Summary
يصف هذا البروتوكول توليد الـ spheroids المشتقة من المريض، والتحليل في المراحل النهائية بما في ذلك القياس الكمي للانتشار، واختبار السمية الخلوية، وقياس التدفق الخلوي، وتلطيخ الفلورة المناعية والتصوير البؤري، من أجل تقييم الدواء إمكانات المرشحين كعلاجات مضادة للأورام. يدعم هذا البروتوكول الطب الدقيق مع تحديد أدوية محددة لكل مريض ومرحلة المرض.
Abstract
في هذا البروتوكول، نحدد الإجراء لتوليد الأورام في غضون 384 جيدا قطرات معلقة للسماح لفحص عالية الإنتاجية من العلاجات المضادة للسرطان في بيئة صغيرة تمثيلية من الناحية الفسيولوجية. نحن الخطوط العريضة لتشكيل المريض المستمدة من السرطان الخلايا الجذعية spheroids، فضلا عن، والتلاعب من هذه spheroids لتحليل شامل بعد العلاج من المخدرات. وعلى وجه التحديد، فإننا نصف جمع مورفولوجيا السفيرويد، والانتشار، والقدرة على البقاء، وسمية المخدرات، والنمط الظاهري للخلايا، وبيانات توطين الخلايا. يركز هذا البروتوكول بشكل كبير على تقنيات التحليل التي يتم تنفيذها بسهولة باستخدام منصة إسقاط معلقة 384 بئر، مما يجعلها مثالية لفحص المخدرات الإنتاجية العالية. في حين أننا نؤكد على أهمية هذا النموذج في دراسات سرطان المبيض وأبحاث الخلايا الجذعية السرطان، منصة 384 جيدا قابلة للبحث من أنواع السرطان الأخرى ونماذج المرض، وتوسيع فائدة المنصة إلى العديد من المجالات. من خلال تحسين سرعة فحص المخدرات الشخصية ونوعية نتائج الفحص من خلال تنفيذها بسهولة الثقافات 3D التمثيلية الفسيولوجية، ومن المتوقع أن تساعد هذه المنصة في تطوير علاجات جديدة والمريض محددة استراتيجيات العلاج، وبالتالي لها تأثير سريري واسع النطاق.
Introduction
بلغت الوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم 9.8مليون حالة وفاة في عام 2018 1، مما يبرز الحاجة إلى تطوير علاجات محسنة. ولسوء الحظ، فإن تكلفة تطوير أدوية السرطان آخذة في الازدياد، مع استحداث دواء واحد يكلف حوالي 650 مليون دولار أمريكي2 مما يشير إلى الحاجة إلى استراتيجيات محسنة لتطوير أدوية جديدة لمكافحة السرطان. الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs)، والتيتتميز بزيادة المقاومة الكيميائية 3، والقدرة على التجديد الذاتي، والقدرة على زرع أورام جديدة4 ويعتقد أن تكون مسؤولة عن تكرار الورم4،الانبثاث5،و المقاومة الكيميائية4،6، والتي تسهم جميعها في القدرة الخبيثة للورم وبالتالي ارتفاع عدد الوفيات. في سرطان المبيض ، يتم العثور على هذه الخلايا المخصب في السائل الاستسقاء الخبيث في تجويف البريكوني ، وهي حالة مرتبطة بضعف النتائج السريرية1. ونتيجة للقدرات الخبيثة لـ CSCs، كان هناك دافع لتطوير أدوية جديدة تستهدف CSC لاستخدامها بالاقتران مع العلاج الكيميائي التقليدي. وهناك العديد من التحديات التي تصاحب تطوير العقاقير التي تستهدف العقاقير التي تستهدف الـ CSC، بما في ذلك: (1) صعوبة توسيع نطاق مراكز الخدمات المجتمعية وصيانتها في المختبر؛ (2) صعوبة توسيع نطاق العقاقير الأساسية في المختبر؛ (2) عدم وجود أي تحديات في مجال التعاطي مع العقاقير الأساسية؛ (3) وضع وتنفيذ برامج لمكافحة العقاقير 2) ندرة عينات المرضى؛ 3) الأهمية الفسيولوجية للمنصة الثقافية؛ و4) عدم التجانس في حساسية المخدرات بين المرضى. يحدد هذا البروتوكول تنفيذ منصة ثقافة ثلاثية الجوانب عالية الإنتاجية يمكنها التغلب على كل من هذه التحديات. وعلى وجه الخصوص، يسمح هذا النظام بإجراء فحص سريع للأدوية باستخدام أعداد صغيرة من مراكز المباسيد اتّصال المبيضية المستمدة من المرضى، وهو قابل إلى حد كبير لتقنيات التحليل في المراحل النهائية. في حين مثالية لدراسة سرطان المبيض وCSCs، منصتنا هي أيضا قيمة في دراسة السرطانات الأخرى وأنواع الخلايا المتمايزة في البيئات المعقدة 3D.
نماذج 3-الأبعاد المعقدة (3D) حاسمة في دراسة البيئة الدقيقة الورم (TME)، وهو محراب 3D تتكون من الخلايا السرطانية، والخلايا الداعمة غير السرطانية، والبروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM)4. هذه البيئة ثلاثية الأبعاد تؤدي إلى مورفولوجيا الخلية الفريدة، وتفاعلات الخلايا ومصفوفة الخلايا، وتمايز الخلايا، وهجرةالخلايا، وكثافة الخلايا، وتدرجات الانتشار مقارنة بثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية في المختبر 4. كل هذه العوامل تتوج في الاستجابة التفاضلية للمخدرات داخل الثقافات 3D، مما يظهر زيادة مقاومة المخدرات والأهمية الفسيولوجية7،8. نظرا لدور TME 3D في CSC التمايز والمقاومة الكيميائية، فمن الحيوي لفحص CSC استهداف المخدرات في البيئات الدقيقة الفسيولوجية. تحسين الأهمية الفسيولوجية لمنصات فحص المخدرات CSC لديه القدرة على تحسين فحص المخدرات المريض محددة، وتطوير المخدرات، وصياغة استراتيجيات العلاج، والنتائج السريرية في نهاية المطاف. ومن المهم بنفس القدر أن تكون المنصة المستخدمة لفحص الأدوية عالية الإنتاجية ومتوافقة مع أساليب التحليل النهائية لتقليل التكلفة والوقت ووقت الترجمة السريرية للأدوية الواعدة9.
حاليا، يتم الحفاظ على TME المعقدة أفضل لتطبيقات فحص المخدرات من خلال في نماذج الجسم الحي مثل نماذج الورم الجينوجيني ة، والخلايا المستمدة من خط xenografts، ونموذج xenograft المستمدة من المريض (PDX)12، كما أنها توفر الفيزيولوجيا الظروف. ومع ذلك، فإن طبيعة الإنتاجية المنخفضة لهذه النماذج، فضلا عن التكلفة والوقت ومجموعات المهارات التقنية التي تتطلبها تحد من فائدتها في تطبيقات فحص المخدرات السريعة والعالية الإنتاجية13. كبدائل لهذه في نماذج الجسم الحي، العديد منالنماذج في المختبر 3D باستخدام هيدروجيلس 8، والثقافة داخل الأجهزة microfluidic أو 'الجهاز على رقاقة' الأجهزة10،14،والثقافات غير الملتصقة3،8 كما تم تطويرها، بسبب انخفاض حاجز الدخول من حيث التكلفة والوقت ومجموعة المهارات المطلوبة.
