Summary
该协议描述了患者衍生球体的生成,以及下游分析,包括增殖定量、细胞毒性测试、流式细胞测定、免疫荧光染色和共聚焦成像,以便评估药物候选人作为抗肿瘤治疗的潜力。该协议支持精密医学,用于识别每个患者和疾病阶段的特定药物。
Abstract
在本协议中,我们概述了在384孔挂液滴内生成肿瘤球体的程序,以便在具有生理代表性的微环境中对抗癌疗法进行高通量筛查。我们概述了患者衍生的癌症干细胞球体的形成,以及这些球体的操作,以便在药物治疗后进行彻底分析。具体来说,我们描述了球体形态、增殖、活力、药物毒性、细胞表型和细胞定位数据的收集。该协议主要侧重于使用 384 well 悬垂平台轻松实现的分析技术,使其成为高通量药物筛选的理想选择。虽然我们强调该模型在卵巢癌研究和癌症干细胞研究中的重要性,但 384 well 平台适用于其他癌症类型和疾病模型的研究,将该平台的实用性扩展到许多领域。通过通过易于实施的具有生理代表性的3D培养技术,提高个性化药物筛选速度和筛查结果的质量,预计该平台将有助于开发新的治疗药物和患者特定疗法治疗策略,因此具有广泛的临床影响。
Introduction
2018年全球癌症相关死亡人数达到980万,突显出需要开发改进的治疗方法。不幸的是,开发抗癌药物的成本正在增加,开发一种药物的成本约为6.5亿美元,这表明需要改进开发抗癌新药的战略。癌症干细胞(CSCs),其特点是增加化学抵抗力3,自我更新的能力,和播种新的肿瘤4的能力被认为是导致肿瘤复发4,转移5,和化学抗药性4,6,所有这些都有助于肿瘤的恶性能力,从而造成高死亡率。在卵巢癌中,这些细胞在腹腔的恶性腹水液中被发现富集,这种病症与不良的临床结果1相关。由于CSC的恶性能力,已经推动开发新的CSC靶向药物,用于与传统化疗。CSC靶向药物的开发面临若干挑战,包括:1) 在体外扩展和维护CSC的困难;2) 患者样本稀缺;3)文化平台的生理相关性;4)患者之间药物敏感性的异质性。该协议概述了高吞吐量 3D 文化平台的实现,该平台可以克服这些挑战。特别是,该系统允许使用少量患者衍生的卵巢CSC进行快速药物筛查,并且高度适用于下游分析技术。我们的平台是研究卵巢癌和CSC的理想选择,在复杂的3D环境中研究其他癌症和分化细胞类型也很有价值。
复杂的三维(3D)模型对于研究肿瘤微环境(TME)至关重要,肿瘤微环境是由癌细胞、非癌症支持细胞和细胞外基质(ECM)蛋白4组成的3D利基。与传统的体外2D细胞培养相比,这种3D环境具有独特的细胞形态、细胞和细胞-基质相互作用、细胞分化、细胞迁移、细胞密度和扩散梯度。所有这些因素最终导致3D培养物内药物反应的差异,表现出耐药性增加和生理相关性7,8 。由于3D TME在CSC分化和化学抗性中的作用,在生理微环境中筛选CSC靶向药物至关重要。提高CSC药物筛选平台的生理相关性,有可能改善患者特定药物筛选、药物开发、治疗策略的制定,并最终获得临床结果。同样重要的是,用于药物筛选的平台具有高通量,并与下游分析方法兼容,以尽量减少有前途的药物9的成本、时间和临床翻译时间。
目前,复杂的TME最好通过体内模型(如鼠群合并肿瘤模型、细胞系衍生异种移植和患者衍生异种移植(PDX)模型12进行药物筛选应用,因为它们提供生理条件。然而,这些模型的低通量性质,以及它们需要的成本、时间和技术技能集限制了它们在快速、高通量药物筛选应用中的效用13。作为这些体内模型的替代品,许多体外3D模型使用水凝胶8,微流体装置或"片上器官"设备10、14和非粘附培养物3,8也已经开发,因为他们在成本,时间和所需的技能集的低进入门槛。
