Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

Summary

Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.

Abstract

In dit protocol schetsen we de procedure voor het genereren van tumor sferoïden binnen 384-goed hangende druppeltjes om een high-throughput screening van anti-kankertherapieën mogelijk te maken in een fysiologisch representatieve micro-omgeving. We schetsen de vorming van patiënten afgeleide Kanker stamcel sferoïden, evenals, de manipulatie van deze sferoïden voor grondige analyse na medicamenteuze behandeling. Concreet beschrijven we de verzameling van spheroid-morfologie, proliferatie, levensvatbaarheid, geneesmiddeltoxiciteit, celfenotype en lokalisatiegegevens van cellen. Dit protocol richt zich sterk op analysetechnieken die eenvoudig worden geïmplementeerd met het 384-well Hanging drop-platform, waardoor het ideaal is voor een hoge doorvoer van drugs screening. Terwijl we benadrukken het belang van dit model in ovariële kanker studies en kanker stamcelonderzoek, de 384-well platform is vatbaar voor onderzoek van andere soorten kanker en ziekte modellen, uitbreiding van het nut van het platform om vele gebieden. Door de snelheid van gepersonaliseerde geneesmiddelen screening en de kwaliteit van screening resultaten te verbeteren door eenvoudig te implementeren fysiologisch representatieve 3D-culturen, wordt dit platform voorspeld om te helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën en patiëntspecifieke behandelstrategieën en hebben zo een brede klinische impact.

Introduction

Wereldwijde kankergerelateerde sterfte bereikte een tol van 9.800.000 sterfgevallen in 2018¹, met de nadruk op de noodzaak voor de ontwikkeling van verbeterde Therapeutics. Helaas, de kosten van het ontwikkelen van kanker drugs neemt toe, met de ontwikkeling van een enkele drug kost ongeveer 650.000.000 USD² wijst op de noodzaak van verbeterde strategieën voor de ontwikkeling van nieuwe anti-kanker drugs. Kanker stamcellen (CSCs), die worden gekenmerkt door verhoogde chemoresistance³, de capaciteit om zichzelf te verlengen, en het vermogen om nieuwe tumoren zaad⁴ worden verondersteld te zijn verantwoordelijk voor tumor recidief⁴, metastase⁵, en chemoresistance^4,6, die allemaal bijdragen aan de kwaadaardige capaciteit van de tumor en dus de hoge dood tol. Bij eierstokkanker worden deze cellen verrijkt in de maligne ascites vloeistof in de peritoneale Holte, een aandoening die gepaard gaat met slechte klinische uitkomsten¹. Als gevolg van de kwaadaardige capaciteiten van CSCs, is er een duw geweest om nieuwe CSC-targeting te ontwikkelen die in combinatie met traditionele chemotherapieën wordt gebruikt. Er zijn verschillende uitdagingen die gepaard gaan met de ontwikkeling van CSC-targeting op drugs, waaronder: 1) moeilijkheden bij het uitbreiden en onderhouden van CSCs in vitro; 2) schaarste van de patiënt monsters; 3) fysiologische relevantie van het cultuurplatform; en 4) heterogeniteit in geneesmiddel gevoeligheid tussen patiënten. Dit protocol schetst de implementatie van een 3D-cultuurplatform met hoge doorvoer dat elk van deze uitdagingen kan overwinnen. Met name dit systeem zorgt voor een snelle geneesmiddelen screening met behulp van kleine aantallen patiënt-afgeleide ovariële CSCs, en is zeer vatbaar voor downstream analysetechnieken. Hoewel ideaal voor het bestuderen van ovariële kanker en CSCs, is ons platform ook waardevol bij het bestuderen van andere kankers en gedifferentieerde celtypen in complexe 3D-omgevingen.

Complexe 3-dimensionale (3D) modellen zijn essentieel in het bestuderen van de tumor micro Environment (TME), dat is een 3D-niche opgebouwd uit kankercellen, niet-kanker ondersteunende cellen, en extracellulaire matrix (ECM) eiwitten⁴. Deze 3D-omgeving resulteert in unieke celmorfologie, celceldeling en celmatrix interacties, celdifferentiatie, Celmigratie, celdichtheid en diffusie gradiënten in vergelijking met traditionele 2D-celkweek in vitro⁴. Al deze factoren culmineren in differentiële drug Response binnen 3D-culturen, exposeren verhoogde drug resistentie en fysiologische relevantie^7,8. Vanwege de rol van de 3D-TME in CSC-differentiatie en chemoresistance, is het essentieel om te schermen voor CSC-targeting op drugs in fysiologische micro-omgevingen. Verbetering van de fysiologische relevantie van CSC drug screening platforms heeft het potentieel om patiënt specifieke drug screening te verbeteren, ontwikkeling van geneesmiddelen, formulering van behandelingsstrategieën, en uiteindelijk klinische uitkomsten. Het is net zo belangrijk dat het platform dat wordt gebruikt voor het screenen van geneesmiddelen een hoge doorvoer is en compatibel is met downstream-analysemethoden om kosten, tijd en klinische Vertaal tijd van veelbelovende medicijnen te minimaliseren⁹.

Op dit moment, het complex TME is het best onderhouden voor drug screening toepassingen door middel van in vivo modellen zoals Murine syngenic tumor modellen, cellijn-afgeleide xenografts, en patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) modellen¹², als ze bieden fysiologisch Voorwaarden. Echter, de lage doorvoer aard van deze modellen, evenals de kosten, tijd en technische vaardigheden sets die ze nodig hebben beperkt hun nut in snelle, hoge doorvoer drug screening toepassingen¹³. Als alternatieven voor deze in vivo modellen, veel in vitro 3D-modellen met behulp van hydrogels⁸, cultuur binnen microfluïdische apparaten of ' Organ-on-a-chip ' apparaten^10,14, en niet-aanhandige culturen^3,8 zijn ook ontwikkeld, vanwege hun lage barrière voor toegang in termen van kosten, tijd en vereiste vaardigheden.

Hydrogel cultuur platforms zijn voordelig in de fijne controle die wordt geboden over de matrix samenstelling, mechanische eigenschappen en matrixstructuur¹⁵; echter, ze kunnen remmen hoge dichtheid celcultuur¹⁴. Bovendien kan het oogsten van cellen uit hydrogels de downstreamanalyse compliceren, als gevolg van mogelijk schadelijke effecten van oogstmethoden¹⁵. Microfluïdische apparaten, aan de andere kant, zijn Microscale apparaten die het mogelijk maken voor output detectie binnen hetzelfde apparaat en voor celkweek op fysiologisch relevante weegschalen met minimale consumptie van reagentia, verminderde reactietijd, geminimaliseerd afval, en Rapid Diffusion¹⁴. Deze kenmerken maken ze veelbelovende platforms voor het onderzoeken van drug toxiciteit, werkzaamheid, en farmacokinetiek. Echter, de uitdagingen van efficiënte, kwantificeerbare, reproduceerbare en gebruiksvriendelijke 3D-celcultuur, evenals, omvangrijke en dure pompsystemen hebben beperkt microfluïdische toepassingen in high-throughput Research¹⁰. Efficiënte detectie opstellingen en mogelijk moeilijke implementatie op verschillende terreinen hebben ook de wijdverbreide acceptatie van microfluïdische systemen¹⁰belemmerd.

