Summary
פרוטוקול זה מתאר את הדור של מטופלים שמקורם בחולים, וניתוח במורד הזרם כולל כימות של התפשטות, בדיקות ציטורעילות, הזרמת cy, כתמים והדמיה מיקוד, על מנת להעריך את התרופה פוטנציאל המועמדים כtherapeutics אנטינאופלסטית. פרוטוקול זה תומך ברפואה מדויקת עם זיהוי תרופות ספציפיות לכל מטופל ולשלב המחלה.
Abstract
בפרוטוקול זה, אנו מתווה את ההליך עבור הדור של spheroids הגידול בתוך 384-היטב לתלות טיפות כדי לאפשר הקרנת תפוקה גבוהה של אנטי סרטניים therapeutics ב מיקרוסביבה ייצוגית מבחינה פיזיולוגית. אנו מתווה את היווצרות של החולה הנגזר הטיפול בתאי גזע הסרטן, כמו גם, מניפולציה של הספרואידים האלה לניתוח מעמיק לאחר טיפולי התרופה. באופן ספציפי, אנו מתארים אוסף של מורפולוגיה ספרואידית, התפשטות, יכולת הרעילות, הרעלת סמים, תאים ומידע לוקליזציה של תאים. פרוטוקול זה מתמקד באופן מעמיק בטכניקות ניתוח אשר מיושמות בקלות באמצעות פלטפורמת הירידה 384-היטב תלויה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור הקרנת תרופות בתפוקה גבוהה. בעוד אנו מדגישים את החשיבות של המודל הזה בלימודי סרטן השחלות ומחקר תאי גזע הסרטן, הפלטפורמה 384-ובכן היא קלה למחקר של סוגי סרטן אחרים ודגמי מחלות, הארכת השירות של הפלטפורמה לתחומים רבים. על-ידי שיפור המהירות של הקרנת תרופות מותאמת אישית ואיכות תוצאות ההקרנה באמצעות מיושם בקלות בתרבויות תלת-ממד של נציג מבחינה פיזיולוגית, פלטפורמה זו צפויה לסייע בפיתוח של therapeutics חדש וספציפי למטופל אסטרטגיות טיפול, ולכן יש להם השפעה קלינית רחבה.
Introduction
התמותה ברחבי העולם הקשורות לסרטן הגיעו לאגרה של 9,800,000 מקרי מוות ב 20181, הדגשת הצורך בפיתוח של therapeutics משופרת. למרבה הצער, העלות של פיתוח תרופות לסרטן גדל, עם התפתחות של תרופה אחת עולה כ 650,000,000 USD2 המציין את הצורך אסטרטגיות משופרות כדי לפתח תרופות נגד סרטן חדש. תאי גזע הסרטן (CSCs), אשר מאופיינים על ידי מוגבר הגברת העמידה3, את היכולת לחדש את העצמי, ואת היכולת זרע גידולים חדשים4 נחשבים להיות אחראים להישנות הגידול4, גרורות5, ו מספר4,6, אשר כל לתרום לקיבולת ממאירה של הגידול ולכן מחיר המוות הגבוה. בסרטן השחלות, תאים אלה נמצאים מועשר בנוזל מיימת ממאיר בחלל הצפק, מצב הקשור עם תוצאות קליניות עניים1. כתוצאה מיכולות ממאירות של CSCs, יש כבר דחיפה לפתח תרופות חדשות CSC המטרה להשתמש בשילוב עם כימותרפיות מסורתיות. ישנם מספר אתגרים המלווים את הפיתוח של CSC מיקוד תרופות כולל: 1) קושי להרחיב ולשמור על CSCs in מבחנה; 2) מחסור בדגימות מטופלים; 3) הרלוונטיות הפיזיולוגית של פלטפורמת התרבות; ו-4) טרוגניות ברגישות לסמים בין המטופלים. פרוטוקול זה מתאר את היישום של פלטפורמת תרבות תלת-ממד בתפוקה גבוהה שיכולה להתגבר על כל אחד מהאתגרים הללו. בפרט, מערכת זו מאפשרת סינון סמים מהיר באמצעות מספרים קטנים של החולה נגזר CSCs השחלות, והוא קל מאוד לניתוח שיטות במורד הזרם. בעוד אידיאלי ללמוד סרטן השחלות ו CSCs, הפלטפורמה שלנו הוא גם בעל ערך בלמידה סרטן אחרים וסוגי תאים הבדיל בסביבות 3D מורכבות.
מורכב תלת מימדי (3D) מודלים הם קריטיים ללמוד מיקרוסביבה הגידול (TME), שהיא נישה 3D מורכב של תאים סרטניים, תאים שאינם סרטניים תמיכה, ו מטריצה החילוץ (ECM) חלבונים4. סביבה תלת-ממדית זו יוצרת מורפולוגיה של תאים ייחודיים, תאי תא ואינטראקציות של מטריצות תאים, בידול תאים, העברת תאים, צפיפות תאים ומעברי דיפוזיה לעומת תרבות תא דו-ממדית מסורתית במבחנה4. כל הגורמים הללו להיות בתגובה תרופה דיפרנציאלית בתוך התרבויות 3d, מציג עמידות לסמים מוגברת רלוונטיות פיזיולוגית7,8. בשל התפקיד של TME 3D בידול CSC ומורשת, זה חיוני על המסך עבור תרופות מיקוד CSC ב מיקרו סביבות פיזיולוגית. שיפור הרלוונטיות הפיזיולוגית של פלטפורמות הסינון התרופתי של CSC יש את הפוטנציאל לשפר את הטיפול בתרופות ספציפיות המטופל, פיתוח התרופה, ניסוח אסטרטגיות ריפוי, ובסופו של דבר תוצאות קליניות. חשוב באותה מידה כי הפלטפורמה המשמשת עבור הקרנת התרופה להיות בתפוקה גבוהה ותואם לשיטות ניתוח במורד הזרם כדי למזער עלות, זמן, ותרגום קליני של תרופות מבטיחות9.
כיום, TME מורכבים מתוחזק בצורה הטובה ביותר עבור יישומים הקרנת סמים דרך מודלים vivo כגון מודלים הגידול מורגית syngeneic, קו הנגזרות xenografts, ואת החולה נגזר xenografts שתל (PDX) מודלים12, כפי שהם מספקים פיזיולוגי תנאים. עם זאת, התפוקה הנמוכה של מודלים אלה, כמו גם, עלות, זמן, ומיומנות טכנית קובע כי הם דורשים מגבלות השירות שלהם במהירות, תפוקה גבוהה של העברת תרופות ביישומים13. כמו חלופות אלה במודלים vivo, רבים מודלים תלת-ממדיים מחוץ למים ניצול הידרוג'ל8, תרבות בתוך התקנים microflu, או "עוגב-on-a-שבב" מכשירים10,14, ותרבויות לא חסיד3,8 פותחו גם הם, בשל המכשול הנמוך שלהם לערך במונחים של עלות, זמן ומושגי חובה.
פלטפורמות תרבות הידרוג'ל מועילים לשליטה העדינה הניתנת על הרכב המטריקס, תכונות מכניות ומבנה מטריצה15; עם זאת, הם יכולים לעכב את תרבות התא בצפיפות גבוהה14. בנוסף, לאסוף תאים מהידרוג יכול לסבך את ניתוח במורד הזרם, בשל השפעות מזיקות פוטנציאלי של שיטות הקציר15. מכשירים זעירים, מצד שני, הם התקנים microscale המאפשרים זיהוי פלט בתוך אותו התקן ועבור תרבות התא בסולמות הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית עם צריכה מינימלית של ריאגנטים, ירידה זמן התגובה, ממוזער פסולת, ו דיפוזיה מהירה14. מאפיינים אלה גורמים להם פלטפורמות מבטיחות לחקירת רעילות, יעילות ופרמקוקינטיקה של סמים. עם זאת, האתגרים של יעיל, ככמת, הניתנות לכימות, ואת ידידותי למשתמש התרבות התא 3D, כמו גם, מערכות שאיבה מגושם ויקר יש מוגבלת יישומים microfluidic במחקר תפוקה גבוהה10. כיוונוני זיהוי יעילים והטמעה בלתי-מסובכת של שדות, הפריע גם לאימוץ נרחב של מערכות microfluidic10.
מבחינה כוללת, שנוצרו בתנאים שאינם מחוללים באמצעות מיקסרים מסתובבים (פסיכים), לוחות קבצים מצורפים אולטרה-נמוכים וטיפות תלויות אינן כוללות רכיבי מטריצה המוגדרים על-ידי המשתמש. מתודולוגיות אלה רלוונטיות במיוחד לחקר סרטן השחלות כמו תנאים שאינם חסיד מייצגים את התנאים בהם הספרואידים לצמוח בתוך חלל הצפק5. בתוך אלה שיטות התרבות שאינם חסיד, שחרור ותליית השחרור התלויים הוכחו התערוכה דחיסה גבוהה יותר, שיפוץ, ו cheמטרות לעומת spheroids שנוצרו לוחיות מצורף אולטרה נמוך, הרומז פיסיולוגיים מוגברת . רלוונטיות16,17,18,19 בשל קיבולת מוגברת עבור הקרנת תפוקה גבוהה מפני גדלים קטנים ומזעריים מספרי תאים נדרשים, הדור ספרואיד בלוחות השחרור תלויה היא פלטפורמה אידיאלית עבור הקרנת סמים. כאן, אנו מציגים פלטפורמת הפיזיולוגית תלת-ממדית של 3D ב 384-ובכן תלויים לוחיות הירידה, כי הוא קל ליישם מאוד קלה לניתוח במורד הזרם, מה שהופך אותו אידיאלי עבור הקרנת סמים בתפוקה גבוהה של סרטן השחלות השחלות CSCs.
פלטפורמת הפיזיולוגית תלת-ממדית שלנו מספקת את כל היתרונות של תרבות תלת-ממדית, כולל אנשי קשר פיזיולוגיים של תאי תא, הדרגתיות במעברי הצבע, צפיפות התא וחלבונים ECM המיוצרים באופן טבעי, אשר עשויים לתרום לתגובות מציאותיות של תרופות16, 17,18,19. בנוסף, על-ידי הפקת הספרואידים האלה עם CSCs החולה נגזר, אנו מסוגלים לקבוע תגובות ספציפיות למטופל תרופות1 עם משכפל טכני רבים בו, כדי להתגבר על טרוגניות שניתן למצוא בתוך הגידול החולה . דוגמיות של20 יתר על כן, תרבות 3d הוכח לשפר את התחזוקה של אוכלוסיות csc3,16 ולכן הוא נציג של אוכלוסיות csc מועשר בתוך מיימת7. זה משולב עם ניתוח קל במורד הזרם, כולל הניתוח cy, הזרימה האבחון של הכדאיות ואת הפרופורציות CSC מאפשר הערכה אופטימלית של מיקוד יעילות הסמים של CSC. לבסוף, פלטפורמת הפיזיולוגית הזאת תואמת להדמיה בנקודות זמן מרובות במהלך הניסוי, הערכה של מוות והתפשטות תאים, ארגון תאים ומורפולוגיה עם אימונוהיסטוכימיה, איתות מסיסים עם אליסה על ממוזג בינונית, פנוטיפים לתא עם הזרימה cy, וביטוי גנים אחרי ה-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל דגימות המטופל נאספים תחת פרוטוקול IRB מאושר של ההסכמה חולים, אשר הדגימות שלהם הם דה מזוהה לאחר הגידול debulking ומיימת אוסף.
1. הדור של Spheroids ממספרי תאים קטנים ב 384-ובכן להוריד תלויים לוחות
- הניחו את צלחת הירידה התלויה בsonicator המלאה במים מעוקרים (DI) וsonicate במשך 20 דקות.
- עם יד כדורית, להסיר את הצלחת מsonicator ולשטוף אותו עם הפעלת מים DI.
- לאפשר את הצלחת לשבת באמבטיה של 0.1% חומצה הצורות הפלורליסטית עבור 24 שעות כדי למנוע ספיחה חלבונים ודבקות ספרואיד לבארות.
- להסיר צלחות עם יד כדורית ולשטוף את שני הצדדים של הצלחת עם הפעלת מים די ביסודיות.
- להקיש במרץ או לנער את הצלחת בתוך הקבינט אבטחה טיחות כדי להסיר את המים מבארות בסביבה סטרילית.
- מניחים את הצלחת תחת אור UV עבור 30-60 דקות על כל צד כדי לעקר את הצלחות ולמזער את הזיהום.
הערה: ניתן לחשוף את הצלחת גם לגז תחמוצת האתילן בחדר לעיקור. - ממלאים כל באר של 6-היטב צלחת עם 4-5 מ ל של מים מעוקרים וכריכים של הסנדוויץ ' וכריך הירידה התלויה בין המכסה והחלק התחתון של הצלחת 6-הבאר. הוסף 800 – 1000 μL של המים סטרילי די מסביב לשפת הלוח ירידה תלויה לספק לח, יציבה, וסטרילי סביבה למזער את נפח לאיבוד אידוי (איור 1 א-ג).
- עבור תאים מגודלים 2D, משלחים תאים כיסוי בינונית בשלב הרישום שלהם של צמיחה ולשטוף עם מלוחים 1x פוספט באגירה (PBS) כדי להסיר עקבות של סרום שור עוברי (FBS) במדיום הצמיחה, כפי שהוא הסלים את הפעולה של טריפסין.
- משאת הערוץ ומוסיפים 1.5-2 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA לצלחת תרבות 100 מ"מ ברקמות. התאים הדגירה 5 דקות בחממה מוגדר 37 ° c.
הערה: תאים עשויים להתנתק בתעריפים שונים, כדי לבדוק את הלוחות במיקרוסקופ אור של שחקן הספסל כדי להבטיח ניתוק תאים לאחר 5 דקות. התאם את פרוטוקול הניתוק לכל הוראות ספק בעת שימוש בשורת תא. - הוסף 6 – 8 מ ל של המדיום הסלולרי המכיל fbs או כל סרום לצלחת לנטרל את טריפסין, לאסוף תאים עם 10 ml סרולוגית, ולהפקיד אותם בצינור 15 מ ל חרוט.
- ספירת תאים על-ידי טעינת 10 μL של מתלה התא בכל צד של הומוציטוטומטר ובצע את פרוטוקול הספירה המשויך.
- עבור תאים שנגזר החולה שנאספו גידולים מוצק או גרורתי או מ מיימת כי לא היו 2D תרבותי, להכין תא בודד השעיות בסרום בינונית חינם (SFM) תיאר בעבר3.
- תהליך רקמות הגידול כפי שמתואר בעבר ולאחסן השעיות תא יחיד לשימוש מאוחר יותר בינונית הקפאה מתאים21,22.
- עבור רקמת הגידול מוצק, האוהב מכנית עם להב תער ולסנן את הפתרון באמצעות פילטר 40 יקרומטר לפני בידוד התאים הרצויים מתוך הדרגתי צפיפות21,22.
- עבור דגימות מיימת, למקד את התאים על ידי צנטריפוגה, להוריד כדוריות הדם האדומות ב-אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) מאגר, לשטוף ב-1x PBS, ולאחר מכן לעבור דרך מסנן יקרומטר 40 ו 28 גרם מחט 4 פעמים22.
- לבידוד של CSCs השחלות, למיין תאים עם הזרימה cy, כפי שמתואר להלן בפירוט.
- תאים בודדים מבודדים טריים קפואים לאחסון להפשיר בעת הצורך לניסויים.
- כדי להכין את ההשעיה התא לציפוי, לחשב את הנפח הרצוי של פתרון התא הנדרש עבור ציפוי: 20 μL לכל טיפה X המספר הכולל של טיפות = נפח הפתרון הכולל הדרוש.
- לדלל את ריכוז התא לריכוז התא הרצוי לכל 20 μL (כלומר, 100 תאים בירידה 20 μL).
- לערבב את ההשעיה התא בעדינות באמצעות pipet לפני הציפוי כדי להבטיח התפלגות הומוגנית של תאים ולשפר אחידות בין טיפות.
הערה: ערבוב יתר של ההשעיה התא עלול להוביל למוות תאים ופסולת בתוך spheroids תלוי. - מניחים את קצה הפיפטה בבאר בזווית של כ 45 ° ו pipet 20 μL של פתרון התא לתוך כל ירידה תלויה היטב.
הערה: תבניות ציפוי ניתן להתאים בהתאם למספר הספרואידים הדרושים. כמויות גדולות של ציפוי היטב בכל הבאר היא בטוחה יותר כאשר הכמות הגדולה של הספרואידים אינה נחוצה בניסוי, משום שהיא מונעת מיזוג מקרי של טיפות (איור 1D, E). אם יש צורך בכמויות גדולות של הספרואידים לניסוי, הצלחת כל השאר להשאיר שורה אחת של בארות הגבול מכל הכיוונים (איור 1F). - מניחים את המכסה של הצלחת 6-הבאר חזרה על גבי הצלחת ירידה תלויה ולהשתמש רצועה תרמופלסטיים מתיחה כי הוא חסר רגישות לאובדן לחות, כדי לאטום את הקצוות ולמנוע אידוי נוסף של טיפות. מהדגירה של מחולל2 שקעים בחממה (5% co2, 37 ° c).
- להאכיל התליה טיפות פעם אחת כל 2 – 3 ימים כדי לחדש את התרבות התאים בינונית עבור חומרים מזינים הדרושים על ידי הוספת 2 – 3 μL לכל מזהה ספרואיד המכיל היטב.
הערה: לאחר הדמיה, מומלץ תמיד להאכיל את טיפות תלוי, כמו חשיפה אוויר במהלך הדמיה מוביל התאיידות.
2. הוספת תרבית תאים בינונית לתליית שחרור לוחות ספרואיד
- הסר את הרצועה התרמופלסטית והמכסה בתוך ארון ביוטיחות והוסף 2 – 3 μL של מדיום התרבות המתאים לכל הטוב המכיל טיפה תלויה.
הערה: אמצעי האחסון שנוסף יהיה תלוי בגודל השחרור ובמשך הזמן שבין הארוחות. - לאחר האכלה, לכסות את הצלחת עם המכסה העליון ולהחיל פס תרמופלסטיים טרי לשוליים החיצוניים לפני לשים את הצלחת חזרה בחממה.
3. הדמיה בניגוד פאזה של מורפולוגיה ספרואיד
- הסירו את הרצועה התרמופלסטית מסביב לקצות הלוחית בארון בטיחות.
- בזהירות להסיר את 384-היטב תלוי ירידה spheroids צלחת מן הקבינט אבטחה טיחות עם המכסה עדיין במקום ולמקם אותו במגש המיקרוסקופ במיקרוסקופ אפיסצנט.
- השתמש באפשרות הדמיה חיה בתוכנת הדימות ב-4x, 10x או 20x כדי להתבונן בהרכבי השחרור התלויים ולצלם את התמונות הרצויות.
- לאחר שמירת התמונות, לקחת את הצלחת בחזרה לקבינט אבטחה טיחות ולהאכיל את התאים כמתואר לעיל.
- לחתום מחדש את הלוחית עם רצועת תרמופלסטית טרייה ולמקם את הלוחית האטומה בחזרה בחממה.
4. קוונפיקציה של התפשטות וכדאיות בתוך Spheroids
- לוחיות הרישוי במספר מספיק של בארות כדי להשיג > 10 משכפל טכני עבור כל נקודת זמן (כלומר, יום 1 ויום 7) כי יש לבדוק.
הערה: הבארות המשמשות לצורך שיטת זה אינן משמשות בדרך כלל בגלל מזהמים פוטנציאליים מצבען הרסאוין. - הוסף 2 μL של הפתרון המבוסס resazurin מסוננים לבארות שנועדו ניתוח התפשטות כאילו האכלה אלה בארות והדגירה לתקופת הדגירה נקבע מראש.
הערה: זמן דגירה זה יכול להשתנות בהתבסס על סוג תא ומספר התאים בתוך הספרואיד. מומלץ לקבוע את זמן הדגירה הנדרש הדרוש לפני תחילת ניסויים התפשטות על ידי התחלת מדידות לאחר הדגירה 1 שעה ולאחר מכן מדידת מחדש כל 30 דקות עד האות האותות במישור בקרת שליטה. קריאת שיטת הנתונים יכולה להילקח פעמים רבות ככל שתרצה. דגירה היא בדרך כלל 4 h עבור spheroids שיזם עם 100 תאים סרטניים. - הפעל את הקורא המיקרו-לוחית הראשון ואחריו את תוכנת הקורא לוחית המשויכת לפחות 15 דקות לפני הקריאה הראשונה כדי לאפשר למחשב להתחמם ולאבטח את הטמפרטורה הפנימית ב -22 ° c כטמפרטורה יכול להשפיע על הקריאות.
- פתח את הפרוטוקול 384-ובכן הגדר עם 530/25 הריגוש nm ו 590/35 פליטת ננומטר אורכי גל עם אופטיקה מוגדר למטה, לצבור להגדיר 35, לקרוא מהירות להגדיר נורמלי, לקרוא סוג להגדיר לקרינה .
- לאחר תקופת הדגירה, לפתוח את הכריך ירידה תלוי בארון בטיחות ולהביא את הצלחת 384-טוב עם המכסה עדיין במקום הקורא לוחית.
- מניחים את הצלחת 384-באר עם המכסה עדיין במקום מגש קורא לוחית, אשר יורחב פעם המכונה היא התחמם ולחץ על אישור כדי לקרוא את הצלחת.
- להחזיר את צלחת הבאר לבסיס 6-היטב ולמקם אותו בחממה. אם כל נקודות הזמן נקראו ליום, לחתום מראש את הצלחת לפני הצבתו בחממה.
- שמור את הניסוי בחלון המוקפץ ולאחר מכן לחץ על כן כשתתבקש האם ברצונך לבצע היצוא powerexports פלייט 1 לנתוני פלט מהתוכנה של קורא הצלחות לגיליון אלקטרוני עבור ארגון.
- ערכי הזריחה הממוצעת עבור כל תנאי ונרמול בממוצע של תנאי הבקרה כדי לדווח על שינוי קיפול בהפצה בתנאים ניסיוניים שונים.
- בעת השוואת היום 1 עד יום 7, יש לנרמל על-ידי חלוקה לפי הזריחה הממוצעת ביום 1 כדי לקבל שינוי מתקפל בהפצה לאורך זמן.
- חשב קווי שגיאה באמצעות שגיאה סטנדרטית של הממוצע וקבע משמעות סטטיסטית בין קבוצות נסיוניות עם מבחן סטטיסטי מתאים, כגון בדיקת ה-T דו-זנבית של התלמיד.
5. הערכה של רעילות בסמים בספרואידים
-
מינהל התרופות
- בכל עת בעקבות היווצרות ספרואיד, לספק תרופה מדולל לריכוז הרצוי כגון 2 מינון μL מכיל 10x ריכוז התרופה הסופית הרצויה.
הערה: זה בהנחה אידוי של 2 μL מ-droplet כך הטיפול הסופי אמצעי אחסון לאחר התרופה הוא 20 μL. לדוגמה, מינון μm 50 של ציספלטין טינית יהיה פתרון מוכן של 500 μm. אם טיפות מכילות יותר מ-20 μL, ריכוז התרופה ו/או אמצעי האחסון שנוסף צריך להיות מותאם בהתאם. - טיפול דגימות בקרה עם 2 μL של תרבות התא בינונית.
הערה: . ציספלטין מסיסות במים לכן, פקדים הם 2 μL של מדיום תרבות התא; עם זאת, אם רכב התרופה הוא ממיס שונים (למשל, DMSO), שולטת צריך להיות בינונית תרבות התא עם ריכוז שווה של DMSO כפי שנעשה בשימוש בטיפול תרופתי. - המשיכו לעקוב אחר התרופה המטופלת ואת מעקב השליטה במהלך תקופת דגירה של התרופה עם מיקרוסקופ פאזה כדי לקבל תיעוד חזותי של ההשפעה של רעילות סמים, כמו גם עם צבע resazurin כפי שמתואר לעיל כדי לפקח על הכדאיות התאית.
הערה: בדרך כלל, התרופות מתווספות לאחר 5 – 7 ימים ב טיפות ורעילות תלוי לאחר 48 –-72 hs אבל זה יכול להיות מגוון בהתאם לניסוי. ניתן להוסיף תרופות ברגע שנוצרו הספרואידים יציבים, בדרך כלל בין 1 – 4 ימים.
- בכל עת בעקבות היווצרות ספרואיד, לספק תרופה מדולל לריכוז הרצוי כגון 2 מינון μL מכיל 10x ריכוז התרופה הסופית הרצויה.
-
כימות רעילות לסמים לפי ספירת תאים
- בנקודת הזמן בסוף של טיפול תרופתי, לאסוף 10 spheroids כל אחד משליטה ותרופות מטופלים בארות באמצעות 1,000 μL pipet והפקדה כל קבוצה של spheroids לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה משלו.
- שוברים את הספירואידים לתאים בודדים באמצעות פיליטוף חוזר.
הערה: כדי להפחית את נזקי התאים הפוטנציאליים עקב הפחתה חוזרת, העיכול האנזימטי עם אנזים כגון טריפסין ניתן לבצע כדי להקל על יצירת פתרונות תאים בודדים לפני ליטוף23. מיניטיזציה של מוות התאים בשל ליטוף יהיה תלוי בסוג התא ויש למטב בהתאם. אם מודאג לגבי מוות בשל פירוק, להתייחס לניתוח עם צבען resazurin ואת הטיפול הרעילות ציטורעלים עבור שיטות חלופיות שאינן דורשות פירוק ספרואיד. - צנטריפוגה את הצינורות עבור 5 דקות ב 400 x g לאסוף תאים בחלק התחתון של צינורות מיקרוצנטריפוגה ומכה את supernatant.
- הוסף 20 μL של מדיה טרייה או 1x PBS לכל צינור לערבב היטב.
- הוסף כחול טרילון ביחס של 2 μL של הכתם הכחול של טריבן עד 20 μL של השעיית תא.
- טען 10 μL של תאים וטריקון כחול הבולם לתוך כל חדר של המוכציטוטומטר ולספור תאים תחת מיקרוסקופ אור, עם תאים מוכתמים כחולים המייצגים תאים מתים ותאים בלתי מוכתמים המייצגים תאים חיים.
- התא החי% = (מספר התאים החיים ÷ המספר הכולל של תאים) x 100.
6. אפיון ספרואיד עם טכניקות היסטולוגית
הערה: ישנן שתי אפשרויות עובש 3D מודפס פולימר ביולוגי לשכפל בתבניות מערך ספרואיד שנעשו על ידי איוונוב ואח '24: 1) 20 ובכן עובש שיכול להחזיק 28 μl לכל טוב ו 2) 63 גם עובש שיכול להחזיק 9 μl לכל טוב (איור 2d).
- לחטא עובש היסטולוגיה והגבול שלה על ידי ניגוב אותם עם 70% אתנול ולצרף את הגבול בחוזקה סביב העובש ולהניח את העובש זקוף. שתי התבניות מתאימות כ 3 מ ל של נוזל (3.203 mL עבור 20 מערך ספרואיד ו 3.196 mL עבור מערך הספרואיד 63).
- מעיל קלות את מערך ספרואיד עם 10,000 cSt הנפט באמצעות ספוגית כותנה מחודד כדי להקל על הסרת ג'ל עיבוד דגימה יצוק בשלבים הבאים.
- לחמם את הדגימה ג'ל עיבוד עד מעובה דרך מיקרוגל עבור 10 – 20 עם כובע התיר.
- הוסף בין 2.6 ו 2.8 mL של ג'ל עיבוד מותכת לתוך העובש עד בקירוב ברמה עם החלק העליון של הגבול.
- בתוך כמה דקות, פעם מתחזק, להסיר את ג'ל עיבוד יצוק על ידי הפרדת הגבול מן העובש ולאחר מכן היפוך עובש המערך.
- הוסף עצה פינצטה בין עובש לבין הגבול כדי להפריד אותם בזהירות ולאחר מכן להשתמש מגרד התא כדי לעזור להוציא את הגבס מן העובש אם זה לא להתנתק מיד.
- לקצור את spheroids מן הצלחת ירידה תלויה על ידי ליטוף את התוכן של באר אחת על 100 או 150 מילימטר תא צלחת פטרי עם 1,000 μL pipetting, ולבודד ויזואלית ספרואיד.
- Pipet 5 μL של התוכן היטב כולל ספרואיד מזוהה לתוך אחת הבארות מערך, עד המערך מתמלא.
- המתן 3 דקות כדי להבטיח spheroids התיישבו בתחתית המערך לפני ליטוף בעדינות ג'ל עיבוד מותכת לתוך כל הבארות להיות זהירים לא להפריע spheroids.
- הוסף ג'ל עיבוד נוסף כדי להחליק את החלק העליון של המערך ולאחר הקירור, מניחים את מערך ספרואיד מתחזק לתוך קלטת בעלת תווית לעיבוד.
- לתקן את הקלטת ב 4% פורמלין הלילה כדי לפתור את הספרואידים ב 4 ° צ' ולאחר מכן לאחסן ב 70% אתנול ב 4 ° צ' עד מוכן לעיבוד.
- תהליך עם תוכנית פרפין רגיל 1 h ולאחר מכן להטביע את המערכים ספרואיד כגון כי מערכים מעובדים פונים זקוף עם החלק התחתון של הבארות הקרובים ביותר הפנים לחסום.
- ודא שהמערכים מוטבעים כשהם שטוחים ככל האפשר, כשסומק הפנים התחתון מוטבע בתחתית הבלוק ובלוקים מניחים על הקרח.
- טען את הבלוק על המיקרוטומה והתאם את הבלוק כך שהלהב יהיה מקביל לפרצוף הבלוק הטעון.
- מערך גזור (עומק לדוגמה = 15 μm) עד שהחלק התחתון של בארות המערך מגיעים ומוודאים שהבארות העגולות גלויות בדגימות שנחתכו.
- לעבור לעומק 5 יקרומטר לדוגמה ולהמשיך לחתוך ולאסוף סרטים. בדקו מתחת למיקרוסקופ כל מספר פרוסות כדי לקבוע אם הגיעו לעומק הספרואיד. לאחר ההגעה של הספרואידים לאסוף כל שקופית לאחר מכן עד הספרואידים אינם גלויים עוד.
- כתמים כל שקופית עם פרוטוקול H & E סטנדרטי.
7. שיטת הרעילות מהמתים בשידור חי
- לכל טיפה תלויה, להוסיף את צבע התא החי, calcein-AM לריכוז הסופי של 2 μM, ואת הצבע תא מת, אתידיום הומודימר -1 לריכוז הסופי של 4 μM, שמירה על היקף האחסון הוא 20 μL.
הערה: נסה לשמור על כרכים נוספים למינימום, ובדרך כלל להוסיף 2 μL של צבעים בשילוב. - מניחים לוחית לאחור בחממה דחוקה בצלחת 6-באר עם מכסה ומודקת את spheroids עבור 45 דקות ב 37 ° c.
הערה: בהתאם לגודל של spheroids, זמן הדגירה הזה משתנה באופן משמעותי. לדוגמה, spheroids תחת 400 יקרומטר בדרך כלל דורשים רק 30 – 45 דקות של דגירה זמן, בעוד spheroids גדול יותר קרוב 800 יקרומטר נדרש עד 90 מינימום של זמן דגירה. זמני הדגירה חייבים להיות ממוטבים לניסוי של הפרט. - עבור הדמיה הבאים, הקציר spheroids עם 1,000 μl pipet בקבינט אבטחה טיחות והפקדה כל ספרואיד על מראש מנוקה מיקרוסקופ זכוכית שקופיות.
- מעבר תמונה דרך הזכוכית, על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד הפוך.
הערה: בהתאם לקרבה של המיקרוסקופ קונפוקלית וקד למעבדה שבה הספרואידים נאספים, spheroids יכול להיות התמונה droplet המקורי של בינונית ממוקם על השקופית או עטוף 2% agarose אם יציבות יותר נדרש עבור הובלה ספרואיד. - באמצעות מצב רכישה רב-ממדי בתוכנת המיקרוסקופ, אתר את הספרואיד באמצעות תאורה DIC בהגדלה של 10 x ולאחר מכן סרוק את מישור z כדי לזהות את הגבהים המקיף את הספרואיד.
- לחץ על סדרת z ולהגדיר את הגבול העליון והתחתון של Z-סריקה מעט גבוה יותר מהחלק העליון של הספרואיד מעט נמוך יותר מהחלק התחתון של הספרואיד.
- להלהיב את הספרואידים ב 488 ננומטר עבור calcein-AM (תאים חיים; ירוק) ו 561 nm עבור אתידיום הומודימר -1 (תאים מתים; אדום) עם גודל השלב המומלץ על ידי התוכנה, רווח מקסימלי וחשיפה מינימלית עבור כל צבע.
- לחץ על ' רכוש ' כדי לקבל תמונה מורכבת מערימת z של תאים חיים ומתים בתוך הספרואיד.
- כימות בממדים חיים/מתים באמצעות תוכנת עיבוד תמונה כדי לכמת אחוז של עוצמת פיקסל מהערוץ המתאים לתאים חיים לעומת האחוזים של עוצמת פיקסל מהערוץ המתאים תאים מתים מן המורכב תמונות z-הקרנה.
הערה: בשל המגבלות באמצעות כימות מבנה תלת-ממד עם הקרנה דו-ממדית, שיטה חלופית לכמת לעומת הזריחה המתה, בתוך צלחות הירידה תלויה להשתמש בקורא לוחית בעקבות הפרוטוקול הכלול עם calcein-AM ו אתידיום ערכת הומודימר-1.
8. אימונולואורנציה
- חום התכה נמוכה 2% הפתרון, כך הפתרון הוא צמיגי וקצת מעל נקודת התכה ומקום על שקופית מיקרוסקופ כדי ליצור מיטה רכה של agarose
- הקציר מנתחים על ידי דחיפת 20 μL של PBS דרך הירידה על המיטה הרך של 2% הצמח.
הערה: יש לעשות זאת במהירות, כך שהצמח אינו מגבש לפני הטבעה של הספרואידים. - לאחר agarose מתקרר ו ג ' ל עם שנקטפו ספרואיד לכוד בתוך (תחת 5 דקות), להוסיף 4% פורמלין מאגור נייטרלי לתקן את spheroids. לחילופין, להוסיף קרח קר מתנול, ולתקן את agheroids מוטבע ב-20 ° c עבור 30 דקות.
- כביסה 3x עבור 5 דקות כל אחד עם 1x PBS, השמטת PBS לאחר כל כביסה.
- בלוק עבור 1 h ב RT עם 10% סרום (כלומר, סרום לסוסים) ו 0.15% סבון פתרון (טריטון X-100) ב 1x PBS.
- כביסה 3x עבור 5 דקות כל אחד עם 1x PBS, השמטת PBS לאחר כל כביסה.
- ספרואידים כתם עם נוגדן הניאון הרצוי ב מומלץ או מראש הקבוע הנוגדנים לדילול (כלומר, התווית באופן מרבי של phalloidin ב-1:100 דילול), דגירה לפחות 90 דקות בטמפרטורת החדר, מכוסה מאור.
הערה: הפרוטוקולים ישתנו בהתאם לנוגדן היעד ודילול נוגדן ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה בהתאם לניסוי. - המחש באופן מוכתם בעזרת שיטות המתוארות בסעיף הקודם עבור הדמיה ממוחשבת.
- תמונות מערימת z משולב להדגים מורפולוגיה תלת-ממדית ב-spheroids.
9. איסוף וניתוח של אוכלוסיות של תאי גזע של סרטן עם הציטוצימטריה זרימה
- הכנת מספרי הספרואידים לניתוח הזרמת cy,
- לאסוף spheroids מכל באר בצלחות טיפה תלוי באמצעות 1,000 μL pipet ולהפקיד אותם לתוך 15 מ"ל שפופרת צנטריפוגה לפירוק עם ליטוף חוזר ונשנה.
- לספור תאים הניתנים לשימוש על הומוציטומטר באמצעות טריקון כחול כדי לקבוע מספר תא וריכוז כפי שמתואר לעיל.
- השעיית תא הבולם לחמש צינורות מיקרוצנטריפוגה כך שכל אחד מהם מכיל מינימום של 50,000 תאים.
- צנטריפוגה את כל הצינורות ב 400 x g עבור 5 דקות ב מיקרוצנטריפוגה.
- מרוב את הסופרנטאנט מכל צינור ומשהה את כדורי מחדש ב-100 μL של מאגר.
- התווית צינורות "Unstained", "DAPI", "APC-iso", "DEAB", ו "ALDH/CD133", בהתאמה.
- הוסף 0.5 μL של נוגדן APC-isotype לצינור הAPC-iso ו-1 μL של נוגדן CD133 לצינור ALDH/CD133 כפי שנקבע על ידי דילול סדרתי והמלצה היצרנים.
- להוסיף 5 μL של מגיב DEAB ו 0.5 μL של ALDH לצינור DEAB, ו 1 μL של ALDH לצינור ALDH/CD133.
- וורטקס כל הצינורות עבור 2 s ו-דגירה ב 37 ° c עבור 45 דקות.
- וורטקס כל הצינורות שוב ו צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב מיקרוצנטריפוגה.
- תווית FACS צינורות "Unstained", "DAPI", "APC-iso", "DEAB", ו "ALDH/CD133" ולמלא קצף בידוד מכולה להניח בצד.
- מכתים מחדש את השליטה "בלתי מוכתם" ב-400 μL מאגר FACS (1x PBS עם 2% FBS) ואת כל הצינורות האחרים ב 400 μL של FACS DAPI מאגר (מאגר FACS עם 300 μM 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול).
- מניחים צינורות במיכל עם קרח עד שנותחו על ציטוטומטר זורם.
הערה: כדי למיין לתאי גזע סרטן השחלות, לאסוף את כל התאים האמצעים cytometer להיות ALDH + ו CD133 + עם שערים להגדיר לכלול 0.5% לא ספציפי האות APC ו 0.15% שאינם ספציפיים ALDH + אות. לפחות 10,000 תאים צריכים להיות מנותח לקבלת תוצאות אמינות. פרטים נוספים ניתן למצוא בפרסומים האחרונים3,17.
- ניתוח אלDH +/cd133 + אוכלוסיות ב-FlowJo
- לחץ פעמיים על הסמל Flowjo כדי לפתוח את התוכנית וגרור. fcs קבצים שהתקבלו מזרימת התוכנה cy, לנסות לתוך סביבת העבודה.
- לחץ פעמיים על הקובץ הבלתי מוכתם והגדר את ציר ה-y לגובה פיזור צדדי (המטה-מסוף) וציר ה-x כדי להעביר גובה פיזור (fsc-h).
- לחץ על לחצן T לצד כל ציר כדי לכוונן את קנה המידה והשינוי כדי למקסם את ההפרדה בין אוכלוסיות תאים שונות.
- לחץ על לחצן המצולע וצייר שער מצולע סביב אוכלוסיית התאים וסמן את התאים של האוכלוסיה.
- לחץ פעמיים על אוכלוסיית התאים בסביבת העבודה כדי להציג רק את התאים שבתוך האוכלוסיה ' תאים ' ולאחר מכן לחץ על ציר fsc כדי לשנות את ערוץ הציר ל-fsc-רוחב ולאחר מכן לחץ על ציר ה-אס. אס. סי ושנה את ערוץ הציר ל-Fsc-H.
- בחר בכלי ' שער מלבן ' וצייר מלבן מסביב לאוכלוסיה הצפופה ביותר של תאים המשתרעים על-ידי ציר ה-y כדי להוציא כדוריות פוטנציאליות לימין החלון ולתייג את השער ' תאים בודדים '.
- לחץ לחיצה ימנית והעתק את התאים ואת שער התאים הבודד המקונן והדבק אותם תחת כל מדגם בסביבת העבודה.
- לחץ פעמיים על שער התאים היחידים המקונן תחת דגימת dapi בסביבת העבודה כדי להציג את אוכלוסיית התאים הבודדת מהצינור לדוגמה ולחץ על ציר fsc ולשנות את ערוץ הציר לערוץ Dapi-Area.
- לחצו על ציר האס. בי. או החליפו את ערוץ הציר להיסטוגרמה.
הערה: התאים החיים יהיו כלפי השמאל כשהם לא יכללו DAPI, בעוד שתאים מתים ייקחו את DAPI ויופיעו לקראת הזכות של הגרף. - לחץ על לחצן T לצד ציר dapi ולחץ על התאמה אישית של ציר כדי לכוונן את הסולם כדי למקסם את ההפרדה בין פסגות חיוביות dapi חיוביים ו-dapi.
הערה: חלון יופיע עם אפשרויות שינוי קנה מידה. פעמים רבות, הגדרת שדה קנה המידה כדי biex והתאמת עשורים שליליים נוספת בסיס רוחב תניב את ההפרדה הגדולה ביותר. - לחצו על ' החל ' בחלון המוקפץ כדי להחיל שינויי קנה מידה, בחרו בלחצן ' שער טווח ' והפיצו אותו מעל לפסגת dapi השלילית, המתאימה לאוכלוסיית התאים החיים.
- לתייג את השער ' תאים חיים ' וקליק ימני כדי להעתיק את השער ' תאים חיים ' כדי להדביק אותו תחת השער ' תאים בודדים ' תחת ' APC-iso, ' DEAB ', ו ' ALDH/CD133 ' צינורות לבחור את אותו חלק של תאים חיים בכל צינור לדוגמה.
- לאחר מכן לחץ פעמיים על אוכלוסיית התאים החיים המקוננים תחת קובץ המדגם של APC-iso והחלף את ציר ה-x ל-aldh — ערוץ השטח וציר ה-y אל APC — ערוץ שטח.
- שוב, התאם את קנה המידה של הציר על-ידי לחיצה על לחצן T והתאמה אישית של ציר של כל ציר כך שהאירועים מותאמים לאזור הימני התחתון של ההתוויה ובחר את האפשרות מרחב השער ולחץ על חלון ההתוויה כדי ליצור שער רבעים .
- להתאים את הצטלבות של השער כך כ 0.5% של האוכלוסייה נמצאת בפינה השמאלית העליונה של חלון העלילה או ' APC חיוביים ' רביע.
הערה: 0.5% זה מייצג את ההכתמים הלא ספציפיים של הנגמ ש מסוג APC. - לחץ לחיצה ימנית על כל תווית רביע באופן נפרד בסביבת העבודה ושנה אותם בהתאם. פקד או Command לחץ על כל תווית של שער הרביע בסביבת העבודה והעתק אותם.
הערה: ' Q1 ' מייצג CD133 + תאים; ' Q2 ' מייצג תאים CD133 + ו-ALDH + '; ' רבעון שנקבע ' מייצג את התאים ALDH +; ו-' רבעון 4 ' מייצג תאים CD133-ו-ALDH-. - הדבק את שערי הרביע לתוך אוכלוסיית התאים החיים המקוננים תחת קובץ ה-deab. כוונן את הקו האנכי כך שכ-0.15% מאוכלוסיית התאים נמצאת בתוך הרביע ' ALDH + ' הדואגים לא להזיז את הקו האופקי.
הערה: 0.15% זה מייצג אות ALDH לא ספציפי.- כדי להבטיח שהקו האופקי לא ישתנה, העתק את השערים החדשים המקוננים תחת קובץ ה- Deab והדבק אותם אל התאים החיים תחת קובץ ה-iso של APC. בחר כן כאשר תתבקש להחליף את שער הרביע הקיים.
- ודא בסביבת העבודה כי ' CD133 + ' אחוז הוא עדיין כ 0.5 תחת ' APC-iso ' קובץ.
- העתק והדבק את שערי הרביע לאוכלוסיית ' התאים החיים ' של הקובץ ' ALDH/CD133 '.
הערה: האחוז של אוכלוסיית תאים קיימא נוכח הרביע הימני העליון יהיה אחוז ALDH + ו CD133 + CSCs חיובי כפול בתוך המדגם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spheroids שנוצרו עם קווי תאים או החולה נגזר CSCs ניתן ליצור עם מגוון של מספרי תאים קטנים בתוך טיפות תלויות (איור 2A). Spheroids טופס מהימן עם כמה כמו 10 תאים לכל טוב, אשר מאפשר שימור של דגימות מטופלים נדירים. תאים בתוך spheroids אלה מוקפים בתאים אחרים 3 ממדים כפי שהם יהיו בvivo, המאפשר לאנשי קשר של תא התא הפיזיולוגי ושיעורי דיפוזיה. תאים סרטניים בתוך spheroids מתרבים גורם spheroids להתרחב בגודל לאורך זמן (איור 2B). כמו תאים אגרסיביים יותר החולים או קווי התאים לצמוח מהר יותר מאשר עמיתיהם שלהם, חשוב לכמת את קיבולת ההתפשטות של כל מדגם ולבחון כיצד הטיפול בסמים משפיע על התפשטות של כל מדגם. כדי לעשות זאת, שיטת פעילות מטבולית, כגון שיטת resazurin מבוסס זריחה, ניתן לבצע בקלות עם פלטפורמת הפיזיולוגית 384-היטב, ללא כל דרישה לקציר spheroids, התוצאות של אשר ניתן לראות באיור 2C. ניתן גם לקצור, לתקן, לסדר מנות, ולוכתם במטאוקסילין ובנוגדנים אאוזין או immunofluorescent באותו הזמן כדי לזהות מורפולוגיות תאים וארגון בתוך spheroids, כמו גם, התפלגות סוגי תאים ECM חלבונים (איור 2ד, ה).
כדי לבחון את ההשפעה של טיפול בסמים על מורפולוגיה ספרואיד, ניתן לדמיין בקלות את הספרואידים על ידי הדמיה בניגוד פאזה (איור 3A). כימות יותר, ההשפעה של טיפול בסמים על תא הגידול או התפשטות CSC יכול להיות גם נמדד על ידי resazurin קריאות אור פלואורסצנטי לשלוט spheroids מטופל לעומת התרופה הטיפול spheroids (איור 3B). כאימות של מוות תאים בעקבות טיפול תרופתי, יכולת הכדאיות בתוך שליטה ותרופות מטופלים spheroids יכול בקלות להיקבע באמצעות תוספת של calcein-AM ו אתידיום הומודימר 1 כדי spheroids מרובים עבור כל תנאי (איור 3C). בעקבות זמן הדגירה, ניתן לקצור את הספרואידים המוכתמים בעזרת פיפטה ובתמונה על מיקרוסקופ קונספקטאלי.
בסופו של דבר, על ידי קציר spheroids ופיזור אותם לתוך השעיות תא יחיד, הנוכחות של CSCs וסמנים תא אחרים פנוטיפ ניתן לנתח עם הזרמת cy, (איור 4). השוואה של CSCs קיימא בין טיפולים שונים תרופות בתוך החולה אותו, כמו גם, בין חולים יכולים לעזור להבחין את האפקטיביות של מיקוד שונים CSC תרופות באופן ספציפי לחולה.
איור 1: התפוקה הגבוהה של 3d 384 תלוי ירידה שחרור הצלחת אחסון ופריסות ציפוי. (א) הפלטה התלויה מונחת על החלק התחתון של 6 צלחת הבאר מלא באופן חלקי עם מים. (ב) מכסה של 6 צלחת באר ממוקם על גבי הלוח הירידה תלוי ליצור מחות סטרילי. (ג) 6-טוב מחסנית צלחת להיות אטום עם פס תרמופלסטי להגנה מפני אובדן לחות ומזהמים. (ד) ציפוי מתחלף לירידה בלוחית הפתיח. ריבועים ורודים מציינים בארות מלאות בתאים ותערובת בינונית. אזורים כחולים מצביעים. על תאי מים לייבוש קופסאות אפורות מציינות בארות ריקות הפועלות כגבול בין תאי לחות וטיפות ספרואיד. (ה) לחיות תמונה של לתלות את הלוח תלויה עם דפוס היטב לסירוגין. (ו) כל הפריסה לציפוי דפוס מנוצל עבור תפוקה גבוהה התלויות שחרור הניסויים spheroids. ריבועים ורודים מצביעים על בארות מצופה תאים ואזורים כחולים מצביעים על המים מלא תאים לחות מוגברת. ריבועים אפורים מצביעים על בארות הגבול הפועלות כגבול בין משטחי שתיה לבין אזורי תרבות התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: החולה נגזר CSC מורפולוגיה המבנה והתפשטות בתוך מתחת טיפות 3d. (A) תמונה חיה של מוכן 384-תלוי ירידה לוחית ספרואיד כפי שהוצג מלמטה. (ב) מיקרוסקופ אור מתקדם תמונות של החולה נגזר הגידול csc ספרואיד לאחר 2, 3, ו 5 ימים בירידה תלויה. סולם ברים = 100 μm. (ג) resazurin העוצמה הפלואורסצנטית מראה עלייה משמעותית לאחר 7 ימים של התרבות שחרור תלוי, הקשורות התפשטות וצמיחה של החולה טיפה תלוי הנגזר csc spheroids (unpaired שני זנב t-test, p < 0.0001, n > 10). (ד) תמונה של תבנית מערך ספרואיד המשמשת ליצירת גבס לצורך איסוף מספרי היסטולוגיה. (ה) H & התמונה של מרכיב תרבותי ספרואיד עם בתאי גזע של סרטן השחלות העיקרי, תאי גזע mesenchymal, תאי האנדותל, והיקפי דם היקפיים תאים שנאספו במערך ספרואיד. להפחיד בר = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח טיפול בתרופות של המטופל הנגזר CSC spheroids תלוי טיפות. (A) החולה נגזר csc התרופות שנזרע ב 50 תאים/ירידה מטופלים עם ריכוזים גוברת של פקליטקסל לאחר 5 ימים של צמיחה. תמונות מייצגות שצולמו 48 h לאחר טיפול תרופתי. (ב) כימות הכדאיות התאית דרך הקרינה הפלואורסצנטית בהגדלת ריכוזי הטיפול בפייליטקאל. לכל הדגימות יש הפחתה משמעותית ביכולת הקיום בהשוואה לשליטה. (בכיוון אחד ANOVA, p < 0.0001, n > 8). (ג) הדמיה מיקוד של חי (calcein-AM) ומתים (אתידיום הומודימר -1) תאים בתוך שחרור בתלייה ספרואיד. צבע ירוק מציין תאים חיים וצבע אדום מצביע על אוכלוסיית תאים מתים. סרגל קנה מידה = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: קוונפיקציה של CSCs בחולה נגזר CSC spheroids שנוצר והתחזק על פלטפורמת הירידה 384-תלוי. (א) בניתוח הזרמת הנתונים של cy, האוכלוסייה הסלולרית נבחרת לראשונה באמצעות שער מצולע כדי לחסל את כל האירועים המיוחס לפסולת. (ב) התאים היחידים נבחרים לאחר מכן כדי למנוע אותות פוטנציאליים אפשריים שעלולים לטשטש תוצאות. (ג) כל התאים החיים היחידים נבחרים לאחר מכן בהתבסס על הדרה של dapi. (ד) הציר האנכי של שער הרביע מותאם בפקד ה-deab כדי לאפשר כ-0.15% כתמים לא ספציפיים של aldh. (ה) הציר האופקי של שער הרביע מותאם בקרת ה-apc ISO כדי לאפשר כ 0.5% לא ספציפי כתמים apc. (ו) שער הרבעים משמש לאחר מכן כדי לקבוע את אחוז CD133 +, aldh +, ו-CD133 +/aldh + תאים נמצאים באוכלוסיית התאים החיים ב CD133 הנסיוני ובתנאי aldh. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
384-היטב תלוי הלוח ירידה פלטפורמה עבור היווצרות 3D ספרוoid הוא כלי מיושם בקלות עבור כל ביולוגיה תא או סרטן בביולוגיה מעבדות. זו פלטפורמה פיזיולוגית מאפשר לימוד של קווי התא, כמו גם, דגימות המטופל העיקרי בתוך תרבויות תלת-ממד רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית תוך מתן אפשרות הקרנת סמים בתפוקה גבוהה. הפלטפורמה מבטיחה גם שתנאי התרבות הם מאוד מהירים ומאפשרים שליטה מדוקה על צפיפויות הציפוי, היחס בין התרבות הסלולרית, הרכיבים המתכלים והקומפוזיציה הבינונית. יתרה מזו, הפלטפורמה הפיזיולוגית הזאת מאפשרת לניסויים להיות מאוד מאפשרים לשיטות ניתוח במטה הדורשות ספירות תאים גדולות או קטנות כגון רביעיית-PCR, FACS ושיטות דימות שונות. בעוד נוחות הניצול מגיע עם ניסיון, מתלמדים חדשים הופכים למצליחים במהירות, פעם אחת מהירות וקלות של ליטוף הם שולט. לפיכך, פלטפורמת הפיזיולוגית הזאת מתאימה מאוד להקרנה אישית של הקרנת תרופות תלת-ממדית, לביולוגיה של CSC ולחקירות הצ.
כמה נקודות דאגה כאשר לאחרונה היישום פלטפורמה זו כוללים העברת צלחות וטיפול בסמים. בעת העברת לוחות ממיקום אחד למשנהו כנדרש עבור הזנה שגרתית, הדמיה וניתוח, יש לנקוט באמצעי זהירות זהירים כדי להימנע מנדחקים מיותרים. לאחוז את לוחיות מן הקצוות החיצוניים לשמור אותם ברמה ככל האפשר, לטפל כדי למנוע תנועות צורם בעת הצבת לוחית למטה. פעולה זו מסייעת להימנע מאובדן או ממיזוג של טיפות שכנות. באופן דומה, תשומת לב המשמר צריך להינתן למשימה של תרופות לטיפול spheroids תלויים כדי למנוע מינון שגוי של כל אחד תלוי הירידה ספרואיד. כמו בכל טכניקה, ביטחון ודיוק עם משימות אלה מגיעות עם תרגול.
מספר מגבלות מולדים זה פלטפורמת הפיזיולוגית 3D. ראשית, אי יציבות droplet עשויה להיות בעיה בנקודות זמן התרבות לטווח ארוך, אם הטיפול לא נלקח כדי לשמור את הנפח הכולל של droplet. יתר על כן, כפי שהוזכר לעיל, הובלה ואחסון של צלחות יש לעשות בזהירות כדי למנוע אובדן או מיזוג של טיפות. בנוסף, את הגודל עבור הסביבה 3D זה מוכתב על ידי גודל droplet יציבה מולדת של 20 μL, למרות שכפול רבים ניתן לייצר עבור ספירות תאים משופרים.
שינויים בפלטפורמה זו הפיסיולוגית 3D יכול להיות מנוצל כדי להגביר את התפוקה ולשנות מאפיינים פיזיולוגיים. למשל, פריסת droplet ניתן לשנות כדי לכלול כל באר בתוך 384 צלחת הבאר כדי להגדיל את התפוקה. בנוסף, פלטפורמת הירידה 3D תלוי מאוד לחקירות שיתוף התרבות על ידי הכללה פשוטה של סוגי תאים מרובים בכל טוב. כדי ליצור ולתחזק את spheroids בהצלחה, מדיום תרבות התא וצפיפות התאים הראשונית הגוף יכול להיות מאופנן בקלות, כדי לווסת בחוזקה את גודל ספרואיד. עם אלה משתנים מאוד מאוד בעלי ממון חקירות אפשריים בתוך התחום של המטופל הפיזי תלת-ממדי שנגזר החולה.
בעוד שיטות הניתוח מתוארות באופן נרחב במחקרים מדעיים, קיימות מספר מגבלות ספציפיות לניתוח שחרור שנוצר על-ידי שימוש בחלק משיטות אלה. לדוגמה, כאשר spheroids הם מתורבתים לפרקי זמן ארוכים בלוחות השחרור התלויים, גודל droplet יכול להגביר באופן משמעותי את הגורם לטיפות לרעוד במהלך הדמיה של ניגודיות פאזה, העלולה לפגוע באיכות התמונה. זה יכול להיות יחסי יחסית על ידי לקיחת כמות שווה של בינונית מתוך כל היטב לפני הוספת מדיום טרי. בנוסף, טכניקות כגון זרימה cy, לספור תאים קיימא בודדים עשוי להיות מושפע על ידי הטכניקה המשמשת כדי לשבור מגזרים spheroids, אשר עשויים להזיק לתאים. ככזה, חשוב עבור כל מעבדה כדי למטב את הטכניקות הפירוק ספרואיד מבוסס על התאים שלהם ולהתנסות למזער את הנזק לתא תוך הגדלת צפיפות התא בודד. לבסוף, ניתוח היסטולוגית של הספרואידים יכול להיות מסובך בגודלם הקטן ודורש תרגול כדי להשיג סעיפים מוצלחים.
בסך הכל, 3D לתלות את הפלטפורמה שטיפה תלויה נפוצה בתוך סרטן מחקר שאינו סרטן. המערכת קלה ללמידה ומספקת סביבה מבחינה מבחינה מבחינה פיזיולוגית לתרבות התא בתבנית תפוקה גבוהה. זמן החניכה של הפלטפורמה הפיזיולוגית 3D זה הוא מינימלי, עם מעטים, אם בכלל, ניתוח טכני מכשולים להתגבר. צדדיות של מערכת זו מספקת אמצעים הקרנה ספציפית החולה של chemotherapeutics יעיל לרפואה מדויקת, בסביבה פיזיולוגית יותר מאשר אי פעם בעבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת בעיקר על ידי משרד ההגנה OCRP הקריירה המוקדמת הפרס W81XWH-13-1-0134 (GM), משרד ההגנה פרס פיילוט W81XWH-16-1-0426 (GM), משרד ההגנה החוקר יזם הפרס W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), ריבקין מרכז לסרטן השחלות וסרטן השחלות מישיגן ברית. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס P30CA046592. CMN נתמך על ידי האגודה הלאומית לחקר בוגרי קרן המדע תחת גרנט מס ' 1256260. MEB נתמכת על-ידי המחלקה לסיוע בוגר מחלקת החינוך בתחומי הצריכה הלאומית (GAANN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
| 100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 mL conical tube | Celltreat | FL4021 | |
| 1x DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
| 1x F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
| ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | - | |
| Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| Fetal Bovine Serum - premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
| Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
| Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | - | |
| Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | - | |
| Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
| Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | - | 3D printer |
| Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | - | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
| Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | - |
References
- All cancers Source: Globocan. , Globocan. http://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/cancers/39-All-cancers-fact-sheet.pdf (2018).
- Prasad, V., Mailankody, S. Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval. JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).
- Raghavan, S., et al. Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids. Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).
- Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. Cancer Stem Cells. New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity. Cancer Research. 76, 150-160 (2016).
- Páez, D., et al. Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence. Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).
- Ahmed, N., Stenvers, K. L. Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
- Varna, M., Bertheau, P., Legrès, L. Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models. Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays. Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).
- Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).
- Murphy, B., et al. Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis. Cancer Research. 76, 5798-5809 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening. Genes. 9, (2018).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture. Nature Methods. 14, 69-81 (2016).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Control Release. , (2012).
- Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G. Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres. Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. Papaccio, G., Desiderio, V. , Springer. New York. 61-75 (2018).
- Raghavan, S., et al. Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays. Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).
- Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).
- Kim, S., et al. Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites. Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Research. 71, 3991-4001 (2011).
- Pulaski, H. L., et al. Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer. Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).
- Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160 (2017).