منصات ثقافة هيدروجيل مفيدة في السيطرة الدقيقة الممنوحة على تكوين المصفوفة، والخصائص الميكانيكية، وهيكل المصفوفة15؛ ومع ذلك، فإنها يمكن أن تمنع ثقافة الخلية عالية الكثافة14. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي حصاد الخلايا من المواد المائية إلى تعقيد التحليل في المصب، وذلك بسبب الآثار الضارة المحتملة لطرق الحصاد15. الأجهزة الميكروفلويدية، من ناحية أخرى، هي أجهزة صغيرة النطاق تسمح بالكشف عن الإخراج داخل نفس الجهاز ولثقافة الخلايا على نطاقات ذات صلة من الناحية الفسيولوجية مع الحد الأدنى من استهلاك الكواشف، وانخفاض وقت التفاعل، وتقليل النفايات، و انتشار سريع14. هذه الخصائص تجعلها منصات واعدة للتحقيق سمية المخدرات, فعالية, والدوائية. ومع ذلك، فإن تحديات ثقافة الخلايا ثلاثية الدفتقنية الفعالة والقابلة للقياس الكمي والقابلة للاستنساخ وسهلة الاستخدام، فضلاً عن أنظمة الضخ الضخمة والمكلفة قد قيدت تطبيقات السوائل الدقيقة في البحوث عالية الإنتاجية10. كما أن عمليات الكشف الفعالة والتنفيذ الصعب المحتمل في جميع المجالات قد أعاقت أيضاً اعتماد النظم الدقيقة السوائل على نطاق واسع10.
على العكس من ذلك، لا تتضمن الـ spheroids التي يتم إنشاؤها في ظروف غير مرتبطة في خلاطات دوارة (nutators)، ولوحات المرفقات منخفضة للغاية، وقطرات معلقة مكونات مصفوفة محددة من قبل المستخدم. هذه المنهجيات ذات الصلة خاصة لدراسة سرطان المبيض حيث أن الظروف غير الملتصقة تمثل الظروفالتي تنمو فيها النفيض داخل التجويف العبي 5. ضمن هذه الأساليب الثقافة غير الملتصقة، وقد ثبت أن nutator وشنقا المتدلية إسقاط spheroids لإظهار ضغط أعلى، وإعادة عرض، ومقاومة كيميائية بالمقارنة مع spheroids ولدت في لوحات المرفقات منخفضة جدا، مما يشير إلى زيادة الفسيولوجية الصلة16،17،18،19. بسبب زيادة القدرة على فحص عالية الإنتاجية من أحجام الآبار الصغيرة والحد الأدنى من أرقام الخلايا المطلوبة، توليد spheroid في لوحات قطرة معلقة هو منصة مثالية لفحص المخدرات. هنا، نقدم منصة فيزيولوجية ثلاثية المدة قابلة للضبط في لوحات إسقاط معلقة 384-well، والتي هي سهلة التنفيذ وقابلة للغاية لتحليل المصب، مما يجعلها مثالية لفحص المخدرات الإنتاجية العالية من سرطان المبيض والمبيض CS.
لدينا منصة فيزيولوجية 3D يوفر كل من مزايا الثقافة 3D، بما في ذلك الاتصالات الخلايا الفسيولوجية، والتدرجات انتشار، كثافات الخلايا، والبروتينات ECM المنتجة بشكل طبيعي، والتي قد تسهم في استجابات المخدرات واقعية16، 17،18،19. بالإضافة إلى ذلك، من خلال توليد هذه spheroids مع CS المستمدة من المريض، ونحن قادرون على تحديد استجابات المريض محددة للأدوية1 مع العديد من تكرار التقنية في وقت واحد، للتغلب على عدم التجانس التي يمكن العثور عليها داخل ورم المريض عينات20. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن الثقافة ثلاثية الجوانب تعزز الحفاظ على سكان CSC3و16، وبالتالي فهي تمثل السكان المخصب CSC في الاستسقاء7. هذا جنبا إلى جنب مع تحليل سهل المصب, بما في ذلك تحليل تدفق قياس السيتومترية من الجدوى ونسب CSC يسمح للتقييم الأمثل لCSC استهداف فعالية المخدرات. وأخيرا، هذه المنصة الفسيولوجية متوافقة مع التصوير في نقاط زمنية متعددة خلال التجربة، وتقييم موت الخلية وانتشارها، وتنظيم الخلايا ومورفولوجيا مع الكيمياء المناعية، والإشارات القابلة للذوبان مع ELISA على مشروط المتوسطة، والأنماط الظاهرية للخلايا مع قياس التدفق الخلوي، والتعبير الجيني بعد PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم جمع جميع عينات المرضى بموجب بروتوكول IRB المعتمدة من المرضى الراضين، الذين يتم إلغاء تحديد عيناتهم بعد إزالة الراسم ة الورم وجمع الاستسقاء.
1. جيل من Spheroids من أرقام الخلايا الصغيرة في لوحات إسقاط معلقة 384 جيدا
- ضع لوحة الإسقاط المعلقة في صوتة مليئة بالماء المعقمة منزوع ة الأيونات (DI) وsonicate لمدة 20 دقيقة.
- مع يد القفاز، وإزالة لوحة من sonicator وغسلها مع المياه DI الجارية.
- السماح لللوحة للجلوس في حمام من 0.1٪ حمض بترونيتش لمدة 24 ساعة لمنع امتصاص البروتين والتمسك spheroid إلى الآبار.
- إزالة لوحات مع اليد القفاز وشطف كلا الجانبين من لوحة مع تشغيل المياه DI جيدا.
- اضغط بقوة أو يهز لوحة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لإزالة المياه من الآبار في بيئة معقمة.
- ضع اللوحة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30-60 دقيقة على كل جانب لتعقيم الصفائح وتقليل التلوث.
ملاحظة: ويمكن أيضا أن تتعرض لوحة لغاز أكسيد الإيثيلين في غرفة للتعقيم. - املأ كل بئر من طبق 6 آبار مع 4-5 مل من ماء DI المعقمة الأوتوكلاف وشطيرة لوحة قطرة معلقة بين الغطاء والجزء السفلي من لوحة 6-جيدا. إضافة 800-1000 درجة مئوية من مياه DI المعقمة حول حافة لوحة الإسقاط المعلقة لتوفير بيئة رطبة ومستقرة ومعقمة لتقليل الحجم المفقود بسبب التبخر (الشكل1 ألف-C).
- للخلايا المزروعة 2D، يستنشق الخلايا المتوسطة تغطي في مرحلة سجل من النمو وغسل مع 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) لإزالة آثار المصل البقري الجنيني (FBS) في وسط النمو، كما أنه يعوق عمل التربسين.
- قم بإستنشق الـ PBS وأضف 1.5-2 مل من 0.25% تريبسين-إدتا إلى طبق زراعة الأنسجة 100 مم. حضانة الخلايا لمدة 5 دقائق في حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: قد تنفصل الخلايا بمعدلات مختلفة، لذلك يجب فحص الأطباق على مجهر خفيف على سطح المقعد لضمان انفصال الخلايا بعد 5 دقائق. - إضافة 6-8 مل من المتوسطة الخلوية التي تحتوي على FBS أو أي مصل إلى الطبق لتحييد التربسين، وجمع الخلايا مع أنبوب المصلية 10 مل، وإيداعها في أنبوب مخروطي 15 مل.
- عد الخلايا عن طريق تحميل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية على كل جانب من مقياس الهيموكيتومات واتبع بروتوكول العد المرتبطة بها.
- بالنسبة للخلايا المشتقة من المريض التي تم جمعها من الأورام الصلبة الأولية أو النقيلية أو من الاستسقاء التي لم يتم استزراعها 2D، قم بإعداد تعليق خلية واحدة في المصل المتوسط الحر (SFM) الموصوفة سابقا3.
- معالجة أنسجة الورم كما سبق وصفها وتخزين تعليق خلية واحدة لاستخدامها في وقت لاحق في تجميد المناسبة المتوسطة21،22.
- لأنسجة الورم الصلبة، وmince ميكانيكيا مع شفرة الحلاقة وتصفية الحل الناتج من خلال مرشح 40 درجة مئوية قبل عزل الخلايا المطلوبة من تدرج الكثافة21،22.