水凝胶培养平台对基质组成、机械特性和基质结构的精细控制具有优势;然而,它们可以抑制高密度细胞培养14。此外,从水凝胶中采集细胞会使下游分析复杂化,因为收获方法15的潜在有害影响。另一方面,微流体设备是微尺度设备,可在同一设备内进行输出检测,并在生理相关尺度上进行细胞培养,同时减少试剂消耗、缩短反应时间、减少浪费,快速扩散14.这些特性使它们成为研究药物毒性、疗效和药代动力学的有希望的平台。然而,高效、可量化、可重复和用户友好的3D细胞培养以及笨重且昂贵的泵送系统的挑战限制了微流体在高通量研究中的应用。有效的检测设置和潜在的困难跨领域的实施也阻碍了微流体系统10的广泛采用。
相反,在旋转混合器(螺母)、超低附着板和悬滴的非附着条件下生成的球体不包括用户定义的矩阵组件。这些方法对于研究卵巢癌特别相关,因为非粘附条件代表球体在围肠腔5内生长的条件。在这些非粘附培养方法中,与超低附着板生成的球体相比,螺母和悬挂滴球体表现出更高的压实、重塑和化学抵抗力,这表明生理上增加相关性16,17,18,19。由于从较小的孔径和最少的所需细胞数量提高高通量筛查能力,悬挂滴板中的球形生成是药物筛选的理想平台。在这里,我们在384孔挂滴板中提供了一个可调的3D生理平台,易于实施,高度易于下游分析,使其成为卵巢癌和卵巢CSC高通量药物筛查的理想选择。
我们的 3D 生理平台提供 3D 培养的所有优势,包括生理细胞-细胞接触、扩散梯度、细胞密度和自然产生的 ECM 蛋白,这些蛋白质可能有助于实现现实的药物反应16 17,18,19.此外,通过使用患者衍生的CSC生成这些球体,我们能够同时确定患者对药物1的具体反应,同时进行许多技术复制,以克服患者肿瘤中可能存在的异质性样本20.此外,3D文化已被证明加强CSC种群的维持3,16,因此代表丰富的CSC种群在腹水7。这与简单的下游分析相结合,包括流动性分析的可行性和CSC比例允许对CSC靶向药物疗效进行最佳评估。最后,该生理平台在实验过程中与多个时间点的成像相容,细胞死亡和增殖评价,细胞组织和形态学与免疫组织化学,在条件性ELISA上的可溶性信号培养基、带流式细胞测定的细胞表型,以及PCR后的基因表达。
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Protocol
所有患者样本均根据经批准的 IRB 协议从同意的患者那里收集,其样本在肿瘤去散、腹水收集后脱认。
1. 在384孔挂落板中从小细胞数生成球形
- 将悬挂的滴板放入装有无菌脱离子 (DI) 水和声波的声波器中 20 分钟。
- 用戴手套的手,从声波器中取出盘子,用运行的DI水清洗。
- 让盘子在0.1%的普鲁酮酸浴中24小时,以防止蛋白质吸附和球体附着在井中。
- 用戴手套的手取出盘子,用运行 DI 水彻底冲洗板的两侧。
- 大力敲打或摇动生物安全柜内的盘子,在无菌环境中从井中去除水。
- 将板置于紫外线下,每侧放置 30-60 分钟,对板进行消毒,并尽量减少污染。
注:该板也可以暴露于室内的环氧乙烷气体进行灭菌。 - 将每口 6 孔板的 4⁄5 mL 无菌高压灭菌 DI 水填充,并将悬挂的滴板夹在 6 孔板盖和底部之间。在悬挂落子板边缘周围加入800~1,000 μL无菌DI水,提供潮湿、稳定和无菌的环境,以尽量减少蒸发损失的体积(图1 A-C)。
- 对于2D生长细胞,吸气培养基覆盖细胞的生长日志阶段,用1倍磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤,以去除生长培养基中的胎儿牛血清(FBS)痕迹,因为它会阻碍胰蛋白酶的作用。
- 吸气,并在100毫米组织培养盘中加入1.5-2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。在设置为 37 °C 的培养箱中孵育细胞 5 分钟。
注:细胞可能以不同的速率分离,因此应在台面光学显微镜上检查板,以确保在5分钟后细胞分离。 - 将含有FBS或任何血清的6~8 mL细胞培养基加入培养皿中,以中和胰蛋白酶,用10 mL血清学移液收集细胞,并将其沉积在15 mL锥形管中。