In tegenstelling tot het ontstaan van sferoïden in niet-aanhangende omstandigheden in roterende mixers (nutators), Ultra-Low-bevestigings platen en hangende druppels worden geen door de gebruiker gedefinieerde matrix componenten opgenomen. Deze methodologieën zijn vooral relevant voor het bestuderen van ovariële kanker, aangezien de niet-aanhandende omstandigheden representatief zijn voor de omstandigheden waarin sferoïden binnen de peritoneale holte⁵groeien. Binnen deze niet-aanhangende kweekmethoden is aangetoond dat nutator en hangende valsspheroids een hogere verdichting, herinrichting en chemoresistance vertonen in vergelijking met sferoïden die in uiterst lage bevestigings platen worden gegenereerd, wat suggereert dat er meer fysiologische relevantie^16,17,18,19. Door de toegenomen capaciteit voor screening met hoge doorvoer van kleinere goed groottes en minimale vereiste celaantallen is spheroid-generatie in hangende drop platen een ideaal platform voor geneesmiddelen screening. Hier presenteren we een instelbaar 3D-fysiologisch platform in 384-goed hangende druppel platen, die gemakkelijk te implementeren en zeer vatbaar zijn voor downstream-analyse, waardoor het ideaal is voor een hoge doorvoer van drug screening van eierstokkanker en ovariële CSCs.

Ons 3D-fysiologisch platform biedt alle voordelen van 3D-cultuur, waaronder fysiologische celcelcontacten, diffusie gradiënten, celdichtheden en natuurlijk geproduceerde ECM-eiwitten, die kunnen bijdragen aan realistische geneesmiddel responsen^{16, 17,18,19}. Bovendien kunnen we, door deze sferoïden te genereren met door de patiënt afgeleide CSCS, patiënt specifieke reacties op drugs¹ vaststellen met veel technische replicaten tegelijkertijd, om heterogeniteit te overwinnen die kan worden gevonden binnen de tumor van de patiënt voorbeelden²⁰. Bovendien is aangetoond dat 3D-cultuur het onderhoud van de CSC-populaties^3,16 verbetert en dus representatief is voor de verrijkte CSC-populaties in de ascites⁷. Dit gecombineerd met eenvoudige downstream analyse, met inbegrip van flow cytometrie analyse van de levensvatbaarheid en CSC-verhoudingen zorgt voor een optimale evaluatie van CSC targeting drug werkzaamheid. Ten slotte is dit fysiologisch platform compatibel met Imaging op meerdere tijdstippen tijdens het experiment, evaluatie van celdood en proliferatie, celorganisatie en morfologie met immunohistochemie, oplosbare signalering met ELISA op geconditioneerde medium, celfenotypes met Flowcytometrie en genexpressie na PCR.

Protocol

Alle patiënt monsters worden verzameld onder een goedgekeurd IRB-Protocol van instan-patienten, waarvan de monsters zijn geïdentificeerd na tumor deballast stoffen en ascites-verzameling.

1. generatie van Spheroids uit kleine Celaantallen in 384-goed hangende drop platen

1. Plaats de hangende druppel plaat in een sonicator gevuld met steriel gedeïoniseerd (di) water en sonificeren gedurende 20 min.
2. Met een handschoenen, verwijder de plaat van de sonicator en was het met stromend DI-water.
3. Laat de plaat zitten in een bad van 0,1% Pluronic acid voor 24 h om te voorkomen dat eiwit adsorptie en spheroid hechting aan de putjes.
4. Verwijder platen met een handschoenen en spoel beide zijden van de plaat grondig af met stromend DI-water.
5. Tik of schud krachtig de plaat in een bioveiligheidskast om water uit de putten te verwijderen in een steriele omgeving.
6. Plaats de plaat 30 – 60 min aan beide zijden onder UV-licht om de platen te steriliseren en verontreiniging te minimaliseren.
   Opmerking: De plaat kan ook worden blootgesteld aan ethyleenoxide-gas in een kamer voor sterilisatie.
7. Vul elke put van een 6-put plaat met 4 – 5 mL steriel geautoclaveerd DI water en sandwich de hangende druppel plaat tussen het deksel en de onderkant van de 6-well plaat. Voeg 800 – 1000 μL steriel DI water rond de rand van de hangende druppel plaat toe om een vochtige, stabiele en steriele omgeving te bieden om het volume dat verloren gaat aan de verdamping te minimaliseren (Figuur 1 a-C).
8. Voor 2D-gekweekte cellen, aspiraat medium bedekt cellen in hun log fase van groei en wassen met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om sporen van foetaal runderserum (FBS) in het groeimedium te verwijderen, omdat het de werking van trypsine belemmert.
9. Zuig de PBS op en voeg 1,5-2 mL 0,25% trypsine-EDTA toe aan de weefselkweek schotel van 100 mm. Incuberen cellen gedurende 5 min in een incubator ingesteld op 37 °C.
   Opmerking: Cellen kunnen met verschillende snelheden losraken, zodat de platen op een tafel lichtmicroscoop moeten worden gecontroleerd om celloslating na 5 min te waarborgen. pas het Detacherings protocol aan volgens de instructies van de leverancier wanneer u een cellijn gebruikt.
10. Voeg 6 – 8 mL cellulair medium met FBS of een serum toe aan het gerecht om de trypsine te neutraliseren, verzamel cellen met een serologische Pipet van 10 mL en stort ze in een conische buis van 15 mL.
11. Tel cellen door 10 μL van de celsuspensie aan elke kant van een hemocytometer te laden en het bijbehorende tellings protocol te volgen.
12. Voor patiënten afgeleide cellen die zijn verzameld uit primaire of gemetastaseerde vaste tumoren, of die niet zijn 2D gecultiveerde, bereiden enkele celsuspensies in serumvrij medium (SFM) beschreven eerder³.
13. Proces tumorweefsels zoals eerder beschreven en opslaan van één cel suspensies voor later gebruik in geschikte Vries middel medium^21,22.
    1. Voor solide tumorweefsel, gehakt mechanisch met een scheermesje en filter resulterende oplossing door middel van een 40 μm filter voor het isoleren van de gewenste cellen uit een dichtheidsgradiënt^21,22.
    2. Voor ascites monsters, concentraat cellen door centrifugeren, lyse rode bloedcellen in ammonium-chloride-kalium (ACK) buffer, wassen in 1x PBS, en dan passeren een 40 μm filter en een 28 G naald 4 maal²².
14. Voor isolatie van ovariële CSCS, Sorteer cellen met Flow flowcytometrieonderzoeken zoals hieronder in detail beschreven.
15. Vers geïsoleerde enkelvoudige cellen zijn bevroren voor opslag en ontdooid wanneer dat nodig is voor experimenten.
16. Om de celsuspensie voor het beplating voor te bereiden, berekent u het gewenste volume van de celoplossing die nodig is voor het beplating: 20 μL per druppel X totaal aantal druppels = totaal oplossings volume nodig.
17. Verdun de celconcentratie tot de gewenste celconcentratie per 20 μL (d.w.z. 100 cellen in een druppel van 20 μL).
18. Meng de celsuspensie zachtjes met behulp van een pipet vóór het beplating om homogene verdeling van cellen te garanderen en de uniformiteit tussen druppels te verbeteren.
    Opmerking: Overmenging van de celsuspensie kan leiden tot celdood en vuil in de hangende valsspheroïden.
19. Plaats de pipetpunt in de put onder een hoek van ongeveer 45 ° en Pipetteer 20 μL van de celoplossing in elke hangende druppel goed.
    Opmerking: Plating patronen kunnen worden aangepast afhankelijk van het aantal benodigde sferoïden. Beplating sspheroids in elke andere put is veiliger wanneer grote hoeveelheden sferoïden niet nodig zijn in een experiment, omdat het onbedoeld samenvoegen van de druppels voorkomt (Figuur 1D, E). Als grote hoeveelheden spheroïden nodig zijn voor een experiment, plaat elke putje een rij grens putten aan alle zijden (Figuur 1f).
20. Plaats de deksel van de 6-well plaat terug bovenop de hangende druppel plaat en gebruik een rekbare thermoplastische strip die ongevoelig is voor vochtverlies, om de randen te dichten en extra verdamping van druppels te voorkomen. Incuberen in een standaard CO₂ bevoficeerde incubator (5% Co₂, 37 °c).
21. Toevoer hangende druppels eens in de 2 – 3 dagen om het celkweekmedium aan te vullen voor noodzakelijke voedingsstoffen door 2 – 3 μL toe te voegen aan elke spheroid die goed bevat.
    Opmerking: Na beeldvorming wordt altijd geadviseerd om de hangende druppels te voeden, omdat de lucht blootstelling tijdens beeldvorming tot verdamping leidt.

