Fysiologisk patient härledda 3D spheroids för anti-neoplastisk drog screening för att rikta cancer stamceller

Summary

Detta protokoll beskriver generering av patientbaserade spheroider och analys i senare led, inklusive kvantifiering av proliferation, cytotoxicitetstester, flödescytometri, färgning av immunofluorescensteknik och konfokal avbildning, för att bedöma potentiella kandidater som anti-neoplastiska Therapeutics. Detta protokoll stöder precisionsmedicin med identifiering av specifika läkemedel för varje patient och stadium av sjukdom.

Abstract

I detta protokoll, vi beskriver förfarandet för generering av tumör spheroids inom 384-väl hängande droppar för att möjliggöra hög genomströmning screening av anti-cancer Therapeutics i en fysiologiskt representativ mikromiljö. Vi beskriver bildandet av patient härledda stamceller spheroids, liksom, manipulering av dessa spheroids för grundlig analys efter läkemedelsbehandling. Specifikt, vi beskriver insamling av sfäroid morfologi, proliferation, lönsamhet, läkemedelstoxicitet, cell fenotyp och cell lokaliseringsuppgifter. Detta protokoll fokuserar tungt på analystekniker som enkelt implementeras med hjälp av 384-well hängande Drop plattform, vilket gör den idealisk för hög genomströmning Drug screening. Medan vi betonar vikten av denna modell i äggstockscancer studier och cancer stamcellsforskning, 384-well plattform är mottaglig för forskning av andra cancertyper och modeller sjukdom, utvidga nyttan av plattformen till många områden. Genom att förbättra hastigheten på personlig drog screening och kvaliteten på screening resultat genom lätt genomfört fysiologiskt representativa 3D-kulturer, denna plattform förutspås till stöd i utvecklingen av nya Therapeutics och patientspecifika behandlingsstrategier och har därmed långtgående klinisk effekt.

Introduction

Världsomspännande cancerrelaterad dödlighet nådde en avgift på 9 800 000 dödsfall i 2018¹, belyser behovet av utveckling av förbättrad Therapeutics. Tyvärr, kostnaden för att utveckla cancerläkemedel ökar, med utvecklingen av ett enda läkemedel kostar cirka 650 000 000 USD² visar behovet av förbättrade strategier för att utveckla nya läkemedel mot cancer. Cancer stamceller (CSCs), som kännetecknas av ökad kemoresistens³, förmågan att själv förnya, och förmågan att utsäde nya tumörer⁴ tros vara ansvarig för tumör upprepning⁴, metastaser⁵, och chemoresistance^4,6, som alla bidrar till den maligna kapaciteten hos tumören och därmed den höga dödssiffran. I äggstockscancer, dessa celler finns berikas i den maligna ascites vätskan i bukhålan, ett tillstånd som förknippas med dåliga kliniska utfall¹. Som ett resultat av CSCs: s maligna förmåga har det funnits en knuff för att utveckla nya CSC-inriktade läkemedel som ska användas tillsammans med traditionella kemoterapier. Det finns flera utmaningar som åtföljer utvecklingen av CSC inriktade på läkemedel, inklusive: 1) svårigheter att utvidga och underhålla CSCs in vitro; 2) brist på patientprover; 3) kultur plattformens fysiologiska relevans. och 4) heterogenitet i läkemedels känslighet mellan patienter. Detta protokoll beskriver implementeringen av en hög genomströmning 3D-kulturplattform som kan övervinna var och en av dessa utmaningar. I synnerhet, detta system möjliggör snabb drog screening med ett litet antal patient-härledda ovariella CSCs, och är mycket mottagliga för nedströms analystekniker. Även idealisk för att studera äggstockscancer och CSCs, vår plattform är också värdefullt att studera andra cancerformer och differentierade celltyper i komplexa 3D-miljöer.

Komplexa 3-dimensionell (3D) modeller är avgörande för att studera tumören mikromiljö (TME), som är en 3D-nisch som består av cancerceller, icke-cancerstödjande celler, och extracellulära matrix (ECM) proteiner⁴. Denna 3D-miljö resulterar i unika cellmorfologi, cell-cell-och cell-matris interaktioner, celldifferentiering, cell migration, celltäthet, och diffusion gradienter jämfört med traditionell 2D-cellkultur in vitro-⁴. Alla dessa faktorer kulminerar i differential drog svar inom 3D-kulturer, uppvisar ökad resistens och fysiologisk relevans^7,8. På grund av den roll som 3D TME i CSC differentiering och chemoresistance, är det viktigt att skärmen för CSC inriktning läkemedel i fysiologisk mikromiljöer. Förbättra den fysiologiska relevansen av CSC Drug screening plattformar har potential att förbättra patientspecifik läkemedels screening, läkemedelsutveckling, formulering av behandlingsstrategier, och i slutändan kliniska resultat. Det är lika viktigt att den plattform som används för läkemedels screening vara hög genomströmning och kompatibel med nedströms analysmetoder för att minimera kostnader, tid och klinisk översättning tid av lovande läkemedel⁹.

För närvarande är den komplexa TME bäst upprätthålls för Drug screening applikationer genom in vivo modeller såsom murin uterustransplantat tumörmodeller, cell linje härledda xenografts, och patient-derived xenograft (pdx) modeller¹², eftersom de ger fysiologisk Villkor. Men den låga genomströmning karaktär av dessa modeller, liksom, kostnad, tid och tekniska färdigheter som de kräver begränsar deras nytta i snabb, hög genomströmning Drug screeningprogram¹³. Som alternativ till dessa in vivo modeller, många in vitro-3D-modeller som använder hydrogeler⁸, kultur inom mikroflödessystem enheter eller "organ-on-a-chip" enheter^10,14, och icke-anhängare kulturer^3,8 har också utvecklats, på grund av deras låga inträdeshinder i termer av kostnad, tid, och krävs skillset.