- 通过在血细胞计的每一侧加载10μL的细胞悬浮液,并遵循相关的计数协议,对细胞进行计数。
- 对于从原发性或转移性实体肿瘤或未培养2D的腹水采集的患者衍生细胞,在血清游离培养基(SFM)中制备单细胞悬浮液,如上文3。
- 如前所述处理肿瘤组织并储存单细胞悬浮液,供以后在适当的冷冻培养基21、22中使用。
- 对于固体肿瘤组织,在将所需细胞从密度梯度21、22中分离之前,用剃刀刀片机械地切碎,并通过40μm过滤器过滤产生的溶液。
- 对于腹水样品,通过离心浓缩细胞,在氯化铵-钾(ACK)缓冲液中溶化红血球,在1xPBS中洗涤,然后通过40μm过滤器和28G针4乘22。
- 对于卵巢CSC的分离,对细胞进行分类,如下所述。
- 新鲜分离的单细胞被冷冻储存,并在实验需要时解冻。
- 要准备用于电镀的电池悬浮液,请计算电镀所需的电池溶液体积:每滴 20 μL X 液滴总数 = 所需的总溶液体积。
- 将细胞浓度稀释到每20μL所需的细胞浓度(即20μL下降中的100个细胞)。
- 在电镀之前,使用移液器轻轻混合细胞悬浮液,以确保细胞均匀分布,提高液滴之间的均匀性。
注:细胞悬浮物的过度混合可能导致细胞死亡和悬挂球体中的碎片。 - 将移液器的尖端置于孔中,角度约为 45°,并将细胞溶液的移液 20 μL 放入每个悬垂孔中。
注:电镀图案可根据所需球形的数量进行调整。当实验中不需要大量球体时,其他油井中的电镀球体更安全,因为它可以防止液滴意外合并(图1D,E)。如果实验需要大量的球体,在四面都有一排边界井,在四面都留下一排边界井(图1F)。 - 将 6 孔板的盖子放回悬挂落子板顶部,并使用对水分流失不敏感的弹性热塑性带,以密封边缘并防止液滴的额外蒸发。在标准 CO2 加湿培养箱中孵育(5% CO2, 37 °C)。
- 饲料悬垂每2~3天一次,通过添加2⁄3 μL到每个含有良好的球体来补充细胞培养基,以补充必要的营养。
注:成像后,建议给挂液滴喂食,因为成像过程中的空气暴露会导致蒸发。
2. 将细胞培养基添加到悬挂滴状板
- 取下生物安全柜内的热塑性带和盖子,并在每口含有悬垂的井中加入 2⁄3 μL 的适当培养基。
注:添加的体积取决于放置大小和喂食之间的时间量。 - 喂食后,用顶盖盖住板,在将板放回培养箱之前,将新鲜的热塑性条涂在外边缘。
3. 球形形态的相位对比成像
- 在生物安全柜中从板边缘取下热塑性条。
- 小心地从生物安全柜中取出 384 孔悬挂的滴球体板,盖子仍然固定到位,并将其放在显微镜托盘中,用表显荧光显微镜。
- 在成像软件中,使用 4 倍、10 倍或 20 倍的实时成像选项来观察悬挂的滴球体并拍摄所需的图像。
- 保存图像后,将板放回生物安全柜和饲料单元,如上所述。
- 用新鲜的热塑性带重新密封板,并将密封板放回培养箱中。
4. 在球体内的增殖和活力的量化
- 在足够数量的井中板球体,以获得每个需要检查的每个时间点(即第 1 天和第 7 天)的 >10 技术复制。
注:由于resazurin染料的潜在污染物,用于此测定的井通常不会再次使用。 - 在指定用于增殖分析的井中加入2 μL的过滤resazurin溶液,就像喂食这些井一样,孵育一个预先确定的潜伏期。
注:这种孵育时间可能因细胞类型和球体中的细胞数量而异。建议在开始增殖实验之前确定所需的孵育时间,在孵育1小时后开始测量,然后每30分钟重新测量一次,直到控制井高原的信号读出。可以根据需要多次使用读数。孵育通常是4小时球体启动与100癌细胞。 - 首先打开微板读卡器,然后先打开相关的板式读卡器软件,在一次阅读前至少 15 分钟,使机器预热,并将内部温度固定在 22°C,因为温度会影响读数。
- 打开 384 孔板协议集,具有 530/25 nm 激发和 590/35 nm 发射波长,光学设置为底部,增益设置为35,读取速度设置为"正常",读取类型设置为荧光.