2. het toevoegen van celkweek medium aan hangende drop Spheroid platen

1. Verwijder de thermoplastische strook en het deksel in een bioveiligheidskast en voeg 2 – 3 μL van het geschikte kweekmedium toe aan elke put met een hangende druppel.
   Opmerking: Het toegevoegde volume is afhankelijk van de druppelgrootte en de hoeveelheid tijd tussen de voedingen.
2. Bedek de plaat na het voeden met de bovenste deksel en breng verse thermoplastische strook aan op de buitenranden voordat u de plaat weer in de incubator plaatst.

3. fase contrast beeldvorming van Spheroid-morfologie

1. Verwijder de thermoplastische strook van rond de randen van de plaat in een bioveiligheidskast.
2. Verwijder voorzichtig de 384-goed hangende druppel sferoïden plaat van de bioveiligheid Cabinet met het deksel nog op zijn plaats en plaats het in de Microscoop lade bij een epifluorescerende Microscoop.
3. Gebruik de optie Live imaging in de imaging-software op 4x, 10x of 20x om de hangende valsspheroids te observeren en gewenste beelden te maken.
4. Na het opslaan van de beelden, neem de plaat terug naar de bioveiligheid Cabinet en voer cellen zoals hierboven beschreven.
5. Reseal plaat met een frisse thermoplastische strook en plaats de verzegelde plaat terug in de incubator.

4. kwantificering van proliferatie en levensvatbaarheid binnen Spheroids

1. Plaat spheroïden in een voldoende aantal putjes om > 10 technische replicaten te verkrijgen voor elk tijdstip (d.w.z. dag 1 en dag 7) dat moet worden onderzocht.
   Opmerking: Putten die worden gebruikt voor deze test worden over het algemeen niet opnieuw gebruikt als gevolg van potentiële verontreinigingen uit de resazurin kleurstof.
2. Voeg 2 μL gefilterde resazuringebaseerde oplossing toe aan de putten die zijn aangewezen voor proliferatie analyse alsof deze putten worden vervoedering en inbroed voor een vooraf bepaalde incubatieperiode.
   Opmerking: Deze incubatietijd kan variëren afhankelijk van het celtype en het aantal cellen in de spheroid. Het wordt geadviseerd om de vereiste incubatietijd te bepalen die nodig is voorafgaand aan het begin van de proliferatie experimenten door metingen te beginnen na 1 uur incubatie en vervolgens elke 30 minuten opnieuw te meten tot het signaal uitlezingen in de controle putten plateau. Testwaarden kunnen zo vaak als gewenst worden ingenomen. Incubatie is meestal 4 h voor sferoïden gestart met 100 kankercellen.
3. Schakel eerst de microplaat Reader in, gevolgd door de bijbehorende Plate Reader-software ten minste 15 minuten vóór de eerste lezing, zodat de machine de inwendige temperatuur op 22 °c kan opwarmen en de temperatuur van de metingen kunnen beïnvloeden.
4. Open een 384-well plate protocol set met 530/25 nm excitatie en 590/35 nm emissie golflengten met optica ingesteld op bodem, Gain ingesteld op 35, leessnelheid ingesteld op normaal, en lees type ingesteld op fluorescentie .
5. Na de incubatieperiode, open de hangende druppel sandwich in een bioveiligheid Cabinet en breng de 384-put plaat met de deksel nog op zijn plaats aan de plaat lezer.
6. Plaats de 384-put plaat met het deksel nog op zijn plaats in de plaat lezer lade, die zal worden verlengd zodra de machine wordt opgewarmd en klik op OK om de plaat te lezen.
7. Breng de goed plaat terug naar de 6-well base en plaats deze in de incubator. Als alle tijdpunten voor de dag zijn gelezen, moet u de plaat opnieuw verzegelen voordat u deze terugplaatst in de incubator.
8. Sla het experiment op in het pop-upvenster en klik vervolgens op Ja wanneer u wordt gevraagd of u Power exports voorplaat 1 wilt uitvoeren om gegevens van de Plate Reader-software in een spreadsheet voor de organisatie uit te voeren.
9. Gemiddelde fluorescentie waarden voor elke aandoening en normaliseren door het gemiddelde van de controle voorwaarde te melden fold verandering in de proliferatie in verschillende experimentele omstandigheden.
10. Bij het vergelijken van dag 1 tot dag 7, normaliseren door te delen door dag 1 gemiddelde fluorescentie te verkrijgen fold verandering in de proliferatie na verloop van tijd.
11. Bereken foutbalken met behulp van een standaardfout van het gemiddelde en bepaal de statistische significantie tussen experimentele groepen met een geschikte statistische test, zoals de tweezijdige T-toets van de student.

