Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von vom Patienten abgeleiteten Sphäroiden und nachgelagerte Analysen, einschließlich Quantifizierung der Proliferation, Zytotoxizitätstests, Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Bildgebung, um Potenzial der Kandidaten als antineoplastische Therapeutika. Dieses Protokoll unterstützt Präzisionsmedizin mit der Identifizierung spezifischer Medikamente für jeden Patienten und das Krankheitsstadium.

Abstract

In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren zur Erzeugung von Tumorsphäroiden innerhalb von 384 gut hängenden Tröpfchen, um ein Hochdurchsatzscreening von Krebstherapeutika in einer physiologisch repräsentativen Mikroumgebung zu ermöglichen. Wir skizzieren die Bildung von patientenabgeleiteten Krebsstammzellsphäroiden sowie die Manipulation dieser Sphäroide für eine gründliche Analyse nach medikamentöser Behandlung. Insbesondere beschreiben wir die Sammlung von Sphäroidmorphologie, Proliferation, Lebensfähigkeit, Arzneimitteltoxizität, Zellphänotyp und Zelllokalisierungsdaten. Dieses Protokoll konzentriert sich stark auf Analysetechniken, die leicht mit der 384-Well hängenden Tropfen-Plattform implementiert werden können, so dass es ideal für High-Through-Through-Drogen-Screening. Während wir die Bedeutung dieses Modells in der Eierstockkrebsforschung und der Krebsstammzellforschung betonen, ist die 384-Well-Plattform für die Erforschung anderer Krebsarten und Krankheitsmodelle zugänglich und erweitert den Nutzen der Plattform auf viele Bereiche. Durch die Verbesserung der Geschwindigkeit des personalisierten Arzneimittelscreenings und der Qualität der Screening-Ergebnisse durch leicht zu implementierende physiologisch repräsentative 3D-Kulturen wird diese Plattform bei der Entwicklung neuer Therapeutika und patientenspezifischer Behandlungsstrategien und haben daher weitreichende klinische Auswirkungen.

Introduction

Die weltweite krebsbedingte Sterblichkeit erreichte 2018 eine Zahl von 9,8 Millionen Todesfällen¹, was die Notwendigkeit der Entwicklung verbesserter Therapeutika unterstreicht. Leider steigen die Kosten für die Entwicklung von Krebsmedikamenten, wobei die Entwicklung eines einzigen Medikaments, das etwa 650 Millionen US-Dollar kostet, darauf hinweist, dass verbesserte Strategien zur Entwicklung neuer Krebsmedikamente erforderlich sind. Krebsstammzellen (CSCs), die durch erhöhte Chemoresistenz gekennzeichnet sind³, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die Fähigkeit, neue Tumoren⁴ auszusäen, werden als verantwortlich für Tumorrezidiv⁴, Metastasierung⁵und Chemoresistenz^4,6, die alle zur bösartigen Kapazität des Tumors und damit zur hohen Zahl von Todesopfern beitragen. Bei Eierstockkrebs, Diese Zellen werden in der bösartigen Aszites Flüssigkeit in der Peritonealhöhle angereichert gefunden, ein Zustand mit schlechten klinischen Ergebnissen verbunden¹. Als Folge der bösartigen Fähigkeiten von CSCs wurde versucht, neue CSC-Medikamente zu entwickeln, die in Verbindung mit herkömmlichen Chemotherapien verwendet werden können. Es gibt mehrere Herausforderungen, die die Entwicklung von CSC-Targeting-Medikamenten begleiten, darunter: 1) Schwierigkeiten bei der Ausweitung und Aufrechterhaltung von CSCs in vitro; 2) Knappheit der Patientenproben; 3) physiologische Relevanz der Kulturplattform; und 4) Heterogenität der Arzneimittelempfindlichkeit zwischen Patienten. Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung einer 3D-Kulturplattform mit hohem Durchsatz, die jede dieser Herausforderungen bewältigen kann. Insbesondere ermöglicht dieses System ein schnelles Arzneimittelscreening mit einer kleinen Anzahl von patientenabgeleiteten Ovarial-CSCs und ist für nachgelagerte Analysetechniken sehr gut geeignet. Unsere Plattform ist zwar ideal für die Untersuchung von Eierstockkrebs und CSCs, aber auch bei der Untersuchung anderer Krebsarten und differenzierter Zelltypen in komplexen 3D-Umgebungen.

Komplexe dreidimensionale (3D) Modelle sind entscheidend für die Untersuchung der Tumor-Mikroumgebung (TME), die eine 3D-Nische aus Krebszellen,nicht-krebsunterstützenden Zellen und extrazellulären Matrixproteinen (ECM) 4 ist. Diese 3D-Umgebung führt zu einer einzigartigen Zellmorphologie, Zellzell- und Zellmatrix-Wechselwirkungen, Zelldifferenzierung, Zellmigration, Zelldichte und Diffusionsgradienten im Vergleich zur traditionellen 2D-Zellkultur in vitro⁴. All diese Faktoren gipfeln in einer differenzierten Arzneimittelreaktion innerhalb von 3D-Kulturen, die eine erhöhte Arzneimittelresistenz und physiologische Relevanz aufweisen^7,8. Aufgrund der Rolle des 3D-TME bei der CSC-Differenzierung und Chemoresistenz ist es wichtig, CSC-Targeting-Medikamente in physiologischen Mikroumgebungen zu überprüfen. Die Verbesserung der physiologischen Relevanz von CSC-Medikamentenscreening-Plattformen hat das Potenzial, patientenspezifische Arzneimittelscreenings, Arzneimittelentwicklung, Formulierung von Behandlungsstrategien und letztlich klinische Ergebnisse zu verbessern. Ebenso wichtig ist es, dass die für das Arzneimittelscreening verwendete Plattform mit hohem Durchsatz und kompatibel mit nachgelagerten Analysemethoden ist, um Kosten, Zeit und klinische Übersetzungszeit vielversprechender Medikamente zu minimieren⁹.

Derzeit ist das komplexe TME am besten für Arzneimittel-Screening-Anwendungen durch In-vivo-Modelle wie murine syngene Tumormodelle, zelllinienabgeleitete Xenografts und patientenabgeleitete Xenograft-Modelle (PDX)¹², da sie physiologische Bedingungen. Der niedrige Durchsatz dieser Modelle sowie die Kosten,-Zeit- und technischen Fähigkeiten, die sie benötigen, schränken jedoch ihren Nutzen in schnellen, hochdurchsatzstarken Arzneimittelscreening-Anwendungen^{ein 13}. Als Alternativen zu diesen In-vivo-Modellen verwenden viele In-vitro-3D-Modelle Hydrogele⁸, Kultur in mikrofluidischen Geräten oder "Organ-on-a-Chip"-Geräten^10,14und nicht-anhantigische Kulturen^3,8 wurden auch entwickelt, aufgrund ihrer geringen Eintrittsbarriere in Bezug auf Kosten, Zeit und erforderliche Fähigkeiten.

Hydrogelkulturplattformen sind vorteilhaft in der Feinkontrolle über die Matrixzusammensetzung, mechanische Eigenschaften und Matrixstruktur¹⁵; sie können jedoch die Zellkultur mit hoher Dichte hemmen¹⁴. Darüber hinaus kann die Ernte von Zellen aus Hydrogelen die nachgelagerte Analyse aufgrund potenziell schädlicher Auswirkungen der Erntemethoden erschweren¹⁵. Mikrofluidische Geräte hingegen sind Mikroskalige Geräte, die die Ausgangserkennung innerhalb desselben Geräts und für die Zellkultur in physiologisch relevanten Maßstäben mit minimalem Reagenzienverbrauch, verringerter Reaktionszeit, minimiertem Abfall und schnelle Diffusion¹⁴. Diese Eigenschaften machen sie vielversprechende Plattformen für die Untersuchung der Arzneimitteltoxizität, Wirksamkeit, und Pharmakokinetik. Die Herausforderungen einer effizienten, quantifizierbaren, reproduzierbaren und benutzerfreundlichen 3D-Zellkultur sowie sperriger und kostspieliger Pumpsysteme haben jedoch mikrofluidische Anwendungen in der Forschung mit hohem Durchsatz eingeschränkt¹⁰. Effiziente Erkennungseinstellungen und potenziell schwierige Implementierung enden über alle Bereiche hinweg haben auch die weit verbreitete Einführung mikrofluidischer Systeme behindert¹⁰.