- 孵化期结束后,打开生物安全柜中的吊滴三明治,将盖仍放在原位的 384 孔板带到板读取器上。
- 将盖仍放在板读盘中的 384 孔板,一旦机器预热,该板将延长,然后单击"确定"以读取板。
- 将井盘返回到 6 孔底座,并将其放入孵化器中。如果当天已读取所有时间点,请重新密封板,然后再将其放回培养箱中。
- 将实验保存在弹出窗口中,然后在提示时单击"是",是否要执行板 1 的 PowerExports将数据从板读取器软件输出到电子表格中,以供组织使用。
- 每种条件的平均荧光值,并通过控制条件的平均值进行标准化,以报告各种实验条件下增殖的褶皱变化。
- 当比较第 1 天到第 7 天时,通过除以第 1 天的平均荧光来标准化,以获得随时间增殖的折叠变化。
- 使用均值的标准误差计算误差条,并使用适当的统计测试(如学生的双尾 T 测试)确定实验组之间的统计显著性。
5. 类球体药物毒性评价
-
药物管理
- 在球形形成后的任何时候,将药物稀释到所需浓度,使2μL剂量含有所需最终药物浓度的10倍。
注:这是假设从液滴蒸发2μL,使药物治疗后的结束体积为20μL。例如,50 μM剂量的顺铂将具有500μM的制备溶液。如果液滴含有超过20μL,应相应地调整药物和/或添加的体积的浓度。 - 使用2μL细胞培养基处理对照样本。
注:西斯铂在水中溶解。因此,对照是细胞培养基的2μL;但是,如果药物载体是一种不同的溶剂(例如 DMSO),则控制应为细胞培养基,其 DMSO 浓度与药物治疗中使用的 DMSO 相同。 - 继续监测药物治疗和对照球体在整个药物潜伏期与相显显微镜有药物毒性的影响的视觉记录,以及上述resazurin染料监测细胞活力。
注:通常,药物在5~7天后在吊滴中添加,在48-72 hs后测量的毒性,但根据实验的不同,这种药可能有所不同。一旦形成稳定的球体,药物可以添加,通常在1~4天之间。
- 在球形形成后的任何时候,将药物稀释到所需浓度,使2μL剂量含有所需最终药物浓度的10倍。
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细胞计数药物毒性定量
- 在药物治疗的结束时间点,使用1000μL移液器从对照和药物治疗井中收集10个球体,并将每组球体放入自己的微离心管中。
- 通过重复移液将球体分解成单个细胞。
注:为了减少重复移液导致的潜在细胞损伤,可以使用胰蛋白酶(如胰蛋白酶)进行酶消化,以利于在移液23之前生成单细胞溶液。移液导致细胞死亡的最小化将取决于细胞类型,应相应地进行优化。如果担心由于分解而死亡,请参阅使用resazurin染料的分析以及细胞毒性测定,寻找不需要球体分解的替代方法。 - 在400 x g下将管离心5分钟,收集微离心管底部的细胞,并吸出上清液。
- 在每个管中加入 20 μL 的新鲜介质或 1x PBS,并混合均匀。
- 以2 μL的试尔潘蓝色染色率将胰盘蓝色加入到20μL的细胞悬浮液。
- 将10μL的细胞和Trypan蓝色悬浮液加载到血细胞仪的每个腔室中,并在光学显微镜下对细胞进行计数,蓝色染色细胞代表死细胞,未染色细胞代表活细胞。
- 活细胞百分比 = (活细胞数 = 细胞总数) x 100。
6. 与组织学技术一起的球形特征
注:有两种模具选项 3D 打印在生物相容性聚合物中,以复制 Ivanov 等人制作的球形阵列模具24: 1) 20 井模具,每口可容纳 28 μL,2) 63 井模具,每井可容纳 9 μL(图 2D)。
- 用70%乙醇擦拭,将成科模具及其边界消毒,并牢固地将边界固定在模具周围,并直立放置模具。两种模具均适合约 3 mL 的流体(20 个球形阵列为 3.203 mL,63 球形阵列为 3.196 mL)。
- 使用尖棉签轻轻涂上 10,000 cSt Si 油的球形阵列,以方便在后续步骤中去除试样加工凝胶。
- 加热试样加工凝胶,直到通过微波炉液化10-20s,并松开盖子。
- 将 2.6 至 2.8 mL 的熔融加工凝胶加入模具中,直到与边界顶部大致平起平。
- 几分钟后,一旦凝固,通过从模具上分离边界,然后反转阵列模具来去除加工凝胶。
- 在模具和边框之间插入 tweezer 尖端,仔细将其分开,然后使用电池刮刀帮助将铸件从模具中拆下,如果它不立即分离。
- 将单孔的含量移至 100 或 150 mm 细胞培养皿上,用 1,000 μL 移液器从悬挂的滴盘中收集球体,并目视地分离球形。
- 将井内内容(包括已识别的球体)的 5 μL 移入其中一个阵列井中,直到阵列充满。
- 等待 3 分钟,以确保球体已稳定到阵列的底部,然后轻轻地将熔融处理凝胶移入每个井中,小心不要干扰球体。
- 添加额外的加工凝胶,使阵列顶部变平,冷却后,将凝固的球形阵列放入带标签的盒式磁带中进行处理。
- 在4%的正弦中浸入4%的盒式球体中,将球体固定在4°C,然后在4°C处储存在70%乙醇中,直到准备加工。
- 使用标准 1 h 石蜡程序进行处理,然后嵌入球形阵列,使处理的阵列与最接近块面的井底直立。
- 确保阵列尽可能平坦,底部面与方块底部齐平,并将方块放在冰上。
- 将块加载到微体上并调整块,使刀片与加载的块面平行。
- 切割阵列(样品深度 = 15 μm),直到到达阵列井的底部,以确保圆形井在切割样品上可见。
- 切换到 5 μm 采样深度,并继续切片和收集色带。每隔几片在显微镜下检查一次,以确定球形深度是否达到。一旦到达球形,收集每个后续幻灯片,直到球形不再可见。
- 使用标准 H&E 协议染色每张幻灯片。
7. 活死细胞毒性测定
- 在每个悬垂滴中,将活细胞染料,钙素-AM添加到2μM的最终浓度,并将死细胞染料,乙二醇-1添加到4μM的最终浓度,请记住,滴体积为20μL。
注:尽量将体积保持在最小,并通常添加 2 μL 的染料组合。 - 将板放回夹在带盖子的 6 孔板中的培养箱中,并在 37°C 下孵育球体 45 分钟。