5. evaluatie van Geneesmiddeltoxiciteit in spheroïden

1. Drug Administration
   1. Lever op elk moment na de vorming van spheroid het geneesmiddel dat verdund is tot de gewenste concentratie, zodanig dat een dosis van 2 μL 10x de gewenste uiteindelijke geneesmiddelconcentratie bevat.
      Opmerking: Hierbij wordt uitgegaan van een verdamping van 2 μL van de druppel, zodat het eindvolume na medicamenteuze behandeling 20 μL is. Bijvoorbeeld, een dosis van 50 μM cisplatine zal een bereide oplossing van 500 μM hebben. Als druppels meer dan 20 μL bevatten, moet de concentratie van het geneesmiddel en/of het toegevoegde volume dienovereenkomstig worden aangepast.
   2. Behandel controlemonsters met 2 μL celkweekmedium.
      Opmerking: Cisplatine wordt oplosbaar in water. Daarom zijn de controles 2 μL celkweekmedium; echter, als het medicijn voertuig een ander oplosmiddel is (bijv. DMSO), dan moeten de besturingselementen celkweekmedium zijn met een gelijke concentratie van DMSO zoals gebruikt in de medicamenteuze behandeling.
   3. Blijven controleren van de drug behandeld en de controle-sferoïden gedurende de incubatieperiode van de drug met fase microscopie een visuele record van het effect van drug toxiciteit, alsmede met resazurin kleurstof zoals hierboven beschreven om te controleren cellulaire levensvatbaarheid.
      Opmerking: Typisch, de drugs worden toegevoegd na 5 – 7 dagen in de hangende druppels en toxiciteit gemeten na 48 –-72 HS maar dit kan worden gevarieerd afhankelijk van het experiment. Geneesmiddelen kunnen worden toegevoegd zodra stabiele sferoïden zijn gevormd, meestal tussen 1 – 4 dagen.
2. Kwantificering van geneesmiddeltoxiciteit door celtelling
   1. Verzamel op het eindpunt van de medicamenteuze behandeling 10 sferioïden van controle-en met geneesmiddelen behandelde putten met behulp van een 1.000 μL pipet en stort elke set sferoïden in zijn eigen micro centrifugebuis.
   2. Breek de sferoïden in afzonderlijke cellen door herhaalde pipetteren.
      Opmerking: Om potentiële celbeschadiging te verminderen als gevolg van herhaald pipetteren, kan enzymatische spijsvertering met een enzym zoals trypsine worden uitgevoerd om het genereren van enkelvoudige celoplossingen te faciliteren voorafgaand aan pipetteren²³. Minimalisering van celdood als gevolg van pipetteren is afhankelijk van het celtype en moet dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd. Als u bezorgd bent over de dood als gevolg van uitsplitsing, raadpleeg dan de analyse met resazurin Dye en de cytotoxiciteits test voor alternatieve methoden waarvoor geen spheroid-aggregatie nodig is.
   3. Centrifugeer de buisjes gedurende 5 minuten bij 400 x g om cellen op de bodem van micro centrifugebuizen te verzamelen en het supernatant te aspireren.
   4. Voeg 20 μL verse media of 1x PBS toe aan elke buis en meng goed.
   5. Voeg Trypaan blauw toe met een verhouding van 2 μL Trypaan blauwe vlek tot 20 μL celsuspensie.
   6. Plaats 10 μL cellen en Trypan blauwe suspensie in elke kamer van de hemocytometer en Tel cellen onder een lichte Microscoop, met blauw gekleurd cellen die dode cellen en ongekleurde cellen vertegenwoordigen die levende cellen representeren.
      1. De Live cel% = (aantal levende cellen ÷ totaal aantal cellen) x 100.

6. spheroid-karakterisering met histologische technieken

Opmerking: Er zijn twee mal opties 3D gedrukt in een biocompatibel polymeer te repliceren spheroid array mallen gemaakt door Ivanov et al.²⁴: 1) 20 put schimmel die kan houden 28 μl per put en 2) 63 goed schimmel die 9 μL per put kan houden (figuur 2D).

1. Steriliseren histologie schimmel en de grens door ze af te vegen met 70% ethanol en bevestig de rand stevig rond de mal en leg de mal rechtop. Beide mallen passen ongeveer 3 mL vloeistof (3,203 mL voor de 20 spheroid-array en 3,196 mL voor de 63 spheroid-array).
2. Verlaag de spheroid-array met 10.000 cSt si-olie met behulp van een puntig wattenstaafje om het verwijderen van de preparaat-gel-gegoten in de daaropvolgende stappen te vergemakkelijken.
3. Opwarmen preparaat gel tot vloeibaar gemaakt via magnetron voor 10 – 20 s met de dop losgemaakt.
4. Voeg tussen 2,6 en 2,8 mL gesmolten verwerkinggel in de mal tot ongeveer het niveau met de bovenkant van de rand.
5. In een paar minuten, eenmaal gestomgd, verwijder de verwerking gel gegoten door het scheiden van de rand van de mal en vervolgens inverteren van de array schimmel.
6. Plaats een pincet tussen de mal en de rand om ze zorgvuldig te scheiden en gebruik vervolgens een celscraper om de cast uit de mal te laten verdwijnen als deze niet meteen loskomt.
7. Oogst de sferoïden van de hangende druppel plaat door de inhoud van een enkele put op een 100 of 150 mm Cell petrischaaltje met een pipet van 1.000 μL te pipetteren en de spheroid visueel te isoleren.
8. Pipet 5 μL van de put-inhoud inclusief de geïdentificeerde spheroid in een van de matrix putten, totdat de array is gevuld.
9. Wacht 3 min om ervoor te zorgen dat sferoïden zich op de bodem van de array bevinden voordat het zachtjes pipetteren van gesmolten verwerkingsgel in elk van de putjes voorzichtig is om de sferoïden niet te storen.
10. Voeg extra processing gel toe om de bovenkant van de array op peil te brengen en eenmaal gekoeld, plaats de gestalde spheroid-array in een gelabelde cassette voor verwerking.
11. Submerge gelabelde cassette in 4% formaline 's nachts om de sferoïden bij 4 °c op te lossen en vervolgens in 70% ethanol bij 4 °c op te slaan totdat het klaar is voor verwerking.
12. Proces met standaard 1 h paraffine programma en sluit vervolgens de spheroid-arrays zo in dat de verwerkte arrays rechtop staan met de bodem van de putjes die het dichtst bij het blok gezicht liggen.
13. Zorg ervoor dat de arrays zijn ingebed zo plat mogelijk, met het onderste gezicht flush met de onderkant van het blok en plaats blokken op ijs.
14. Laad het blok op de microtoom en stel het blok zo in dat het blad parallel is met het geladen blok vlak.
15. Gesneden array (samplediepte = 15 μm) tot de onderkant van de array putten zijn bereikt, zodat de ronde putten zichtbaar zijn op gesneden samples.
16. Schakel over naar een 5 μm samplediepte en blijf linten snijden en verzamelen. Controleer onder de Microscoop elke paar sneetjes om te bepalen of de spheroid-diepte is bereikt. Zodra sferoïden zijn bereikt, verzamelt u elke volgende dia totdat de sferoïden niet meer zichtbaar zijn.
17. Beits elke dia met standaard H & E-protocol.