Im Gegensatz dazu enthalten Sphäroide, die unter nicht haftenden Bedingungen in rotierenden Mischern (Nutatoren), ultraniedrigen Befestigungsplatten und hängenden Tröpfchen erzeugt werden, keine benutzerdefinierten Matrixkomponenten. Diese Methoden sind besonders relevant für die Untersuchung von Eierstockkrebs, da die nicht haftenden Bedingungen repräsentativ für die Bedingungen sind, unter denen Sphäroide innerhalb der Peritonealhöhle wachsen⁵. Innerhalb dieser nicht-haftenden Kulturmethoden haben Nutator- und hängende Tropfensphäroide gezeigt, dass sie eine höhere Verdichtung, Umgestaltung und Chemoresistenz im Vergleich zu Sphäroiden aufweisen, die in ultraniedrigen Befestigungsplatten erzeugt werden, was auf eine erhöhte physiologische Relevanz^16,17,18,19. Aufgrund der erhöhten Kapazität für High-Throughput-Screening von kleineren Brunnengrößen und minimal erforderlichen Zellzahlen ist die Sphäroid-Generierung in hängenden Fallplatten eine ideale Plattform für das Drogenscreening. Hier präsentieren wir eine abstimmbare 3D-physiologische Plattform in 384 gut hängenden Fallplatten, die einfach zu implementieren ist und für nachgelagerte Analysen hochgradig zugänglich ist, was sie ideal für das Screening von Eierstockkrebs und Eierstock-CSCs mit hohem Durchsatz ermöglicht.

Unsere 3D-physiologische Plattform bietet alle Vorteile der 3D-Kultur, einschließlich physiologischer Zell-Zell-Kontakte, Diffusionsgradienten, Zelldichten und natürlich produzierten ECM-Proteinen, die zu realistischen Wirkstoffreaktionen beitragen können^{16, 17,18,19}. Darüber hinaus sind wir durch die Erzeugung dieser Sphäroide mit patientenabgeleiteten CSCs in der Lage, patientenspezifische Reaktionen auf Medikamente¹ mit vielen technischen Replikationen gleichzeitig zu bestimmen, um Heterogenität zu überwinden, die innerhalb des Patiententumors gefunden werden kann. Proben²⁰. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die 3D-Kultur die Erhaltung der CSC-Populationen^3,16 verbessert und somit repräsentativ für angereicherte CSC-Populationen in den Aszites⁷ist. Dies in Kombination mit einer einfachen nachgelagerten Analyse, einschließlich der Durchflusszytometrieanalyse der Lebensfähigkeit und cSC-Proportionen, ermöglicht eine optimale Bewertung der CSC-Targeting-Arzneimittelwirksamkeit. Schließlich ist diese physiologische Plattform mit der Bildgebung zu mehreren Zeitpunkten während des Experiments, der Bewertung von Zelltod und Zellproliferation, der Zellorganisation und Morphologie mit Immunhistochemie, der löslichen Signalisierung mit ELISA auf konditionierten Zellphänotypen mit Durchflusszytometrie und Genexpression nach PCR.

Protocol

Alle Patientenproben werden im Rahmen eines zugelassenen IRB-Protokolls von einwilligenden Patienten entnommen, deren Proben nach der Tumordebulk- und Aszites-Sammlung deidentifiziert werden.

1. Erzeugung von Sphäroiden aus kleinen Zellennummern in 384-gut hängenden Tropfenplatten

1. Legen Sie die hängende Fallplatte in einen Beschallungsgerät gefüllt mit sterilem deionisiertem (DI) Wasser und beschallen Sie 20 min.
2. Mit einer handgeliebten Hand die Platte aus dem Beschallungsgerät entfernen und mit fließendem DI-Wasser waschen.
3. Lassen Sie die Platte in einem Bad von 0,1% Pluronsäure für 24 h sitzen, um Proteinadsorption und Sphäroid-Haftung an den Brunnen zu verhindern.
4. Platten mit einer handgeliebten Hand entfernen und beide Seiten der Platte mit fließendem DI-Wasser gründlich abspülen.
5. Die Platte in einem Biosicherheitsschrank kräftig anzapfen oder schütteln, um Wasser aus den Brunnen in einer sterilen Umgebung zu entfernen.
6. Legen Sie die Platte auf jeder Seite 30–60 min unter UV-Licht, um die Platten zu sterilisieren und die Kontamination zu minimieren.
   HINWEIS: Die Platte kann auch Ethylenoxidgas in einer Sterilisationskammer ausgesetzt werden.
7. Füllen Sie jeden Brunnen einer 6-Well-Platte mit 4-5 ml sterilem autoklaviertem DI-Wasser und sandwichen Sie die hängende Fallplatte zwischen deckel und unten der 6-Well-Platte. Fügen Sie 800–1.000 l steriles DI-Wasser um den Rand der hängenden Fallplatte hinzu, um eine feuchte, stabile und sterile Umgebung zu schaffen, um den Verlust des Volumens bei der Verdunstung zu minimieren (Abbildung 1 A-C).
8. Bei 2D-gewachsenen Zellen aspirieren mitteldeckende Zellen in ihrer Wachstumsphase und waschen mit 1x Phosphat gepufferter Saline (PBS), um Spuren von fetalem Rinderserum (FBS) im Wachstumsmedium zu entfernen, da es die Wirkung von Trypsin behindert.
9. Aspirieren Sie die PBS und fügen Sie 1,5-2 ml von 0,25% Trypsin-EDTA in die 100 mm Gewebekulturschale. Inkubieren Sie Zellen für 5 min in einem Inkubator auf 37 °C eingestellt.
   HINWEIS: Zellen können sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten lösen, daher sollten Platten auf einem Tischlichtmikroskop überprüft werden, um eine Zellablösung nach 5 min zu gewährleisten. Passen Sie das Abstellprotokoll pro Herstelleranleitung an, wenn Sie eine Zelllinie verwenden.
10. Fügen Sie 6–8 ml zelluläres Medium, das FBS oder ein beliebiges Serum enthält, in die Schale ein, um das Trypsin zu neutralisieren, Zellen mit einer 10 ml serologischen Pipt zu sammeln und sie in einem 15 ml konischen Rohr ablegen.
11. Zählen Sie zellen, indem Sie auf jeder Seite eines Hämozytometers 10 l der Zellsuspension laden, und folgen Sie dem zugehörigen Zählprotokoll.
12. Für patientenabgeleitete Zellen, die aus primären oder metastasierenden soliden Tumoren oder von Nicht-2D-kultivierten Aszites gewonnen wurden, bereiten Sie einzelzellige Suspensionen im serumfreien Medium (SFM) vor, die zuvor³beschrieben wurden.
13. Verarbeiten Sie Tumorgewebe wie zuvor beschrieben und speichern Sie einzellige Suspensionen für die spätere Verwendung in geeigneten Gefriermedium^21,22.
    1. Für festes Tumorgewebe mechanisch mit einer Rasierklinge und Filter resultierende Lösung durch einen 40-mm-Filter vor der Isolierung der gewünschten Zellen aus einem Dichtegradienten^21,22.
    2. Bei Aszitenproben konzentrieren Sichtrifugierungszellen, lyserote Blutkörperchen im Ammoniumchlorid-Kalium-Kaliumpuffer (ACK), waschen in 1x PBS, und durchlaufen dann einen 40-mm-Filter und eine 28 G-Nadel 4 mal²².
14. Zur Isolierung von Ovarial-CSCs sortieren Sie Zellen mit Durchflusszytometrie, wie unten ausführlich beschrieben.
15. Frisch isolierte Einzelzellen werden zur Lagerung eingefroren und bei Experimenten aufgetaut.
16. Um die Zellsuspension für die Beschichtung vorzubereiten, berechnen Sie das gewünschte Volumen der Zelllösung, das für die Beschichtung erforderlich ist: 20 l pro Tropfen X Gesamtzahl der Tröpfchen = Gesamtlösungsvolumen erforderlich.
17. Verdünnung der Zellkonzentration auf die gewünschte Zellkonzentration pro 20 l (d. h. 100 Zellen in einem Tropfen von 20 l).
18. Mischen Sie die Zellsuspension vor der Beschichtung vorsichtig mit einer Pipetette, um eine homogene Zellverteilung zu gewährleisten und die Gleichmäßigkeit zwischen tröpfchen den Tröpfchen zu verbessern.
    HINWEIS: Eine Übermischung der Zellsuspension kann zum Zelltod und zu Ablagerungen in den hängenden Tropfensphäroiden führen.
19. Legen Sie die Spitze der Pipette in einem Winkel von ca. 45° in den Brunnen und pipetdieren Sie 20 l der Zelllösung in jeden hängenden Tropfen gut.
    HINWEIS: Beschichtungsmuster können abhängig von der Anzahl der benötigten Sphäroide angepasst werden. Das Verschichten von Sphäroiden in jedem anderen Brunnen ist sicherer, wenn große Mengen von Sphäroiden in einem Experiment nicht benötigt werden, da es das versehentliche Zusammenführen der Tröpfchen verhindert (Abbildung 1D, E). Wenn große Mengen von Sphäroiden für ein Experiment benötigt werden, platten Sie jeden Brunnen, der eine Reihe von Grenzbrunnen auf allen Seiten hinterlässt (Abbildung 1F).
20. Legen Sie den Deckel der 6-Well-Platte wieder auf die hängende Fallplatte und verwenden Sie einen dehnbaren thermoplastischen Streifen, der unempfindlich gegen Feuchtigkeitsverlust ist, um die Kanten zu versiegeln und eine zusätzliche Verdunstung von Tröpfchen zu verhindern. Inkubieren in einem standardmäßigen CO2 befeuchteten Inkubator (5% CO2 , 37 °C).
21. Füttern Sie alle 2–3 Tage hängende Tropfen, um das Zellkulturmedium für die notwendigen Nährstoffe aufzufüllen, indem Sie jedem Sphäroid, das einen Brunnen enthält, 2 –3 l hinzufügen.
    HINWEIS: Nach der Bildgebung wird immer empfohlen, die hängenden Tropfen zu füttern, da die Luftexposition während der Bildgebung zu Verdunstung führt.