- بالنسبة لعينات الاستسقاء، تُركّز الخلايا حسب الطرد المركزي، وخلايا الدم الحمراء في المخزن المؤقت لكلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم (ACK)، وتُغسل في 1x PBS، ثم تمر عبر مرشح 40 ميكرومتر وإبرة 28 G 4 مرات22.
- لعزل CSCs المبيض، فرز الخلايا مع تدفق قياس الخلايا كما هو موضح أدناه بالتفصيل.
- يتم تجميد الخلايا المفردة المعزولة حديثًا للتخزين وذوبانها عند الحاجة للتجريب.
- لإعداد تعليق الخلية للطلاء، وحساب الحجم المطلوب من محلول الخلية المطلوبة للطلاء: 20 درجة مئوية لكل قطرة قطرة مجموعها = إجمالي حجم الحل اللازم.
- تخفيف تركيز الخلية إلى تركيز الخلية المطلوب لكل 20 ميكرولتر (أي 100 خلية في قطرة 20 ميكرولتر).
- خلط تعليق الخلية بلطف باستخدام pipet قبل الطلاء لضمان توزيع متجانس للخلايا وتحسين التوحيد بين قطرات.
ملاحظة: قد يؤدي الإفراط في تعليق الخلية إلى موت الخلية والحطام في المتدلية قطرة spheroids. - وضع غيض من الماصة في البئر في زاوية من حوالي 45 درجة وpipet 20 درجة مئوية من محلول الخلية في كل قطرة معلقة جيدا.
ملاحظة: يمكن تعديل أنماط الطلاء اعتمادا على عدد من spheroids اللازمة. الطلاء spheroids في كل بئر أخرى أكثر أمانا عندما لا تكون هناك حاجة إلى كميات كبيرة من spheroids في تجربة، لأنه يمنع دمج عرضي من قطرات (الشكل1D، E). إذا كانت هناك حاجة إلى كميات كبيرة من spheroids لتجربة، لوحة كل بئر ترك صف واحد من الآبار الحدودية على جميع الجوانب (الشكل1F). - ضع غطاء اللوحة ذات الـ 6 آبار مرة أخرى فوق لوحة الإسقاط المعلقة واستخدم شريط اللدائن الحرارية التمدد غير الحساس لفقدان الرطوبة، لختم الحواف ومنع التبخر الإضافي للقطرات. حضانة في معيار CO2 حاضنة ترطيب (5٪ CO2،37 درجة مئوية).
- قطرات الأعلاف المعلقة مرة واحدة كل 2-3 أيام لتجديد وسط زراعة الخلايا للمغذيات الضرورية عن طريق إضافة 2-3 ميكرولتر إلى كل spheroid تحتوي على ما يرام.
ملاحظة: بعد التصوير، ينصح دائما لتغذية قطرات معلقة، كما التعرض للهواء أثناء التصوير يؤدي إلى التبخر.
2. إضافة خلية الثقافة المتوسطة إلى شنقا إسقاط لوحات Spheroid
- قم بإزالة الشريط والغطاء بالحرارة داخل خزانة السلامة البيولوجية وأضف 2-3 ميكرولتر من وسط الثقافة المناسبة إلى كل بئر تحتوي على قطرة معلقة.
ملاحظة: يعتمد الحجم المضاف على حجم الانخفاض ومقدار الوقت بين التغذية. - بعد التغذية، تغطية لوحة مع الغطاء العلوي وتطبيق قطاع بالحرارة الطازجة على الحواف الخارجية قبل وضع لوحة مرة أخرى في الحاضنة.
3. مرحلة التصوير التباين من مورفولوجيا Spheroid
- إزالة الشريط بالحرارة من حول حواف لوحة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
- قم بإزالة لوحة الإسقاط المعلقة 384 بئرًا بعناية من خزانة السلامة الحيوية مع الغطاء الذي لا يزال في مكانه وضعه في صينية المجهر في مجهر الفلورسنت.
- استخدم خيار التصوير الحي في برنامج التصوير بمعدل 4x أو 10x أو 20x لمراقبة السقطات المعلقة والتقاط الصور المطلوبة.
- بعد حفظ الصور، خذ اللوحة مرة أخرى إلى خزانة السلامة البيولوجية وخلايا التغذية كما هو موضح أعلاه.
- أعد ختم اللوحة بشريط بالحرارة الطازج وضع اللوحة المختومة مرة أخرى في الحاضنة.
4 - التحديد الكمي للانتشار والقدرة على البقاء داخل الـ Spheroids
- لوحة spheroids في عدد كاف من الآبار للحصول على > 10 تكرار التقنية لكل نقطة زمنية (أي اليوم 1 واليوم 7) التي سيتم فحصها.
ملاحظة: الآبار التي تستخدم لهذا القول عموما لا تستخدم مرة أخرى بسبب الملوثات المحتملة من صبغ ريسازورين. - إضافة 2 ميكرولتر من الحل القائم على ريسازورين المصفاة إلى الآبار المخصصة لتحليل الانتشار كما لو تغذية تلك الآبار وحضانة لفترة حضانة محددة مسبقا.
ملاحظة: يمكن أن يختلف وقت الحضانة هذا استنادًا إلى نوع الخلية وعدد الخلايا في الspheroid. وينصح بتحديد وقت الحضانة المطلوب قبل بدء تجارب الانتشار عن طريق بدء القياسات بعد 1 ساعة الحضانة ومن ثم إعادة قياس كل 30 دقيقة حتى قراءة إشارة في هضبة آبار التحكم. يمكن أن تؤخذ قراءات الفحص عدة مرات كما هو مطلوب. الحضانة عادة 4 ساعة للspheroids بدأت مع 100 الخلايا السرطانية. - تشغيل قارئ لوحة صغيرة تليها أولا ً البرامج قارئ لوحة المرتبطة على الأقل 15 دقيقة قبل القراءة الأولى للسماح للآلة الاحماء وتأمين درجة الحرارة الداخلية في 22 درجة مئوية كما يمكن أن تؤثر درجة الحرارة على القراءات.
- فتح بروتوكول لوحة 384 جيدا مجموعة مع 530/25 نانومتر الإثارة و 590/35 نانومتر الموجات الموجية الانبعاثات مع البصريات تعيين إلى أسفل، كسب تعيين إلى 35، قراءة السرعة تعيين إلى عادي،وقراءة نوع تعيين إلى الفلورة .
- بعد فترة الحضانة، افتح شطيرة الإسقاط المعلقة في خزانة السلامة البيولوجية وأحضر لوحة 384 بئر مع غطاء لا يزال في مكان لقارئ لوحة.
- ضع لوحة 384-well مع الغطاء لا يزال في مكان في علبة قارئ لوحة، والتي سيتم تمديدها بمجرد تسخين الجهاز وانقر فوق موافق لقراءة لوحة.
- العودة لوحة جيدا إلى قاعدة 6-جيدا ووضعها في الحاضنة. إذا تمت قراءة جميع نقاط الوقت لهذا اليوم، أعد ختم اللوحة قبل وضعها مرة أخرى في الحاضنة.
- حفظ التجربة في الإطار المنبثق ثم انقر فوق نعم عند المطالبة هل تريد تنفيذ PowerExports للوحة 1 لإخراج البيانات من برنامج قارئ لوحة في جدول بيانات للمؤسسة.
- متوسط قيم الفلورة لكل حالة وتطبيع حسب متوسط شرط التحكم للإبلاغ عن تغير أضعاف في الانتشار في مختلف الظروف التجريبية.
- عند مقارنة اليوم 1 إلى اليوم 7، تطبيع عن طريق تقسيم على متوسط الفلورة اليوم 1 للحصول على تغيير أضعاف في الانتشار مع مرور الوقت.
- حساب أشرطة الخطأ باستخدام خطأ قياسي من المتوسط وتحديد الأهمية الإحصائية بين المجموعات التجريبية مع اختبار إحصائي مناسب، مثل اختبار T ذي ذيلين الطالب.