7. levende dode Cytotoxiciteits test

1. Voeg aan elke hangende druppel de levende celkleur stof, calcein-AM toe aan de uiteindelijke concentratie van 2 μM, en de dode celkleur stof, ethidiumbromide homodimer-1 tot de uiteindelijke concentratie van 4 μM, in gedachten houden dat het druppel volume 20 μL is.
   Opmerking: Probeer volumes tot een minimum te beperken en voeg meestal 2 μL van de kleurstoffen samen.
2. Plaats de platen terug in een incubator die ingeklemd is in een 6-put-plaat met een deksel en incueren de sferoïden voor 45 min bij 37 °c.
   Opmerking: Afhankelijk van de grootte van spheroids varieert deze incubatietijd aanzienlijk. Bijvoorbeeld, sferoïden onder 400 μm vereisen doorgaans slechts 30 – 45 minuten incubatietijd, terwijl grotere sferoïden dichter bij 800 μm tot 90 min incubatietijd nodig hebben. Incubatie tijden moeten worden geoptimaliseerd voor het experiment van een individu.
3. Voor latere beeldvorming, oogst sferoïden met een 1.000 μL pipet in een bioveiligheidskast en stort elke spheroid op voorgereinigde glazen Microscoop glaasjes.
4. Beeld sferoïden door het glas, op een omgekeerde confocale Microscoop.
   Opmerking: Afhankelijk van de nabijheid van de confocale Microscoop tot het lab waarin sferoïden worden geoogst, kunnen de sferoïden ofwel worden afgebeeld in de oorspronkelijke druppel medium geplaatst op de glijbaan of omhuld in 2% agarose als er meer stabiliteit nodig is voor spheroid-transport.
5. Gebruik de multidimensionale acquisitie modus in de Microscoop software, zoek de spheroid met behulp van dic-verlichting bij 10x vergroting en scan vervolgens het z-vlak om de hoogten te identificeren die de spheroid omvat.
6. Klik op z-serie en stel de boven-en ondergrens van de z-scan iets hoger dan de bovenkant van de spheroid en iets lager dan de onderkant van de spheroid.
7. Prikkel de spheroïden met 488 nm voor calcein-AM (levende cellen; groen) en 561 nm voor ethidiumbromide homodimer-1 (dode cellen; rood) met de door de software aanbevolen stapgrootte, maximale Gain en minimale belichting voor elke kleur.
8. Klik op verwerven om een samengestelde z-stack-afbeelding van levende en dode cellen binnen de spheroid te verkrijgen.
9. Kwantificeer Live/Dead-verhoudingen met behulp van beeldverwerkingssoftware om een percentage van de pixel intensiteit te kwantificeren van het kanaal dat overeenkomt met levende cellen versus het percentage van de pixel intensiteit van het kanaal dat overeenkomt met dode cellen uit de samengestelde z-projectie beelden.
   Opmerking: Als gevolg van de beperkingen in het kwantificeren van een 3D-structuur met een 2D-projectie, een alternatieve methode om levend versus dode fluorescentie te kwantiseren, binnen de hangende druppel platen is het gebruik van een plaat lezer volgens het protocol dat is meegeleverd met de calcein-AM en ethidiumbromide homodimer-1 Kit.

8. immunofluorescentie

1. Verwarm een laag smeltend 2% agarose-oplossing, dus de oplossing is visceus en net boven het smeltpunt en de plaats op een Microscoop glijbaan om een zacht bed van agarose te creëren
2. Oogst sferoïden door de daling van 20 μL PBS door de druppel op het zachte bed van 2% agarose.
   Opmerking: Dit moet snel gebeuren zodat agarose niet stollen voordat sferoïden zijn ingebed.
3. Zodra de agarose afkoelt en gels met de geoogste spheroid binnen (minder dan 5 min), voeg dan 4% neutrale gebufferde formaline toe om de spheroids te fixeren. Voeg afwisselend ijskoude methanol toe en fixeer de agarose-ingesloten sferioïden bij-20 °C gedurende 30 minuten.
4. Was 3x voor 5 min elk met 1x PBS en gooi de PBS na elke wasbeurt af.
5. Blok voor 1 uur bij RT met 10% serum (d.w.z. paarden serum) en 0,15% zeepoplossing (Triton X-100) in 1x PBS.
6. Was 3x voor 5 min elk met 1x PBS en gooi de PBS na elke wasbeurt af.
7. Beits-spheroïden met gewenst fluorescerende antilichaam bij aanbevolen of vooraf bepaalde antilichaam verdunning (d.w.z. fluorescerend gelabeld phalloidine bij een 1:100-verdunning), die gedurende ten minste 90 min bij kamertemperatuur wordt ingebroed, bedekt met licht.
   Opmerking: De protocollen zullen variëren afhankelijk van antilichamen en doel-en antilichaam verdunning moeten afhankelijk van het experiment mogelijk worden geoptimaliseerd.
8. Visualiseer fluorescentieerde sferoïden met de omgekeerde confocale Microscoop met behulp van methoden die in de vorige sectie zijn beschreven voor beeldvormings-sferoïden.
9. Samengestelde z-stack beelden tonen de 3D-morfologie in de spheroids.