注:根据球体的大小,这种孵育时间会有很大差异。例如,400 μm以下的球体通常只需要 30-45 分钟的孵育时间,而接近 800 μm 的较大球体则需要长达 90 分钟的孵育时间。孵育时间必须针对个人的实验进行优化。 - 对于后续成像,在生物安全柜中收集带有 1,000 μL 移液管的球体,并将每个球体沉积在预清洁的玻璃显微镜玻片上。
- 在倒置共聚焦显微镜上,通过玻璃成像球体。
注:根据共聚焦显微镜与收获球体的实验室的接近程度,球形可以成像在放置在幻灯片上的介质的原始水滴中,或者被包裹在2%的胶质中,如果球体运输需要更大的稳定性的话。 - 在显微镜软件中使用多维采集模式,使用 DIC 照明以 10 倍放大倍率定位球形,然后扫描 z 平面以识别球体所包含的高度。
- 单击Z 系列并设置 z 扫描的上限和下限略高于球形的顶部,并略低于球形的底部。
- 以软件推荐的步长大小、最大增益和最小曝光率,在488nm处为钙素-AM(活细胞;绿色)和561nm的球形激发。
- 单击"获取"可获取球体内活细胞和死细胞的复合 z 堆栈图像。
- 使用图像处理软件量化活/死比例,以量化与活细胞对应的通道的像素强度百分比与与合成死细胞对应的通道的像素强度百分比z 投影图像。
注:由于使用 2D 投影量化 3D 结构的局限性,在悬挂滴板内量化活荧光与死荧光的替代方法是使用板读取器,遵循钙质-AM 和 ethidium 附带的协议霍莫默-1套件。
8. 免疫荧光
- 加热低熔融2%的甘蔗溶液,因此溶液是粘性的,正好高于熔点,放在显微镜上滑动,形成硬脂的角胶
- 通过推动 20 μL 的 PBS 通过滴到 2% 甘蔗糖的软床上来收获球体。
注:这应该迅速完成,以便腺糖不会在球形嵌入之前凝固。 - 一旦腺糖冷却和凝胶与收获的球体被困在(不到5分钟),添加4%中性缓冲形式,以修复球体。或者,加入冰冷的甲醇,并将甘蔗嵌入的球体固定在-20°C下30分钟。
- 用1x PBS每洗3次5分钟,每次洗涤后丢弃PBS。
- 在 RT 与 10% 血清(即马血清)和 0.15% 肥皂溶液 (Triton X-100) 在 1x PBS 中块 1 小时。
- 用1x PBS每洗3次5分钟,每次洗涤后丢弃PBS。
- 在推荐或预先确定的抗体稀释下使用所需荧光抗体的染色球体(即,在1:100稀释时以荧光标记的phalloidin),在室温下孵育至少90分钟,由光覆盖。
注:协议会因抗体和目标而异,抗体稀释可能需要根据实验进行优化。 - 使用上一节中概述的方法,使用倒置共聚焦显微镜可视化荧光染色球体,用于成像球体。
- 复合 z 堆栈图像将在球体中演示 3D 形态。
9. 流细胞测定癌症干细胞群的收集与分析
- 为流式细胞测定分析准备球体
- 使用 1,000 μL 移液器从悬挂液塞中从每个孔中收集球体,并将其放入 15 mL 离心管中,通过重复移液进行分解。
- 使用 Trypan Blue 在血细胞仪上计数活细胞,以确定上述细胞数量和浓度。
- 等分细胞悬浮液放入五个微离心管中,每个管至少包含50,000个细胞。
- 在微离心机中,在 400 x g下将所有管数在 5 分钟内离用。
- 从每个管中吸出上清液,并在100μL的缓冲液中重新悬浮颗粒。
- 标签管"未染色","DAPI","APC-iso","DEAB"和"ALDH/CD133",分别。
- 根据连续稀释和制造商建议,在 APC-等索管中加入 0.5 μL 的 APC 等型抗体和 1 μL CD133 抗体到 ALDH/CD133 管中。
- 在DEAB管中加入5μL的DEAB试剂和0.5μL的ALDH,向ALDH/CD133管中加入1μL的ALDH。
- 涡旋所有管约2秒,并在37°C孵育45分钟。
- 涡旋所有管再次和离心机在400 x g在微离心机5分钟。
- 将FACS管标为"未染色"、"DAPI"、"APC-iso"、"DEAB"和"ALDH/CD133",并填充一个绝缘泡沫容器,放在一边。
- 在 400 μL FACS 缓冲液(1x PBS,带 2% FBS)和 400 μL FACS DAPI 缓冲液(FACS 缓冲液中带有 300 μM 4',6-二甲苯-2-苯林多尔)中,吸气上清和重新悬浮"未染色"控制。
- 将管子放入装有冰块的容器中,直到在流动细胞仪上进行分析。
注:要对卵巢癌干细胞进行分类,请收集细胞计测量为 ALDH+ 和 CD133+ 的所有细胞,其门门设置为包括 0.5% 非特异性 APC 信号和 0.15% 非特异性 ALDH+ 信号。至少需要分析 10,000 个细胞才能获得可靠的结果。其他详情可在最近出版的刊物3、17中找到。
- FlowJo 中 ALDH+/CD133+ 种群的分析
- 双击FlowJo图标以打开程序,并将从流式细胞学软件获取的 .fcs 文件拖到工作区中。
- 双击未染色的文件,并将 y 轴设置为侧散射高度 (SSC-H) 和 x 轴以向前散射高度 (FSC-H)。
- 单击每个轴旁边的T按钮可调整比例和变换,以最大化不同细胞群之间的分离。
- 单击"多边形门控"按钮,在单元格总体周围绘制多边形门,并将总体标记为"单元格"。
- 双击工作区中的"单元格"总体,仅查看"单元格"总体中的单元格,然后单击 FSC 轴将轴通道更改为 FSC 宽度,然后单击 SSC 轴并将轴通道更改为 FSC-H。
- 选择矩形门工具,并围绕跨越整个 y 轴的左侧最密集的单元格群绘制一个矩形,以排除窗口右侧的潜在双精度值,并将此门标记为"单个单元格"。
- 右键单击并复制单元格和嵌套的单个单元格门,并将它们粘贴到工作区中的每个示例下。
- 双击工作区中嵌套在 DAPI 样本下的单个单元格门,以查看该样本管中的单个单元群,然后单击 FSC 轴并将轴通道更改为 DAPI - 区域通道。
- 单击 SSC 轴并将轴通道更改为直方图。
注: 活细胞在排除 DAPI 时将朝向左侧,而死单元格将采用 DAPI 并朝图形右侧显示。 - 单击DAPI轴旁边的T按钮,然后单击"自定义轴"以调整比例以最大化 DAPI 正峰和 DAPI 负峰之间的分离。