5- تقييم سمية المخدرات في السفيرويدات
-
إدارة المخدرات
- في أي وقت بعد تشكيل spheroid، تسليم المخدرات المخففة إلى التركيز المطلوب بحيث جرعة 2 ميكرولتر يحتوي على 10X تركيز الدواء النهائي المطلوب.
ملاحظة: هذا هو افتراض تبخر 2 ميكرولتر من قطرات بحيث نهاية حجم العلاج بعد المخدرات هو 20 درجة مئوية. على سبيل المثال، جرعة 50 ميكرومتر من سيسبلاتين سيكون لها حل معد من 500 درجة مئوية. إذا كانت قطرات تحتوي على أكثر من 20 درجة مئوية، ينبغي تعديل تركيز المخدرات و / أو الحجم المضافة وفقا لذلك. - علاج عينات التحكم مع 2 ميكرولتر من خلية الثقافة المتوسطة.
ملاحظة: سيسبلاتين هو solubilized في الماء. لذلك، الضوابط هي 2 μL من خلية الثقافة المتوسطة; ومع ذلك، إذا كانت مركبة المخدرات مذيب مختلف (على سبيل المثال، DMSO)، ثم الضوابط ينبغي أن تكون الخلية المتوسطة الثقافة مع تركيز متساو من DMSO كما هو مستخدم في العلاج من المخدرات. - مواصلة رصد المخدرات المعالجة وspheroids السيطرة طوال فترة حضانة المخدرات مع المرحلة المجهرية أن يكون لها سجل مرئي من تأثير سمية المخدرات وكذلك مع صبغ ريسازورين كما هو موضح أعلاه لرصد الجدوى الخلوية.
ملاحظة: عادة، يتم إضافة الأدوية بعد 5-7 أيام في قطرات معلقة والسمية تقاس بعد 48-72 هس ولكن هذا يمكن أن تختلف اعتمادا على التجربة. يمكن إضافة الأدوية بمجرد أن تتشكل السفيرويدات المستقرة، عادة ما تتراوح بين 1-4 أيام.
- في أي وقت بعد تشكيل spheroid، تسليم المخدرات المخففة إلى التركيز المطلوب بحيث جرعة 2 ميكرولتر يحتوي على 10X تركيز الدواء النهائي المطلوب.
-
كمية سمية المخدرات عن طريق عد الخلايا
- في نقطة نهاية الوقت من العلاج من المخدرات، وجمع 10 spheroids كل من السيطرة والمخدرات المعالجة الآبار باستخدام 1000 ميكرولتر pipet وإيداع كل مجموعة من spheroids في أنبوب الطرد المركزي الصغير الخاصة بها.
- كسر spheroids إلى خلايا واحدة عن طريق الأنابيب المتكررة.
ملاحظة: للحد من تلف الخلايا المحتملة بسبب تكرار الأنابيب، يمكن إجراء الهضم الأنزيمي مع إنزيم مثل التربسين لتسهيل توليد حلول خلية واحدة قبل الأنابيب23. التقليل من موت الخلايا بسبب الأنابيب سوف تعتمد على نوع الخلية وينبغي أن يكون الأمثل وفقا لذلك. إذا كنت تشعر بالقلق بشأن الوفاة بسبب التصنيف، راجع التحليل مع صبغ ة ريسازورين وتسرب السمية الخلوية للأساليب البديلة التي لا تتطلب تصنيف السفيرويد. - طرد مركزي الأنابيب لمدة 5 دقائق في 400 × ز لجمع الخلايا في الجزء السفلي من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة واستنشاق supernatant.
- إضافة 20 درجة مئوية من وسائل الإعلام الطازجة أو 1X PBS إلى كل أنبوب ومزيج جيدا.
- أضف التريبان الأزرق بنسبة 2 ميكرولتر من بقعة تريبان الزرقاء إلى 20 درجة مئوية من تعليق الخلايا.
- تحميل 10 ميكرولتر من الخلايا وتعليق الأزرق تريبان في كل غرفة من مقياس الهيموكيتوميومتر وخلايا العد تحت المجهر الخفيف، مع الخلايا الملونة الزرقاء التي تمثل الخلايا الميتة والخلايا غير الملطخة التي تمثل الخلايا الحية.
- الخلية الحية % = (عدد الخلايا الحية - العدد الإجمالي للخلايا) × 100.
6. توصيف السفيرويد مع التقنيات النسيجية
ملاحظة: هناك خياران العفن 3D المطبوعة في البوليمر متوافق ة بيولوجيا لتكرار قوالب صفيف spheroid التي أدلى بها إيفانوف وآخرون24: 1) 20 قالب جيدا التي يمكن أن تعقد 28 ميكرولتر لكل بئر و 2) 63 قالب جيدا التي يمكن أن تعقد 9 ميكرولتر لكل بئر (الشكل2D).
- تعقيم العفن الأنسجة وحدودها عن طريق مسح لهم أسفل مع الإيثانول 70٪ وإرفاق الحدود بحزم حول القالب ووضع القالب تستقيم. كلا القوالب تناسب ما يقرب من 3 مل من السوائل (3.203 مل لمجموعة 20 spheroid و 3.196 مل لمجموعة 63 spheroid).
- معطف طفيفة مجموعة spheroid مع 10،000 cSt Si النفط باستخدام مسحة القطن وأشار لتسهيل إزالة هلام معالجة عينة يلقي في الخطوات اللاحقة.
- قم بتسخين جل معالجة العينات حتى يتم تسييله عن طريق الميكروويف لمدة 10-20 s مع تخفيف الغطاء.
- إضافة بين 2.6 و 2.8 مل من هلام المعالجة المنصهرة في القالب حتى مستوى تقريبا مع الجزء العلوي من الحدود.
- في بضع دقائق، مرة واحدة توطدت، وإزالة هلام المعالجة يلقي عن طريق فصل الحدود من القالب ومن ثم عكس قالب مجموعة.
- إدراج طرف ملاقط بين العفن والحدود لفصلها بعناية ومن ثم استخدام مكشطة الخلية للمساعدة في إخراج المدلى بها من القالب إذا كان لا فصل على الفور.
- حصاد spheroids من لوحة قطرة شنقا عن طريق الأنابيب محتويات بئر واحد على طبق بيتري خلية 100 أو 150 ملم مع pipet 1000 درجة مئوية، وعزل spheroid بصريا.
- Pipet 5 μL من محتويات البئر بما في ذلك spheroid المحدد في واحدة من الآبار صفيف، حتى يتم تعبئة الصفيف.
- انتظر 3 دقائق للتأكد من أن الـ spheroids قد استقرت في الجزء السفلي من الصفيف قبل أن تضخ بلطف جل المعالجة المنصهر في كل من الآبار مع الحرص على عدم إزعاج الـ spheroids.
- إضافة هلام معالجة إضافية إلى مستوى قبالة الجزء العلوي من الصفيف وتبريد مرة واحدة، ووضع مجموعة spheroid مترسخ ة في كاسيت المسمى للمعالجة.
- قم بغمر الكاسيت المسمى في 4% من الكالفين بين عشية وضحاها لإصلاح الـ spheroids عند درجة حرارة 4 درجة مئوية ثم تخزينه في 70% إيثانول عند درجة حرارة 4 درجة مئوية حتى يصبح جاهزاً للمعالجة.
- معالجة مع معيار 1 ح برنامج البارافين ومن ثم تضمين صفائف spheroid بحيث صفائف معالجتها تواجه تستقيم مع الجزء السفلي من الآبار الأقرب إلى وجه كتلة.
- تأكد من أن صفائف جزءا لا يتجزأ من شقة قدر الإمكان، مع تدفق الوجه السفلي مع الجزء السفلي من كتلة ووضع كتل على الجليد.
- قم بتحميل الكتلة على الميكروتومي واضبط الكتلة بحيث تكون الشفرة موازية للوجه المحمل.