2. Hinzufügen von Zellkultur Medium zu hanging Drop Spheroid Platten

1. Entfernen Sie den thermoplastischen Streifen und deckel in einem Biosicherheitsschrank und fügen Sie jedem Brunnen, der einen hängenden Tropfen enthält, 2–3 l des entsprechenden Kulturmediums hinzufügen.
   HINWEIS: Das hinzugefügte Volumen hängt von der Tropfengröße und der Zeitspanne zwischen den Fütterungen ab.
2. Nach der Zuführung die Platte mit dem Deckel bedecken und frischen thermoplastischen Streifen auf die Außenkanten auftragen, bevor sie die Platte wieder in den Inkubator legen.

3. Phasenkontrast-Bildgebung der Sphäroid-Morphologie

1. Entfernen Sie den thermoplastischen Streifen um die Ränder der Platte in einem Biosicherheitsschrank.
2. Entfernen Sie vorsichtig die 384 gut hängende Tropfensphäroide Platte aus dem Biosicherheitsschrank mit dem Deckel noch an Ort und Stelle und legen Sie sie in der Mikroskop-Tablett an einem epifluoreszierenden Mikroskop.
3. Verwenden Sie die Live-Imaging-Option in der Imaging-Software bei 4x, 10x oder 20x, um die hängenden Tropfensphäroide zu beobachten und die gewünschten Bilder aufzunehmen.
4. Nach dem Speichern der Bilder, nehmen Sie die Platte zurück in den Biosicherheitsschrank und Futterzellen wie oben beschrieben.
5. Platte mit frischem thermoplastischem Streifen aufbeschließen und die versiegelte Platte wieder in den Inkubator legen.

4. Quantifizierung der Proliferation und Lebensfähigkeit innerhalb von Spheroiden

1. Plattensphäride in einer ausreichenden Anzahl von Brunnen, um >10 technische Replikationen für jeden zu untersuchenden Zeitpunkt (d. h. Tag 1 und Tag 7) zu erhalten.
   HINWEIS: Brunnen, die für diesen Test verwendet werden, werden in der Regel nicht wieder verwendet, da mögliche Verunreinigungen aus dem Resazurinfarbstoff entstehen.
2. Fügen Sie den für die Proliferationsanalyse vorgesehenen Brunnen 2 L filterte Resazurin-basierte Lösung hinzu, als ob sie diese Brunnen füttern und für eine vorher festgelegte Inkubationszeit inkubieren würden.
   HINWEIS: Diese Inkubationszeit kann je nach Zelltyp und Anzahl der Zellen im Sphäroid variieren. Es wird empfohlen, die erforderliche Inkubationszeit vor Beginn der Proliferationsexperimente zu bestimmen, indem Messungen nach 1 Stunde Inkubation beginnen und dann alle 30 min neu gemessen werden, bis das Signal in Kontrollbrunnen plateau ausgelesen wird. Assay-Messungen können beliebig oft genommen werden. Inkubation ist in der Regel 4 h für Sphäroide mit 100 Krebszellen initiiert.
3. Schalten Sie den Mikroplattenleser zuerst ein, gefolgt von der zugehörigen Plattenleser-Software mindestens 15 min vor dem ersten Lesen, damit sich die Maschine aufwärmen und die Innentemperatur bei 22 °C sichern kann, da die Temperatur die Messwerte beeinflussen kann.
4. Öffnen Sie ein 384-Well-Plattenprotokoll-Set mit 530/25 nm Anregung und 590/35 nm Emissionswellenlängen mit Optics auf Bottomgesetzt, Gain auf 35gesetzt, Lesegeschwindigkeit auf Normaleingestellt, und Lesetyp auf Fluoreszenz eingestellt .
5. Öffnen Sie nach der Inkubationszeit das hängende Tropfen-Sandwich in einem Biosicherheitsschrank und bringen Sie die 384-Well-Platte mit dem Deckel noch an Ort und Stelle zum Plattenleser.
6. Legen Sie die 384-Well-Platte mit dem Deckel noch in der Plattenleserschale, die nach dem Aufwärmen der Maschine verlängert wird, und klicken Sie auf OK, um die Platte zu lesen.
7. Geben Sie die Brunnenplatte auf die 6-Well-Basis zurück und legen Sie sie in den Inkubator. Wenn alle Zeitpunkte für den Tag gelesen wurden, versiegeln Sie die Platte erneut, bevor Sie sie wieder in den Inkubator legen.
8. Speichern Sie das Experiment im Popupfenster, und klicken Sie dann auf Ja, wenn Sie aufgefordert werden, PowerExports für Plate 1 auszuführen, um Daten aus der Plattenlesersoftware in eine Kalkulationstabelle für die Organisation auszugeben.
9. Durchschnittliche Fluoreszenzwerte für jede Bedingung und normalisieren sich durch den Durchschnitt der Kontrollbedingung, um Faltenveränderungen in der Proliferation unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu melden.
10. Beim Vergleich von Tag 1 mit Tag 7 normalisieren Sie sich durch Division durch Tag 1 durchschnittliche Fluoreszenz, um Faltenveränderung in der Proliferation im Laufe der Zeit zu erhalten.
11. Berechnen Sie Fehlerbalken mit Standardfehler des Mittelwerts und bestimmen Sie die statistische Signifikanz zwischen experimentellen Gruppen mit einem geeigneten statistischen Test, wie z. B. dem zweischwanzigen T-Test des Schülers.