Hydrogel kulturplattformar är fördelaktiga för den fina kontroll som ges över matrisens sammansättning, mekaniska egenskaper och matrisens struktur¹⁵; men de kan hämma hög densitet cellkultur¹⁴. Dessutom kan skörd celler från hydrogeler försvåra nedströms analys, på grund av potentiellt skadliga effekter av skördemetoder¹⁵. Microfluidic enheter, å andra sidan, är mikroanalys enheter som möjliggör utdata detektering inom samma enhet och för cellodling i fysiologiskt relevanta skalor med minimal konsumtion av reagens, minskad reaktionstid, minimerat avfall, och snabb diffusion¹⁴. Dessa egenskaper gör dem lovande plattformar för undersökning av läkemedelstoxicitet, effekt och farmakokinetik. Men utmaningarna med effektiv, kvantifierbar, reproducerbar och användarvänlig 3D-cellkultur, liksom, skrymmande och kostsamma pumpsystem har begränsat mikrofluidic applikationer i hög kapacitet forskning¹⁰. Effektiva detekterings inställningar och potentiellt svåra genomförande över fält har också hindrat utbredd användning av mikroflödessystem system¹⁰.

I motsats, spheroids genereras i icke-adherent villkor i roterande blandare (nutators), ultra-låg tillbehör tallrikar, och hängande droppar inte innehåller användardefinierade Matrix komponenter. Dessa metoder är särskilt relevanta för att studera äggstockscancer eftersom de icke-adherenta villkor är representativa för de förhållanden där spheroids växa inom bukhålan⁵. Inom dessa icke-anhängare kultur metoder, nutator och hängande Drop spheroids har visat sig uppvisa högre kompaktionsförmåga, remodeling, och kemoresistens jämfört med spheroids genereras i ultra-låg fästplattor, vilket tyder på ökad fysiologiska relevans^16,17,18,19. På grund av ökad kapacitet för hög genomflöde screening från mindre bra storlekar och minimala krävs cell nummer, sfäroid generation i hängande Drop tallrikar är en idealisk plattform för Drug screening. Här presenterar vi en avstämbara 3D fysiologisk plattform i 384-väl hängande Drop tallrikar, som är lätt att implementera och mycket mottagliga för nedströms analys, vilket gör den idealisk för hög genomströmning Drug screening av äggstockscancer och ovariella CSCs.

Vår 3D-fysiologisk plattform ger alla fördelar med 3D-kulturen, inklusive fysiologiska cell cells kontakter, diffusions gradienter, cell tätheter och naturligt producerade ECM-proteiner, som kan bidra till realistiska läkemedelssvar^{16, 17,18,19}. Dessutom, genom att generera dessa spheroids med patient-derived CSCs, vi har möjlighet att bestämma patientens specifika svar på läkemedel¹ med många tekniska replikat samtidigt, att övervinna heterogenitet som kan hittas inom patientens tumör prover²⁰. Dessutom har 3D-kultur visat sig förbättra underhållet av CSC populationer^3,16 och därmed är representativ för berikade CSC populationer i ascites⁷. Detta kombinerat med lätt nedströms analys, inklusive flödescytometri analys av lönsamhet och CSC proportioner möjliggör optimal utvärdering av CSC inriktning läkemedels effektivitet. Slutligen är denna fysiologisk plattform kompatibel med avbildning vid flera tidpunkter under experimentet, utvärdering av celldöd och proliferation, cell organisation och morfologi med immunohistokemi, löslig signalering med ELISA på konditionerade cell fenotyper med flödescytometri och genuttryck efter PCR.

Protocol

Alla patientprover samlas in enligt en godkänd IRB protokoll från samtyckande patienter, vars prover är de-identifierade efter tumör debulk och ascites samling.

1. generering av spheroids från små cell nummer i 384-väl hängande Drop tallrikar

1. Placera den hängande dropp plattan i en sonikator fylld med sterilt avjoniserat (DI) vatten och Sonikera i 20 minuter.
2. Med en handgjord hand, ta bort plattan från sonikatorn och tvätta den med rinnande DI-vatten.
3. Låt plattan att sitta i ett bad med 0,1% Pluronic syra för 24 h för att förhindra proteinadsorption och sfäroid följsamhet till brunnarna.
4. Ta bort plattorna med en handgjord hand och skölj båda sidorna av plattan med rinnande DI-vatten grundligt.
5. Tryck kraftigt på eller skaka plattan inuti ett biosäkerhetsskåp för att avlägsna vatten från brunnarna i en steril miljö.
6. Placera plattan i UV-belysning i 30 – 60 min på vardera sidan för att sterilisera plattorna och minimera kontaminering.
   Anmärkning: Plattan kan också utsättas för etylenoxid gas i en kammare för sterilisering.
7. Fyll varje brunn på en 6-brunn tallrik med 4-5 mL sterilt autoklaverat DI vatten och smörgås den hängande Drop plattan mellan locket och botten av 6-brunnen plattan. Tillsätt 800 – 1000 μL sterilt vatten runt den hängande dropp plattans fälg för att ge en fuktig, stabil och steril miljö för att minimera volymen som förlorats till avdunstning (figur 1 a-C).
8. För 2D-odlade celler, aspirera medium som täcker celler i deras log fas av tillväxt och tvätta med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna spår av foster bovint serum (FBS) i odlingsmediet, eftersom det hämmar verkan av trypsin.
9. Aspirera PBS och tillsätt 1,5-2 mL 0,25% trypsin-EDTA till 100 mm vävnad kultur skålen. Inkubera celler i 5 minuter i en inkubator inställd på 37 ° c.
   Anmärkning: Celler kan lossna i olika takt, så plattorna bör kontrolleras på ett bänk ljusmikroskop för att säkerställa cell avlossning efter 5 min. Justera avlossning protokoll per leverantör instruktioner när du använder en cellinjer.
10. Tillsätt 6 – 8 mL cellulärt medium som innehåller FBS eller något serum till skålen för att neutralisera trypsin, samla in celler med en 10 mL serologiska pipet, och deponera dem i ett 15 mL koniskt rör.
11. Räkna celler genom att ladda 10 μL av cellsuspensionen på vardera sidan av en hemocytometern och följ det tillhörande inventerings protokollet.
12. För patient-härledda celler som samlats in från primära eller metastaserande solida tumörer eller från ascites som inte har 2D-odlade, förbereda Single cellsuspensioner i serumfritt medium (SFM) beskrivs tidigare³.
13. Process tumör vävnader som tidigare beskrivits och lagra enstaka cellsuspensioner för senare användning i lämplig frysning medium^21,22.
    1. För solid tumör vävnad, finhacka mekaniskt med ett rakblad och filtrera resulterande lösningen genom ett 40 μm filter innan isolera önskade celler från en densitet lutning^21,22.
    2. För ascites prover, koncentrera celler genom centrifugering, lyse röda blodkroppar i ammonium-klorid-kalium (ACK) buffert, tvätta i 1x PBS, och sedan passera genom ett 40 μm filter och en 28 G nål 4 gånger²².
14. För isolering av ovariella CSCs, sortera celler med flödescytometri som beskrivs nedan i detalj.
15. Nyligen isolerade enstaka celler fryses för lagring och tinas när det behövs för experiment.
16. För att förbereda cellsuspensionen för plätering, Beräkna önskad volym av cell lösning som krävs för plätering: 20 μL per droppe X totalt antal droppar = total lösning volym behövs.
17. Späd cellkoncentrationen till önskad cell koncentration per 20 μL (dvs. 100 celler i en droppe på 20 μL).
18. Blanda cellsuspensionen försiktigt med en Pipettera före plätering för att säkerställa en homogen fördelning av celler och förbättra enhetlighet mellan droppar.
    Anmärkning: Överblandning av cellsuspensionen kan leda till celldöd och skräp i hängande droppe spheroids.
19. Placera spetsen på pipetten i brunnen i en vinkel på ca 45 ° och Pipettera 20 μL av cell lösningen i varje hängande droppe väl.
    Anmärkning: Bordläggningen mönster kan justeras beroende på antalet spheroids behövs. Plätering spheroids i alla andra väl är säkrare när stora mängder spheroids inte behövs i ett experiment, eftersom det förhindrar oavsiktlig sammanslagning av droppar (figur 1D, E). Om stora mängder spheroids behövs för ett experiment, plattan varje brunn lämnar en rad av gränsbrunnar på alla sidor (figur 1f).
20. Placera locket på 6-brunnen plattan tillbaka på toppen av hängande Drop plattan och använda en stretchig termoplast remsa som är okänslig för fuktförlust, att täta kanterna och förhindra ytterligare avdunstning av droppar. Inkubera i en standardbefuktad inkubator för CO₂ (5% Co₂, 37 ° c).
21. Feed hängande droppar en gång varje 2 – 3 dagar för att fylla på cell odlingssubstrat för nödvändiga näringsämnen genom att tillsätta 2 – 3 μL till varje sfäroid innehåller väl.
    Anmärkning: Efter avbildning, är det alltid klokt att mata hängande droppar, som luft exponering under Imaging leder till avdunstning.

2. lägga cell kultur medium till hängande Drop spheroid tallrikar

1. Ta bort termoplastband och lock i ett biosäkerhetsskåp och tillsätt 2 – 3 μL av det lämpliga odlingsmediet till varje brunn som innehåller en hängande droppe.
   Anmärkning: Volymen som läggs till beror på droppstorlek och hur länge mellan utfodringen.
2. Efter utfodring, täck plattan med det övre locket och tillämpa färsk termoplastisk remsa till ytterkanterna innan du sätter plattan tillbaka i inkubatorn.

3. faskontrast avbildning av sfäroid morfologi

1. Ta bort termoplastisk remsa från runt kanterna på plattan i ett biosäkerhetsskåp.
2. Ta försiktigt bort 384-brunnen hängande droppe spheroids plattan från biosäkerhets skåpet med locket fortfarande på plats och placera den i Mikroskop facket på ett epifluorescerande Mikroskop.
3. Använd alternativet Live Imaging i bildhanteringsprogrammet på 4x, 10X eller 20x för att observera hängande spheroids och ta önskade bilder.
4. Efter att ha sparat bilderna, ta plattan tillbaka till biosäkerhets skåpet och foder celler som beskrivs ovan.
5. Återförslutsplattan med en fräsch termoplastremsa och placera den förseglade plattan i inkubatorn igen.

4. kvantifiering av proliferation och lönsamhet inom spheroids

1. Plattspheroider i tillräckligt antal brunnar för att erhålla > 10 tekniska replikat för varje tidspunkt (dvs dag 1 och dag 7) som ska undersökas.
   Anmärkning: Brunnar som används för denna analys används i allmänhet inte igen på grund av potentiella föroreningar från resazurin Dye.
2. Tillsätt 2 μL filtrerad resazurin-baserad lösning till de brunnar som utsetts för spridnings analys som om de utfodrades med dessa brunnar och Inkubera under en förutbestämd inkubationstid.
   Anmärkning: Denna inkubationstid kan variera beroende på celltyp och antalet celler i sfäroid. Det rekommenderas att bestämma den inkubationstid som krävs innan spridnings experiment påbörjas genom att man påbörjar mätningar efter 1 timmes inkubering och sedan åter mäter var 30: de minut tills signal Utläsningarna i kontroll Wells platå. Analys avläsningar kan tas så många gånger som önskas. Inkubering är typiskt 4 h för spheroids initieras med 100 cancerceller.
3. Slå på mikrotiterplattor Reader först följt av den tillhörande plattan läsare programvara minst 15 min före första behandlingen för att göra det möjligt för maskinen att värma upp och säkra den inre temperaturen vid 22 ° c som temperaturen kan påverka avläsningarna.
4. Öppna en 384-brunn plattan protokoll set med 530/25 nm excitation och 590/35 nm emission våglängder med optik inställd på botten, Gain inställd på 35, Läs hastighet inställd på Normal, och Läs typ inställd på fluorescens .
5. Efter inkubationstiden, öppna hängande droppe smörgås i ett biosäkerhetsskåp och föra 384-väl plattan med locket fortfarande på plats till plattan läsaren.
6. Placera 384-brunnen plattan med locket fortfarande på plats i plattan läsaren facket, som kommer att förlängas när maskinen värms upp och klicka på OK för att läsa plattan.
7. Returnera brunnen plattan till 6-brunn basen och placera den i inkubatorn. Om alla tidpunkter har lästs för dagen, återförse plattan innan du placerar den tillbaka i inkubatorn.
8. Spara experimentet i popup-fönstret och klicka sedan på Ja när du uppmanas vill du köra powerexports för plattan 1 för att mata ut data från plattan läsare programvara i ett kalkylblad för organisation.
9. Genomsnittliga fluorescensvärden för varje tillstånd och normalisera med genomsnittet av kontrollvillkoret att rapportera Fold förändring i spridningen i olika experimentella förhållanden.
10. När du jämför dag 1 till dag 7, normalisera genom att dividera med dag 1 genomsnittlig fluorescens för att få veck förändring i spridningen över tiden.
11. Beräkna felstaplar med standardfel av medelvärdet och bestäm statistisk signifikans mellan experimentella grupper med ett lämpligt statistiskt test, som elevens tvåsidiga T-test.

5. utvärdering av läkemedelstoxicitet i spheroids

1. Drug Administration
   1. När som helst efter sfäroid formation, leverera läkemedel späddes till önskad koncentration så att en 2 μl dos innehåller 10X den önskade slutliga läkemedelskoncentrationen.
      Anmärkning: Detta förutsätter en avdunstning av 2 μl från dropp så att slutvolymen efter läkemedelsbehandling är 20 μl. Till exempel kommer en dos på 50 μM av cisplatin att ha en beredd lösning på 500 μM. Om droppar innehåller mer än 20 μL bör koncentrationen av läkemedlet och/eller den tillförde volymen justeras i enlighet med detta.
   2. Behandla kontrollprover med 2 μL cell odlingssubstrat.
      Anmärkning: Cisplatin är solubilized i vatten. Därför är kontrollerna 2 μL cell odlingssubstrat. men om drogen fordonet är ett annat lösningsmedel (t. ex., DMSO), då kontroller bör vara cell odlingssubstrat med en lika koncentration av DMSO som används i läkemedelsbehandling.
   3. Fortsätt att övervaka den behandlade drogen och kontroll spheroids under hela drogen inkubationstiden med fas Mikroskop för att få ett visuellt rekord av effekten av läkemedelstoxicitet samt med resazurin Dye som beskrivs ovan för att övervaka cellulära lönsamhet.
      Anmärkning: Typiskt, läkemedlen tillsätts efter 5 – 7 dagar i hängande droppar och toxicitet mätt efter 48 –-72 HS men detta kan varieras beroende på experimentet. Läkemedel kan tillsättas så snart stabila sfäoiderna har bildats, vanligtvis mellan 1 – 4 dagar.
2. Kvantifiering av läkemedelstoxicitet genom cellräkning
   1. Vid sluttidpunkten punkt för läkemedelsbehandling, samla in 10 spheroids vardera från kontroll och läkemedelsbehandlade brunnar med hjälp av en 1 000 μL Pipettera och deponera varje uppsättning spheroids i sin egen microcentrifug röret.
   2. Bryt ner spheroiderna i enstaka celler genom upprepad pipettering.
      Anmärkning: För att minska potentiell cellskada på grund av upprepad pipettering kan enzymatisk matsmältning med ett enzym som trypsin utföras för att underlätta generering av Single cell-lösningar före pipettering²³. Minimering av celldöd på grund av pipettering kommer att bero på celltypen och bör optimeras i enlighet med detta. Om du är bekymrad över döden på grund av disaggregation, hänvisa till analys med resazurin Dye och cytotoxicitetstest för alternativa metoder som inte kräver sfäroid disaggregation.
   3. Centrifugera rören i 5 min vid 400 x g för att samla celler i botten av mikrocentrifug rör och Aspirera supernatanten.
   4. Tillsätt 20 μL färskt material eller 1x PBS till varje tub och blanda väl.
   5. Tillsätt Trypan Blue med ett förhållande på 2 μL Trypan Blue Stain till 20 μL cellsuspension.
   6. Ladda 10 μL av celler och Trypan blå suspension i varje kammare av hemocytometern och räkna celler under ett ljusmikroskop, med blå färgade celler som representerar döda celler och obefläckade celler som representerar levande celler.
      1. Den levande cellen% = (antal levande celler ÷ totalt antal celler) x 100.

6. sfäroid karakterisering med histologisk teknik

Anmärkning: Det finns två mögel alternativ 3D tryckt i en biokompatibel polymer att replikera sfäroid array formar från Ivanov et al.²⁴: 1) 20 väl mögel som kan rymma 28 μl per brunn och 2) 63 väl mögel som kan rymma 9 μl per brunn (figur 2D).

1. Sterilisera histologi mögel och dess gräns genom att torka ner dem med 70% etanol och bifoga gränsen stadigt runt mögel och lägga formen upprätt. Båda formar passar ca 3 ml vätska (3,203 ml för 20 sfäroid array och 3,196 ml för 63 sfäroid array).
2. Lätt päls sfäroid array med 10 000 cSt si olja med hjälp av en spetsig bomullspinne för att underlätta avlägsnande av preparatet bearbetning gel gjutna i efterföljande steg.
3. Värm upp preparat processen gel tills kondenserad via mikrovågsugn för 10-20 s med locket lossas.
4. Tillsätt mellan 2,6 och 2,8 mL smält bearbetning gel i formen tills ungefär nivå med toppen av gränsen.
5. I ett par minuter, en gång stelnat, ta bort bearbetningen gel rösterna genom att separera gränsen från mögel och sedan Invertera matrisen mögel.
6. Sätt pincett spetsen mellan mögel och gränsen för att noggrant separera dem och sedan använda en cell skrapa för att hjälpa till att få bort rösterna från formen om den inte lossnar direkt.
7. Skörda spheroids från den hängande dropp plattan genom att Pipettera innehållet i en enda brunn på en 100 eller 150 mm cell petriskål med en 1 000 μL pipet, och isolera sfäroid visuellt.
8. Pipet 5 μL av brunnen tillfredsställer inklusive den identifierade sfäoiden in i en av matrisbrunnarna, tills matrisen fylls.
9. Vänta 3 min för att säkerställa spheroids har slagit sig till botten av matrisen innan försiktigt Pipettera smält bearbetning gel i var och en av brunnarna är noga med att inte störa spheroids.
10. Lägg till ytterligare bearbetning gel till nivå utanför toppen av matrisen och en gång svalnat, placera stelnade sfäroid array i en märkt kassett för bearbetning.
11. Submerge märkt kassett i 4% formalin över natten för att fastställa spheroids vid 4 ° c och sedan förvara i 70% etanol vid 4 ° c tills klar för bearbetning.
12. Process med standard 1 h paraffin program och sedan bädda sfäroid arrayer så att de bearbetade arrayer står inför upprätt med botten av brunnarna närmast blocket ansiktet.
13. Se till att arrayer är inbäddade så platt som möjligt, med botten ansiktet spola med botten av blocket och placera block på is.
14. Ladda blocket på mikrotomen och justera blocket så att bladet är parallellt med den laddade blocket ansiktet.
15. Cut array (prov djup = 15 μm) tills botten av matrisen brunnar nås se till att de cirkulära brunnarna är synliga på skurna prover.
16. Växla till ett prov djup på 5 μm och fortsätt att skära och samla upp band. Kontrollera under mikroskopet med några skivor för att avgöra om sfäroid djup har uppnåtts. När spheroids uppnås samla varje efterföljande bild tills sfäoiderna inte längre syns.
17. Fläcken varje bild med standard H & E-protokollet.

7. levande död Cytotoxicitetstest

1. Till varje hängande droppe, tillsätt levande cell färgämne, calcein-am till den slutliga koncentrationen av 2 μm, och den döda cellen färg, etidiumbromid homodimer-1 till den slutliga koncentrationen av 4 μm, med tanke på att dropp volymen är 20 μl.
   Anmärkning: Försök att hålla volymerna läggs till ett minimum, och vanligtvis Tillsätt 2 μL av färgerna kombinerade.
2. Placera plattorna tillbaka i inkubator inklämt i en 6-brunn tallrik med lock och inkubera spheroids för 45 min vid 37 ° c.
   Anmärkning: Beroende på storleken på spheroids, denna inkubationstid varierar avsevärt. Till exempel, spheroids under 400 μm kräver normalt bara 30 – 45 min av inkubationstiden, medan större sfäoider närmare 800 μm har krävt upp till 90 min av inkubationstiden. Inkubationstiden måste optimeras för individens experiment.
3. För efterföljande avbildning, skörd spheroids med en 1 000 μL Pipettera i ett biosäkerhetsskåp och deponera varje sfäroid på förrengjorda glas Mikroskop diabilder.
4. Bild spheroids genom glaset, på ett inverterat konfokala Mikroskop.
   Anmärkning: Beroende på närheten av det konfokala mikroskopet till labbet där spheroids skördas, kan spheroids antingen avbildas i den ursprungliga dropp av medium placeras på bilden eller innesluten i 2% aguppstod om mer stabilitet krävs för sfäroid transport.
5. Med hjälp av det flerdimensionella förvärvs läget i Mikroskop programvaran, lokalisera sfäroid med hjälp av DIC belysning vid 10X förstoring och sedan skanna z-Plane för att identifiera de höjder som omfattar sfäroid.
6. Klicka på z-serien och ställa den övre och undre gränsen för z-Scan något högre än toppen av sfäroid och något lägre än botten av sfäroid.
7. Excitera spheroids vid 488 Nm för calcein-am (levande celler, grön) och 561 Nm för etidiumbromid homodimer-1 (döda celler, röd) med den steg storlek som rekommenderas av programvaran, maximal förstärkning och minimal exponering för varje färg.
8. Klicka på Skaffa för att få en sammansatt z-stack-bild av levande och döda celler inom sfäroid.
9. Kvantifiera Live/Dead proportioner med hjälp av bildbehandling programvara för att kvantifiera en procentandel av pixel intensitet från den kanal som motsvarar levande celler kontra andelen pixel intensitet från den kanal som motsvarar döda celler från komposit z-projicering av bilder.
   Anmärkning: På grund av begränsningarna i att kvantifiera en 3D-struktur med en 2D-projektion, en alternativ metod för att kvantifiera levande kontra död fluorescens, inom hängande Drop plattorna är att använda en tallrik läsare enligt protokollet som ingår i calcein-am och etidiumbromid homodimer-1 kit.

8. immunofluorescens

1. Värm en låg smältning 2% aguppstod lösning, så lösningen är trögflytande och precis ovanför Smältpunkt och placera på ett Mikroskop glida för att skapa en mjuk säng av aguppstod
2. Skörd spheroids genom att trycka 20 μL av PBS genom droppe på den mjuka sängen av 2% Agreste.
   Anmärkning: Detta bör ske snabbt så att aguppstod inte stelna innan spheroids är inbäddade.
3. När agrose svalnar och geler med den skördade sfäroid fångade i (under 5 min), tillsätt 4% neutral buffrad formalin att fixa sfäoiderna. Växelvis, tillsätt iskall metanol, och fixera Agros-inbäddade spheroids vid-20 ° c i 30 min.
4. Tvätta 3x för 5 min vardera med 1x PBS, kasta PBS efter varje tvätt.
5. Block för 1 h vid RT med 10% serum (dvs., Horse serum) och 0,15% tvål lösning (Triton X-100) i 1x PBS.
6. Tvätta 3x för 5 min vardera med 1x PBS, kasta PBS efter varje tvätt.
7. Fläcken spheroids med önskad fluorescerande antikropp vid rekommenderad eller förutbestämd antikropps utspädning (dvs., överföras märkt phalloidin vid en 1:100 utspädning), inkuberande för minst 90 min vid rumstemperatur, täckt av ljus.
   Anmärkning: Protokollen kommer att variera beroende på antikropp och mål och utspädning av antikroppar kan behöva optimeras beroende på experimentet.
8. Visualisera överföras färgade spheroids med inverterade konfokala Mikroskop med metoder som beskrivs i föregående avsnitt för Imaging spheroids.
9. Sammansatta z-stack bilder kommer att demonstrera 3D morfologi i spheroids.

9. insamling och analys av populationer av cancer stamceller med flödescytometri

1. Beredning spheroids för flödescytometri analys
   1. Samla spheroids från varje brunn i de hängande dropp plattorna med hjälp av en 1 000 μL Pipettera och deponera dem i ett 15 mL centrifugrör för uppdelning med upprepad pipettering.
   2. Räkna livskraftiga celler på en hemocytometern med Trypan blå för att bestämma cell nummer och koncentration som beskrivs ovan.
   3. Alikvot cellsuspension i fem mikrocentrifugrör så att varje innehåller minst 50 000 celler.
   4. Centrifugera alla rör vid 400 x g i 5 minuter i en microcentrifug.
   5. Aspirera supernatanten från varje tub och Omsuspendera pellets i 100 μL buffert.
   6. Etikett rör "ofärgade", "DAPI", "APC-ISO", "DEAB", och "ALDH/CD133", respektive.
   7. Tillsätt 0,5 μL APC-isotype-antikropp till APC-ISO-röret och 1 μL CD133 antikropp till ALDH/CD133-röret enligt rekommendation från serie utspädning och tillverkare.
   8. Tillsätt 5 μL DEAB-reagens och 0,5 μL ALDH till DEAB-röret och 1 μL ALDH till ALDH/CD133-röret.
   9. Vortex alla rör för ca 2 s och inkubera vid 37 ° c för 45 min.
   10. Vortex alla rör igen och centrifugera vid 400 x g i 5 min i en microcentrifug.
   11. Etikett FACS rör "ofärgade", "DAPI", "APC-ISO", "DEAB", och "ALDH/CD133" och fylla en isolerad skum behållare för att ställa åt sidan.
   12. Aspirera supernatanten och Omsuspendera "obefläckade" kontroll i 400 μL FACS buffert (1x PBS med 2% FBS) och alla andra rör i 400 μL FACS DAPI buffert (FACS buffert med 300 μM 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole).
   13. Placera rören i behållaren med is tills de analyseras på en flödescytometer.
       Anmärkning: För att sortera efter äggstockscancer stamceller, samla alla celler som flödescytometerns åtgärder som ALDH + och CD133 + med grindar som att inkludera 0,5% icke-specifik APC-signal och 0,15% icke-specifik ALDH + signal. Minst 10 000 celler måste analyseras för tillförlitliga resultat. Ytterligare detaljer finns i de senaste publikationerna^3,17.
2. Analys av ALDH +/CD133 + populationer i FlowJo
   1. Dubbelklicka på flowjo ikonen för att öppna programmet och dra. FCS filer som erhållits från flödescytometri programvara i arbetsytan.
   2. Dubbelklicka på den ofärgade filen och ange y-axeln till sidan scatter höjd (SSC-h) och x-axeln för att vidarebefordra scatter höjd (FSC-h).
   3. Klicka på T -knappen bredvid varje axel för att justera skalan och omvandlingen för att maximera separationen mellan olika cellpopulationer.
   4. Klicka på knappen polygon gating och rita en polygongrind runt cellpopulationen och märk populationens celler.
   5. Dubbelklicka på cellerna population i arbetsytan för att bara Visa cellerna i "celler" populationen och klicka sedan på FSC-axeln för att ändra Axis kanal till FSC-width och klicka sedan på SSC-axeln och ändra Axis kanal till FSC-H.
   6. Välj verktyget rektangelgrind och rita en rektangel runt den vänstra, mest täta populationen av celler som spänner över hela y-axeln för att utesluta potentiella dubbletter till höger om fönstret och märk den här porten med "enstaka celler".
   7. Högerklicka och kopiera cellerna och den kapslade enkel cells porten och klistra in dem under varje prov i arbetsytan.
   8. Dubbelklicka på Single cells Gate kapslad under DAPI-exemplet i arbetsytan för att visa enstaka cellpopulationen från det provröret och klicka på FSC-axeln och ändra Axis kanal till DAPI-området kanalen.
   9. Klicka på SSC-axeln och ändra Axis kanal till histogram.
      Obs: de levande cellerna kommer att vara mot vänster som de utesluter DAPI, medan döda celler kommer att ta i DAPI och visas mot höger om grafen.
   10. Klicka på T -knappen bredvid DAPI -axeln och klicka på Anpassa axel för att justera skalan för att maximera separationen mellan DAPI-positiva och DAPI-negativa toppar.
       Anmärkning: Ett fönster kommer att dyka upp med skalningsalternativ. Ofta gånger, ställa in skalan fältet till biex och justera de extra negativa årtionden och bredd grund kommer att ge den största separationen.
   11. Klicka på Verkställ i popup-fönstret för att tillämpa skalnings ändringar, Välj knappen Range Gate och fördela den över DAPI-negativ topp, som motsvarar den levande cellpopulationen.
   12. Märk denna grind "levande celler" och högerklicka för att kopiera "Live cells" Gate för att klistra in den under "Single cells" Gate under "APC-ISO," DEAB "och" ALDH/CD133 "rör för att välja samma del av levande celler i varje provröret.
   13. Dubbelklicka sedan på Live cells populationen kapslad under APC-ISO-exempelfilen och växla x-axeln till Aldh-området kanal och y-axeln till APC-området kanal.
   14. Justera axelskalan igen genom att klicka på T -knappen och Anpassa axeln för varje axel så att händelserna lokaliseras i det nedre vänstra området av handlingen och välj alternativet Quad Gate och klicka på Plot-fönstret för att upprätta en kvadrant grind .
   15. Justera korsningen av grinden så att cirka 0,5% av befolkningen ligger i det övre vänstra av tomten fönstret eller "APC positiva" kvadrant.
       Anmärkning: Detta 0,5% representerar den icke-specifika färgning av APC isotype.
   16. Högerklicka på varje kvadrant etikett individuellt i arbetsytan och byta namn på dem på rätt sätt. Kontroll eller kommando klicka på varje kvadrant grind etikett i arbetsytan och kopiera dem.
       Anmärkning: ' Q1 ' representerar CD133 + celler; ' Q2 ' representerar CD133 + och ALDH + ' celler; "Q3" representerar ALDH + celler; och ' Q4 ' representerar CD133-och ALDH-celler.
   17. Klistra in kvadrant portarna på levande celler population kapslad under "DEAB" fil. Justera den vertikala linjen så att cirka 0,15% av cellpopulationen ligger inom "ALDH +" kvadranten noga med att inte flytta den horisontella linjen.
       Anmärkning: Detta 0,15% representerar icke-specifik ALDH-signal.
       1. För att säkerställa att den horisontella linjen inte ändra position, kopiera den nya kvadrant grindar kapslade under DEAB filen och klistra in dem på de levande cellerna under APC ISO-filen. Välj Ja när du ombeds ersätta den befintliga kvadrant-porten.
       2. Kontrollera i arbetsytan att "CD133 +" procent är fortfarande cirka 0,5 under "APC-ISO"-filen.
   18. Kopiera och klistra in kvadrant portarna till "ALDH/CD133" filens "levande celler" population.
       Anmärkning: Procentandelen av den livskraftiga cellpopulationen som finns i övre högra kvadranten kommer att vara den procentuella andelen ALDH + och CD133 + dubbel positiva CSCs i provet.

Representative Results

Spheroids bildas med cellinjer eller patient-derived CSCs kan bildas med en rad små cell nummer inom hängande droppar (figur 2A). Spheroids bildar tillförlitligt med så få som 10 celler per brunn, vilket gör det möjligt för bevarande av sällsynta patientprover. Celler inom dessa spheroids är omgivna av andra celler i 3 dimensioner som de skulle vara in vivo, vilket möjliggör fysiologisk cell-Cellkontakter och diffusions hastigheter. Tumörceller inom spheroids föröka orsakar spheroids att expandera i storlek över tiden (figur 2b). Eftersom mer aggressiva patient celler eller cellinjer växer snabbare än sina motsvarigheter är det viktigt att kvantifiera spridnings kapaciteten för varje prov och undersöka hur läkemedelsbehandling påverkar spridningen av varje prov. För att göra detta, en metabolisk aktivitet analys, såsom en resazurin baserad fluorescens analys, kan lätt utföras med 384-och fysiologisk plattform, utan krav på skörd spheroids, vars resultat kan ses i figur 2C. Flera spheroids kan också skördas, fasta, sektioneras, och färgas med hematoxylin och eosin eller Immunofluorescerande antikroppar samtidigt för att identifiera cellmorfologier och organisation inom spheroids, samt, distribution av celltyper och ECM proteiner (figur 2D, E).

För att undersöka effekten av läkemedelsbehandling på sfäroid morfologi, spheroids kan enkelt visualiseras genom faskontrast avbildning (figur 3a). Mer kvantitativt, effekten av läkemedelsbehandling på tumör cell eller CSC proliferation kan också mätas genom resazurin Dye fluorescens avläsningar i kontroll obehandlade spheroids jämfört med i de läkemedelsbehandlade spheroids (figur 3b). Som en validering av celldöd efter läkemedelsbehandling, kan lönsamheten inom kontroll och läkemedelsbehandlade spheroids lätt bestämmas genom tillsats av calcein-am och etidiumbromid homodimer-1 till flera spheroids för varje tillstånd (figur 3c). Efter inkubationstiden kan färgade spheroider skördas med pipett och avbildas på ett konfokalmikroskop.

Slutligen, genom skörd spheroids och dispergering dem till enstaka cellsuspensioner, förekomst av CSCs och andra celler fenotyp markörer kan analyseras med flödescytometri (figur 4). Jämförelse av livskraftiga CSCs mellan olika läkemedelsbehandlingar inom samma patient, liksom, mellan patienter kan bidra till att urskilja effektiviteten av olika CSC riktade mot läkemedel på ett patientspecifikt sätt.

Bild 1:3D hög genomströmning 384 hängande Drop sfäroid plattan lagring och plätering layouter. (A) hängande dropp platta är placerad på botten av en 6 brunn plattan delvis fylld med vatten. (B) locket på 6 väl plattan är placerad ovanpå hängande droppe plattan för att skapa steril hydrering kammare. (C) 6-well plattstapel som ska förseglas med en termoplastisk remsa för skydd mot fuktförlust och föroreningar. Dalternerande pläteringsmönster för hängande dropp platta. Rosa rutor indikerar brunnar fyllda med celler och medelstora blandningar. Blå områden indikerar vatten kammare för återfuktning. Grå rutor indikerar tomma brunnar som fungerar som en gräns mellan vätske kammare och sfäroid droppar. (E) levande bild av hängande dropp platta klädd med omväxlande väl mönster. (F) alla väl plätering mönster layout utnyttjas för hög genomströmning hängande droppe sfäanoider experiment. Rosa rutor indikerar cellpläterade brunnar och blå områden indikerar vattenfyllda kammare för ökad återfuktning. Grå rutor indikerar gränsbrunnar som fungerar som gräns mellan vätske sektioner och cell odlings områden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: patient härrör CSC spheroids morfologi och proliferation inom 3D hängande droppar. (A) levande bild av beredd 384-hängande droppe sfäroid plattan som visas från botten. (B) progressiva ljusmikroskop bilder av patientens härledda CSC sfäroid tillväxt efter 2, 3 och 5 dagar i en hängande droppe. Skalstreck = 100 μm. (C) resazurin fluorescens intensitet visar signifikant ökning efter 7 dagar av hängande droppe kultur, korrelera till proliferation och tillväxt av hängande droppe patienten härrör CSC spheroids (unparade två tailed t-test, p < 0,0001, n > 10). (D) bild av sfäroid array mögel används för att skapa en gjuten för insamling av spheroids för histologi snittning. (E) H & E bild av en sfäroid odlade med primär äggstockscancer stamceller, mesenkymala stamceller, endotelceller, och givare perifera mononukleära blodceller som samlats in i sfäroid array. Skrämsel bommar för = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: läkemedelsbehandling analys av patientens härledda CSC spheroids hängande droppar. A) patientsomhärrör CSC-spheroider seedade vid 50 celler/Drop behandlade med ökande koncentrationer av paklitaxel efter 5 dagars tillväxt. Representativa bilder tagna 48 h efter läkemedelsbehandling. Bkvantifiering av cellernas lönsamhet via resazurin fluorescens vid ökande koncentrationer av paklitaxel-behandling. Alla prover har en signifikant minskning av lönsamheten jämfört med kontroll. (Enkelriktad ANOVA, p < 0,0001, n > 8). (C) konfokal avbildning av levande (calcein-am) och döda (ethidium homodimer-1) celler inom hängande droppe sfäroid. Grön färg indikerar att levande celler och röd färg indikerar död cells population. Scale bar = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: kvantifiering av CSCs hos patient som härrör CSC-spheroids som genereras och underhålls på 384-hängande Drop-plattform. (A) vid analys av flödescytometridata väljs cellpopulationen först med en polygongrind för att eliminera eventuella händelser som kan hänföras till skräp. B) de enskilda cellerna väljs sedan ut för att eliminera potentiella dubbel signaler som kan dölja resultat. (C) alla enskilda Live-celler väljs sedan baserat på DAPI-uteslutning. (D) den vertikala axeln i en kvadrant grind justeras i DEAB kontroll för att möjliggöra ca 0,15% icke-specifik aldh färgning. (E) den horisontella axeln av kvadrant porten justeras i APC ISO-kontroll för att möjliggöra ca 0,5% icke-specifik APC färgning. (F) kvadrant Gate används sedan för att bestämma procent av CD133 +, aldh +, och CD133 +/aldh + celler finns i levande cellpopulationen i den experimentella CD133 plus aldh skick. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den 384-well hängande Drop Plate plattform för 3D sfäroid formation är ett lätt genomfört verktyg för alla cellbiologi eller cancer biologi laboratorier. Denna fysiologisk plattform gör det möjligt att studera cellinjer, samt, primära patientprover inom fysiologiskt relevanta 3D-kulturer samtidigt som det möjliggör hög genomströmning Drug screening. Plattformen säkerställer också att odlingsförhållandena är mycket avstämbara, vilket möjliggör en stram kontroll över beläggnings tätheter, cell samkultursförhållanden, extracellulära komponenter och medelsammansättning. Dessutom tillåter denna fysiologisk plattform experiment att vara mycket mottagliga för nedströms analystekniker som kräver stora eller små celler som qRT-PCR, FACS, och olika avbildningsmetoder. Samtidigt som användarvänlighet kommer med erfarenhet, blir nya praktikanter framgångsrika snabbt, en gånghastighet och enkel pipettering behärskar. Sålunda, denna fysiologisk plattform är mycket tillämplig för personlig 3D Drug screening, CSC biologi och kemoresistens utredningar.

Några punkter av oro när nyligen genomföra denna plattform inkluderar plattan överföring och läkemedelsbehandling. Vid överföring av plåtar från en plats till en annan som krävs för rutinmässig matning, avbildning, och analys, bör noggranna försiktighetsåtgärder vidtas för att undvika onödig trängning. Greppa plattorna från ytterkanterna och håll dem så jämna som möjligt och var noga med att undvika skärande rörelser när du placerar plattan. Detta bidrar till att undvika dropp förlust eller sammanslagning av angränsande droppar. Likaså bör vaksam uppmärksamhet ägnas åt uppgiften att narkotikabehandling hängande droppe spheroids att undvika felaktig dosering av någon hängande droppe spheroid. Som med all teknik, förtroende och noggrannhet med dessa uppgifter anländer med övning.

Några begränsningar är medfödda till denna 3D fysiologisk plattform. Första, dropp instabilitet kan vara i fråga på lång sikt kultur tid punkter, om försiktighet inte vidtas för att upprätthålla korrekt total droppvolym. Som nämnts ovan måste transport och lagring av plåtar göras noggrant för att undvika förlust eller sammanslagning av små droppar. Dessutom är storleken för denna 3D-miljö styrs av medfödda stabil droppstorlek på 20 μL, även om många replikat kan produceras för ökat antal celler.

Ändringar av denna 3D-fysiologisk plattform kan utnyttjas för att öka genomströmningen och förändra fysiologiska egenskaper. Till exempel kan dropp layout ändras för att inkludera varje brunn inom 384 väl plattan för att öka genomströmningen. Dessutom är 3D hängande Drop plattformen mycket gynnsam för co-kultur utredningar genom enkel inkludering av flera celltyper i varje brunn. För att generera och underhålla sfäroid framgångsrikt, cellkulturmedium och initial cell sådd densitet kan lätt moduleras, att tätt reglera sfäoid storlek. Med dessa högt avstämbara variabler är otaliga utredningar möjligheten inom sfären av 3D-fysiologisk tålmodig härledd spheroids.

Medan de flesta analysmetoder som beskrivs används ofta i vetenskaplig forskning, det finns några begränsningar som är specifika för att analysera hängande droppe genererade spheroids med några av dessa metoder. Till exempel, när spheroids odlas under lång tid i hängande Drop tallrikar, droppstorlek kan öka avsevärt orsakar droppar att skaka under faskontrast bild Ande, potentiellt kompromissa bildkvalitet. Detta kan förbättras genom att ta en motsvarande mängd medium ur varje brunn innan du lägger till färskt medium. Dessutom kan tekniker som flödescytometri och räkning av enskilda livskraftiga celler påverkas av den teknik som används för att bryta sönder spheroids, vilket kan vara skadligt för celler. Som sådan är det viktigt för varje labb att optimera sfäroid disaggregering tekniker baserat på deras celler och experimentera för att minimera cellskador samtidigt maximera Enkelcell densitet. Slutligen, histologisk analys av spheroids kan kompliceras av sin ringa storlek och kräver övning för att få framgångsrika sektioner.

Sammantaget är den 3D hängande Drop sfäroid plattformen allmänt anpassningsbar inom cancer och icke-cancerforskning. Systemet är lätt att lära sig och ger en 3D fysiologiskt relevant miljö för cellkultur i ett högt dataflöde format. Initiering tid för denna 3D fysiologiska plattform är minimal, med få, om någon, teknisk analys hinder att övervinna. Mångsidigheten hos detta system ger ett sätt för patientspecifik screening av effektiva kemoterapeutika för precisionsmedicin, i en mer fysiologisk miljö än någonsin tidigare.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	ILT25200056
10 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11E
10,000 cSt Si oil	Millipore Sigma	63148-62-9	Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.
100 mm tissue culture dish	Thermo Scientific	130182
15 mL conical tube	Celltreat	FL4021
1x DMEM for Serum Free Medium	Gibco	11965-092
1x F12 for Serum Free Medium	Gibco	11765-054
1x phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	ILT10010023
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	D1306
40 µm filter	Fisher Scientific	22363547
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Accutase	Innovative Cell Technologies Inc.	1449	A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.
ACK Lysing Buffer	Thermo Scientific	A1049201
alamarBlue	Invitrogen	DAL1025	Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.
ALDEFLUOR assay kit	Stem Cell Tech	1700	Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stem Cell Tech	1705	Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.
Andor iXon x3 CCD Camera	Oxford Instruments	-
Antibiotics and Antimycotics	Gibco	15240-062
APC-isotype IgG2b	Miltenyi biotec	130-092-217	Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.
B27 Supplement	Gibco	17504044
basic Fibroblast Growth Factor	Stem Cell Technologies	78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate Reader	BioTek	7091000
CD133-APC	Miltenyi biotec	130-113-184	Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.
cellSens Dimension Software	Olympus
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394	Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging System	Life Technologies	AME3300
Fetal Bovine Serum - premium (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F4375
Hemacytometer	Hausser Scientific	1490
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-5006
Human Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC2543
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement	Gibco	51500-056
Live/Dead viability kit	Invitrogen	L3224	Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140-050
MetaMorph 7.8 Software	Molecular Devices	-
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope	Olympus	-
Olympus IX83 Research Inverted Microscope	Olympus
Parafilm M	Thomas Scientific	7315D35	Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix	HDP1384-8	Available through Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488	Invitrogen	A12379	Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.
ProJet 3500 HD Max	3D Systems	-	3D printer
Sterile DI water	Fisher Scientific	353046
Trypan Blue	Gibco	15250061	Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.
VisiJet M3 Crystal	3D Systems	-	A biocompatible polymer material for 3D printing.
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	-