- قص صفيف (عمق العينة = 15 درجة مئوية) حتى يتم الوصول إلى الجزء السفلي من آبار الصفيف للتأكد من أن الآبار الدائرية مرئية على عينات القطع.
- التبديل إلى عمق عينة 5 ميكرومتر والاستمرار في شريحة وجمع شرائط. تحقق تحت المجهر كل شرائح قليلة لتحديد ما إذا كان قد تم التوصل إلى عمق spheroid. بمجرد الوصول إلى spheroids جمع كل شريحة اللاحقة حتى spheroids لم تعد مرئية.
- وصمة عار كل شريحة مع معيار H & E البروتوكول.
7. يعيش الميت السمية الخلوية السمية
- إلى كل قطرة معلقة، إضافة صبغة الخلية الحية، calcein-AM إلى التركيز النهائي من 2 μM، وصبغة الخلية الميتة، ethidium homodimer-1 إلى التركيز النهائي من 4 μM، مع الأخذ في الاعتبار أن حجم الانخفاض هو 20 ميكرولتر.
ملاحظة: حاول الاحتفاظ بوحدات التخزين المضافة إلى الحد الأدنى، وعادة ما تضيف 2 ميكرولتر من الأصباغ مجتمعة. - ضع لوحات مرة أخرى في حاضنة تقع في لوحة 6 جيدا مع غطاء واحتضان spheroids لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: اعتمادا على حجم spheroids، هذا الوقت الحضانة يختلف اختلافا كبيرا. على سبيل المثال، تتطلب السفيرويدات التي تقل عن 400 ميكرومتر فقط 30-45 دقيقة فقط من وقت الحضانة، في حين أن السفيرويدات الأكبر الأقرب إلى 800 ميكرومتر قد تطلبت ما يصل إلى 90 دقيقة من وقت الحضانة. يجب تحسين أوقات الحضانة لتجربة الفرد. - للتصوير اللاحق، حصاد spheroids مع 1000 ميكرولتر pipet في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وإيداع كل spheroid على الشرائح المجهر الزجاج تنظيفها مسبقا.
- صورة النفاية من خلال الزجاج، على مجهر مقلوب.
ملاحظة: اعتمادا على قرب المجهر البؤري إلى المختبر الذي يتم حصاد spheroids، يمكن إما أن يتم تصوير spheroids في قطرات الأصلي من المتوسطة وضعت على الشريحة أو مغلفة في 2٪ agarose إذا كان هناك حاجة إلى مزيد من الاستقرار لنقل spheroid. - باستخدام وضع الاكتساب متعدد الأبعاد في برنامج المجهر، حدد موقع spheroid باستخدام إضاءة DIC في التكبير 10x ثم مسح z-المستوى لتحديد المرتفعات التي تشمل spheroid.
- انقر على سلسلة Z وتعيين الحد العلوي والسفلي من z-المسح الضوئي أعلى قليلا من الجزء العلوي من spheroid وأقل قليلا من الجزء السفلي من spheroid.
- تثير spheroids في 488 نانومتر للكالسين-AM (الخلايا الحية؛ الأخضر) و 561 نانومتر للميثيديوم homodimer-1 (الخلايا الميتة؛ الأحمر) مع حجم الخطوة الموصى بها من قبل البرنامج، ومكاسب قصوى والحد الأدنى من التعرض لكل لون.
- انقر فوق اكتساب للحصول على صورة مركبة z-المكدس من الخلايا الحية والميتة داخل spheroid.
- تحديد النسب المباشرة/الميتة باستخدام برامج معالجة الصور لتحديد نسبة مئوية من كثافة البكسل من القناة المقابلة للخلايا الحية مقابل النسبة المئوية لشدة البكسل من القناة المقابلة للخلايا الميتة من المركب صور z-projection.
ملاحظة: بسبب القيود في تحديد كمية هيكل 3D مع إسقاط 2D، طريقة بديلة لتحديد كمية الحية مقابل الفلورة الميتة، داخل لوحات إسقاط معلقة هو استخدام قارئ لوحة بعد البروتوكول المدرجة مع calcein-AM وethidium homodimer-1 عدة.
8- الفلورة المناعية
- تسخين محلول أغروس منخفض الذوبان 2٪، وبالتالي فإن الحل لزج وفوق نقطة الانصهار ومكان على شريحة المجهر لخلق سرير لينة من أغاروز
- حصاد spheroids عن طريق دفع 20 درجة مئوية من PBS من خلال قطرة على السرير لينة من 2٪ أغاروز.
ملاحظة: وينبغي أن يتم ذلك بسرعة بحيث لا تترسخ أغاروز قبل أن يتم تضمين spheroids. - مرة واحدة في أجاروز يبرد والمواد الهلامية مع spheroid حصادها المحاصرين داخل (أقل من 5 دقائق)، إضافة 4٪ محايدة المخزنة الرسمية لإصلاح spheroids. بدلا من ذلك، إضافة الميثانول الباردة الجليد، وإصلاح spheroids الأجاروز جزءا لا يتجزأ من في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- غسل 3X لمدة 5 دقائق كل مع 1X PBS، وتجاهل PBS بعد كل غسل.
- كتلة لمدة 1 ساعة في RT مع 10٪ المصل (أي، مصل الحصان) و 0.15٪ محلول الصابون (تريتون X-100) في 1X PBS.
- غسل 3X لمدة 5 دقائق كل مع 1X PBS، وتجاهل PBS بعد كل غسل.
- تلطيخ spheroids مع الأجسام المضادة الفلورسنت المطلوب في تخفيف الأجسام المضادة الموصى بها أو المحددة مسبقا (أي، الفلورسنت المسمى phalloidin في تخفيف 1:100)، وحضانة لمدة 90 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة، مغطاة من الضوء.
ملاحظة: سوف تختلف البروتوكولات اعتمادا على الأجسام المضادة والهدف والتخفيف الأجسام المضادة قد تحتاج إلى تحسين اعتمادا على التجربة. - تصور spheroids ملطخة الفلورسنت مع المجهر البؤري المقلوب باستخدام الأساليب المبينة في القسم السابق لتصوير spheroids.
- سوف تظهر الصور المركبة z-كومة مورفولوجيا 3D في spheroids.
9. جمع وتحليل مجموعات الخلايا الجذعية السرطان مع قياس التدفق الخلوي
- إعداد الـ spheroids لتحليل قياس التدفق
- جمع spheroids من كل بئر في لوحات إسقاط شنقا باستخدام pipet 1000 درجة مئوية وإيداعها في أنبوب الطرد المركزي 15 مل للتصنيف مع الأنابيب المتكررة.
- عد الخلايا القابلة للحياة على مقياس الهيموكيتومية باستخدام تريبان الأزرق لتحديد رقم الخلية والتركيز على النحو المبين أعلاه.
- تعليق خلية Aliquot في خمسة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بحيث يحتوي كل منها على ما لا يقل عن 50،000 خلية.
- الطرد المركزي جميع الأنابيب في 400 × ز لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي صغير.
- يستنشق supernatant من كل أنبوب وإعادة تعليق الكريات في 100 درجة مئوية من العازلة.
- أنابيب التسمية "غير ملطخة"، "DAPI"، "APC-ISO"، "DEAB"، و "ALDH/CD133"، على التوالي.
- إضافة 0.5 درجة مئوية من الأجسام المضادة APC-isotype إلى أنبوب APC-ISO و 1 μL من الأجسام المضادة CD133 إلى أنبوب ALDH/CD133 كما هو محدد من قبل تخفيف المسلسل وتوصية الشركات المصنعة.
- إضافة 5 ميكرولتر من كاشف DEAB و 0.5 ميكرولتر من ALDH إلى أنبوب DEAB، و1 ميكرولتر من ALDH إلى أنبوب ALDH/CD133.