5. Bewertung der Arzneimitteltoxizität in Sphäroiden

1. Arzneimittelverwaltung
   1. Liefern Sie das Medikament nach der Sphäroidbildung jederzeit so, dass eine Dosis von 2 l das 10-fache der gewünschten endgültigen Wirkstoffkonzentration enthält.
      HINWEIS: Hierbei wird eine Verdunstung von 2 l aus dem Tröpfchen vorausgesetzt, so dass das Endvolumen nach der medikamentösen Behandlung 20 l beträgt. Zum Beispiel wird eine 50-M-Dosis Cisplatin eine vorbereitete Lösung von 500 M haben. Wenn Tröpfchen mehr als 20 l enthalten, sollte die Konzentration des Arzneimittels und/oder des zugesetzten Volumens entsprechend angepasst werden.
   2. Behandeln Sie Kontrollproben mit 2 L Zellkulturmedium.
      HINWEIS: Cisplatin ist in Wasser löslich. Daher sind die Steuerelemente 2 L zellkulturmedium; Wenn das Arzneimittelfahrzeug jedoch ein anderes Lösungsmittel ist (z. B. DMSO), sollten Kontrollen ein Zellkulturmedium mit einer gleichen Konzentration von DMSO sein, wie es bei der medikamentösen Behandlung verwendet wird.
   3. Weiterhin das Medikament behandelt und die Kontrolle Sphäroide während der Gesamten tatkräftige Zeit mit Phasenmikroskopie zu überwachen, um eine visuelle Aufzeichnung der Wirkung der Arzneimitteltoxizität sowie mit Resazurin Farbstoff wie oben beschrieben, um die zelluläre Lebensfähigkeit zu überwachen.
      HINWEIS: Typischerweise werden die Medikamente nach 5–7 Tagen in den hängenden Tropfen und Toxizität nach 48--72 hs gemessen hinzugefügt, aber dies kann je nach Experiment variiert werden. Medikamente können hinzugefügt werden, sobald sich stabile Sphäroide gebildet haben, in der Regel zwischen 1 und 4 Tagen.
2. Quantifizierung der Arzneimitteltoxizität durch Zellzählung
   1. Am Endzeitpunkt der medikamentösen Behandlung, sammeln Sie 10 Sphäroide jeweils aus der Kontrolle und medikamentös behandelten Brunnen mit einer 1.000 L Pipette und legen Sie jeden Satz von Spheroiden in seinem eigenen Mikrozentrifugenrohr.
   2. Unterteilen Sie die Sphäroide durch wiederholtepipetieren in einzelne Zellen.
      HINWEIS: Um potenzielle Zellschäden durch wiederholte Pipetten zu reduzieren, kann die enzymatische Verdauung mit einem Enzym wie Trypsin durchgeführt werden, um die Erzeugung von einzelligen Lösungen vor der Pipettierung zu erleichtern²³. Die Minimierung des Zelltodes durch Pipettierung hängt vom Zelltyp ab und sollte entsprechend optimiert werden. Wenn Sie über den Tod aufgrund der Disaggregation besorgt sind, beziehen Sie sich auf die Analyse mit Resazurinfarbstoff und den Zytotoxizitätstest für alternative Methoden, die keine Sphäroid-Disaggregation erfordern.
   3. Zentrifugieren Sie die Rohre für 5 min bei 400 x g, um Zellen am Boden von Mikrozentrifugenröhrchen zu sammeln und den Überstand anzusaugen.
   4. Fügen Sie jedem Rohr 20 L Frischmedien oder 1x PBS hinzu und mischen Sie sie gut.
   5. Fügen Sie Trypan blue im Verhältnis von 2 l Trypan-Blaufleck zu 20 l Zellsuspension hinzu.
   6. Laden Sie 10 L Zellen und Trypan-Blaususpension in jede Kammer des Hämozytometers und zählen Sie Zellen unter einem Lichtmikroskop, wobei blau gefärbte Zellen abgestorbene Zellen und unbefleckte Zellen für lebende Zellen darstellen.
      1. Die lebende Zelle % = (Anzahl der lebenden Zellen - Gesamtzahl der Zellen) x 100.

6. Sphäroid-Charakterisierung mit histologischen Techniken

HINWEIS: Es gibt zwei Formenoptionen 3D in einem biokompatiblen Polymer gedruckt, um Sphäroid-Array-Formen von Ivanov et al.²⁴: 1) 20 Well-Form, die 28 l pro Brunnen und 2) 63 Brunnenform halten kann, die 9 l pro Brunnen halten kann (Abbildung 2D) zu replizieren.

1. Sterilisieren Sie die Histologieform und ihre Grenze, indem Sie sie mit 70% Ethanol abwischen und die Grenze fest um die Form befestigen und die Form aufrecht legen. Beide Formen passen ca. 3 ml Flüssigkeit (3,203 ml für das 20 Sphäroid-Array und 3,196 ml für das 63 Sphäroid-Array).
2. Beschichten Sie das Sphäroid-Array mit 10.000 cSt Si Öl leicht mit einem spitzen Wattestäbchen, um die Entfernung des Probenverarbeitungsgelgusses in späteren Schritten zu erleichtern.
3. Aufwärmen Sie Dasbieren von Probenverarbeitungsgel, bis sie über die Mikrowelle für 10-20 s verflüssigt werden, wobei die Kappe gelockert wird.
4. Zwischen 2,6 und 2,8 ml geschmolzenes Verarbeitungsgel in die Form geben, bis sie mit der Oberseite des Rands etwa eben ist.
5. In wenigen Minuten, einmal erstarrt, entfernen Sie das Verarbeitungsgel gegossen, indem Sie den Rahmen von der Form trennen und dann die Arrayform invertieren.
6. Fügen Sie pinzette Spitze zwischen Form und den Rahmen, um sie sorgfältig zu trennen und dann verwenden Sie einen Zellschaber, um den Guss von der Form zu entfernen, wenn es nicht sofort löst.
7. Ernten Sie die Sphäroide von der hängenden Fallplatte, indem Sie den Inhalt eines einzelnen Brunnens auf eine 100- oder 150-mm-Zell-Petrischale mit einer 1.000-L-Pipt pipetieren, und isolieren Sie das Sphäroid visuell.
8. Pipetten Sie 5 l des Brunneninhalts einschließlich des identifizierten Sphäroids in eine der Arraybrunnen, bis das Array gefüllt ist.
9. Warten Sie 3 min, um sicherzustellen, dass sich Sphäroide an den Boden des Arrays gelegt haben, bevor Sie geschmolzenes Verarbeitungsgel vorsichtig in jeden der Brunnen pfeifen, wobei darauf geachtet wird, die Sphäroide nicht zu stören.
10. Fügen Sie zusätzliches Verarbeitungsgel hinzu, um die Oberseite des Arrays abzugleichen, und legen Sie das verfestigte Sphäroid-Array nach dem Abkühlen in eine beschriftete Kassette für die Verarbeitung.
11. Beschriftete Kassette über Nacht in 4% Formalin untertauchen, um die Sphäroide bei 4 °C zu fixieren und dann in 70% Ethanol bei 4 °C lagern, bis sie zur Verarbeitung bereit sind.
12. Prozess mit Standard 1 h Paraffin-Programm und dann die Sphäroid-Arrays einbetten, so dass die verarbeiteten Arrays aufrecht mit dem Boden der Brunnen am nächsten an der Blockfläche.
13. Stellen Sie sicher, dass die Arrays so flach wie möglich eingebettet sind, wobei die untere Fläche bündig mit der Unterseite des Blocks ist, und legen Sie Blöcke auf Eis.
14. Laden Sie den Block auf das Mikrotom und stellen Sie den Block so ein, dass die Klinge parallel zur geladenen Blockfläche ist.
15. Schneiden Sie das Array (Probentiefe = 15 m) aus, bis der Boden der Arraybohrungen erreicht ist, um sicherzustellen, dass die kreisförmigen Bohrungen auf geschnittenen Proben sichtbar sind.
16. Wechseln Sie zu einer Probentiefe von 5 m, und schneiden Sie die Bänder weiter und sammeln Sie sie. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop alle paar Scheiben, um festzustellen, ob die Sphäroidtiefe erreicht wurde. Sobald Sphäroide erreicht sind, sammeln Sie jede nachfolgende Folie, bis die Sphäroide nicht mehr sichtbar sind.
17. Beflecken Sie jede Folie mit dem Standard-H&E-Protokoll.