9. verzameling en analyse van Kanker stamcel populaties met Flowcytometrie

1. Voorbereiding van sferoïden voor Flowcytometrie analyse
   1. Verzamel sferoïden van elke put in de hangende druppel platen met een pipet van 1.000 μL en stort ze in een centrifugebuis van 15 ml voor uitsplitsing met herhaalde pipetteren.
   2. Graaf levensvatbare cellen op een hemocytometer met behulp van Trypan Blue om het celnummer en de concentratie te bepalen zoals hierboven beschreven.
   3. Aliquot celsuspensie in vijf micro centrifugebuizen, zodanig dat elk een minimum van 50.000 cellen bevat.
   4. Centrifugeer alle buisjes bij 400 x g gedurende 5 minuten in een micro centrifuge.
   5. Aspireren de supernatant van elke buis en respenderen pellets in 100 μL buffer.
   6. Label buizen "onbevlekt", "DAPI", "APC-ISO", "DEAB", en "ALDH/CD133", respectievelijk.
   7. Voeg 0,5 μL APC-Isotype-antilichaam toe aan de APC-ISO-buis en 1 μL CD133-antilichaam aan de ALDH/CD133-buis, zoals bepaald door seriële verdunning en aanbeveling van de fabrikant.
   8. Voeg 5 μL DEAB-reagens en 0,5 μL ALDH toe aan de DEAB-buis en 1 μL ALDH aan de ALDH/CD133-buis.
   9. Vortex alle buisjes gedurende ongeveer 2 sec. en incuberen bij 37 °C gedurende 45 min.
   10. Vortex alle buisjes opnieuw en Centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 x g in een micro centrifuge.
   11. Label FACS buizen "onbevlekt", "DAPI", "APC-ISO", "DEAB", en "ALDH/CD133" en vul een geïsoleerde schuim container opzij te zetten.
   12. Aspirate supernatant en hervat de "Onbevlekte" controle in 400 μL FACS buffer (1x PBS met 2% FBS) en alle andere buizen in 400 μL FACS DAPI buffer (FACS buffer met 300 μM 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole).
   13. Plaats de buisjes in de container met ijs tot ze op een flow cytometer worden geanalyseerd.
       Opmerking: Om te sorteren voor eierstokkanker stamcellen, verzamel alle cellen die de cytometer maatregelen om ALDH + en CD133 + met Gates ingesteld op te nemen 0,5% niet-specifieke APC-signaal en 0,15% niet-specifieke ALDH + signaal. Ten minste 10.000 cellen moeten worden geanalyseerd op betrouwbare resultaten. Meer informatie is te vinden in recente publicaties^3,17.
2. Analyse van ALDH +/CD133 + populaties in FlowJo
   1. Dubbelklik op het Flowjo -pictogram om het programma te openen en sleep. FCS-bestanden die zijn verkregen van flowcytometry-software naar de werkruimte.
   2. Dubbelklik op het niet-bevlekt bestand en stel de y-as in op de zijspreidings hoogte (SSC-h) en de x-as om de spreidings hoogte te doorsturen (FSC-h).
   3. Klik op de T -knop naast elke as om de schaal en transformatie aan te passen om de scheiding tussen verschillende celpopulaties te maximaliseren.
   4. Klik op de knop veelhoek gating en teken een veelhoek poort rond de celpopulatie en label de populatie ' cellen '.
   5. Dubbelklik op de cellen populatie in de werkruimte om alleen de cellen in de populatie ' cellen ' te bekijken en klik vervolgens op de FSC-as om het askanaal te veranderen in FSC-breedte en klik vervolgens op de SSC-as en verander het askanaal naar de FSC-H.
   6. Kies de rechthoek Gate gereedschap en teken een rechthoek rond de meest dichtbevolkte populatie van cellen over de gehele y-as om mogelijke dubbeltjes aan de rechterkant van het venster uit te sluiten en deze poort ' enkele cellen ' te labelen.
   7. Klik met de rechtermuisknop en kopieer de cellen en de geneste enkele cellen Gate en plak ze onder elk voorbeeld in de werkruimte.
   8. Dubbelklik op de enkele cellen Gate genest onder het DAPI-voorbeeld in de werkruimte om de eencellige populatie uit die voorbeeld buis te bekijken en klik op de FSC-as en verander het askanaal naar het DAPI-gebied kanaal.
   9. Klik op de SSC-as en wijzig het askanaal in histogram.
      Let op: de levende cellen zullen naar links zijn als ze DAPI uitsluiten, terwijl dode cellen in de DAPI zullen worden weergegeven en rechts van de grafiek verschijnen.
   10. Klik op de T -knop naast de DAPI -as en klik op as aanpassen om de schaal aan te passen om de scheiding tussen DAPI-positieve en DAPI-negatieve pieken te maximaliseren.
       Opmerking: Een venster zal verschijnen met schaalopties. Vaak, het instellen van het schaal veld op biex en het aanpassen van de extra negatieve decennia en breedte basis zal de grootste scheiding opleveren.
   11. Klik op toepassen in het pop-upvenster om schalingswijzigingen toe te passen, kies de knop bereik poort en verdeel deze over de negatieve piek van de DAPI, overeenkomend met de populatie van de levende cellen.
   12. Label deze poort ' Live Cells ' en klik met de rechtermuisknop om de ' Live Cells ' poort te kopiëren om deze te plakken onder de ' single Cells ' Gate onder de ' APC-ISO ', ' DEAB ', en ' ALDH/CD133 ' tubes om hetzelfde deel van de levende cellen in elke sample Tube te selecteren.
   13. Dubbelklik vervolgens op de populatie van levende cellen die is genest onder het APC-ISO-voorbeeldbestand en schakel de x-as over naar het Aldh-gebied kanaal en de y-as naar het APC-gebied kanaal.
   14. Nogmaals, pas de asschaal aan door op de T -knop te klikken en de as van elke as aan te passen , zodat de gebeurtenissen in de linkerbenedenhoek van het plot worden gelokaliseerd en selecteer de optie Quad Gate en klik op het plot venster om een Kwadrant poort te vestigen .
   15. Pas het snijpunt van de poort zodanig aan dat ongeveer 0,5% van de populatie in de linkerbovenhoek van het plot venster of het ' APC positive ' Kwadrant ligt.
       Opmerking: Deze 0,5% vertegenwoordigt de niet-specifieke kleuring van het APC-Isotype.
   16. Klik met de rechtermuisknop op elk kwadrant label afzonderlijk in de werkruimte en wijzig deze op de juiste manier. Besturingselement of opdracht klikt u op elk kwadrant poort label in de werkruimte en kopieer deze.
       Opmerking: ' Q1 ' staat voor CD133 + cellen; ' Q2 ' staat voor CD133 + en ALDH + ' cellen; ' Q3 ' staat voor ALDH + cellen; en ' Q4 ' staat voor CD133-en ALDH-cellen.
   17. Plak de Kwadrant poorten op de populatie van levende cellen die is genest onder het ' deab ' bestand. Pas de verticale lijn zodanig aan dat ongeveer 0,15% van de celpopulatie binnen het ' ALDH + ' Kwadrant ligt, waarbij de horizontale lijn niet wordt verplaatst.
       Opmerking: Deze 0,15% vertegenwoordigt een niet-specifiek ALDH-signaal.
       1. Om ervoor te zorgen dat de horizontale lijn niet van positie verandert, kopieert u de nieuwe Kwadrant poorten onder het Deab -bestand en plakt u deze op de Live cellen onder het APC ISO-bestand. Selecteer Ja wanneer u wordt gevraagd de bestaande Kwadrant poort te vervangen.
       2. Controleer in de werkruimte dat het ' CD133 + ' percentage nog steeds ongeveer 0,5 is onder het bestand ' APC-ISO '.
   18. Kopieer en plak de Kwadrant-Gates in de populatie ' Live Cells ' van het bestand ' ALDH/CD133 '.
       Opmerking: Het percentage van de levensvatbare celpopulatie aanwezig in het kwadrant rechtsboven is het percentage ALDH + en CD133 + dubbele positieve CSCs in het monster.

Representative Results

Spheroids gevormd met cellijnen of door de patiënt afgeleide CSCs kunnen worden gevormd met een reeks kleine celaantallen binnen hangende druppeltjes (Figuur 2a). Spheroids vormen betrouwbaar met slechts 10 cellen per put, waardoor zeldzame patiënt monsters kunnen worden beschermd. Cellen binnen deze sferoïden zijn omgeven door andere cellen in 3 dimensies zoals ze zouden zijn in vivo, waardoor fysiologisch celcelcontacten en diffusie percentages. Tumor cellen binnen de spheroïden prolifereren waardoor de sferoïden in de loop van de tijd in grootte toenemen (Figuur 2b). Naarmate meer agressieve patiënt cellen of cellijnen sneller groeien dan hun tegenhangers, is het belangrijk om de proliferatie capaciteit van elk monster te kwantificeren en te onderzoeken hoe medicamenteuze behandeling de proliferatie van elk monster beïnvloedt. Om dit te doen, een metabole activiteit Assay, zoals een resazurin gebaseerd fluorescentie Assay, kan gemakkelijk worden uitgevoerd met de 384-goed fysiologisch platform, zonder enige vereiste voor het oogsten van spheroids, waarvan de resultaten kunnen worden gezien in figuur 2c. Meerdere sferoïden kunnen ook worden geoogst, opgelost, gesectioneerd en gekleurd met hematoxyline en eosine of immunofluorescentie-antilichamen op hetzelfde moment om celmorfologieën en organisatie binnen sferoïden te identificeren, evenals de verdeling van celtypen en ECM eiwitten (Figuur 2D, E).