- دوامة جميع الأنابيب لحوالي 2 ق وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
- دوامة جميع الأنابيب مرة أخرى والطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي دقيق.
- تسمية FACS أنابيب "غير ملطخة"، "DAPI"، "APC-ISO"، "DEAB"، و "ALDH/CD133" وملء حاوية رغوة معزولة لوضعها جانبا.
- استنشق supernatant وإعادة تعليق السيطرة "غير ملطخة" في 400 μL FACS العازلة (1X PBS مع 2٪ FBS) وجميع الأنابيب الأخرى في 400 ميكرولتر من FACS DAPI العازلة (FACS العازلة مع 300 μM 4', 6-diamidino-2-phenylindole).
- وضع أنابيب في حاوية مع الجليد حتى تحليلها على مقياس التدفق.
ملاحظة: لفرز الخلايا الجذعية سرطان المبيض، وجمع جميع الخلايا التي يقيس مقياس الخلايا لتكون ALDH + و CD133 + مع بوابات تعيين لتشمل 0.5٪ إشارة APC غير محددة و 0.15٪ غير محددة ALDH + إشارة. يحتاج ما لا يقل عن 10,000 خلية إلى تحليل للحصول على نتائج موثوقة. ويمكن الاطلاع على تفاصيل إضافية في المنشورات الأخيرة3و17.
- تحليل السكان ALDH +/CD133+ في FlowJo
- انقر نقراً مزدوجاً فوق رمز FlowJo لفتح البرنامج وسحب ملفات .fcs التي تم الحصول عليها من برنامج قياس التدفق إلى مساحة العمل.
- انقر نقراً مزدوجاً فوق الملف غير ملطخ وتعيين محور ص إلى جانب ارتفاع مبعثر (SSC-H) والمحور س إلى ارتفاع مبعثر إلى الأمام (FSC-H).
- انقر فوق الزر T بجوار كل محور لضبط المقياس والتحول لزيادة الفصل بين مجموعات الخلايا المختلفة إلى أقصى حد.
- انقر على زر المضلع gating ورسم بوابة مضلع حول السكان الخلية وتسمية السكان 'الخلايا'.
- انقر نقراً مزدوجاً فوق مجموعة الخلايا في مساحة العمل لعرض الخلايا فقط ضمن مجموعة "الخلايا" ثم انقر على محور FSC لتغيير قناة المحور إلى عرض FSC ثم انقر فوق محور SSC وتغيير قناة المحور إلى FSC-H.
- اختر أداة بوابة مستطيل ورسم مستطيل حول السكان الأكثر كثافة من الخلايا التي تغطي كامل المحور ص لاستبعاد doublets المحتملة نحو يمين النافذة وتسمية هذه البوابة 'خلايا واحدة'.
- انقر بزر الماوس الأيمن وانسخ الخلايا وبوابة الخلايا المفردة المتداخلة والصقها تحت كل عينة في مساحة العمل.
- انقر نقراً مزدوجاً فوق بوابة الخلايا المفردة المتداخلة تحت نموذج DAPI في مساحة العمل لعرض مجموعة الخلايا المفردة من أنبوب العينة هذا وانقر على محور FSC وتغيير قناة المحور إلى قناة DAPI - المنطقة.
- انقر على محور SSC وتغيير قناة المحور إلى الرسم البياني.
ملاحظة: ستكون الخلايا الحية نحو اليسار كما أنها تستبعد DAPI، بينما الخلايا الميتة سوف تأخذ في DAPI وتظهر نحو يمين الرسم البياني. - انقر على الزر T بجوار محور DAPI وانقر على تخصيص المحور لضبط المقياس لتحقيق أقصى قدر من الفصل بين DAPI القمم الإيجابية وDAPI السلبية.
ملاحظة: سوف تظهر نافذة مع خيارات التحجيم. في كثير من الأحيان، فإن تعيين حقل المقياس إلى Biex وضبط العقود السلبية الإضافية وأساس العرض سوف تسفر عن أكبر فصل. - انقر فوق تطبيق في النافذة المنبثقة لتطبيق تغييرات التحجيم، واختيار زر بوابة النطاق، وتوزيعه على الذروة السلبية DAPI، المقابلة لتجمعات الخلايا الحية.
- تسمية هذه البوابة 'الخلايا الحية' وانقر بزر الماوس الأيمن لنسخ بوابة 'الخلايا الحية' للصقه تحت بوابة 'خلايا واحدة' تحت أنابيب 'APC-ISO، 'DEAB'، و 'ALDH/CD133' لتحديد نفس الجزء من الخلايا الحية في كل أنبوب عينة.
- ثم انقر نقراً مزدوجاً فوق مجموعة الخلايا الحية المتداخلة تحت ملف نموذج APC-ISO والتبديل محور س إلى ALDH — قناة المنطقة والمحور ص إلى APC — قناة المنطقة.
- مرة أخرى، ضبط مقياس المحور عن طريق النقر على زر T وتخصيص محور كل محور بحيث يتم ترجمة الأحداث في المنطقة اليسرى السفلى من المؤامرة وحدد الخيار بوابة رباعية وانقر فوق نافذة المؤامرة لإنشاء بوابة رباعية .
- ضبط تقاطع البوابة بحيث ما يقرب من 0.5٪ من السكان تقع في الجزء العلوي الأيسر من نافذة المؤامرة أو 'APC إيجابية' الربع.
ملاحظة: هذا 0.5٪ يمثل تلطيخ غير محددة من isotype APC. - انقر بزر الماوس الأيمن فوق كل تسمية ربع ية بشكل فردي في مساحة العمل ثم أعد تسميتها بشكل مناسب. التحكم أو الأمر انقر فوق كل تسمية بوابة ربع ية في مساحة العمل ونسخها.
ملاحظة: 'Q1' يمثل خلايا CD133+; 'Q2' يمثل CD133+ و ALDH +' الخلايا; 'Q3' يمثل خلايا ALDH +; و'Q4' يمثل CD133- وALDH- الخلايا. - لصق البوابات الرباعية على السكان الخلايا الحية المتداخلة ضمن ملف 'DEAB'. ضبط الخط العمودي بحيث ما يقرب من 0.15٪ من سكان الخلية تقع داخل الربع 'ALDH +' مع الحرص على عدم تحريك الخط الأفقي.
ملاحظة: هذا 0.15٪ يمثل إشارة ALDH غير محددة.- للتأكد من أن الخط الأفقي لم يغير الموضع، انسخ البوابات الرباعية الجديدة المتداخلة تحت ملف DEAB والصقها على الخلايا الحية ضمن ملف Iso APC. حدد نعم عند مطالبتك باستبدال بوابة الربع الموجودة.
- تحقق في مساحة العمل من أن النسبة المئوية 'CD133+' لا يزال تقريباً 0.5 ضمن الملف 'APC-iso'.
- نسخ ولصق البوابات الرباعية إلى مجموعة ملفات 'ALDH/CD133' 'الخلايا الحية'.
ملاحظة: وستكون النسبة المئوية لتجمعات الخلايا القابلة للحياة الموجودة في الربع الأيمن العلوي هي النسبة المئوية لـ ALDH+ وCD133+
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن تشكيل Spheroids شكلت مع خطوط الخلايا أو CSCs المستمدة من المريض مع مجموعة من أرقام الخلايا الصغيرة داخل قطرات معلقة (الشكل2A). تتشكل الـ Spheroids بشكل موثوق مع عدد قليل يصل إلى 10 خلايا لكل بئر، مما يسمح بالحفاظ على عينات المريض النادرة. وتحيط الخلايا داخل هذه spheroids من قبل خلايا أخرى في 3 أبعاد كما أنها ستكون في الجسم الحي، مما يسمح لاتصالات الخلايا الخلوية الفسيولوجية ومعدلات الانتشار. تنتشر الخلايا السرطانية داخل الـ spheroids مما يتسبب في توسع الـ spheroids في الحجم مع مرور الوقت (الشكل2B). ومع نمو خلايا المرضى أو خطوط الخلايا الأكثر عدوانية بشكل أسرع من نظيراتها، من المهم تحديد قدرة انتشار كل عينة على الانتشار ودراسة كيفية تأثير العلاج الدوائي على انتشار كل عينة. للقيام بذلك، يمكن إجراء اختبار النشاط الأيضي، مثل فحص الفلورة القائم على ريسازورين، بسهولة مع منصة فيزيولوجية 384-well، دون أي شرط لحصاد spheroids، ويمكن رؤية نتائجها في الشكل 2C. ويمكن أيضا حصاد السفيرويدات المتعددة، وثابتة، ومقطعة، وملطخة بالهيماتوإكسلين ويوسين أو الأجسام المضادة الفلورية المناعية في نفس الوقت لتحديد مورفولوجيات الخلايا وتنظيمها داخل النفيد، وكذلك توزيع أنواع الخلايا وECM البروتينات (الشكل2D،E).
لدراسة تأثير العلاج من المخدرات على مورفولوجيا spheroid، يمكن تصور spheroids بسهولة عن طريق التصوير على النقيض المرحلة (الشكل3A). من الناحية الكمية أكثر، يمكن أيضا قياس تأثير العلاج الدوائي على الخلايا السرطانية أو انتشار CSC عن طريق قراءات الفلورة صبغ ريسازورين في الspheroids السيطرة غير المعالجة بالمقارنة مع في spheroids المعالجة المخدرات (الشكل3B). كتحقق من موت الخلايا بعد العلاج من المخدرات، يمكن بسهولة تحديد الجدوى داخل السيطرة والأدوية المعالجة spheroids عن طريق إضافة calcein-AM وethidium homodimer-1 إلى spheroids متعددة لكل حالة (الشكل3C). بعد وقت الحضانة، يمكن حصاد البشيرويدات الملطخة مع ماصة وتصورها على مجهر البؤري.
وأخيرا، عن طريق حصاد spheroids وتشتيتها في تعليق خلية واحدة، يمكن تحليل وجود CSCs وغيرها من علاماتالنمط الظاهري للخلايا مع قياس التدفق الخلوي (الشكل 4). مقارنة CS قابلة للحياة بين مختلف العلاجات الدوائية داخل المريض نفسه، وكذلك، بين المرضى يمكن أن تساعد على تمييز فعالية مختلف CSC استهداف الأدوية بطريقة خاصة المريض.
الشكل 1: 3D الإنتاجية العالية 384 شنقا إسقاط spheroid لوحة التخزين وتخطيطات الطلاء. (أ) يتم وضع لوحة قطرة معلقة على الجزء السفلي من لوحة بئر 6 مليئة جزئيا بالماء. (B) يتم وضع غطاء من 6 لوحة جيدا على رأس لوحة قطرة شنقا لخلق غرفة ترطيب معقمة. (C) 6-جيدا كومة لوحة ليتم ختمها مع شريط بالحرارة للحماية من فقدان الرطوبة والملوثات. (D) نمط الطلاء بالتناوب للوحة قطرة شنقا. المربعات الوردية تشير إلى الآبار المليئة بالخلايا والخليط المتوسط. المناطق الزرقاء تشير إلى غرف المياه للترطيب. تشير الصناديق الرمادية إلى الآبار الفارغة التي تعمل كحدود بين غرف الترطيب وقطرات السفيرويد. (E) صورة حية من لوحة إسقاط شنقا مطلي مع نمط البئر بالتناوب. (F) كل تخطيط نمط الطلاء بشكل جيد المستخدمة لالإنتاجية العالية شنقا إسقاط التجارب spheroids. تشير المربعات الوردية إلى الآبار المطلية بالخلايا والمناطق الزرقاء التي تشير إلى وجود غرف مملوءة بالماء لزيادة الترطيب. تشير المربعات الرمادية إلى الآبار الحدودية التي تعمل كحدود بين أقسام الترطيب ومناطق زراعة الخلايا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المريض المستمدة CSC spheroids مورفولوجيا وانتشار داخل قطرات معلقة 3D. (أ) صورة حية من إعداد 384-شنقا إسقاط لوحة spheroid كما ينظر إليها من أسفل. (B) صور مجهر الضوء التدريجي للمريض المستمدة CSC نمو spheroid بعد 2، 3، و 5 أيام في قطرة معلقة. قضبان مقياس = 100 درجة مئوية (C) يظهر شدة الفلورة Resazurin زيادة كبيرة بعد 7 أيام من ثقافة إسقاط شنقا ، وترتبط بانتشار ونمو المريض إسقاط شنقا المستمدة CSC spheroids (غير المقترنة اثنين من الذيل t-اختبار ، ف <؛ 0.0001، ن > 10). (D) صورة من قالب صفيف spheroid المستخدمة لإنشاء يلقي لمجموعة من spheroids لتشريح الأنسجة. (E) H & E صورة من spheroid المستزرعة مع الخلايا الجذعية سرطان المبيض الأولية، والخلايا الجذعية mesenchymal، والخلايا البطانية، والخلايا أحادية النووية الدم المحيطية المانحة التي تم جمعها في مجموعة spheroid. شريط تخويف = 100 درجة.
الشكل 3: تحليل العلاج من المخدرات من المريض المستمدة CSC spheroids شنقا قطرات. (أ) المريض المستمدة CSC spheroids البذر في 50 خلية / قطرة تعامل مع تركيزات متزايدة من باكليتاكسيل بعد 5 أيام من النمو. الصور التمثيلية التي التقطت 48 ساعة بعد العلاج من المخدرات. (ب) القياس الكمي للصلاحية الخلوية عن طريق الفلورة ريسازورين في تركيزات متزايدة من العلاج باكليتاكسيل. جميع العينات لديها انخفاض كبير في القدرة على البقاء بالمقارنة مع السيطرة. (في اتجاه واحد ANOVA، ص <0.0001، n> 8). (C) التصوير البؤري للخلايا الحية (calcein-AM) والميتة (ethidium homodimer-1) داخل المتدلية قطرة spheroid. يشير اللون الأخضر إلى الخلايا الحية واللون الأحمر يشير إلى عدد الخلايا الميتة. شريط مقياس = 100 درجة.
الشكل 4: القياس الكمي لـ CSCs في spheroids CSC المشتقة من المرضى التي تم إنشاؤها وصيانتها على منصة إسقاط 384 معلقة. (أ) في تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي، يتم اختيار مجموعة الخلايا لأول مرة باستخدام بوابة مضلعة للقضاء على أي أحداث تعزى إلى الحطام. (ب) ثم يتم اختيار الخلايا المفردة للقضاء على إشارات الضعف المحتملة التي قد تحجب النتائج. (C) ثم يتم تحديد كافة الخلايا الحية المفردة استنادًا إلى استبعاد DAPI. (D) يتم تعديل المحور الرأسي لبوابة الربع في عنصر تحكم DEAB للسماح لحوالي 0.15٪ غير محددة ALDH تلطيخ. (E) يتم تعديل المحور الأفقي للبوابة الربعية في عنصر تحكم Iso APC للسماح بحوالي 0.5٪ غير محددة APC تلطيخ. (F) ثم يتم استخدام البوابة الرباعية لتحديد النسبة المئوية لخلايا CD133+وALDH+وCD133+/ALDH+ الموجودة في خلايا الخلايا الحية في CD133 التجريبيبالإضافة إلى حالة ALDH. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
منصة لوحة إسقاط معلقة 384 جيدا لتشكيل spheroid 3D هو أداة تنفذ بسهولة لأي بيولوجيا الخلية أو مختبرات بيولوجيا السرطان. هذه المنصة الفسيولوجية تمكن من دراسة خطوط الخلايا، فضلا عن عينات المرضى الأولية داخل الثقافات 3D ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية مع السماح لفحص المخدرات الإنتاجية العالية. كما تضمن المنصة أن ظروف الثقافة قابلة للضبط إلى حد كبير، مما يتيح التحكم الصارم في كثافات الطلاء، ونسب الثقافة المشتركة للخلايا، والمكونات خارج الخلية، والتكوين المتوسط. وعلاوة على ذلك، تسمح هذه المنصة الفسيولوجية للتجارب بأن تكون قابلة للغاية لتقنيات التحليل المصب التي تتطلب عدد خلايا كبيرة أو صغيرة مثل qRT-PCR، FACS، وأساليب التصوير المختلفة. في حين أن سهولة الاستخدام تأتي مع الخبرة، والمتدربين الجدد تصبح ناجحة بسرعة، بمجرد أن يتقن سرعة وسهولة الأنابيب. وهكذا، فإن هذه المنصة الفسيولوجية قابلة للتطبيق إلى حد كبير لفحص المخدرات 3D شخصية، والبيولوجيا CSC والتحقيقات المقاومة الكيميائية.
وتشمل بعض النقاط المثيرة للقلق عند تنفيذ هذا المنبر حديثا نقل لوحة وعلاج المخدرات. عند نقل لوحات من موقع إلى آخر كما هو مطلوب للتغذية الروتينية، والتصوير، والتحليل، ينبغي اتخاذ احتياطات حذرة لتجنب التناحر لا لزوم لها. قبضة لوحات من الحواف الخارجية حفظها على مستوى ممكن والحرص على تجنب حركات التنافر عند وضع لوحة أسفل. وهذا يساعد على تجنب فقدان قطرات أو دمج قطرات المجاورة. وبالمثل ، ينبغي إيلاء اهتمام يقظ لمهمة المخدرات علاج شنقا إسقاط spheroids لتجنب الاوييد غير صحيحة من أي واحد شنقا قطرة spheroid. كما هو الحال مع أي تقنية، والثقة والدقة مع هذه المهام تصل مع الممارسة.
وهناك عدد قليل من القيود الفطرية لهذه المنصة الفسيولوجية 3D. أولاً، قد يكون عدم استقرار قطرات مشكلة في نقاط وقت الثقافة على المدى الطويل، إذا لم يتم الحرص على الحفاظ على حجم قطرات إجمالي الصحيح. وعلاوة على ذلك، وكما ذُكر أعلاه، يجب أن يتم نقل الصفائح وتخزينها بعناية لتجنب فقدان أو دمج القطرات. بالإضافة إلى ذلك، يتم إملاء حجم هذه البيئة 3D من قبل حجم قطرات مستقرة فطرية من 20 درجة مئوية، على الرغم من أن العديد من عمليات تكرار يمكن أن تنتج لأعداد الخلايا المحسنة.
يمكن استخدام التعديلات على هذه المنصة الفسيولوجية ثلاثية المدة لزيادة الإنتاجية وتغيير الخصائص الفسيولوجية. على سبيل المثال، يمكن تغيير تخطيط قطرات لتشمل كل بئر داخل لوحة بئر 384 لزيادة الإنتاجية. بالإضافة إلى ذلك، فإن منصة إسقاط معلقة 3D مواتية للغاية للتحقيقات الثقافة المشتركة عن طريق إدراج بسيط لأنواع الخلايا متعددة في كل بئر. لتوليد والحفاظ على spheroids بنجاح، يمكن تعديل كثافة البذر الخلية المتوسطة والأولية الخلية بسهولة، لتنظيم بإحكام حجم spheroid. مع هذه المتغيرات القابلة للضبط للغاية تحقيقات لا تعد ولا تحصى ممكنة داخل عالم 3D المرضى الفسيولوجية المستمدة من spheroids.
في حين أن معظم أساليب التحليل الموصوفة تستخدم على نطاق واسع في البحث العلمي، هناك عدد قليل من القيود المحددة لتحليل إسقاط شنقا ولدت spheroids مع بعض هذه الأساليب. على سبيل المثال، عندما يتم زراعة spheroids لفترات طويلة من الوقت في لوحات إسقاط معلقة، يمكن أن يزيد حجم قطرات بشكل كبير مما تسبب في قطرات ليهز أثناء مرحلة التصوير التباين، مما قد يعرض للخطر جودة الصورة. ويمكن تحسين هذا عن طريق أخذ كمية مماثلة من المتوسطة من كل بئر قبل إضافة وسيلة جديدة. بالإضافة إلى ذلك، قد تتأثر تقنيات مثل قياس التدفق وحساب الخلايا القابلة للحياة الفردية بالتقنية المستخدمة لتفكيك الspheroids، والتي قد تكون ضارة للخلايا. وعلى هذا النحو، من المهم لكل مختبر تحسين تقنيات تصنيف السفيرويد استناداً إلى خلاياهم وتجربتهم لتقليل تلف الخلايا مع زيادة كثافة الخلايا الواحدة إلى أقصى حد. وأخيرا، يمكن أن يكون التحليل النسيجي للspheroids معقدة من حجمها الصغير ويتطلب ممارسة للحصول على أقسام ناجحة.
عموما، منصة 3D شنقا إسقاط spheroid قابلة للتكيف على نطاق واسع داخل السرطان والبحوث غير السرطان. النظام سهل التعلم ويوفر بيئة 3D ذات الصلة الفسيولوجية لثقافة الخلايا في شكل الإنتاجية العالية. وقت بدء هذه المنصة الفسيولوجية 3D هو الحد الأدنى، مع عدد قليل، إن وجدت، عقبات التحليل الفني للتغلب عليها. براعة هذا النظام يوفر وسيلة لفحص المريض محددة من العلاج الكيميائي الفعال للطب الدقيق، في بيئة أكثر فيزيولوجيا من أي وقت مضى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل في المقام الأول من قبل DOD OCRP جائزة الباحث الوظيفي المبكر W81XWH-13-1-0134 (GM)، جائزة الطيار DOD W81XWH-16-1-0426 (جنرال موتورز)، بدأت لجنة التحقيق في الدفاع عن حقوق الإنسان جائزة W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM)، مركز ريفكين لسرطان المبيض وسرطان المبيض ميشيغان التحالف. وقد تم دعم البحوث التي وردت في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للسرطان من المعاهد الوطنية للصحة تحت جائزة رقم P30CA046592. وتتلقى هذه المؤسسة الدعم من زمالة بحوث الدراسات العليا التابعة للمؤسسة الوطنية للعلوم في إطار المنحة رقم 1256260. ويتلقى المكتب الدعم من وزارة التعليم في مجال مساعدة الدراسات العليا في مجالات الحاجة الوطنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
| 100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 mL conical tube | Celltreat | FL4021 | |
| 1x DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
| 1x F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
| ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | - | |
| Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| Fetal Bovine Serum - premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
| Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
| Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | - | |
| Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | - | |
| Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
| Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | - | 3D printer |
| Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | - | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
| Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | - |
References
- All cancers Source: Globocan. , Globocan. http://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/cancers/39-All-cancers-fact-sheet.pdf (2018).
- Prasad, V., Mailankody, S. Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval. JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).
- Raghavan, S., et al. Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids. Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).
- Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. Cancer Stem Cells. New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity. Cancer Research. 76, 150-160 (2016).
- Páez, D., et al. Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence. Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).
- Ahmed, N., Stenvers, K. L. Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
- Varna, M., Bertheau, P., Legrès, L. Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models. Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays. Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).
- Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).
- Murphy, B., et al. Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis. Cancer Research. 76, 5798-5809 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening. Genes. 9, (2018).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture. Nature Methods. 14, 69-81 (2016).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Control Release. , (2012).
- Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G. Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres. Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. Papaccio, G., Desiderio, V. , Springer. New York. 61-75 (2018).
- Raghavan, S., et al. Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays. Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).
- Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).
- Kim, S., et al. Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites. Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Research. 71, 3991-4001 (2011).
- Pulaski, H. L., et al. Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer. Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).
- Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160 (2017).