7. Leben toter Zytotoxizität Assay

1. Zu jedem hängenden Tropfen fügen Sie den lebenden Zellfarbstoff, Calcein-AM zur Endkonzentration von 2 M und den toten Zellfarbstoff Ethidium homodimer-1 zur Endkonzentration von 4 m hinzu, wobei zu berücksichtigen ist, dass das Tropfenvolumen 20 l beträgt.
   HINWEIS: Versuchen Sie, die Mengen auf ein Minimum zu beschränken, und fügen Sie in der Regel 2 L der Farbstoffe zusammen.
2. Legen Sie die Platten wieder in den Inkubator, der in einer 6-Well-Platte mit Deckel eingeklemmt ist, und bebrüten Sie die Sphäroide 45 min bei 37 °C.
   HINWEIS: Je nach Größe der Sphäroide variiert diese Inkubationszeit erheblich. Sphäroide unter 400 m benötigen in der Regel nur 30–45 min Inkubationszeit, während größere Sphäroide, die näher bei 800 m sind, bis zu 90 min Inkubationszeit benötigen. Die Inkubationszeiten müssen für das Experiment eines Individuums optimiert werden.
3. Für die nachfolgende Bildgebung sphärieren Sie Sphäroide mit einer 1.000-L-Pipette in einem Biosicherheitsschrank und legen Sie jedes Sphäroid auf vorgereinigte Glasmikroskop-Dias ab.
4. Bild sphäroidiert durch das Glas, auf einem invertierten konfokalen Mikroskop.
   HINWEIS: Abhängig von der Nähe des konfokalen Mikroskops zum Labor, in dem Sphäroide geerntet werden, können die Sphäroide entweder im ursprünglichen Tröpfchen des auf dem Dia platzierten Mediums abgebildet oder mit 2% Agarose umhüllt werden, wenn mehr Stabilität für den Sphäroidtransport erforderlich ist.
5. Mit dem Multidimensional Acquisition-Modus in der Mikroskop-Software, lokalisieren Sie das Sphäroid mit DIC-Beleuchtung bei 10-facher Vergrößerung und scannen Sie dann die Z-Ebene, um die Höhen zu identifizieren, die das Sphäroid umfassen.
6. Klicken Sie auf die Z-Serie und legen Sie die obere und untere Grenze des Z-Scans etwas höher als die Oberseite des Sphäroids und etwas niedriger als die Unterseite des Sphäroids fest.
7. Erregen Sie die Sphäroide bei 488 nm für Calcein-AM (lebende Zellen; grün) und 561 nm für Ethidium homodimer-1 (tote Zellen; rot) mit der von der Software empfohlenen Schrittgröße, maximaler Verstärkung und minimaler Belichtung für jede Farbe.
8. Klicken Sie auf Erwerben, um ein zusammengesetztes Z-Stack-Bild von lebenden und abgestorbenen Zellen innerhalb des Sphäroids zu erhalten.
9. Quantifizieren Sie Live/Dead Proportionen mithilfe von Bildverarbeitungssoftware, um einen Prozentsatz der Pixelintensität aus dem Kanal zu quantifizieren, der lebenden Zellen entspricht, im Vergleich zum Prozentsatz der Pixelintensität aus dem Kanal, der toten Zellen aus dem Verbund entspricht Z-Projektionsbilder.
   HINWEIS: Aufgrund der Einschränkungen bei der Quantifizierung einer 3D-Struktur mit einer 2D-Projektion, einer alternativen Methode zur Quantifizierung von Lebend- versus toter Fluoreszenz, innerhalb der hängenden Fallplatten ist es, einen Plattenleser nach dem Protokoll zu verwenden, das mit dem Calcein-AM und Ethidium homodimer-1 Kit.

8. Immunfluoreszenz

1. Erhitzen Sie eine niedrig schmelzende 2% Agarose-Lösung, so dass die Lösung viskos ist und knapp über Schmelzpunkt und legen Sie auf einem Mikroskop-Dia, um ein weiches Bett aus Agarose zu schaffen
2. Ernten Sie Sphäroide, indem Sie 20 l PBS durch den Tropfen auf das weiche Bett von 2% Agarose schieben.
   HINWEIS: Dies sollte schnell erfolgen, damit Agarose nicht verfestigt wird, bevor Sphäroide eingebettet werden.
3. Sobald die Agarose abkühlt und geliert, wobei das geerntete Sphäroid im Inneren gefangen ist (unter 5 min), fügen Sie 4% neutral gepuffertes Formalin hinzu, um die Sphäroide zu fixieren. Alternativ fügen Sie eiskaltes Methanol hinzu und fixieren Sie die agarose-eingebetteten Sphäroide 30 min bei -20 °C.
4. Waschen Sie 3x für 5 min jeweils mit 1x PBS, abwerfen PBS nach jeder Wäsche.
5. Block für 1 h bei RT mit 10% Serum (d.h. Pferdeserum) und 0,15% Seifenlösung (Triton X-100) in 1x PBS.
6. Waschen Sie 3x für 5 min jeweils mit 1x PBS, abwerfen PBS nach jeder Wäsche.
7. Fleckensphäroide mit gewünschtem fluoreszierendem Antikörper bei empfohlener oder vorbestimmter Antikörperverdünnung (d. h. fluoreszierend phalloidin bei einer Verdünnung von 1:100), inkubieren für mindestens 90 min bei Raumtemperatur, von Licht bedeckt.
   HINWEIS: Die Protokolle variieren je nach Antikörper- und Ziel- und Antikörperverdünnung, die je nach Experiment möglicherweise optimiert werden muss.
8. Visualisieren Sie fluoreszierend gefärbte Sphäroide mit dem invertierten konfokalen Mikroskop mit Methoden, die im vorherigen Abschnitt für bildgebende Sphäroide beschrieben wurden.
9. Zusammengesetzte Z-Stack-Bilder zeigen 3D-Morphologie in den Sphäroiden.