注:将弹出一个窗口,其中会显示缩放选项。通常,将"缩放"字段设置为 Biex 并调整"额外负十年和宽度基础"将产生最大的分离。 - 单击"在弹出窗口中应用"以应用缩放更改,选择"范围门"按钮,并将其分布到 DAPI 负峰值上,与活动单元格填充相对应。
- 将此门标记为"活细胞",右键单击可复制"活细胞"门,将其粘贴到"APC-iso、DEAB"和"ALDH/CD133"管下的"单细胞"门下,以选择每个样本管中具有相同部分的活细胞。
- 然后双击 APC-iso 示例文件下嵌套的活细胞群,并将 x 轴切换到 ALDH + 区域通道,将 y 轴切换到 APC + 区域通道。
- 同样,通过单击每个轴的T按钮和自定义轴来调整轴比例,以便事件在绘图的左下角区域进行本地化,然后选择"四门"选项,然后单击绘图窗口以建立象限门.
- 调整门的交点,使大约 0.5% 的人口位于绘图窗口或"APC 正"象限的左上角。
注:这 0.5% 表示 APC 等值型的非特定染色。 - 右键单击工作区中的每个象限标签,并相应地重命名它们。控件或命令单击工作区中的每个象限门标签并复制它们。
注:"Q1"表示CD133+细胞;"Q2"表示CD133+和ALDH+细胞;"Q3"表示ALDH+细胞;和"Q4"表示CD133-和ALDH-细胞。 - 将象限门粘贴到嵌套在"DEAB"文件下的活细胞总体。调整垂直线,使大约 0.15% 的细胞总体位于"ALDH+"象限内,注意不要移动水平线。
注:此 0.15% 表示非特定 ALDH 信号。- 为确保水平线不改变位置,请复制嵌套在DEAB文件下的新象限门,并将它们粘贴到 APC 等子文件下的活单元格上。当要求替换现有象限门时,请选择"是"。
- 在工作区中验证"CD133+"百分比在"APC-iso"文件下仍约为 0.5。
- 复制象限门并将其粘贴到"ALDH/CD133"文件的"活细胞"填充。
注:右上象限中存活的细胞群的百分比将是样本中 ALDH+ 和 CD133+ 双阳性 CSC 的百分比。
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Representative Results
用细胞系或患者衍生的CSC形成的类球体可以在悬挂液滴内用一系列小细胞数形成(图2A)。球形能可靠地形成,每口井只有10个细胞,这样可以保存稀有的患者样本。这些球体内的细胞被其他细胞以3维包围,就像它们在体内一样,允许生理细胞-细胞接触和扩散率。球体内的肿瘤细胞增殖,导致球体随时间而扩大大小(图2B)。由于更具攻击性的患者细胞或细胞系比其同龄人生长更快,因此必须量化每个样本的增殖能力,并检查药物治疗如何影响每个样本的增殖。为此,代谢活性测定,如基于resaszurin的荧光测定,可以很容易地执行与384井生理平台,无需采集球体,其结果可以在图2C中看到。多个球体也可以收获,固定,切片,并染色与血氧素和欧辛或免疫荧光抗体在同一时间,以识别细胞形态和组织在球体,以及细胞类型和ECM的分布蛋白质(图2D,E)。
为了检查药物治疗对球体形态的影响,球体可以通过相对比成像轻松可视化(图3A)。更定量地,药物治疗对肿瘤细胞或CSC增殖的影响,也可以通过治疗未处理球体的雷沙祖林染料荧光读数来测量(图3B)。作为药物治疗后细胞死亡的验证,控制内的可行性和药物治疗的球形体可以很容易地通过添加钙素-AM和ethidium homodimer-1到每个情况的多个球体(图3C)。在孵育时间之后,彩色球体可以使用移液器进行采集,并在共聚焦显微镜上成像。
最后,通过采集球体并将其分散到单个细胞悬浮液中,CSC和其他细胞表型标记物的存在可以通过流动细胞学进行分析(图4)。在同一患者内不同药物治疗之间的可行 CSC 进行比较,有助于以患者特定的方式识别各种 CSC 靶向药物的有效性。
图1:3D高通量384挂滴球体板存储和电镀布局。(A) 悬挂的落板被放置在6个井板的底部,部分装满水。(B) 6孔板的盖子被放置在悬挂的落子板顶部,以形成无菌水化室。(C) 6 孔板堆叠用热塑性条密封,以防止水分流失和污染物。(D) 悬挂落板的交替电镀图案。粉红色方块表示充满细胞和中度混合物的井。蓝色区域表示水室用于水化。灰色框表示作为水化室和球形液滴之间的边界的空白孔。(E) 挂落板与交替井模式的镀层的实时图像。(F) 所有用于高通量吊滴球体实验的电镀图案布局。粉红色方块表示细胞镀井,蓝色区域表示充满水的腔室用于增加水化。灰色方块表示作为水化截面和细胞培养区域之间的边界孔。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:患者衍生CSC球体形态和增殖在3D挂滴内。(A) 从底部看,已准备的384挂滴球形板的实时图像。(B) 患者在挂落后2、3和5天后衍生的CSC球体生长的渐进光显微镜图像。刻度条 = 100 μm. (C) Resazurin 荧光强度在挂滴培养 7 天后显著增加,与挂滴患者衍生 CSC 球体的增殖和生长相关 (未配对两个尾尾 t-test, p <0.0001,n >10)。(D) 用于创建用于收集用于组织学切片的球形的铸件的球形阵列模具的图片。(E) 用原发性卵巢癌干细胞、中位干细胞、内皮细胞和供体外周血单核细胞在球体阵列中收集的球体培养的球体H&E图像。吓唬栏 = 100 μm.请点击此处查看此图的较大版本。
