisher ICN19024280 Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactone Millipore Sigma L7035 Various other vendors
Cryogenic cup Fisher 033377B Various other vendors
DMSO DMSO D8418 Varous other vendors
DTT Millipore Sigma D0632 Various other vendors
Glycerol Millipore Sigma G5516 Various other vendors
H3 antibody Abcam ab1791 Various other vendors
HEPES Millipore Sigma H3375 Various other vendors
Hydrochloric acid Fisher SA48 Various other vendors
IGEPAL (NP-40) Millipore Sigma I3021 Various other vendors
K48 Ubiquitin Antibody Abcam ab140601 Various other vendors
K63 Ubiquitin Antibody Abcam ab179434 Various other vendors
KCl Millipore Sigma P9541 Various other vendors
KONTES tissue grinder VWR KT885300-0002 Various other vendors
Laemmli sample buffer Bio-rad 161-0737 Various other vendors
Linear Ubiquitin Antibody Life Sensors AB-0130-0100 Only M1 antibody
MgCl Millipore Sigma 442611 Various other vendors
Microcentrifuge Eppendorf 2231000213 Various other manufacturers/models
myr-AIP Enzo Life Sciences BML-P212-0500 Carried by Millipore-Sigma
NaCl Millipore Sigma S3014 Various other vendors
Odyssey Fc Imaging System LiCor 2800-02 Other vendors carry different versions
Phosphatase Inhibitor Millipore Sigma 524625 Various other vendors
Precision Plus Protein Standard Bio-rad 161-0373 Various other vendors
Protease Inhibitor Millipore Sigma P8340 Various other vendors
PSD95 antibody Cell signaling 3450T Various other vendors
SDS Millipore Sigma L3771 Various other vendors
Sodium hydroxide Fisher SS255 Various other vendors
Sucrose Millipore Sigma S0389 Various other vendors
TBS Alfa Aesar J62938 Varous other vendors
Tris Millipore Sigma T1503 Various other vendors
Tween-20 Fisher BP337-100 Various other vendors
Ubiquitin Antibody Enzo Life Sciences BML-PW8810 Various other vendors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
  2. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
  3. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).
  4. Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).
  5. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).
  6. Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).
  7. Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).
  9. Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).
  10. Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
  11. Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).
  12. Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).
  13. Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).
  14. Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).
  15. Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).
  16. Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).
  17. Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).
  18. Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).
  19. Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
  20. Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
  21. Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
  22. Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).
  23. Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
  24. Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).
  25. Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).
  26. Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).
  27. Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).

Tags

מדעי המוח סוגיה 147 אוביקוויב פרוטאסדום גרעין סינפסה ציטופלסמה זיכרון היפוקמפוס אמיגדלה
בדיקת כימות משנית אוביקוויאין-פעילות פרוטאסדום במוח מכרסם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McFadden, T., Devulapalli, R. K.,… More

McFadden, T., Devulapalli, R. K., Jarome, T. J. Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59695, doi:10.3791/59695 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter