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Cancer Research

कैंसर स्टेम सेल को लक्षित करने के लिए एंटी-नोप्लास्टिक दवा स्क्रीनिंग के लिए फिजियोलॉजी रोगी व्युत्पन्न 3 डी स्फिरॉइड्स

Published: July 5, 2019 doi: 10.3791/59696
Automatic Translation
*1, *1, *1, *2, *1, *2, *2, 1,2,3,4
1Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Michigan, 3Rogel Cancer Center, School of Medicine, University of Michigan, 4Macromolecular Science and Engineering, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल में रोगी व्युत्पन्न स्फीरोइड की पीढ़ी का वर्णन किया गया है, और दवा का आकलन करने के लिए, प्रसार, साइटोटॉक्सिसिटी परीक्षण, प्रवाह साइटोमेट्री, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और कॉन्फोकल इमेजिंग के परिमाणीकरण सहित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण का वर्णन किया गया है। विरोधी neoplastic चिकित्सा के रूप में उम्मीदवारों की क्षमता. इस प्रोटोकॉल प्रत्येक रोगी और रोग के चरण के लिए विशिष्ट दवाओं की पहचान के साथ सटीक दवा का समर्थन करता है।

Abstract

इस प्रोटोकॉल में, हम 384-अच्छी तरह से फांसी बूंदों के भीतर ट्यूमर अफलोइड के उत्पादन के लिए प्रक्रिया की रूपरेखा के लिए एक शारीरिक प्रतिनिधि microenvironment में विरोधी कैंसर चिकित्सकीय के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देते हैं. हम रोगी व्युत्पन्न कैंसर स्टेम सेल गोलोइड के गठन की रूपरेखा, साथ ही, दवा उपचार के बाद पूरी तरह से विश्लेषण के लिए इन गोलोइड के हेरफेर. विशेष रूप से, हम गोलोइड आकारिकी, प्रसार, व्यवहार्यता, दवा विषाक्तता, सेल phenotype और सेल स्थानीयकरण डेटा के संग्रह का वर्णन. इस प्रोटोकॉल विश्लेषण तकनीक है कि आसानी से 384 अच्छी तरह से फांसी ड्रॉप मंच का उपयोग कर लागू कर रहे हैं पर भारी केंद्रित है, यह उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए आदर्श बना रही है. जबकि हम डिम्बग्रंथि के कैंसर के अध्ययन और कैंसर स्टेम सेल अनुसंधान में इस मॉडल के महत्व पर जोर, 384 अच्छी तरह से मंच अन्य कैंसर प्रकार और रोग मॉडल के अनुसंधान के लिए अनुकूल है, कई क्षेत्रों के लिए मंच की उपयोगिता का विस्तार. व्यक्तिगत दवा स्क्रीनिंग की गति और आसानी से कार्यान्वित शारीरिक प्रतिनिधि 3 डी संस्कृतियों के माध्यम से स्क्रीनिंग परिणामों की गुणवत्ता में सुधार करके, इस मंच के लिए नई चिकित्सा और रोगी विशेष के विकास में सहायता की भविष्यवाणी की है उपचार रणनीतियों, और इस प्रकार व्यापक नैदानिक प्रभाव पड़ता है.

Introduction

दुनिया भर में कैंसर से संबंधित मृत्यु 20181में 9.8 मिलियन मौतों की संख्या तक पहुंच गई, जिसमें उन्नत चिकित्सा विज्ञान के विकास की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया। दुर्भाग्य से, कैंसर दवाओं के विकास की लागत बढ़ रही है, लगभग 650 मिलियन अमरीकी डालर2 लागत एक ही दवा के विकास के साथ नए विरोधी कैंसर दवाओं को विकसित करने के लिए बेहतर रणनीतियों के लिए की आवश्यकता का संकेत. कैंसर स्टेम सेल (CSCs), जो वृद्धि हुई chemoresistance3की विशेषता है, स्वयं को नवीनीकृत करने की क्षमता, और नए ट्यूमर बीज करने की क्षमता4 ट्यूमर पुनरावृत्ति के लिए जिम्मेदार माना जाता है4, मेटास्टेसिस5, और chemoresistance4,6, जो सभी ट्यूमर की घातक क्षमता में योगदान और इस प्रकार उच्च मरने वालों की संख्या. डिम्बग्रंथि के कैंसर में, इन कोशिकाओं peritoneal गुहा में घातक जलोदर तरल पदार्थ में समृद्ध पाए जाते हैं, गरीब नैदानिक परिणामों1के साथ जुड़े एक शर्त. सीएससी की घातक क्षमताओं का एक परिणाम के रूप में, पारंपरिक chemotherapies के साथ संयोजन के रूप में उपयोग करने के लिए नए सीएससी लक्ष्यीकरण दवाओं को विकसित करने के लिए एक धक्का दिया गया है। वहाँ कई चुनौतियों है कि सहित सीएससी लक्ष्यीकरण दवाओं के विकास के साथ कर रहे हैं: 1) विस्तार और इन विट्रो में सीएससी बनाए रखने में कठिनाई; 2) रोगी के नमूनों की कमी; 3) संस्कृति मंच की शारीरिक प्रासंगिकता; और 4) रोगियों के बीच दवा संवेदनशीलता में विषमता। इस प्रोटोकॉल एक उच्च थ्रूपुट 3 डी संस्कृति मंच है कि इन चुनौतियों में से प्रत्येक को दूर कर सकते हैं के कार्यान्वयन की रूपरेखा. विशेष रूप से, इस प्रणाली के रोगी व्युत्पन्न डिम्बग्रंथि CSCs की छोटी संख्या का उपयोग कर तेजी से दवा स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है, और अत्यधिक बहाव विश्लेषण तकनीकों के लिए अनुकूल है. जबकि डिम्बग्रंथि के कैंसर और सीएससी के अध्ययन के लिए आदर्श, हमारे मंच भी जटिल 3 डी वातावरण में अन्य कैंसर और विभेदित सेल प्रकार के अध्ययन में मूल्यवान है.

जटिल 3 आयामी (3 डी) मॉडल ट्यूमर microenvironment (TME) है, जो एक 3 डी आला कैंसर कोशिकाओं से बना है, गैर कैंसर का समर्थन कोशिकाओं, और extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन4के अध्ययन में महत्वपूर्ण हैं. इस 3 डी पर्यावरण अद्वितीय सेल आकारिकी, सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत, सेल भेदभाव, सेल प्रवास, सेल घनत्व, और प्रसार gradients में परिणाम इन विट्रो4में पारंपरिक 2 डी सेल संस्कृति की तुलना में. इन सभी कारकों 3 डी संस्कृतियों के भीतर अंतर दवा प्रतिक्रिया में समापन, वृद्धि हुई दवा प्रतिरोध और शारीरिक प्रासंगिकता7,8का प्रदर्शन . सीएससी भेदभाव और chemoresistance में 3 डी TME की भूमिका के कारण, यह शारीरिक microenvironments में दवाओं को लक्षित सीएससी के लिए स्क्रीन करने के लिए महत्वपूर्ण है। सीएससी दवा स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों की शारीरिक प्रासंगिकता में सुधार रोगी विशिष्ट दवा स्क्रीनिंग, दवा विकास, उपचार रणनीतियों के निर्माण, और अंततः नैदानिक परिणामों में सुधार करने की क्षमता है। यह भी उतना ही महत्वपूर्ण है कि दवा स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया मंच उच्च throughput और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण तरीकों के साथ संगत हो लागत, समय, और होनहार दवाओं के नैदानिक अनुवाद समय को कम करने के लिए9.

वर्तमान में, जटिल TME सबसे अच्छा इस तरह के murine syngeneic ट्यूमर मॉडल के रूप में विवो मॉडल में के माध्यम से दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए बनाए रखा है, सेल लाइन व्युत्पन्न xenografts, और रोगी व्युत्पन्न xenograft (PDX) मॉडल12, के रूप में वे शारीरिक प्रदान शर्तों. हालांकि, इन मॉडलों के कम throughput प्रकृति, साथ ही, लागत, समय, और तकनीकी कौशल सेट है कि वे तेजी से, उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों13में अपनी उपयोगिता सीमा की आवश्यकता होती है. विवो मॉडल में इन के लिए विकल्प के रूप में, कई इन विट्रो 3 डी मॉडल hydrogels8का उपयोग, microfluidic उपकरणों के भीतर संस्कृति या 'ऑर्गन-ऑन-ए-चिप' उपकरणों10,14, और गैर-अनुकूल संस्कृतियों3,8 लागत, समय, और आवश्यक skillset के मामले में प्रवेश के लिए उनके कम बाधा के कारण भी विकसित किया गया है.

hydrogel संस्कृति प्लेटफार्मों मैट्रिक्स संरचना, यांत्रिक गुण, और मैट्रिक्स संरचना15पर afforded ठीक नियंत्रण में फायदेमंद होते हैं; हालांकि, वे उच्च घनत्व सेल संस्कृति14को बाधित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, hydrogels से कटाई कोशिकाओं बहाव विश्लेषण जटिल हो सकता है, कटाई के तरीकों के संभावित हानिकारक प्रभावों के कारण15. दूसरी ओर, Microfluidic उपकरणों, microscale उपकरणों है कि एक ही डिवाइस के भीतर और अभिकर्मकों की कम से कम खपत के साथ शारीरिक रूप से प्रासंगिक तराजू पर सेल संस्कृति के लिए उत्पादन का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं, प्रतिक्रिया समय में कमी आई, कम से कम अपशिष्ट, और तेजी से प्रसार14| इन विशेषताओं उन्हें दवा विषाक्तता की जांच के लिए मंच का वादा करते हैं, प्रभावकारिता, और फार्माकोकाइनेटिक्स. हालांकि, कुशल, परिमाणात्मक, reproduible, और उपयोगकर्ता के अनुकूल 3 डी सेल संस्कृति की चुनौतियों, साथ ही, भारी और महंगा पम्पिंग सिस्टम उच्च throughput अनुसंधान10में microfluidic अनुप्रयोगों को प्रतिबंधित किया है. कुशल पता लगाने की व्यवस्था और क्षेत्रों में संभावित रूप से कठिन कार्यान्वयन ने भी माइक्रोफ्लूइडिक प्रणालियों10को व्यापक रूप से अपनाने में बाधा पहुंचाई है .

इसके विपरीत, मिक्सर (न्यूटर), अल्ट्रा-कम अटैचमेंट प्लेट, और हैंगिंग बूंदों को उपयोगकर्ता-निर्धारित मैट्रिक्स घटकों को शामिल नहीं करते हैं, घूर्णन में गैर-अनुकूल स्थितियों में उत्पन्न गोलभों में शामिल नहीं हैं। ये पद्धतियां विशेष रूप से डिम्बग्रंथि के कैंसर का अध्ययन करने के लिए प्रासंगिक हैं क्योंकि गैर-अनुकूल स्थितियां उन परिस्थितियों के प्रतिनिधि हैं जिनमें उप-मंडल गुहा5के भीतर स्फीभ बढ़ते हैं। इन गैर-अनुकूल संस्कृति विधियों के भीतर, पोषक और फांसी ड्रॉप स्रूपॉइड अल्ट्रा-लो लगाव प्लेटों में उत्पन्न गोलोइड की तुलना में उच्च संहनन, remodeling, और chemoresistance प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है, वृद्धि हुई शारीरिक सुझाव प्रासंगिकता16,17,18,19. छोटे अच्छी तरह से आकार और कम से कम आवश्यक सेल नंबर से उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए क्षमता में वृद्धि के कारण, फांसी ड्रॉप प्लेटों में अफ़ग़ाइड पीढ़ी दवा स्क्रीनिंग के लिए एक आदर्श मंच है। यहाँ, हम 384-अच्छी तरह से फांसी ड्रॉप प्लेटों में एक टूनाबल 3 डी शारीरिक मंच पेश करते हैं, जो लागू करने में आसान है और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए अत्यधिक अनुकूल है, जिससे डिम्बग्रंथि के कैंसर और डिम्बग्रंथि सीएससी की उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए आदर्श बनता है।

हमारे 3 डी शारीरिक मंच शारीरिक सेल संपर्क, प्रसार ढाल, सेल घनत्व, और स्वाभाविक रूप से उत्पादित ईसीएम प्रोटीन, जो यथार्थवादी दवा प्रतिक्रियाओं के लिए योगदान कर सकते हैं सहित 3 डी संस्कृति के लाभ के सभी प्रदान करता है16, 17,18,19. इसके अतिरिक्त, रोगी व्युत्पन्न सीएससी के साथ इन गोलोइड पैदा करके, हम कई तकनीकी प्रतिकृति के साथएक साथ दवाओं के लिए रोगी विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का निर्धारण करने में सक्षम हैं, विषमता है कि रोगी ट्यूमर के भीतर पाया जा सकता है पर काबू पाने के लिए नमूने20| इसके अलावा, 3 डी संस्कृति सीएससी आबादीकेरखरखाव को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है 3,16 और इस प्रकार जलोदर7में समृद्ध सीएससी आबादी का प्रतिनिधि है . यह व्यवहार्यता और सीएससी अनुपात के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सहित आसान डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के साथ संयुक्त, दवा प्रभावकारिता को लक्षित सीएससी के इष्टतम मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। अंत में, इस शारीरिक मंच प्रयोग के दौरान कई समय बिंदुओं पर इमेजिंग के साथ संगत है, सेल मौत और प्रसार का मूल्यांकन, सेल संगठन और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ आकृति विज्ञान, वातानुकूलित पर एलिसा के साथ घुलनशील संकेत मध्यम, प्रवाह साइटोमेट्री के साथ सेल phenotypes, और पीसीआर के बाद जीन अभिव्यक्ति.

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Protocol

सभी रोगी नमूने सहमति रोगियों, जिनके नमूने ट्यूमर debulking और जलोदर संग्रह के बाद de-पहचान कर रहे हैं से एक अनुमोदित आईआरबी प्रोटोकॉल के तहत एकत्र कर रहे हैं.

1. 384-वेल हैंगिंग ड्रॉप प्लेट्स में छोटे सेल नंबर से स्फीरॉइड्स का उत्पादन

  1. बाँझ deionized (डीआई) पानी और 20 मिनट के लिए sonicate के साथ भरा एक sonicator में फांसी ड्रॉप प्लेट रखें।
  2. एक दस्ताने हाथ से, sonicator से थाली को हटाने और DI पानी चलाने के साथ धो लें.
  3. प्लेट को 24 एच के लिए 0.1% प्लुरॉनिक एसिड के स्नान में बैठने की अनुमति दें ताकि कुओं में प्रोटीन अधिशोषण और गोलोइड पालन को रोका जा सके।
  4. एक दस्ताने हाथ से प्लेटें निकालें और अच्छी तरह से चल DI पानी के साथ थाली के दोनों पक्षों कुल्ला.
  5. एक बाँझ वातावरण में कुओं से पानी निकालने के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर थाली को जोरदार नल या हिला।
  6. प्लेटों को बाँझ और संदूषण को कम करने के लिए प्रत्येक पक्ष पर 30-60 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के तहत प्लेट रखें।
    नोट: थाली भी नसबंदी के लिए एक कक्ष में एथिलीन ऑक्साइड गैस के संपर्क में किया जा सकता है.
  7. एक 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं को 4-5 एमएल के साथ भरें और 6-वेल प्लेट के ढक्कन और नीचे के बीच फांसी की बूंद प्लेट को सैंडविच करें। वाष्पीकरण के लिए खोई हुई मात्रा को कम करने के लिए एक आर्द्र, स्थिर और बाँझ वातावरण प्रदान करने के लिए फांसी की बूंद प्लेट के रिम के चारों ओर बाँझ डीआई पानी के 800-1,000 $L जोड़ें (चित्र 1 ए-सी)।
  8. 2 डी हो कोशिकाओं के लिए, विकास के अपने लॉग चरण में aspirate मध्यम कवर कोशिकाओं और 1x फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ धोने के लिए विकास के माध्यम में भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के निशान को दूर करने के लिए, के रूप में यह trypsin की कार्रवाई में बाधा.
  9. पीबीएस को प्रेरित करें और 100 मिमी ऊतक संस्कृति डिश में 0.25% ट्रिप्सिन-एड्टा के 1.5-2 एमएल जोड़ें। एक इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट किया गया है।
    नोट: सेल अलग-अलग दरों पर अलग हो सकते हैं, इसलिए प्लेटों को बेंचटॉप लाइट माइक्रोस्कोप पर जांच की जानी चाहिए ताकि सेल लाइन का उपयोग करते समय 5 मिनट के बाद सेल टुकड़ी को समायोजित किया जा सके। सेल लाइन का उपयोग करते समय प्रति विक्रेता निर्देशों के अनुसार टुकड़ी प्रोटोकॉल समायोजित करें।
  10. TRYpsin बेअसर करने के लिए पकवान करने के लिए FBS या किसी भी सीरम युक्त सेलुलर माध्यम के 6-8 एमएल जोड़ें, एक 10 एमएल serological pipet के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा, और उन्हें एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में जमा.
  11. एक हेमोसाइटोमीटर के प्रत्येक पक्ष पर सेल निलंबन के 10 डिग्री सेल्सियस लोड करके कोशिकाओं की गणना करें और संबद्ध गणना प्रोटोकॉल का पालन करें।
  12. रोगी व्युत्पन्न प्राथमिक या metastatic ठोस ट्यूमर से एकत्र कोशिकाओं के लिए या जलोदर है कि 2 डी सुसंस्कृत नहीं किया गया है से, सीरम मुक्त माध्यम में एकल सेल निलंबन तैयार (SFM) पहले से वर्णित3.
  13. प्रक्रिया ट्यूमर के ऊतकों के रूप में पहले वर्णित है और उचित ठंड मध्यम21,22में बाद में उपयोग के लिए एकल सेल निलंबन की दुकान .
    1. ठोस ट्यूमर ऊतक के लिए, एक रेजर ब्लेड के साथ यंत्रवत् कीमा और एक घनत्व ढाल21,22से वांछित कोशिकाओं को अलग करने से पहले एक 40 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से जिसके परिणामस्वरूप समाधान फिल्टर .
    2. नमूनों को जलते हुए नमूनों के लिए, सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को ध्यान केंद्रित करें, अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (ACK) बफर में लाल रक्त कोशिकाओं को लॉग इन करें, 1x पीबीएस में धोएं, और फिर 40 डिग्री मीटर फिल्टर और 28 जी सुई 4 गुना22से गुजरती हैं।
  14. डिम्बग्रंथि सीएससी के अलगाव के लिए, विस्तार से नीचे वर्णित के रूप में प्रवाह साइटोमेट्री के साथ कोशिकाओं को सॉर्ट करें।
  15. ताजा अलग एकल कोशिकाओं भंडारण के लिए जमे हुए हैं और जब प्रयोग के लिए आवश्यक thawed.
  16. चढ़ाना के लिए सेल निलंबन तैयार करने के लिए, चढ़ाना के लिए आवश्यक सेल समाधान की वांछित मात्रा की गणना: 20 $L प्रति बूंद X बूंदों की कुल संख्या - कुल समाधान मात्रा की जरूरत है।
  17. 20 डिग्री सेल्सियस (अर्थात्, 20 डिग्री एल ड्रॉप में 100 कोशिकाओं) को वांछित कोशिका सांद्रता के लिए निरूपित कोशिका सांद्रता।
  18. कोशिकाओं के सजातीय वितरण सुनिश्चित करने और बूंदों के बीच एकरूपता में सुधार करने के लिए चढ़ाना से पहले एक पाइप का उपयोग कर धीरे सेल निलंबन मिक्स।
    नोट: सेल निलंबन के overmixing फांसी ड्रॉप गोलिॉइड में सेल मौत और मलबे के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
  19. पिपेट की नोक को लगभग 45 डिग्री के कोण पर अच्छी तरह से रखें और प्रत्येक हैंगिंग ड्रॉप में सेल समाधान के 20 डिग्री सेल्सियस को अच्छी तरह से पाइपेट करें।
    नोट: चढ़ाना पैटर्न की जरूरत गोलभॉइड की संख्या के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। हर दूसरे कुएं में कांठ चढ़ाना जब किसी प्रयोग में बड़ी मात्रा में गोलाभ की आवश्यकता नहीं होती है, तो यह बूंदों के आकस्मिक विलय को रोकता है (चित्र 1D,E)। यदि किसी प्रयोग के लिए बड़ी मात्रा में गोलिभदों की आवश्यकता हो तो प्रत्येक कुएं को चारों ओर से सीमा कूपों की एक पंक्ति छोड़ दें (चित्र 1एफ)।
  20. 6-वेल प्लेट का ढक्कन वापस फांसी ड्रॉप प्लेट के शीर्ष पर रखें और एक स्ट्रेच थर्मोप्लास्टिक पट्टी का उपयोग करें जो नमी हानि के प्रति असंवेदनशील है, किनारों को सील करने और बूंदों के अतिरिक्त वाष्पीकरण को रोकने के लिए। एक मानक सीओ2 आर्द्र इनक्यूबेटर (5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस) में इनक्यूबेट।
  21. फ़ीड फांसी बूँदें एक बार हर 2-3 दिन के लिए आवश्यक पोषक तत्वों के लिए सेल संस्कृति माध्यम की भरपाई करने के लिए जोड़ कर 2-3 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक गोलिकाभ युक्त करने के लिए.
    नोट: इमेजिंग के बाद, यह हमेशा फांसी की बूंदों को खिलाने की सलाह दी जाती है, क्योंकि इमेजिंग के दौरान हवा के संपर्क में वाष्पीकरण की ओर जाता है।

2. सेल संस्कृति मध्यम को हैंगिंग ड्रॉप स्फ़रॉइड प्लेट्स में जोड़ना

  1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर थर्माप्लास्टिक पट्टी और ढक्कन निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से एक फांसी ड्रॉप युक्त करने के लिए उपयुक्त संस्कृति माध्यम के 2-3 $L जोड़ें।
    नोट: जोड़ा मात्रा ड्रॉप आकार और feedings के बीच समय की मात्रा पर निर्भर करेगा.
  2. खिलाने के बाद, प्लेट को शीर्ष ढक्कन से ढक दें और प्लेट को इन्क्यूबेटर में वापस डालने से पहले बाहर के किनारों पर ताजा थर्माप्लास्टिक पट्टी लागू करें।

3. स्फीरॉइड मॉर्फोलॉजी के चरण कंट्रास्ट इमेजिंग

  1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में थाली के किनारों के आसपास से थर्माप्लास्टिक पट्टी निकालें.
  2. ध्यान से जगह में अभी भी ढक्कन के साथ जैव सुरक्षा कैबिनेट से 384 अच्छी तरह से फांसी ड्रॉप स्फिरॉइड्स प्लेट निकालें और यह एक epifluorescent माइक्रोस्कोप पर माइक्रोस्कोप ट्रे में जगह है.
  3. फांसी ड्रॉप गोलोइड का निरीक्षण करने और वांछित चित्र लेने के लिए 4x, 10x या 20x पर इमेजिंग सॉफ्टवेयर में लाइव इमेजिंग विकल्प का उपयोग करें।
  4. छवियों को बचाने के बाद, प्लेट वापस जैव सुरक्षा कैबिनेट और फ़ीड कोशिकाओं के रूप में ऊपर वर्णित करने के लिए ले लो.
  5. एक ताजा थर्माप्लास्टिक पट्टी के साथ रीसील प्लेट और सील प्लेट इनक्यूबेटर में वापस जगह है।

4. स्फीरॉइड्स के भीतर प्रसार और व्यवहार्यता का परिमाणीकरण

  1. प्राप्त करने के लिए पर्याप्त संख्या में कुओं में प्लेट गोलाभ (अर्थात्, दिन 1 और दिन 7) जिसे प्राप्त किया जाना है।
    नोट: कुओं कि इस परख के लिए उपयोग किया जाता है आम तौर पर फिर से resazurin डाई से संभावित contaminants के कारण नहीं कर रहे हैं.
  2. प्रसार विश्लेषण के लिए नामित कुओं में फ़िल्टर किए गए रेज़ुरिन-आधारित समाधान के 2 $L जोड़ें जैसे कि पूर्व-निर्धारित ऊष्मायन अवधि के लिए उन कुओं और इनक्यूबेट को खिलाना।
    नोट: यह ऊष्मायन समय कक्ष प्रकार और गोलभ में कोशिकाओं की संख्या के आधार पर भिन्न हो सकता है। यह आवश्यक ऊष्मायन समय 1 घंटे ऊष्मायन के बाद माप शुरुआत से पहले प्रसार प्रयोगों की शुरुआत करने से पहले की जरूरत निर्धारित करने के लिए सलाह दी जाती है और फिर नियंत्रण कुओं पठार में संकेत readouts जब तक हर 30 मिनट फिर से मापने. परख रीडिंग के रूप में कई बार के रूप में वांछित लिया जा सकता है. इनक्यूबेशन आम तौर पर 100 कैंसर कोशिकाओं के साथ शुरू किए गए गोलभड़ियों के लिए 4 एच है।
  3. माइक्रोप्लेट रीडर को पहले से कम से कम 15 मिनट पहले पढ़ने से पहले संबद्ध प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर द्वारा पीछा करने के बाद चालू करें ताकि मशीन को गर्म करने और 22 डिग्री सेल्सियस पर आंतरिक तापमान को सुरक्षित करने की अनुमति दी जा सके क्योंकि तापमान रीडिंग को प्रभावित कर सकता है।
  4. 530/25 एनएम उत्तेजना और 590/35 एनएम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ एक 384-वेल प्लेट प्रोटोकॉल सेट खोलें नीचे करने के लिए सेट प्रकाशिकी के साथ, 35करने के लिए सेट लाभ , सामान्यकरने के लिए सेट गति पढ़ें, और पढ़ने के प्रकार Fluorscence के लिए सेट .
  5. ऊष्मायन अवधि के बाद, एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में फांसी ड्रॉप सैंडविच खोलें और 384-वेल प्लेट को ढक्कन के साथ अभी भी प्लेट रीडर के पास ले आओ।
  6. 384-वेल प्लेट को प्लेट रीडर ट्रे में अभी भी ढक्कन के साथ रखें, जिसे मशीन को गर्म करने के बाद बढ़ाया जाएगा और प्लेट पढ़ने के लिए ठीक क्लिक करें।
  7. 6-वेल बेस पर अच्छी प्लेट को लौटाएं और इसे इनक्यूबेटर में रखें। यदि सभी समय अंक दिन के लिए पढ़ा गया है, तो इसे वापस इनक्यूबेटर में रखने से पहले प्लेट को रीसील करें।
  8. पॉप-अप विंडो में प्रयोग सहेजें और फिर संकेत मिलने पर हाँ क्लिक करें कि क्या आप प्लेट रीडर सॉफ़्टवेयर से आउटपुट डेटा के लिए PowerExports को संगठन के लिए स्प्रेडशीट में निष्पादित करना चाहते हैं.
  9. प्रत्येक स्थिति के लिए औसत फ्लोरोसेंट मान और विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों में प्रसार में गुना परिवर्तन की रिपोर्ट करने के लिए नियंत्रण स्थिति के औसत से सामान्य।
  10. जब दिन 1 से 7 दिन की तुलना, दिन से विभाजित करके सामान्य 1 औसत फ्लोरोसेंट समय के साथ प्रसार में गुना परिवर्तन प्राप्त करने के लिए.
  11. मतलब के मानक त्रुटि का उपयोग कर त्रुटि सलाखों की गणना और एक उचित सांख्यिकीय परीक्षण के साथ प्रयोगात्मक समूहों के बीच सांख्यिकीय महत्व का निर्धारण, छात्र के दो पूंछ टी परीक्षण की तरह.

5. स्फीरॉइड्स में औषधि विषाक्तता का मूल्यांकन

  1. औषधि प्रशासन
    1. किसी भी समय गोलोइड गठन के बाद, वांछित एकाग्रता के लिए पतला दवा देने कि एक 2 जेडएल खुराक 10x वांछित अंतिम दवा एकाग्रता शामिल हैं।
      नोट: यह छोटी बूंद से 2 डिग्री सेल्सियस का वाष्पीकरण मान रहा है ताकि अंत मात्रा के बाद दवा उपचार 20 डिग्री सेल्सियस है। उदाहरण के लिए, सिसप्टिन की 50 डिग्री सेल्सियस खुराक में 500 डिग्री सेल्सियस का एक तैयार समाधान होगा। यदि बूंदों में 20 डिग्री सेल्सियस से अधिक होता है, तो दवा की सांद्रता और/या जोड़ी गई मात्रा को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।
    2. सेल संस्कृति माध्यम के 2 डिग्री एल के साथ नियंत्रण नमूने का इलाज करें।
      नोट: सिसप्लैटिन पानी में solubilized है. इसलिए, नियंत्रण सेल संस्कृति माध्यम के 2 डिग्री एल हैं; हालांकि, अगर दवा वाहन एक अलग विलायक है (जैसे, DMSO), तो नियंत्रण दवा उपचार में इस्तेमाल के रूप में DMSO के एक समान एकाग्रता के साथ सेल संस्कृति माध्यम होना चाहिए.
    3. दवा का इलाज किया और चरण माइक्रोस्कोपी के साथ दवा ऊष्मायन अवधि भर में नियंत्रण गोलोइड की निगरानी करने के लिए जारी रखने के लिए दवा विषाक्तता के प्रभाव का एक दृश्य रिकॉर्ड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से resazurin डाई के साथ ऊपर वर्णित सेलुलर व्यवहार्यता पर नजर रखने के लिए.
      नोट: आमतौर पर, दवाओं फांसी बूँदें और विषाक्तता में 5-7 दिनों के बाद जोड़ा जाता है 48--72 एच एस के बाद मापा लेकिन इस प्रयोग के आधार पर अलग किया जा सकता है. ड्रग्स के रूप में जल्द ही जोड़ा जा सकता है के रूप में स्थिर गोलभॉइड का गठन किया है, आमतौर पर 1-4 दिनों के बीच.
  2. सेल गिनती द्वारा दवा विषाक्तता परिमाणीकरण
    1. दवा उपचार के अंतिम समय बिंदु पर, नियंत्रण और दवा इलाज कुओं से प्रत्येक 10 गोलिभड़ों को इकट्ठा एक 1,000 $L पाइप का उपयोग कर और अपने स्वयं के microcentrifuge ट्यूब में गोलोइड के प्रत्येक सेट जमा.
    2. बार-बार पाइपिंग द्वारा गोलोइड को एकल कोशिकाओं में तोड़ ें।
      नोट: बार-बार पाइपिंग के कारण संभावित कोशिका क्षति को कम करने के लिए, ट्रिप्सिन जैसे एंजाइम के साथ एंजाइमी पाचन किया जा सकता है ताकि पाइपिंग23से पहले एकल कोशिका समाधानों के उत्पादन को सुविधाजनक बनाया जा सके। पाइपिंग के कारण सेल मृत्यु का न्यूनतमीकरण सेल प्रकार पर निर्भर करेगा और तदनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए। यदि वियोग के कारण मृत्यु के बारे में चिंतित हैं, तो resazurin डाई और वैकल्पिक तरीकों के लिए साइटोटॉक्सिसिटी परख के साथ विश्लेषण देखें जो गोलाभ वियोग की आवश्यकता नहीं है।
    3. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के तल पर कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 400 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनेंट को प्रेरित करें।
    4. प्रत्येक ट्यूब के लिए ताजा मीडिया या 1x पीबीएस के 20 डिग्री एल जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण.
    5. सेल निलंबन के 20 डिग्री सेल्सियस करने के लिए Trypan नीले दाग के 2 डिग्री सेल्सियस के अनुपात में Trypan नीले जोड़ें।
    6. हेमोसाइटोमीटर के प्रत्येक कक्ष में कोशिकाओं और ट्रिपन ब्लू सस्पेंशन के 10 डिग्री सेल्सियस लोड करें और एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की गणना करें, जिसमें नीले रंग की दागी कोशिकाएं मृत कोशिकाओं और जीवित कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं।
      1. लाइव सेल % ] (लाइव कोशिकाओं की संख्या ] कोशिकाओं की कुल संख्या) x 100.

6. हिस्टोलॉजिकल तकनीक के साथ स्फिरॉइड विशेषता

नोट: वहाँ दो मोल्ड विकल्प 3 डी एक bioसंगत बहुलक में मुद्रित करने के लिए Ivanov एट अल द्वारा किए गए spheroid सरणी मोल्डों को दोहराने के लिए कर रहे हैं24:1) 20 अच्छी तरह से मोल्ड है कि 28 $L प्रति अच्छी तरह से पकड़ कर सकते हैं और 2) 63 अच्छी तरह से मोल्ड है कि अच्छी तरह से 9L पकड़ कर सकते हैं (चित्र 2 डी)

  1. ऊतक विज्ञान मोल्ड और इसकी सीमा को 70% इथेनॉल के साथ पोंछते हुए और मोल्ड के चारों ओर मजबूती से सीमा संलग्न करें और मोल्ड को सीधा रखें। दोनों मोल्ड लगभग 3 एमएल तरल पदार्थ के लिए फिट (3.203 एमएल 20 गोलाभ सरणी के लिए और 3.196 एमएल 63 गोलाभ सरणी के लिए).
  2. हल्के से 10,000 cSt सी तेल के साथ गोलाभ सरणी कोट एक नुकीले कपास झाड़ू का उपयोग करने के बाद के चरणों में डाली नमूना प्रसंस्करण जेल को हटाने की सुविधा के लिए.
  3. नमूना प्रसंस्करण जेल गर्म जब तक माइक्रोवेव के माध्यम से तरलीकृत के लिए 10-20 एस टोपी ढीला के साथ.
  4. सीमा के शीर्ष के साथ लगभग स्तर तक मोल्ड में पिघला हुआ प्रसंस्करण जेल के 2.6 और 2.8 एमएल के बीच जोड़ें.
  5. कुछ ही मिनटों में, एक बार ठोस, मोल्ड से सीमा को अलग करने और फिर सरणी मोल्ड उलटा द्वारा प्रसंस्करण जेल डाली हटा दें।
  6. उन्हें ध्यान से अलग करने के लिए मोल्ड और बॉर्डर के बीच ट्वीज़र टिप डालें और फिर मोल्ड से कास्ट को हटाने में मदद करने के लिए एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करें यदि यह सही दूर अलग नहीं होता है।
  7. एक 100 या 150 मिमी सेल पेट्री डिश पर एक अच्छी तरह से pipeting द्वारा फांसी ड्रॉप प्लेट से गोलिभड़ा फसल एक 1,000 $L पाइप के साथ, और spheroid नेत्रहीन को अलग.
  8. सरणी कुओं में से एक में पहचान की गोलोइड सहित अच्छी तरह से सामग्री के 5 डिग्री एल, जब तक सरणी भर जाता है.
  9. 3 मिनट प्रतीक्षा करें सुनिश्चित करने के लिए spheroids धीरे से उपभक्षी भंग करने के लिए परेशान नहीं किया जा रहा सावधान किया जा रहा है में पिघला हुआ प्रसंस्करण जेल pipeting से पहले सरणी के नीचे करने के लिए बसे हैं।
  10. सरणी के शीर्ष से दूर स्तर के लिए अतिरिक्त प्रसंस्करण जेल जोड़ें और एक बार ठंडा, प्रसंस्करण के लिए एक लेबल कैसेट में ठोस गोलक सरणी जगह.
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर spheroids को ठीक करने के लिए रात में 4% फॉर्मेलिन में कैसेट लेबल और फिर प्रसंस्करण के लिए तैयार जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल में स्टोर.
  12. मानक 1 ज पैराफिन प्रोग्राम के साथ प्रक्रिया करें और फिर गोलोइड सरणियों को एम्बेड करें ताकि संसाधित सरणियां ब्लॉक चेहरे के निकटतम कुओं के नीचे के साथ सीधा सामना कर रहे हों।
  13. सुनिश्चित करें कि सरणियाँ संभव के रूप में फ्लैट के रूप में एम्बेडेड हैं, ब्लॉक के नीचे के साथ नीचे चेहरा फ्लश और बर्फ पर ब्लॉक जगह के साथ.
  14. माइक्रोटोम पर ब्लॉक लोड करें और ब्लॉक को समायोजित करें ताकि ब्लेड लोड किए गए ब्लॉक चेहरे के समानांतर हो।
  15. सरणी (नमूना गहराई ] 15 डिग्री मी) को तब तक काटें जब तक कि सरणी कुओं के नीचे तक यह सुनिश्चित नहीं किया जाता कि परिपत्र कुएं कट ेली नमूनों पर दिखाई दे रहे हैं।
  16. 5 डिग्री मीटर नमूना गहराई पर स्विच करें और रिबन को स्लाइस और एकत्रित करना जारी रखें. यह निर्धारित करने के लिए कि अभी तक काउपयोग हो चुका है या नहीं, माइक्रोस्कोप के नीचे हर कुछ स्लाइस की जांच करें। एक बार जब स्रूपीभों तक पहुँच रहे हैं प्रत्येक बाद स्लाइड इकट्ठा जब तक spheroids अब दिखाई नहीं दे रहे हैं.
  17. मानक एच एंड ई प्रोटोकॉल के साथ प्रत्येक स्लाइड दाग।

7. लाइव मृत Cytotoxicity परख

  1. प्रत्येक फांसी ड्रॉप करने के लिए, लाइव सेल डाई, कैल्सीन-एएम को अंतिम सांद्रता में जोड़ें 2 डिग्री सेल्सियस, और मृत कोशिका डाई, एथिडियम होमोडाइमर-1 को अंतिम सांद्रता में 4 डिग्री एम, ध्यान में रखते हुए कि ड्रॉप की मात्रा 20 डिग्री सेल्सियस है।
    नोट: वॉल्यूम को न्यूनतम में जोड़ने का प्रयास करें, और आम तौर पर संयुक्त रंगों के 2 $L जोड़ें।
  2. इनक्यूबेटर में वापस प्लेटें रखें जो एक ढक्कन के साथ 6-वेल प्लेट में सैंडविच की गई है और 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए गोलोइड को इनक्यूबेट करें।
    नोट: गोलभों के आकार के आधार पर, यह ऊष्मायन समय काफी भिन्न होता है। उदाहरण के लिए, 400 डिग्री उ के अंतर्गत गोलभों को सामान्यतः केवल 30-45 मिनट के ऊष्मायन समय की आवश्यकता होती है, जबकि 800 डिग्री उ के करीब बड़े गोलोइड ों के लिए 90 मिनट तक ऊष्मायन समय की आवश्यकता होती है। किसी व्यक्ति के प्रयोग के लिए इनक्यूबेशन समय को ऑप्टिमाइज़ किया जाना चाहिए.
  3. बाद इमेजिंग के लिए, एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में एक 1,000 $L पाइप के साथ फसल spheroids और पूर्व साफ ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर प्रत्येक गोलोइड जमा.
  4. कांच के माध्यम से छवि गोलभॉइड, एक उल्टे confocal माइक्रोस्कोप पर.
    नोट: जिसमें गोलाभ काटा जाता है प्रयोगशाला के लिए confocal माइक्रोस्कोप की निकटता के आधार पर, गोलाभ या तो स्लाइड पर रखा मध्यम की मूल छोटी बूंद में छवि या 2% agarose में encased अगर और अधिक स्थिरता गोलाभ परिवहन के लिए आवश्यक है.
  5. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में बहुआयामी अधिग्रहण मोड का उपयोग करके, 10x आवर्धन पर डीआईसी रोशनी का उपयोग करके गोलभ का पता लगाएं और फिर गोलभॉइड को शामिल करने वाली ऊंचाइयों की पहचान करने के लिए z-प्लेन को स्कैन करें।
  6. $ श्रृंखला पर क्लिक करें और z-स्कैन के ऊपरी और निचले सीमा को गोलिभ के शीर्ष से थोड़ा अधिक और गोलिकाइड के नीचे से थोड़ा कम निर्धारित करें।
  7. कैल्सीन-एएम (लाइव सेल; हरे) और 561 एनएम के लिए कैलिसिन-एएम (लाइव सेल; ग्रीन) और 561 एनएम के लिए एथिडियम होमोडाइमर-1 (मृत कोशिकाओं; लाल) के लिए स्टेप आकार के साथ, सॉफ्टवेयर, अधिकतम लाभ और प्रत्येक रंग के लिए न्यूनतम जोखिम के लिए गोलाइड को उत्तेजित करें।
  8. गोलाभ के भीतर लाइव और मृत कोशिकाओं की एक समग्र z-स्टैक छवि प्राप्त करने के लिए प्राप्त करें क्लिक करें.
  9. छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर लाइव / मृत अनुपात परिमाणित करने के लिए समग्र से मृत कोशिकाओं के लिए इसी चैनल से पिक्सेल तीव्रता के प्रतिशत बनाम जीवित कोशिकाओं के लिए इसी चैनल से पिक्सेल तीव्रता का एक प्रतिशत की मात्रा निर्धारित करने के लिए z-प्रक्षेप छवियों.
    नोट: एक 2 डी प्रक्षेपण के साथ एक 3 डी संरचना परिमाणक में सीमाओं के कारण, मृत फ्लोरोसेंट बनाम लाइव मात्रा निर्धारित करने के लिए एक वैकल्पिक विधि, फांसी ड्रॉप प्लेटों के भीतर कैल्सीन-एएम और एथिडियम के साथ शामिल प्रोटोकॉल के बाद एक प्लेट रीडर का उपयोग करने के लिए है homodimer-1 किट.

8. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. एक कम पिघलने 2% agarose समाधान गर्मी, तो समाधान चिपचिपा है और बस पिघलने बिंदु के ऊपर और एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर जगह agarose के एक नरम बिस्तर बनाने के लिए
  2. 2% agarose के नरम बिस्तर पर ड्रॉप के माध्यम से पीबीएस के 20 डिग्री एल धक्का द्वारा हार्वेस्ट गोलाभ.
    नोट: यह जल्दी से किया जाना चाहिए ताकि अग्रोहों से पहले अग्रोहों एम्बेडेड हैं ठोस नहीं है।
  3. एक बार agarose ठंडा और (के तहत 5 मिनट के भीतर फंस काटे गोफिर के साथ जैल), spheroids को ठीक करने के लिए 4% तटस्थ बफर फॉर्मलिन जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, बर्फ ठंडा मेथनॉल जोड़ने के लिए, और 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर agarose-एम्बेडेड गोहरॉइड को ठीक।
  4. 1x पीबीएस के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x धो लें, प्रत्येक धोने के बाद पीबीएस discarding.
  5. 10% सीरम (यानी, घोड़े सीरम) और 1x पीबीएस में 0.15% साबुन समाधान (ट्रिटन एक्स-100) के साथ आरटी में 1 एच के लिए ब्लॉक।
  6. 1x पीबीएस के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x धो लें, प्रत्येक धोने के बाद पीबीएस discarding.
  7. अनुशंसित या पूर्व निर्धारित एंटीबॉडी कमजोर पड़ने पर वांछित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ दाग स्फीरोइड (यानी, फ्लोरोसेंट एक 1:100 कमजोर पड़ने पर फलालॉयडिन लेबल), कमरे के तापमान पर कम से कम 90 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग, प्रकाश से कवर किया गया।
    नोट: प्रोटोकॉल एंटीबॉडी और लक्ष्य और एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के आधार पर अलग अलग हो जाएगा प्रयोग के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है.
  8. इमेजिंग अफ़ीरॉइड के लिए पिछले अनुभाग में उल्लिखित विधियों का उपयोग करके उलटा शंखाकार माइक्रोस्कोप के साथ फ्लोरोसेंट रूप से दाग वाले गोलभों को विज़ुअलाइज़ करें।
  9. समग्र z-स्टैक छवियों का प्रदर्शन करेंगे 3 डी गोलाकार में आकृति विज्ञान.

9. प्रवाह साइटोमेट्री के साथ कैंसर स्टेम सेल जनसंख्या का संग्रह और विश्लेषण

  1. प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए गोलोइड तैयार करना
    1. एक 1,000 $L पाइप्ट का उपयोग कर फांसी ड्रॉप प्लेटों में प्रत्येक कुएं से गोलाभ लीजिए और उन्हें बार-बार पाइपिंग के साथ विघटन के लिए 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जमा करें।
    2. ऊपर उल्लिखित के रूप में सेल संख्या और एकाग्रता निर्धारित करने के लिए Trypan ब्लू का उपयोग कर एक हेमोसाइटोमीटर पर व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना.
    3. पांच माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में अलीकोट सेल निलंबन इस तरह है कि प्रत्येक में 50,000 कोशिकाओं की एक न्यूनतम शामिल है।
    4. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर सभी ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. प्रत्येक ट्यूब से सुपरनेटेंट को प्रेरित करें और बफर के 100 डिग्री एल में छर्रों को पुन: स्फूर्त करें।
    6. लेबल ट्यूब "अनस", "DAPI", "APC-iso", "DEAB", और "ALDH/CD133", क्रमशः.
    7. APC-isotype एंटीबॉडी के 0.5 $L जोड़ें APC-iso ट्यूब और 1 $L CD133 एंटीबॉडी के ALDH/CD133 ट्यूब के रूप में सीरियल कमजोर पड़ने और निर्माताओं की सिफारिश द्वारा निर्धारित करने के लिए.
    8. DEAB अभिकर्मक के 5 डिग्री सेल्सियस और ALDH के 0.5 डिग्री एल DEAB ट्यूब में जोड़ें, और ALDH के 1 $L ALDH/
    9. भंवर लगभग 2 एस के लिए सभी ट्यूबों और 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    10. भंवर सभी ट्यूबों फिर से और एक microcentrifuge में 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर centrifuge.
    11. लेबल FACS ट्यूब "अनसमुटावित", "DAPI", "APC-iso", "DEAB", और "ALDH/CD133" और एक अछूता फोम कंटेनर को भरने के लिए अलग सेट.
    12. Aspirate supernatant और 400 00 डिग्री FACS बफर (1x पीबीएस के साथ 2% FBS) और FACS DAPI बफर के 400 $L में अन्य सभी ट्यूबों में "अनिवार्य" नियंत्रण को फिर से शुरू (FACS बफर के साथ 300M 4',6-diamidino-2-phenildiole).
    13. बर्फ के साथ कंटेनर में ट्यूब प्लेस जब तक एक प्रवाह cytometer पर विश्लेषण किया.
      नोट: डिम्बग्रंथि के कैंसर स्टेम कोशिकाओं के लिए सॉर्ट करने के लिए, सभी कोशिकाओं है कि cytometer उपाय ALDH + और CD133 + फाटकों के साथ शामिल करने के लिए इकट्ठा 0.5% गैर विशिष्ट APC संकेत और 0.15% गैर विशिष्ट ALDH + संकेत. विश्वसनीय परिणामों के लिए कम से कम 10,000 कोशिकाओं का विश्लेषण करने की आवश्यकता है। हाल के प्रकाशनों3,17में अतिरिक्त विवरण प्राप्त किए जा सकते हैं .
  2. FlowJo में ALDH +/CD133 + आबादी का विश्लेषण
    1. प्रोग्राम खोलने के लिए FlowJo चिह्न को डबल क्लिक करें और प्रवाह साइटोमेट्री सॉफ़्टवेयर से प्राप्त .fcs फ़ाइलों को कार्यस्थान में खींचें.
    2. अनसमुडियेशन फ़ाइल को डबल क्लिक करें और sscatter ऊँचाई (SSC-H) और x-अक्ष स्कैटर ऊँचाई (FSC-H) को अग्रेषित करने के लिए साइड स्कैटर ऊँचाई (SSC-H) के लिए y-अक्ष सेट करें।
    3. विभिन्न कोशिका जनसंख्या के बीच पृथक्करण को अधिकतम करने के लिए स्केल और रूपांतरण समायोजित करने के लिए प्रत्येक अक्ष के आगे T बटन क्लिक करें.
    4. बहुभुज गेटिंग बटन पर क्लिक करें और सेल जनसंख्या के चारों ओर एक बहुभुज गेट आकर्षित करें और जनसंख्या 'सेल' को लेबल करें।
    5. केवल 'Cells' जनसंख्या के भीतर कक्षों को देखने के लिए कार्यस्थान में कक्ष जनसंख्या को डबल क्लिक करें और फिर अक्ष चैनल को FSC-चौड़ाई में परिवर्तित करने के लिए FSC अक्ष पर क्लिक करें और फिर SSC अक्ष पर क्लिक करें और अक्ष चैनल को FSC-H में परिवर्तित करें.
    6. आयत गेट उपकरण चुनें और विंडो के दाईं ओर संभावित डबलट्स को बाहर करने और इस गेट 'एकल सेल' को लेबल करने के लिए y-अक्ष की संपूर्णता फैले कोशिकाओं की बाईं-सबसे घनी आबादी के चारों ओर एक आयत आकर्षित करें।
    7. सीधे क्लिक करें और कक्षऔर नेस्टेड एकल कक्ष गेट की प्रतिलिपि बनाएँ और उन्हें कार्यस्थान में प्रत्येक नमूने के अंतर्गत चिपकाएँ.
    8. एकल कक्ष जनसंख्या उस नमूना ट्यूब से देखने के लिए कार्यस्थान में DAPI नमूने के अंतर्गत नेस्टेड एकल कक्ष गेट डबल क्लिक करें और FSC अक्ष पर क्लिक करें और अक्ष चैनल DAPI - क्षेत्र चैनल में परिवर्तित करें।
    9. SSC अक्ष पर क्लिक करें और अक्ष चैनल को हिस्टोग्राममें परिवर्तित करें.
      नोट: लाइव सेल बाईं ओर हो जाएगा के रूप में वे DAPI बाहर, जबकि मृत कोशिकाओं DAPI में ले जाएगा और ग्राफ के दाईं ओर दिखाई देते हैं.
    10. DAPI अक्ष के आगे T बटन पर क्लिक करें और DAPI धनात्मक और DAPI नकारात्मक चोटियों के बीच पृथक्करण को अधिकतम करने के लिए स्केल को समायोजित करने के लिए अक्ष अनुकूलित करें पर क्लिक करें.
      नोट: एक विंडो स्केलिंग विकल्पों के साथ पॉप अप होगी. अक्सर बार, Biex करने के लिए स्केल क्षेत्र की स्थापना और अतिरिक्त नकारात्मक दशकों और चौड़ाई आधार समायोजन सबसे बड़ी जुदाई उपज होगी.
    11. स्केलिंग परिवर्तन लागू करने, श्रेणी गेट बटन चुनने, और इसे DAPI ऋणात्मक शिखर पर फैलाने, लाइव कक्ष जनसंख्या के संगत करने के लिए पॉप-अप विंडो में लागू करें क्लिक करें।
    12. प्रत्येक नमूना ट्यूब में लाइव सेल के एक ही हिस्से का चयन करने के लिए 'एपीसी-आइसो, 'डीईएबी' और 'ALDH/CD133' ट्यूबों के तहत 'एकल सेल' गेट के तहत पेस्ट करने के लिए 'लाइव सेल' गेट को कॉपी करने के लिए इस गेट 'लाइव सेल' और राइट क्लिक करें।
    13. फिर APC-iso नमूना फ़ाइल के अंतर्गत नेस्टेड लाइव सेल जनसंख्या को डबल क्लिक करें और x-अक्ष को ALDH ] क्षेत्र चैनल और y-अक्ष को APC ] क्षेत्र चैनल पर स्विच करें.
    14. फिर से, टी बटन पर क्लिक करके अक्ष पैमाने को समायोजित करें और प्रत्येक अक्ष के अक्ष अनुकूलित करें ताकि घटनाओं को साजिश के नीचे बाएं क्षेत्र में स्थानीयकृत किया जाए और क्वाड गेट विकल्प का चयन करें और एक क्वाड्रेंट गेट स्थापित करने के लिए प्लॉट विंडो पर क्लिक करें .
    15. गेट के चौराहे को इस तरह समायोजित करें कि लगभग 0.5% आबादी प्लॉट विंडो के ऊपरी बाएं या 'एपीसी सकारात्मक' वृत्त का चतुर्थ भाग में स्थित है।
      नोट: यह 0.5% APC isotype के गैर-विशिष्ट धुंधला का प्रतिनिधित्व करता है.
    16. कार्यस्थान में प्रत्येक वृत्ताकार लेबल को अलग-अलग क्लिक करें और उनका उचित रूप से नाम बदलें. नियंत्रण या आदेश कार्यस्थान में प्रत्येक वृत्त का चतुर्थ भाग गेट लेबल क्लिक करें और उन्हें प्रतिलिपि बनाएँ।
      नोट: 'Q1' CD133+ कक्षों का प्रतिनिधित्व करता है; 'Q2' CD133 + और ALDH +' कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है; 'Q3' ALDH + कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है; और 'Q4' CD133- और ALDH- कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है.
    17. 'DEAB' फ़ाइल के नीचे नेस्टेड लाइव सेल जनसंख्या पर क्वाड्रेंट गेट चिपकाएँ. ऊर्ध्वाधर रेखा को इस प्रकार समायोजित करें कि सेल जनसंख्या का लगभग 0.15% क्षैतिज रेखा को स्थानांतरित न करने के लिए ध्यान रखने वाले 'ALDH+' वृत्त का चतुर्थ भाग के भीतर स्थित हो।
      नोट: यह 0.15% गैर-विशिष्ट ALDH संकेत का प्रतिनिधित्व करता है.
      1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि क्षैतिज रेखा की स्थिति में परिवर्तन नहीं हुआ है, DEAB फ़ाइल के नीचे नेस्टेड नए वृत्त का चतुर्थ भाग द्वार की प्रतिलिपि बनाएँ और उन्हें APC iso फ़ाइल के अंतर्गत लाइव सेल पर चिपकाएँ. मौजूदा वृत्त का चतुर्थ भाग गेट को बदलने के लिए कहा जब हाँ का चयन करें।
      2. 'CD133+' प्रतिशत अभी भी लगभग 0.5 'APC-iso' फ़ाइल के अंतर्गत है कि कार्यस्थान में सत्यापित करें।
    18. 'ALDH/CD133' फ़ाइल की 'लाइव सेल' जनसंख्या के लिए क्वाड्रेंट गेट की प्रतिलिपि बनाएँ और चिपकाएँ.
      नोट: शीर्ष दाएँ वृत्त का चतुर्थ भाग में मौजूद व्यवहार्य सेल जनसंख्या का प्रतिशत नमूने के भीतर ALDH + और CD133 + डबल सकारात्मक सीएससी का प्रतिशत होगा.

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Representative Results

सेल लाइनों या रोगी व्युत्पन्न सीएससी के साथ गठित स्फीरोइड फांसी बूंदों के भीतर छोटे सेल नंबरों की एक श्रृंखला के साथ गठन किया जा सकता है (चित्र 2क) . Spheroids के रूप में अच्छी तरह से प्रति 10 कोशिकाओं के रूप में कुछ के साथ मज़बूती से फार्म, जो दुर्लभ रोगी के नमूनों के संरक्षण के लिए अनुमति देता है. इन गोलभों के भीतर कोशिकाओं को 3 आयामों में अन्य कोशिकाओं से घिरे हुए हैं क्योंकि वे विवो में होंगे, जिससे शारीरिक कोशिका संपर्क और प्रसार दरों के लिए अनुमति दी जाती है। गोलाभ के भीतर ट्यूमर कोशिकाओं का प्रसार होता है जिसके कारण समय के साथ स्फिरॉइड का आकार बढ़ जाता है (चित्र 2ख) । के रूप में और अधिक आक्रामक रोगी कोशिकाओं या सेल लाइनों तेजी से अपने समकक्षों की तुलना में बढ़ने, यह प्रत्येक नमूने के प्रसार की क्षमता मात्रा निर्धारित करने और जांच कैसे दवा उपचार प्रत्येक नमूने के प्रसार को प्रभावित करता है के लिए महत्वपूर्ण है. ऐसा करने के लिए, एक चयापचय गतिविधि परख, जैसे एक resazurin आधारित फ्लोरोसेंट परख, आसानी से 384 अच्छी तरह से शारीरिक मंच के साथ किया जा सकता है, गोलाभभों की कटाई के लिए किसी भी आवश्यकता के बिना, जिसके परिणाम चित्रा 2Cमें देखा जा सकता है. एकाधिक गोलाभ भी काटा जा सकता है, तय, अनुभाग, और एक ही समय में hematoxylin और eosin या इम्यूनोफ्लोरेसेंट एंटीबॉडी के साथ दाग सेल morphologies और गोलाभ के भीतर संगठन की पहचान करने के लिए, साथ ही, सेल प्रकार और ECM के वितरण प्रोटीन (चित्र 2D, E)।

गोलाभ आकारिकी पर औषध उपचार के प्रभाव की जांच करने के लिए, प्रावस्था कंट्रास्ट इमेजिंग द्वारा स्फिरॉइडों की कल्पना आसानी से की जा सकती है (चित्र 3क) अधिक मात्रात्मक, ट्यूमर सेल या सीएससी प्रसार पर दवा उपचार के प्रभाव को भी उपचारित गोलिभॉइड की तुलना में अनुपचारित गोलोइड ों को नियंत्रित करने में रेज़ुरिन डाई फ्लोरोसेंट रीडिंग द्वारा मापा जा सकता है । दवा उपचार के बाद सेल मौत के सत्यापन के रूप में, नियंत्रण और दवा उपचार गोलाभ के भीतर व्यवहार्यता आसानी से calcein-AM और एथिडियम homodimer-1 के अलावा प्रत्येक स्थिति के लिए कई गोलाभ के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है (चित्र 3C) . ऊष्मायन समय के बाद, दाग गोलोइड एक पिपेट के साथ काटा जा सकता है और एक confocal माइक्रोस्कोप पर छवि.

अंत में, गोलाभ की कटाई करके और उन्हें एकल सेल निलंबन में dispersing द्वारा, सीएससी और अन्य सेल phenotype मार्करों की उपस्थिति प्रवाह साइटोमेट्री के साथ विश्लेषण किया जा सकता है (चित्र4). एक ही रोगी के भीतर विभिन्न दवा उपचार के बीच व्यवहार्य सीएससी की तुलना, साथ ही, रोगियों के बीच एक रोगी विशिष्ट तरीके से विभिन्न सीएससी लक्षित दवाओं की प्रभावशीलता को समझने में मदद कर सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: 3 डी उच्च थ्रूपुट 384 फांसी ड्रॉप कांबरॉइड प्लेट भंडारण और चढ़ाना लेआउट। (ए) हैंगिंग ड्रॉप प्लेट आंशिक रूप से पानी से भरी 6 अच्छी प्लेट के नीचे रखी जाती है। (बी) 6 अच्छी प्लेट का लिड बाँझ जलयोजन कक्ष बनाने के लिए लटकी हुई ड्रॉप प्लेट के शीर्ष पर रखा गया है। (सी) 6-वेल प्लेट स्टैक को नमी हानि और संदूषकों से सुरक्षा के लिए थर्माप्लास्टिक पट्टी के साथ सील किया जाएगा। (डी) लटकी हुई ड्रॉप प्लेट के लिए प्लेटिंग पैटर्न को बदलना। गुलाबी वर्गों कोशिकाओं और मध्यम मिश्रण से भरा कुओं से संकेत मिलता है। नीले क्षेत्रों जलयोजन के लिए पानी कक्षों से संकेत मिलता है. धूसर बक्से रिक्त कुओं को इंगित करते हैं जो जलयोजन कक्षों और गोलाभ बूंदों के बीच एक सीमा के रूप में कार्य करते हैं। (ई) लटकी हुई ड्रॉप प्लेट की लाइव छवि जो बारी-बारी से अच्छी तरह से पैटर्न के साथ चढ़ाया जाता है। (एफ) सभी अच्छी तरह से चढ़ाना पैटर्न लेआउट उच्च थ्रूपुट फांसी ड्रॉप स्फीरॉइड प्रयोगों के लिए उपयोग किया। गुलाबी वर्गों सेल चढ़ाया कुओं और नीले क्षेत्रों से संकेत मिलता है वृद्धि हुई जलयोजन के लिए पानी भरा कक्षों से संकेत मिलता है। धूसर वर्ग सीमा कुओं को इंगित करते हैं जो जलयोजन वर्गों और सेल संस्कृति क्षेत्रों के बीच सीमा के रूप में कार्य करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: रोगी व्युत्पन्न सीएससी गोलोइड आकारिकी और 3 डी फांसी बूंदों के भीतर प्रसार. (ए) तैयार 384-हैंगिंग ड्रॉप स्फीरॉइड प्लेट की लाइव छवि जैसा कि नीचे से देखा गया है। (ख) रोगी के प्रगतिशील प्रकाश सूक्ष्मदर्शी छवियों को फांसी की बूंद में 2, 3 और 5 दिनों के बाद सीएससी गोलभॉइड वृद्धि प्राप्त की जाती है। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. (सी) रेसोजुरिन फ्लोरोसेंट तीव्रता फांसी ड्रॉप संस्कृति के 7 दिनों के बाद महत्वपूर्ण वृद्धि से पता चलता है, प्रसार और फांसी ड्रॉप रोगी व्युत्पन्न सीएससी गोलोइड के विकास के लिए संबंधित (अयुग्मित दो पूंछ टी परीक्षण, पी एंड टी; 0.0001, n gt; 10). (घ) शाभिकाभ सरणी मोल्ड का चित्र जिसका प्रयोग ऊतक विज्ञान अनुभागीकरण के लिए गोलोइडों के संग्रहण के लिए एक कास्ट बनाने के लिए किया जाता है। (ई) प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर स्टेम कोशिकाओं, मेसेनकाइमल स्टेम सेल, एंडोथेलियल कोशिकाओं, और गोलोइड सरणी में एकत्र दाता परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के साथ सुसंस्कृत एक गोलभड़ की एच एंड ई छवि। डरा बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: रोगी व्युत्पन्न सीएससी गोलोइड फांसी बूँदें की दवा उपचार विश्लेषण. (क) रोगी ने 50 कोशिकाओं/ड्रॉप पर सीड सीएससी स्फीरॉइड्स प्राप्त किए जिनका उपचार 5 दिनों के विकास के बाद paclitaxel की बढ़ती सांद्रता के साथ किया जाता है। प्रतिनिधि छवियों दवा उपचार के बाद 48 एच लिया. (ख) पेसलिटेक्सेल उपचार की सांद्रता में वृद्धि पर रेसोजुरिन फ्लोरोसेंट के माध्यम से कोशिकीय व्यवहार्यता का परिमाणीकरण। सभी नमूनों को नियंत्रण की तुलना में व्यवहार्यता में एक महत्वपूर्ण कमी है. (एक तरह से ANOVA, p और lt;0.0001, n gt; 8). (ग) फांसी ड्रॉप स्फीरॉइड के भीतर जीवित (कैल्सीन-एएम) और मृत (इथिडियम होमोडाइमर-1) कोशिकाओं का कनफोकल इमेजिंग। हरा रंग लाइव कोशिकाओं को इंगित करता है और लाल रंग मृत कोशिका जनसंख्या को इंगित करता है। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: रोगी व्युत्पन्न सीएससी अफलात में सीएससी का परिमाणीकरण 384-हैंगिंग ड्रॉप प्लेटफॉर्म पर उत्पन्न और अनुरक्षित किया जाता है। (क) प्रवाह साइटोमेट्री डेटा का विश्लेषण करने में, कोशिका जनसंख्या को पहले बहुभुज द्वार का उपयोग करके किसी भी घटना को समाप्त करने के लिए चुना जाता है जो मलबे के कारण होती है। (ख) एकल कोशिकाओं को तब संभावित दोहरे संकेतों को समाप्त करने के लिए चुना जाता है जो परिणामों को अस्पष्ट कर सकते हैं। (C) सभी एकल लाइव कक्षों का चयन DAPI बहिष्करण के आधार पर किया जाता है. (घ) एक वृत्त का चतुर्थ भाग फाटक के ऊर्ध्वाधर अक्ष DEAB नियंत्रण में समायोजित किया जाता है के बारे में 0.15% गैर विशिष्ट ALDH धुंधला के लिए अनुमति देते हैं. (ई) वृत्त का चतुर्थ भाग गेट की क्षैतिज अक्ष APC ISO नियंत्रण में समायोजित किया जाता है के बारे में 0.5% गैर विशिष्ट एपीसी धुंधला के लिए अनुमति देते हैं. (च) वृत्तपाद द्वार का उपयोग CD133+, ALDH+, और CD13+/ALDH+ कक्षों के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो प्रायोगिक CD133 प्लस ALDH स्थिति में लाइव सेल जनसंख्या में मौजूद हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

3 डी spheroid गठन के लिए 384 अच्छी तरह से फांसी ड्रॉप प्लेट मंच किसी भी सेल जीव विज्ञान या कैंसर जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए एक आसानी से लागू उपकरण है. यह शारीरिक मंच सेल लाइनों के अध्ययन में सक्षम बनाता है, साथ ही, शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी संस्कृतियों के भीतर प्राथमिक रोगी नमूने, जबकि उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है। मंच यह भी सुनिश्चित करता है कि संस्कृति की स्थिति अत्यधिक टूनाबल हैं, जिससे चढ़ाना घनत्व, सेल सह-संस्कृति अनुपात, extracellular घटकों, और मध्यम संरचना पर तंग नियंत्रण को सक्षम किया जा सकता है। इसके अलावा, इस शारीरिक मंच प्रयोगों अत्यधिक downstream विश्लेषण इस तरह के क्यूआरटी-पीसीआर, FACS, और विभिन्न इमेजिंग तरीकों के रूप में बड़े या छोटे सेल मायने रखता है की आवश्यकता होती है तकनीक ों के लिए अनुकूल होने की अनुमति देता है। जबकि उपयोग में आसानी अनुभव के साथ आता है, नए प्रशिक्षुओं जल्दी से सफल हो जाते हैं, एक बार गति और पाइपिंग में आसानी महारत हासिल कर रहे हैं। इस प्रकार, इस शारीरिक मंच अत्यधिक व्यक्तिगत 3 डी दवा स्क्रीनिंग, सीएससी जीव विज्ञान और chemoresistance जांच के लिए लागू है.

चिंता के कुछ अंक जब नए इस मंच को लागू करने प्लेट हस्तांतरण और दवा उपचार शामिल हैं. नियमित भोजन, इमेजिंग, और विश्लेषण के लिए आवश्यक के रूप में एक स्थान से दूसरे करने के लिए प्लेटों को स्थानांतरित करते हैं, अनावश्यक उत्साह से बचने के लिए सावधान सावधानियों लिया जाना चाहिए। बाहरी किनारों से प्लेटों को पकड़ लें ताकि वे यथासंभव स्तर पर रहें और प्लेट को नीचे रखते समय विवाद से बचने के लिए सावधानी बरतें। यह छोटी बूंद हानि या पड़ोसी बूंदों के विलय से बचने में मदद करता है. इसी तरह, किसी भी एक फांसी ड्रॉप स्फीरॉइड के गलत खुराक से बचने के लिए फांसी ड्रॉप स्फीरॉइड के इलाज के लिए दवा के कार्य पर सतर्क ध्यान दिया जाना चाहिए। किसी भी तकनीक के साथ के रूप में, विश्वास और इन कार्यों के साथ सटीकता अभ्यास के साथ पहुंचें.

कुछ सीमाओं इस 3 डी शारीरिक मंच के लिए सहज हैं. सबसे पहले, छोटी अस्थिरता दीर्घकालिक संस्कृति समय अंक पर मुद्दा का हो सकता है, अगर देखभाल के लिए सही कुल छोटी बूंद मात्रा बनाए रखने के लिए नहीं लिया जाता है. इसके अलावा, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, प्लेटों के परिवहन और भंडारण को ध्यान से किया जाना चाहिए ताकि बूंदों के नुकसान या विलय से बचा जा सके। इसके अतिरिक्त, इस 3 डी वातावरण के लिए आकार 20 डिग्री सेल्सियस की सहज स्थिर छोटी बूंद आकार से तय होता है, हालांकि कई प्रतिकृति बढ़ाया सेल मायने रखता है के लिए उत्पादन किया जा सकता है.

इस 3 डी शारीरिक मंच में संशोधन थ्रूपुट बढ़ाने के लिए और शारीरिक विशेषताओं को बदलने के लिए उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, बूंद लेआउट को थ्रूपुट बढ़ाने के लिए 384 अच्छी प्लेट के भीतर हर अच्छी तरह से शामिल करने के लिए बदला जा सकता है। इसके अतिरिक्त, 3 डी फांसी ड्रॉप मंच अत्यधिक प्रत्येक अच्छी तरह से कई सेल प्रकार के सरल शामिल किए जाने से सह संस्कृति जांच के लिए अनुकूल है. उत्पन्न करने और गोलभॉइड सफलतापूर्वक बनाए रखने के लिए, सेल संस्कृति मध्यम और प्रारंभिक सेल सीडिंग घनत्व आसानी से संग्राहक किया जा सकता है, कसकर गोलोइड आकार को विनियमित करने के लिए। इन अत्यधिक टूनाबल चर के साथ अनगिनत जांच 3 डी शारीरिक रोगी व्युत्पन्न गोलभॉइड के दायरे के भीतर संभव हैं।

जबकि वर्णित सबसे विश्लेषण विधियों व्यापक रूप से वैज्ञानिक अनुसंधान में उपयोग किया जाता है, वहाँ कुछ इन विधियों में से कुछ के साथ उत्पन्न अखंड ड्रॉप का विश्लेषण करने के लिए विशिष्ट सीमाएं हैं. उदाहरण के लिए, जब गोलाभ बूंद प्लेटों को लटकाने में लंबे समय तक सुसंस्कृत होते हैं, तो बूंद का आकार चरण कंट्रास्ट इमेजिंग के दौरान बूंदों को हिलाने के कारण काफी बढ़ सकता है, संभावित रूप से छवि गुणवत्ता से समझौता कर सकता है। ताजा माध्यम जोड़ने से पहले प्रत्येक अच्छी तरह से बाहर मध्यम के एक बराबर राशि लेने के द्वारा यह सुधार किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, प्रवाह साइटोमेट्री और व्यक्तिगत व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती जैसी तकनीक अलग गोलोइड को तोड़ने के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीक से प्रभावित हो सकती है, जो कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकती है। इस प्रकार, प्रत्येक प्रयोगशाला के लिए यह महत्वपूर्ण है कि वे एकल कोशिका घनत्व को अधिकतम करते हुए सेल क्षति को कम करने के लिए अपनी कोशिकाओं और प्रयोग के आधार पर गोलाभ वियोग तकनीकों का अनुकूलन करें। अंत में, गोलाभ का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण उनके छोटे आकार से जटिल हो सकता है और सफल वर्गों को प्राप्त करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है।

कुल मिलाकर, 3 डी फांसी ड्रॉप अफ़ीरॉइड मंच व्यापक रूप से कैंसर और गैर कैंसर अनुसंधान के भीतर अनुकूलनीय है. प्रणाली जानने के लिए आसान है और एक उच्च थ्रूपुट प्रारूप में सेल संस्कृति के लिए एक 3 डी शारीरिक रूप से प्रासंगिक वातावरण प्रदान करता है. इस 3 डी शारीरिक मंच की दीक्षा समय कम से कम है, कुछ के साथ, यदि कोई हो, तकनीकी विश्लेषण बाधाओं को दूर करने के लिए. इस प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा पहले से कहीं अधिक शारीरिक वातावरण में, सटीक चिकित्सा के लिए प्रभावी chemotherapeutics के रोगी विशिष्ट स्क्रीनिंग के लिए एक साधन प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम मुख्य रूप से DOD OCRP अर्ली कैरियर अन्वेषक पुरस्कार W81XWH-13-1-0134 (जीएम), DOD पायलट पुरस्कार W81XWH-16-1-0426 (जीएम), DOD अन्वेषक शुरू पुरस्कार W81XWH-17-OCRP-IIRA (जीएम), डिम्बग्रंथि कैंसर और मिशिगन डिम्बग्रंथि के लिए Rivkin केंद्र द्वारा समर्थित है संधि. इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान पुरस्कार संख्या P30CA046592 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था. सीएमएन को ग्रांट नंबर के तहत नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप का समर्थन 1256260 MEB राष्ट्रीय आवश्यकता (GAANN) फैलोशिप के क्षेत्रों में शिक्षा स्नातक सहायता विभाग द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco ILT25200056
10 mL serological pipet Fisher Scientific 13-678-11E
10,000 cSt Si oil Millipore Sigma 63148-62-9 Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.
100 mm tissue culture dish Thermo Scientific 130182
15 mL conical tube Celltreat FL4021
1x DMEM for Serum Free Medium Gibco 11965-092
1x F12 for Serum Free Medium Gibco 11765-054
1x phosphate buffered saline (PBS) Gibco ILT10010023
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher D1306
40 µm filter Fisher Scientific 22363547
6-well plate Fisher Scientific 353046
Accutase Innovative Cell Technologies Inc. 1449 A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.
ACK Lysing Buffer Thermo Scientific A1049201
alamarBlue Invitrogen DAL1025 Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.
ALDEFLUOR assay kit Stem Cell Tech 1700 Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) Stem Cell Tech 1705 Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.
Andor iXon x3 CCD Camera Oxford Instruments -
Antibiotics and Antimycotics Gibco 15240-062
APC-isotype IgG2b Miltenyi biotec 130-092-217 Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.
B27 Supplement Gibco 17504044
basic Fibroblast Growth Factor Stem Cell Technologies 78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes Fisher Scientific 14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate Reader BioTek 7091000
CD133-APC Miltenyi biotec 130-113-184 Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.
cellSens Dimension Software Olympus
Cisplatin Sigma-Aldrich P4394 Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
Epidermal Growth Factor Gibco PHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging System Life Technologies AME3300
Fetal Bovine Serum - premium (FBS) Atlanta Biologicals S11150
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F4375
Hemacytometer Hausser Scientific 1490
Histogel Thermo Scientific HG-4000-012 Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Lonza PT-5006
Human Microvascular Endothelial Cells Lonza CC2543
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement Gibco 51500-056
Live/Dead viability kit Invitrogen L3224 Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).
MEM Non-essential Amino Acids Gibco 11140-050
MetaMorph 7.8 Software Molecular Devices -
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope Olympus -
Olympus IX83 Research Inverted Microscope Olympus
Parafilm M Thomas Scientific 7315D35 Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates 3D Biomatrix HDP1384-8 Available through Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488 Invitrogen A12379 Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.
ProJet 3500 HD Max 3D Systems - 3D printer
Sterile DI water Fisher Scientific 353046
Trypan Blue Gibco 15250061 Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.
VisiJet M3 Crystal 3D Systems - A biocompatible polymer material for 3D printing.
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit Yokogawa -

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References

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Bregenzer, M. E., Davis, C., Horst, E. N., Mehta, P., Novak, C. M., Raghavan, S., Snyder, C. S., Mehta, G. Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells. J. Vis. Exp. (149), e59696, doi:10.3791/59696 (2019).

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