9. Sammlung und Analyse von Krebsstammzellpopulationen mit Durchflusszytometrie

1. Vorbereitung von Sphäroiden für die Analyse der Durchflusszytometrie
   1. Sammeln Sie Sphäroide von jedem Brunnen in den hängenden Fallplatten mit einer 1.000 L Pipette und legen Sie sie in einem 15 ml Zentrifugenrohr für die Disaggregation mit wiederholter Pipettierung ab.
   2. Zählen Sie lebensfähige Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypan Blue, um die Zellzahl und Konzentration wie oben beschrieben zu bestimmen.
   3. Aliquot Zellsuspension in fünf Mikrozentrifugenröhren, so dass jeder enthält ein Minimum von 50.000 Zellen.
   4. Zentrifugieren Sie alle Rohre bei 400 x g für 5 min in einer Mikrozentrifuge.
   5. Aspirieren Sie den Überstand aus jedem Rohr und suspendieren Pellets in 100 l Puffer.
   6. Etikettenröhren "Unstained", "DAPI", "APC-iso", "DEAB" bzw. "ALDH/CD133".
   7. Fügen Sie dem APC-Iso-Iso-Antikörper 0,5 l APC-Isotyp-Antikörper und dem ALDH/CD133-Antikörper 1 l CD133-Antikörper hinzu, wie durch serielle Verdünnung und Herstellerempfehlung bestimmt.
   8. Fügen Sie dem DEAB-Rohr 5 l DEAB-Reagenz und 0,5 l ALDH und dem ALDH/CD133-Rohr 1 l ALDH/CD133 hinzu.
   9. Alle Rohre ca. 2 s vortex und bei 37 °C für 45 min inkubieren.
   10. Wirbel alle Röhren wieder und Zentrifuge bei 400 x g für 5 min in einer Mikrozentrifuge.
   11. Beschriften Sie FACS-Rohre "Unstained", "DAPI", "APC-iso", "DEAB" und "ALDH/CD133" und füllen Sie einen isolierten Schaumbehälter, um ihn beiseite zu legen.
   12. Aspirieren Sie überstand und setzen Sie die "ungefärbte" Steuerung in 400 L FACS Puffer (1x PBS mit 2% FBS) und alle anderen Röhren in 400 l FACS DAPI Puffer (FACS Puffer mit 300 'M 4',6-Diamidino-2-Phenylindole) wieder auf.
   13. Rohre mit Eis in Behälter legen, bis sie auf einem Durchflusszytometer analysiert werden.
       HINWEIS: Um nach Eierstockkrebs-Stammzellen zu sortieren, sammeln Sie alle Zellen, die das Zytometer als ALDH+ und CD133+ misst, wobei die Tore 0,5 % unspezifisches APC-Signal und 0,15 % unspezifisches ALDH+-Signal enthalten. Mindestens 10.000 Zellen müssen analysiert werden, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Weitere Details finden Sie in den jüngsten Veröffentlichungen^3,17.
2. Analyse von ALDH+/CD133+ Populationen in FlowJo
   1. Doppelklicken Sie auf das FlowJo-Symbol, um das Programm zu öffnen und .fcs-Dateien aus Flow-Zytometrie-Software in den Arbeitsbereich zu ziehen.
   2. Doppelklicken Sie auf die unbefleckte Datei und legen Sie die y-Achse auf die Seitenstreuhöhe (SSC-H) und die x-Achse auf die Streuhöhe nach vorne (FSC-H) fest.
   3. Klicken Sie auf die T-Schaltfläche neben jeder Achse, um die Skalierung und Transformation anzupassen, um die Trennung zwischen verschiedenen Zellpopulationen zu maximieren.
   4. Klicken Sie auf die Polygon-Gating-Schaltfläche, und zeichnen Sie ein Polygontor um die Zellenpopulation und beschriften Sie die Grundgesamtheit als "Zellen".
   5. Doppelklicken Sie auf die Zellen-Population im Arbeitsbereich, um nur die Zellen innerhalb der "Zellen"-Population anzuzeigen, und klicken Sie dann auf die FSC-Achse, um den Achsenkanal in Die FSC-Breite zu ändern, und klicken Sie dann auf die SSC-Achse und ändern Sie den Achsenkanal in das FSC-H.
   6. Wählen Sie das Rechteck-Tor-Werkzeug aus, und zeichnen Sie ein Rechteck um die am weitesten links dichte Gedaltgesamtheit von Zellen, die sich über die gesamte y-Achse erstrecken, um potenzielle Doublets rechts neben dem Fenster auszuschließen und dieses Gate als "Einzelne Zellen" zu beschriften.
   7. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Cells-Gate und das verschachtelte Einzelne Cells-Gate, und fügen Sie sie unter jedem Beispiel im Arbeitsbereich ein.
   8. Doppelklicken Sie auf das Unterdason Einzelzellen geschachtelte Gate unter dem DAPI-Beispiel im Arbeitsbereich, um die Einzelzellenpopulation aus diesem Beispielrohr anzuzeigen, und klicken Sie auf die FSC-Achse, und ändern Sie den Achsenkanal in den DAPI-Bereichskanal.
   9. Klicken Sie auf die SSC-Achse und ändern Sie den Achsenkanal in Histogramm.
      HINWEIS: Die lebenden Zellen befinden sich nach links, da sie DAPI ausschließen, während abgestorbene Zellen die DAPI aufnehmen und rechts neben dem Diagramm angezeigt werden.
   10. Klicken Sie auf die T-Schaltfläche neben der DAPI-Achse und klicken Sie auf Achse anpassen, um die Skala anzupassen, um die Trennung zwischen DAPI-positiven und DAPI-negativen Peaks zu maximieren.
       HINWEIS: Ein Fenster wird mit Skalierungsoptionen angezeigt. Häufig führt das Festlegen des Felds "Skalieren" auf Biex und das Anpassen der Extra Negative Decades and Width Basis zu der größten Trennung.
   11. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Anwenden, um Skalierungsänderungen anzuwenden, die Schaltfläche Range-Gate auszuwählen und sie über den negativen DAPI-Peak zu verteilen, der der Livezellenpopulation entspricht.
   12. Beschriften Sie dieses Tor als "Live Cells" und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um das "Live Cells"-Gate zu kopieren, um es unter das "Einzelne Zellen"-Gate unter den Röhren "APC-iso", "DEAB" und "ALDH/CD133" einzufügen, um den gleichen Teil der lebenden Zellen in jedem Probenröhrchen auszuwählen.
   13. Doppelklicken Sie dann auf die Live Cells-Population, die unter der APC-iso-Beispieldatei verschachtelt ist, und schalten Sie die x-Achse auf den ALDH - Flächenkanal und die y-Achse in den APC - Flächenkanal um.
   14. Passen Sie erneut die Achsenskala an, indem Sie auf die Schaltfläche T klicken und die Achse jeder Achse anpassen, sodass die Ereignisse im unteren linken Bereich des Plots lokalisiert werden, und wählen Sie die Option Quad-Gate aus, und klicken Sie auf das Plotfenster, um ein Quadrantentor einzurichten. .
   15. Passen Sie den Schnittpunkt des Tores so an, dass etwa 0,5 % der Bevölkerung in der oberen linken Ecke des Plotfensters oder des "APC-positiven" Quadranten liegen.
       HINWEIS: Diese 0,5% stellen die unspezifische Färbung des APC-Isotyps dar.
   16. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf jede Quadrantenbeschriftung einzeln im Arbeitsbereich, und benennen Sie sie entsprechend um. Steuerung oder Befehl klicken Sie auf jede Quadranten-Gate-Beschriftung im Arbeitsbereich, und kopieren Sie sie.
       HINWEIS: 'Q1' stellt CD133+ Zellen dar; 'Q2' steht für CD133+ und ALDH+'-Zellen; 'Q3' stellt ALDH+-Zellen dar; und 'Q4' steht für CD133- und ALDH-Zellen.
   17. Fügen Sie die Quadrantentore in die Live Cells-Population ein, die unter der Datei "DEAB" verschachtelt ist. Passen Sie die vertikale Linie so an, dass etwa 0,15 % der Zellpopulation innerhalb des Quadranten "ALDH+" liegen, wobei darauf geachtet wird, die horizontale Linie nicht zu verschieben.
       HINWEIS: Dieses 0,15% stellt ein unspezifisches ALDH-Signal dar.
       1. Um sicherzustellen, dass die horizontale Linie die Position nicht ändert, kopieren Sie die neuen Quadrantentore, die unter der DEAB-Datei verschachtelt sind, und fügen Sie sie in die Live-Zellen unter der APC-Isodatei ein. Wählen Sie Ja aus, wenn Sie aufgefordert werden, das vorhandene Quadrantentor zu ersetzen.
       2. Stellen Sie im Arbeitsbereich sicher, dass der Prozentsatz "CD133+" unter der Datei 'APC-iso' immer noch ungefähr 0,5 beträgt.
   18. Kopieren Sie die Quadranten-Gates in die "Live Cells"-Population der Datei 'ALDH/CD133'.
       HINWEIS: Der Prozentsatz der lebensfähigen Zellpopulation im oberen rechten Quadranten ist der Prozentsatz der ALDH+ und CD133+ doppelt positiven CSCs innerhalb der Stichprobe.

Representative Results

Sphäroide, die mit Zelllinien oder vom Patienten abgeleiteten CSCs gebildet werden, können mit einem Bereich von kleinen Zellnummern innerhalb hängender Tröpfchen gebildet werden (Abbildung 2A). Sphäroide bilden sich zuverlässig mit nur 10 Zellen pro Brunnen, was die Konservierung seltener Patientenproben ermöglicht. Zellen innerhalb dieser Sphäroide sind von anderen Zellen in 3 Dimensionen umgeben, wie sie in vivo wären, was physiologische Zell-Zell-Kontakte und Diffusionsraten ermöglicht. Tumorzellen innerhalb der Sphäroide vermehren sich, wodurch sich die Sphäroide im Laufe der Zeit in ihrer Größe ausdehnen (Abbildung2B). Da aggressivere Patientenzellen oder Zelllinien schneller wachsen als ihre Gegenstücke, ist es wichtig, die Proliferationsfähigkeit jeder Probe zu quantifizieren und zu untersuchen, wie sich die medikamentöse Behandlung auf die Proliferation jeder Probe auswirkt. Um dies zu tun, kann ein metabolischer Aktivitätstest, wie ein Resazurin-basierter Fluoreszenz-Assay, leicht mit der 384-Well-physiologischen Plattform durchgeführt werden, ohne dass Sphäroide geerntet werden müssen, deren Ergebnisse in Abbildung 2Czu sehen sind. Mehrere Sphäroide können auch geerntet, fixiert, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin oder immunfluoreszierenden Antikörpern gleichzeitig gefärbt werden, um Zellmorphologien und Organisation innerhalb von Sphäroiden sowie die Verteilung von Zelltypen und ECM zu identifizieren. Proteine (Abbildung 2D, E).

Um die Wirkung der medikamentösen Behandlung auf die Sphäroidmorphologie zu untersuchen, können Sphäroide leicht durch Phasenkontrast-Bildgebung visualisiert werden (Abbildung 3A). Quantitativ, die Wirkung der medikamentösen Behandlung auf Tumorzellen oder CSC-Proliferation kann auch durch Resazurin-Farbstoff Fluoreszenz-Messungen in der Kontrolle unbehandelte Sphäroide im Vergleich zu in der medikamentös behandelten Sphäroide gemessen werden (Abbildung 3B). Als Validierung des Zelltodes nach medikamentöser Behandlung kann die Lebensfähigkeit innerhalb der Kontrolle und medikamentös behandelte Sphäroide leicht durch die Zugabe von Calcein-AM und Ethidium homodimer-1 zu mehreren Sphäroiden für jede Erkrankung bestimmt werden (Abbildung 3C). Nach der Inkubationszeit können gefärbte Sphäroide mit einer Pipette geerntet und auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet werden.

Schließlich kann durch die Ernte von Sphäroiden und deren Dispergierung in einzelzellige Suspensionen das Vorhandensein von CSCs und anderen Zellphänotypmarkern mit Durchflusszytometrie analysiert werden (Abbildung 4). Der Vergleich lebensfähiger CSCs zwischen verschiedenen medikamentösen Behandlungen innerhalb desselben Patienten sowie zwischen Patienten kann dazu beitragen, die Wirksamkeit verschiedener CSC-Targeting-Medikamente auf patientenspezifische Weise zu erkennen.

Abbildung 1: 3D hoher Durchsatz 384 hängende Tropfen Sphäroid Platte Lagerung und Beschichtung Layouts. (A) Hängende Fallplatte wird auf der Unterseite einer 6 Brunnenplatte teilweise mit Wasser gefüllt platziert. (B) Deckel von 6 Brunnenplatte wird auf hängende Fallplatte platziert, um sterile Hydratationskammer zu schaffen. (C) 6-Well-Plattenstapel, der mit einem thermoplastischen Streifen zum Schutz vor Feuchtigkeitsverlust und Verunreinigungen versiegelt werden soll. (D) Abwechselndes Beschichtungsmuster zum Aufhängen der Fallplatte. Rosa Quadrate zeigen Brunnen mit Zellen und mittlere Mischung gefüllt. Blaue Flächen zeigen Wasserkammern für die Hydratation an. Graue Felder zeigen leere Brunnen an, die als Grenze zwischen Hydratationskammern und Sphäroidtröpfchen fungieren. (E) Live-Bild der hängenden Fallplatte mit dem abwechselnden Brunnenmuster vergoldet. (F) Alle gut plattieren Muster Layout für hohen Durchsatz hängenden Tropfen Sphäroide Experimente verwendet. Rosa Quadrate zeigen zellbeschichtete Brunnen und blaue Bereiche zeigen wassergefüllte Kammern für eine erhöhte Hydratation an. Graue Quadrate zeigen Rahmenbrunnen an, die als Grenze zwischen Hydratationsabschnitten und Zellkulturbereichen fungieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Vom Patienten abgeleitete CSC-Sphäroiden Morphologie und Proliferation innerhalb von 3D hängenden Tropfen. (A) Live-Bild von vorbereiteten 384-hängenden Tropfen Sphäroid Platte von unten betrachtet. (B) Progressive Lichtmikroskopbilder des Patienten abgeleitet CSC Sphäroid Wachstum nach 2, 3, und 5 Tage in einem hängenden Tropfen. Skalenstäbe = 100 m. (C) Die Resazurin-Fluoreszenzintensität zeigt nach 7 Tagen hängender Tropfenkultur einen signifikanten Anstieg, der mit der Proliferation und dem Wachstum des hängenden Tropfenpatienten korreliert, abgeleitete CSC-Sphäroide (Unpaired two tailed t-test, p < 0.0001, n >10). (D) Bild der Sphäroid-Array-Form, die verwendet wird, um eine Umwandlung für die Sammlung von Sphäroiden für histologische Schnitte zu erstellen. (E) H&E-Bild eines Sphäroids, das mit primären Ovarialkarzinom-Stammzellen, mesenchymalen Stammzellen, Endothelzellen und spenderperipheren mononukleären Blutzellen im Sphäroid-Array kultiviert wurde. Scare bar = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Arzneimittelbehandlungsanalyse von Patienten abgeleitet CSC Sphäroide hängende Tropfen. (A) Patienten abgeleitet CSC Sphäroide mit 50 Zellen/Tropfen mit zunehmenden Konzentrationen von Paclitaxel nach 5 Tagen Wachstum behandelt. Repräsentative Bilder, die 48 h nach medikamentöser Behandlung aufgenommen wurden. (B) Quantifizierung der zellulären Lebensfähigkeit über Resazurinfluoreszenz bei zunehmenden Konzentrationen der Paclitaxel-Behandlung. Alle Proben haben eine signifikante Verringerung der Lebensfähigkeit im Vergleich zur Kontrolle. (Einweg-ANOVA, p <0.0001, n> 8). (C) Konfokale Bildgebung von lebenden (calcein-AM) und toten (Ethidium homodimer-1) Zellen im hängenden Tropfensphäroid. Grüne Farbe zeigt lebende Zellen und rote Farbe zeigt die Population der toten Zellen an. Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Quantifizierung von CSCs in patientenabgeleiteten CSC-Sphäroiden, die auf der 384 hängenden Tropfenplattform erzeugt und gepflegt werden. (A) Bei der Analyse der Flusszytometriedaten wird die Zellpopulation zunächst mithilfe eines Polygontors ausgewählt, um alle Ereignisse zu beseitigen, die auf Trümmer zurückzuführen sind. (B) Die einzelnen Zellen werden dann ausgewählt, um potenzielle Doublet-Signale zu eliminieren, die die Ergebnisse verschleiern können. (C) Alle einzelnen live Zellen werden dann basierend auf dem DAPI-Ausschluss ausgewählt. (D) Die vertikale Achse eines Quadrantentors wird in der DEAB-Steuerung so eingestellt, dass etwa 0,15 % unspezifische ALDH-Färbung möglich ist. (E) Die horizontale Achse des Quadrantentors wird in der APC ISO-Steuerung so eingestellt, dass etwa 0,5 % unspezifische APC-Färbung möglich ist. (F) Das Quadrantentor wird dann verwendet, um den Prozentsatz der CD133+, ALDH+- und CD133+/ALDH+-Zellen zu bestimmen, die in der Lebendzellpopulation im experimentellen CD133 plus ALDH-Zustand vorhanden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die 384-Well hängende Fallplatte plattform für die 3D-Sphäroidbildung ist ein leicht zu implementierendes Werkzeug für alle Zellbiologie- oder Krebsbiologielabore. Diese physiologische Plattform ermöglicht das Studium von Zelllinien sowie primären Patientenproben in physiologisch relevanten 3D-Kulturen und ermöglicht gleichzeitig ein Arzneimittelscreening mit hohem Durchsatz. Die Plattform stellt außerdem sicher, dass die Kulturbedingungen hochgradig abstimmbar sind, was eine enge Kontrolle über Beschichtungsdichten, Zellkokulturverhältnisse, extrazelluläre Komponenten und mittlere Zusammensetzung ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht diese physiologische Plattform, dass Experimente für nachgeschaltete Analysetechniken, die große oder kleine Zellanzahlen erfordern, wie z. B. qRT-PCR, FACS und verschiedene bildgebende Verfahren, in hohem Maße zugänglich sind. Während die Benutzerfreundlichkeit erfahrungsgemäß ist, werden neue Auszubildende schnell erfolgreich, sobald Geschwindigkeit und einfaches Pipetieren gemeistert sind. Daher ist diese physiologische Plattform hochanwendbar für personalisierte 3D-Arzneimittel-Screening, CSC-Biologie und Chemoresistenz-Untersuchungen.

Einige Punkte, die bei der neuen Implementierung dieser Plattform besorgniserregend sind, sind der Plattentransfer und die medikamentöse Behandlung. Bei der Übertragung von Platten von einem Ort an einen anderen, wie es für die routinemäßige Fütterung, Bildgebung und Analyse erforderlich ist, sollten sorgfältige Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um unnötiges Jostling zu vermeiden. Greifen Sie die Platten von den äußeren Rändern so flach wie möglich und achten Sie darauf, störende Bewegungen zu vermeiden, wenn Sie die Platte nach unten legen. Dies hilft, Tröpfchenverlust oder Zusammenführen benachbarter Tropfen zu vermeiden. In ähnlicher Weise sollte wachsame Aufmerksamkeit auf die Aufgabe der Medikament Behandlung hängenden Tropfen Sphäroide gegeben werden, um falsche Dosing von einem hängenden Tropfen Sphäroid zu vermeiden. Wie bei jeder Technik kommen Selbstvertrauen und Genauigkeit bei diesen Aufgaben mit der Praxis.

Ein paar Einschränkungen sind angeboren, um diese 3D physiologische Plattform. Erstens kann die Instabilität von Tröpfchen bei langfristigen Kulturzeitpunkten von Belang sein, wenn nicht darauf geachtet wird, das korrekte gesamte Tröpfchenvolumen beizubehalten. Darüber hinaus müssen, wie bereits erwähnt, der Transport und die Lagerung von Platten sorgfältig erfolgen, um den Verlust oder das Zusammenführen von Tröpfchen zu vermeiden. Darüber hinaus wird die Größe für diese 3D-Umgebung durch angeborene stabile Tröpfchengröße von 20 l diktiert, obwohl viele Replikationen für verbesserte Zellzahlen erzeugt werden können.

Änderungen an dieser 3D-physiologischen Plattform können genutzt werden, um den Durchsatz zu erhöhen und physiologische Eigenschaften zu verändern. Zum Beispiel kann das Tröpfchenlayout so geändert werden, dass jeder Bohrplatz innerhalb der 384 Well-Platte enthalten ist, um den Durchsatz zu erhöhen. Darüber hinaus ist die 3D-Hängetropfenplattform durch die einfache Einbeziehung mehrerer Zelltypen in jeden Brunnen sehr förderlich für Co-Kultur-Untersuchungen. Um Sphäroide erfolgreich zu erzeugen und zu erhalten, können Zellkulturmedium und anfängliche Zellsädichte leicht moduliert werden, um die Sphäroidgröße streng zu regulieren. Mit diesen hochgradig abstimmbaren Variablen sind unzählige Untersuchungen im Bereich der 3D-physiologischen Patientensphäroide möglich.

Während die meisten beschriebenen Analysemethoden in der wissenschaftlichen Forschung weit verbreitet sind, gibt es einige Einschränkungen, die spezifisch für die Analyse hängender Tropfen erzeugte Sphäroide mit einigen dieser Methoden sind. Wenn z. B. Sphäroide für längere Zeit in hängenden Fallplatten kultiviert werden, kann die Tröpfchengröße erheblich ansteigen, wodurch Tröpfchen während der Phasenkontrastabbildung zittern, was die Bildqualität des Bildes beeinträchtigen könnte. Dies kann verbessert werden, indem eine entsprechende Menge von Medium aus jedem Brunnen vor dem Hinzufügen von frischem Medium genommen wird. Darüber hinaus können Techniken wie Durchflusszytometrie und Zählen einzelner lebensfähiger Zellen von der Technik beeinflusst werden, die verwendet wird, um Sphäroide aufzubrechen, die für Zellen schädlich sein können. Daher ist es für jedes Labor wichtig, Sphäroid-Disaggregationstechniken auf der Grundlage ihrer Zellen zu optimieren und zu experimentieren, um Zellschäden zu minimieren und gleichzeitig die Dichte einzelner Zellen zu maximieren. Schließlich kann die histologische Analyse von Sphäroiden durch ihre geringe Größe kompliziert werden und erfordert Praxis, um erfolgreiche Abschnitte zu erhalten.

Insgesamt ist die 3D-Hängetropfensphäroid-Plattform in der Krebs- und Nicht-Krebsforschung weitgehend anpassungsfähig. Das System ist leicht zu erlernen und bietet eine physiologisch relevante 3D-Umgebung für die Zellkultur in einem Format mit hohem Durchsatz. Die Initiationszeit dieser 3D-physiologischen Plattform ist minimal, mit wenigen, wenn überhaupt, technischen Analysehürden zu überwinden. Die Vielseitigkeit dieses Systems bietet ein Mittel für ein patientenspezifisches Screening von effektiven Chemotherapeutika für die Präzisionsmedizin in einer physiologischeren Umgebung als je zuvor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	ILT25200056
10 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11E
10,000 cSt Si oil	Millipore Sigma	63148-62-9	Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.
100 mm tissue culture dish	Thermo Scientific	130182
15 mL conical tube	Celltreat	FL4021
1x DMEM for Serum Free Medium	Gibco	11965-092
1x F12 for Serum Free Medium	Gibco	11765-054
1x phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	ILT10010023
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	D1306
40 µm filter	Fisher Scientific	22363547
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Accutase	Innovative Cell Technologies Inc.	1449	A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.
ACK Lysing Buffer	Thermo Scientific	A1049201
alamarBlue	Invitrogen	DAL1025	Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.
ALDEFLUOR assay kit	Stem Cell Tech	1700	Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stem Cell Tech	1705	Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.
Andor iXon x3 CCD Camera	Oxford Instruments	-
Antibiotics and Antimycotics	Gibco	15240-062
APC-isotype IgG2b	Miltenyi biotec	130-092-217	Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.
B27 Supplement	Gibco	17504044
basic Fibroblast Growth Factor	Stem Cell Technologies	78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate Reader	BioTek	7091000
CD133-APC	Miltenyi biotec	130-113-184	Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.
cellSens Dimension Software	Olympus
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394	Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging System	Life Technologies	AME3300
Fetal Bovine Serum - premium (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F4375
Hemacytometer	Hausser Scientific	1490
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-5006
Human Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC2543
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement	Gibco	51500-056
Live/Dead viability kit	Invitrogen	L3224	Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140-050
MetaMorph 7.8 Software	Molecular Devices	-
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope	Olympus	-
Olympus IX83 Research Inverted Microscope	Olympus
Parafilm M	Thomas Scientific	7315D35	Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix	HDP1384-8	Available through Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488	Invitrogen	A12379	Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.
ProJet 3500 HD Max	3D Systems	-	3D printer
Sterile DI water	Fisher Scientific	353046
Trypan Blue	Gibco	15250061	Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.
VisiJet M3 Crystal	3D Systems	-	A biocompatible polymer material for 3D printing.
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	-