Om het effect van medicamenteuze behandeling op de morfologie van de spheroid te onderzoeken, kunnen sferoïden gemakkelijk worden gevisualiseerd door phase contrast Imaging (Figuur 3a). Meer kwantitatief, het effect van medicamenteuze behandeling op tumor cel of CSC proliferatie kan ook worden gemeten door resazurin kleurstof fluorescentie lezingen in Control onbehandelde sferoïden in vergelijking met in de drug behandeld sferoïden (Figuur 3b). Als een validatie van celdood na medicamenteuze behandeling, kan de levensvatbaarheid binnen de controle en de met geneesmiddelen behandelde sferoïden gemakkelijk worden bepaald via de toevoeging van calcein-am en ethidiumbromide homodimeer-1 aan meerdere spheroïden voor elke aandoening (figuur 3c). Na incubatietijd kunnen gekleurde spheroïden met een pipet worden geoogst en op een confocale Microscoop worden afgebeeld.

Tot slot kunnen de aanwezigheid van CSCS en andere celfenotype markers worden geanalyseerd met Flowcytometrie (Figuur 4) door sferoïden te oogsten en te dispergeren in enkelvoudige celsuspensies. Vergelijking van levensvatbare CSCs tussen verschillende medicamenteuze behandelingen binnen dezelfde patiënt, evenals, tussen patiënten kan helpen om de effectiviteit van verschillende CSC-targeting drugs te onderscheiden op een patiënt specifieke manier.

Figuur 1:3D hoge doorvoer 384 hangende drop spheroid plaat opslag en plating lay-outs. A) hangende druppel plaat wordt op de bodem van een 6-waterput, gedeeltelijk gevuld met water, geplaatst. (B) deksel van 6-put plaat wordt bovenop de hangende druppel plaat geplaatst om een steriele hydratatie kamer te creëren. C) 6-well plaat stapel om te worden verzegeld met een thermoplastische strook ter bescherming tegen vochtverlies en verontreinigingen. D) afwisselend plating patroon voor hangende druppel plaat. Roze vierkantjes geven putten aan die gevuld zijn met cellen en middelhoog mengsel. Blauwe gebieden geven water kamers voor hydratatie. Grijze dozen geven lege putjes aan die als een grens tussen hydratatie kamers en spheroid druppeltjes fungeren. (E) levend beeld van hangende druppel plaat verguld met het alternerende goed patroon. (F) alle goed plating patroon lay-out gebruikt voor hoge doorvoer opknoping drop sferoïden experimenten. Roze vierkantjes geven cel vergulde putten en blauwe gebieden geven water gevulde kamers voor verhoogde hydratatie. Grijze vierkantjes geven rand putten aan die fungeren als grens tussen hydratatie secties en celcultuurgebieden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: patiënt afgeleide CSC-sferoïden morfologie en proliferatie binnen 3D hangende druppels. (A) live beeld van bereide 384-hangende druppel spheroid plaat zoals gezien vanaf de bodem. B) progressieve lichtmicroscoop beelden van de patiënt afgeleide CSC-spheroid-groei na 2, 3 en 5 dagen in een hangende druppel. Schaal staven = 100 μm. (C) resazurin intensiteit fluorescentie toont significante toename na 7 dagen van hangende druppel cultuur, corgerelateerd aan proliferatie en groei van de hangende druppel patiënt afgeleide CSC-sferoïden (ongepaarde tweezijdige t-toets, p < 0,0001, n > 10). D) afbeelding van een spheroid-array-mal die wordt gebruikt voor het maken van een cast voor het verzamelen van sferoïden voor het snijden van histologie. E) H & E beeld van een gecultiveerde spheroid met primaire eierstokkanker stamcellen, mesenchymale stamcellen, endotheelcellen, en donor perifeer bloed mononucleaire cellen verzameld in de spheroid-array. Scare Bar = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: analyse van de medicamenteuze behandeling van door de patiënt afgeleide CSC-sferoïden hangende druppels. A) de door de patiënt afgeleide CSC-spheroïden werden bij 50 cellen/druppel behandeld met toenemende concentraties van paclitaxel na 5 dagen groei. Representatieve beelden genomen 48 h na medicamenteuze behandeling. B) kwantificering van de cellulaire levensvatbaarheid via resazurin fluorescentie bij toenemende concentraties van de behandeling met paclitaxel. Alle monsters hebben een aanzienlijke vermindering van de levensvatbaarheid ten opzichte van de controle. (One-way ANOVA, p < 0,0001, n > 8). C) confocale beeldvorming van levende (calcein-am) en dode (ethidium homodimer-1) cellen binnen hangende valspheroid. Groene kleur geeft aan dat levende cellen en rode kleur de dode celpopulatie aangeeft. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: kwantificering van CSCS in door de patiënt afgeleide CSC-sferoïden gegenereerd en onderhouden op het 384-hangende drop platform. (A) bij het analyseren van de Flowcytometrie-gegevens wordt de celpopulatie eerst geselecteerd met behulp van een polygoon poort om alle gebeurtenissen te elimineren die aan puin kunnen worden toegeschreven. B) de enkelvoudige cellen worden vervolgens geselecteerd om mogelijke Doublet signalen te elimineren die de resultaten kunnen verhullen. (C) alle enkelvoudige levende cellen worden vervolgens geselecteerd op basis van DAPI-uitsluiting. D) de verticale as van een Kwadrant poort wordt in de deab-besturing aangepast om ongeveer 0,15% niet-specifieke aldh-kleuring mogelijk te maken. E) de horizontale as van de Kwadrant poort wordt in het APC ISO-besturingselement aangepast om ongeveer 0,5% niet-specifieke APC-kleuring mogelijk te maken. (F) de Kwadrant poort wordt vervolgens gebruikt om het percentage van CD133 +, aldh + en CD133 +/aldh + cellen aanwezig zijn in de populatie van de levende cel in de experimentele CD133 plus aldh voorwaarde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Het 384-well Hanging drop Plate-platform voor 3D-spheroid-formatie is een eenvoudig te implementeren tool voor elke celbiologie of Kankerbiologie Labs. Dit fysiologisch platform maakt de studie van cellijnen, evenals, primaire patiënt monsters binnen fysiologisch relevante 3D-culturen mogelijk, terwijl het een hoge doorvoer van drugs screening toestaat. Het platform zorgt er ook voor dat de cultuuromstandigheden sterk instelbaar zijn, waardoor een strakke controle over de dichtheden, celcocultuurverhoudingen, extracellulaire componenten en medium samenstelling mogelijk wordt. Bovendien maakt dit fysiologisch platform het mogelijk om experimenten zeer vatbaar te maken voor downstreamanalyse technieken die grote of kleine aantallen cellen vereisen, zoals qRT-PCR, FACS en verschillende beeldvormingsmethoden. Terwijl gebruiksgemak wordt geleverd met ervaring, worden nieuwe stagiairs snel succesvol, zodra de snelheid en het gemak van pipetteren worden beheerst. Dit fysiologisch platform is dus zeer toepasbaar voor gepersonaliseerde 3D drug screening, CSC biologie en chemoresistance onderzoeken.

Sommige aandachtspunten bij de nieuwe implementatie van dit platform zijn onder andere plaat overdracht en medicamenteuze behandeling. Bij het overdragen van platen van de ene locatie naar de andere, zoals vereist voor routine voeding, beeldvorming en analyse, moeten zorgvuldige voorzorgsmaatregelen worden genomen om onnodige jostling te voorkomen. Grijp de platen van de buitenste randen zodat ze zo niveau mogelijk blijven en zorg ervoor dat er geen bewegingen bij het plaatsen van de plaat naar beneden gaan. Dit helpt om druppel verlies of het samenvoegen van naburige druppels te voorkomen. Evenzo moet waakzaam aandacht worden besteed aan de taak van de medicamenteuze behandeling van hangende druppel sferoïden om te voorkomen dat een verkeerde dosering van een hangende druppel spheroid. Zoals met elke techniek, vertrouwen en nauwkeurigheid met deze taken komen met de praktijk.

Een paar beperkingen zijn aangeboren aan dit 3D-fysiologisch platform. Ten eerste kan instabiliteit van de druppel een probleem zijn op lange termijn cultuur tijdpunten, als er geen zorg wordt besteed aan het handhaven van het juiste totale druppel volume. Bovendien moeten, zoals hierboven vermeld, het vervoer en de opslag van platen zorgvuldig worden uitgevoerd om verlies of samenvoeging van druppels te voorkomen. Bovendien wordt de grootte van deze 3D-omgeving bepaald door een stabiele druppelgrootte van 20 μL, hoewel veel replicaten kunnen worden geproduceerd voor een verbeterd aantal cellen.

Aanpassingen aan dit 3D-fysiologisch platform kunnen worden gebruikt om de doorvoer te verhogen en fysiologische kenmerken te veranderen. Zo kan de druppel indeling worden gewijzigd om elke put binnen de 384 goed plaat te bevatten om de doorvoer te verhogen. Bovendien is het 3D Hanging drop-platform zeer bevorderlijk voor co-cultuur onderzoeken door eenvoudige opname van meerdere celtypen in elke put. Om sferoïden met succes te genereren en te behouden, kunnen celkweekmedium en initiële celseeding-dichtheid eenvoudig worden gemoduleerd, om de spheroid-grootte strak te reguleren. Met deze zeer instelbare variabelen zijn talloze onderzoeken mogelijk binnen het rijk van 3D-fysiologische patiënten afgeleide spheroids.

Terwijl de meeste analysemethoden die worden beschreven op grote schaal worden gebruikt in wetenschappelijk onderzoek, zijn er een paar beperkingen specifiek voor het analyseren van hangende druppel gegenereerde sferoïden met een aantal van deze methoden. Bijvoorbeeld, wanneer sferoïden voor langere tijd worden gekweekt in hangende neerzet platen, kan de druppelgrootte aanzienlijk toenemen waardoor druppels kunnen schudden tijdens fase contrast Imaging, wat de beeldkwaliteit mogelijk in gevaar brengt. Dit kan worden verbeterd door het nemen van een gelijkwaardige hoeveelheid medium uit elk goed vóór het toevoegen van vers medium. Bovendien kunnen technieken zoals Flowcytometrie en het tellen van individuele levensvatbare cellen worden beïnvloed door de techniek die wordt gebruikt om spheroids te splitsen, wat schadelijk kan zijn voor cellen. Als zodanig is het belangrijk voor elk lab om spheroid-aggregatie technieken te optimaliseren op basis van hun cellen en te experimenteren om celbeschadiging te minimaliseren terwijl de dichtheid van één cel wordt gemaximaliseerd. Tot slot kan de histologische analyse van sferoïden worden bemoeilijkt door hun geringe omvang en moet de praktijk om succesvolle secties te verkrijgen.

Over het algemeen is het 3D hangende drop spheroid-platform breed aanpasbaar binnen kanker en niet-kankeronderzoek. Het systeem is gemakkelijk te leren en biedt een 3D-fysiologisch relevante omgeving voor celkweek in een hoge doorvoer indeling. De initiatie tijd van dit 3D fysiologische platform is minimaal, met weinig, eventuele, technische analyse hindernissen te overwinnen. De veelzijdigheid van dit systeem biedt een middel voor patiëntspecifieke screening van effectieve chemotherapeutica voor precisie geneeskunde, in een meer fysiologisch milieu dan ooit tevoren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	ILT25200056
10 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11E
10,000 cSt Si oil	Millipore Sigma	63148-62-9	Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.
100 mm tissue culture dish	Thermo Scientific	130182
15 mL conical tube	Celltreat	FL4021
1x DMEM for Serum Free Medium	Gibco	11965-092
1x F12 for Serum Free Medium	Gibco	11765-054
1x phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	ILT10010023
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	D1306
40 µm filter	Fisher Scientific	22363547
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Accutase	Innovative Cell Technologies Inc.	1449	A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.
ACK Lysing Buffer	Thermo Scientific	A1049201
alamarBlue	Invitrogen	DAL1025	Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.
ALDEFLUOR assay kit	Stem Cell Tech	1700	Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stem Cell Tech	1705	Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.
Andor iXon x3 CCD Camera	Oxford Instruments	-
Antibiotics and Antimycotics	Gibco	15240-062
APC-isotype IgG2b	Miltenyi biotec	130-092-217	Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.
B27 Supplement	Gibco	17504044
basic Fibroblast Growth Factor	Stem Cell Technologies	78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate Reader	BioTek	7091000
CD133-APC	Miltenyi biotec	130-113-184	Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.
cellSens Dimension Software	Olympus
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394	Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging System	Life Technologies	AME3300
Fetal Bovine Serum - premium (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F4375
Hemacytometer	Hausser Scientific	1490
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-5006
Human Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC2543
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement	Gibco	51500-056
Live/Dead viability kit	Invitrogen	L3224	Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140-050
MetaMorph 7.8 Software	Molecular Devices	-
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope	Olympus	-
Olympus IX83 Research Inverted Microscope	Olympus
Parafilm M	Thomas Scientific	7315D35	Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix	HDP1384-8	Available through Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488	Invitrogen	A12379	Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.
ProJet 3500 HD Max	3D Systems	-	3D printer
Sterile DI water	Fisher Scientific	353046
Trypan Blue	Gibco	15250061	Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.
VisiJet M3 Crystal	3D Systems	-	A biocompatible polymer material for 3D printing.
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	-