图3:药物治疗分析患者衍生CSC球体悬垂。(A) 患者衍生的CSC球体在50个细胞/滴下进行,经过5天的生长后,其浓度增加。药物治疗后48小时拍摄的代表性图像。(B) 在增加帕利他塞治疗浓度时,通过resazurin荧光定量细胞活力。与对照相比,所有样品的可存活性均显著降低。(单向方差分析,p <0.0001,n> 8)。(C) 悬落球体内活(钙素-AM)和死细胞(甲苯-1)的共聚焦成像。绿色表示活细胞,红色表示死细胞群。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:在384悬垂平台上生成和维护患者衍生CSC球体的CSC定量。(A) 在分析流式细胞测量数据时,首先使用多边形门选择细胞群,以消除任何可归因于碎片的事件。(B) 然后选择单个细胞来消除可能掩盖结果的潜在双数信号。(C) 然后根据 DAPI 排除选择所有单个活细胞。(D) 象限门的垂直轴在DEAB控制中调整,以允许约0.15%的非特异性ALDH染色。(E) 象限门的水平轴在 APC ISO 控制中调整,以允许约 0.5% 非特定 APC 染色。(F) 象限门用于确定 CD133+、ALDH+和 CD133+/ALDH+ 细胞在实验 CD133 加 ALDH 条件下的活细胞群中存在的百分比。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
用于 3D 球形形成的 384 孔挂落板平台是任何细胞生物学或癌症生物学实验室轻松实现的工具。该生理学平台支持研究细胞系,以及生理相关3D培养系内的初级患者样本,同时允许高通量药物筛选。该平台还确保培养条件高度可调,从而严格控制电镀密度、细胞共培养比、细胞外组件和介质组成。此外,该生理学平台使实验高度适应下游分析技术,需要大或小细胞计数,如qRT-PCR、FACS和各种成像方法。虽然易用性伴随着经验,但一旦掌握了移液的速度和易用性,新学员很快就成功了。因此,该生理平台高度适用于个性化3D药物筛选、CSC生物学和化学抗药性研究。
新实施这个平台时,一些关注点包括盘子转移和药物治疗。在按照常规喂养、成像和分析所需的要求将板从一个位置转移到另一个位置时,应采取谨慎的预防措施,以避免不必要的争用。从外边缘夹住板,使其尽可能保持水平,并注意在放下板时避免抖动。这有助于避免水滴丢失或相邻水滴合并。同样,应警惕地注意药物治疗挂滴球体的任务,以避免对任何一个悬挂滴球体的不当给药。与任何技术一样,这些任务的信心和准确性也随着实践而出现。
这个3D生理平台有一些固有的局限性。首先,如果不注意保持正确的总滴数,则长期培养时间点可能存在滴不稳定性。此外,如上所述,必须小心运输和储存板材,以避免液滴丢失或合并。此外,此 3D 环境的大小取决于 20 μL 的先天稳定滴大小,但可以生成许多复制以增强细胞计数。
修改这个3D生理平台可用于增加吞吐量和改变生理特性。例如,可以更改滴布局,以包括 384 井板中的每个井,以增加吞吐量。此外,3D悬垂平台通过简单地在每个孔中包含多种细胞类型,非常有利于共同培养研究。为了成功生成和维持球体,细胞培养基培养基和初始细胞播种密度可以很容易地调节,以严格调节球形大小。有了这些高度可调的变量,在3D生理患者衍生球体领域内,无数的研究是可能的。
虽然所描述的大多数分析方法在科学研究中被广泛应用,但其中一些方法对分析悬落产生的球体有一些特定的局限性。例如,当球体在悬挂滴板中长时间培养时,液滴大小会显著增加,导致液滴在相对比成像过程中发生抖动,从而可能损害图像质量。在添加新介质之前,从每口井中拿出同等数量的介质,可以改善这种情况。此外,流动细胞学和计数单个活细胞等技术可能受用于分解球体的技术的影响,这可能对细胞有害。因此,每个实验室必须根据细胞优化球体分解技术,并进行实验,以尽量减少细胞损伤,同时最大化单细胞密度。最后,球体的组织学分析可能由于体积小而变得复杂,需要实践才能获得成功的部分。
总体而言,3D悬垂球形平台在癌症和非癌症研究中广泛适应。该系统易于学习,以高通量格式为细胞培养提供3D生理相关环境。这个3D生理平台的启动时间极短,几乎没有技术分析障碍需要克服。该系统的多功能性为患者在前所未有的生理环境中对精密医学的有效化疗进行特定筛查提供了手段。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作主要支持 DOD OCRP 早期职业调查员奖 W81XWH-13-1-0134 (GM), DOD 飞行员奖 W81XWH-16-1-0426 (GM), 国防部调查员启动奖 W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), 里夫金卵巢癌和密歇根州卵巢癌中心联盟。本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家癌症研究所的支持,奖励编号为P30CA046592。CMN由国家科学基金会研究生研究奖学金资助,奖学金号为1256260。教育部由教育部国家需要领域研究生援助(GAANN)研究金提供支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
| 100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 mL conical tube | Celltreat | FL4021 | |
| 1x DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
| 1x F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
| ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | - | |
| Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| Fetal Bovine Serum - premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
| Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
| Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | - | |
| Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | - | |
| Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
| Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | - | 3D printer |
| Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | - | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
| Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | - |
References
- All cancers Source: Globocan. , Globocan. http://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/cancers/39-All-cancers-fact-sheet.pdf (2018).
- Prasad, V., Mailankody, S. Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval. JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).
- Raghavan, S., et al. Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids. Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).
- Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. Cancer Stem Cells. New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity. Cancer Research. 76, 150-160 (2016).
- Páez, D., et al. Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence. Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).
- Ahmed, N., Stenvers, K. L. Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
- Varna, M., Bertheau, P., Legrès, L. Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models. Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays. Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).
- Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).
- Murphy, B., et al. Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis. Cancer Research. 76, 5798-5809 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening. Genes. 9, (2018).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture. Nature Methods. 14, 69-81 (2016).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Control Release. , (2012).
- Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G. Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres. Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. Papaccio, G., Desiderio, V. , Springer. New York. 61-75 (2018).
- Raghavan, S., et al. Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays. Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).
- Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).
- Kim, S., et al. Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites. Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Research. 71, 3991-4001 (2011).
- Pulaski, H. L., et al. Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer. Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).
- Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160 (2017).
