Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para o clivagem dnazyme-dependente do RNA. Isto permite a análise rápida e local-dependente do RNA 2 '-O-methylation. Esta aproximação pode ser usada para a avaliação preliminar ou principal da atividade do snoRNA.
Abstract
A caixa de guia C/D RNAs nucleolar pequenas (snoRNAs) cataleia 2 '-O-methylation do RNA nuclear ribosomal e pequeno. Entretanto, um grande número de snoRNA em eucariotas mais elevados pode promiscuo reconhecer outras espécies do RNA e 2 '-O-methylate alvos múltiplos. Aqui, nós fornecemos o guia passo-a-passo para a análise rápida e não-caro do site-specific 2 '-O-methylation usando um método bem estabelecido empregando o ADN curto oligonucleotídeos chamado dnazymes. Estes fragmentos do ADN contêm as seqüências catalíticas que Cleave o RNA em posições específicas do consenso, assim como os braços variáveis da homologia que direcionam DNAzyme a seus alvos do RNA. A atividade de dnazyme é inibida por 2-' o-methylation do nucleotide adjacente ao local do clivagem no RNA. Assim, os DNAzymes, limitados somente pelo consenso da seqüência clivada, são ferramentas perfeitas para a análise rápida do RNA 2 '-O-methylation mediado por snoRNA. Nós analisamos o snoRNA snR13-e O 2 '-O-methylation snR47-guiado do RNA ribosomal 25S em Saccharomyces cerevisiae para demonstrar a simplicidade da técnica e para fornecer um protocolo detalhado para o ensaio DNAzyme-dependente.
Introduction
As modificações do RNA jogam papéis importantes na regulação da expressão gênica. RNA 2 '-O-metilação e pseudouridilation, que são guiados por caixa C/D e caixa H/Aca pequenas nucleolar RNAs (snoRNAs), respectivamente, protegem o RNA da degradação e estabilizam suas estruturas de ordem superior1,2,3 . Os alvos do SnoRNA foram identificados principalmente em RNAs ribosomal (rRNA) e em RNAs nucleares pequenas (snRNAs). Entretanto, em eukaryotes mais elevados, há potencial centenas de snoRNA sem funções atribuídas e alguns deles podem reconhecer RNAs Múltiplo1,4,5,6,7. Portanto, métodos que permitam a identificação e análise de modificações guiadas por snoRNA são ferramentas importantes para desvendar mecanismos que regem os processos celulares.
Uma caixa C/D snoRNA-guiada putativo 2 '-O-methylation site pode ser identificado bioinformaticamente e confirmado experimentalmente por muitas técnicas, incluindo RNase H-dirigido clivagem, ou local-específico e genoma-Wide métodos, que empregam transcrição reversa na abordagem de concentração de nucleotídeos baixos (dNTPs)8,9,10,11. Estas técnicas são muito sensíveis, mas também trabalhoso e caro, portanto, pode não ser adequado para o teste inicial ou rápido. Um dos métodos mais simples e de baixo custo para identificar sites de 2 '-O-metilação é a clivagem de RNA dependente de DNAzyme12. Os DNAzymes são moléculas de DNA curtas, únicas e catalisadas, capazes de clivagem endonucleolítica de RNA em posições específicas. Eles consistem em uma seqüência de núcleos conservadas e catalisadora ativa e 5 ' e 3 ' braços de ligação compostos de sequências variáveis projetadas para hibridizar por Watson-Crick base-emparelhamento para o alvo de RNA (Figura 1). Assim, os braços 5 ' e 3 ' entregam a seqüência catalítica ao local específico do RNA. A clivagem dependente de dnazyme é inibida por 2 '-o-methylation do nucleotide posicionado diretamente a montante do local de clivagem12,13. Isto faz dnazymes ferramentas muito práticas para a análise de locais putativo ou conhecidos do RNA 2 '-O-methylation.
Dois tipos de DNAzymes são usados para análises de modificações do RNA12. A sequência ativa de 10-23 DNAzyme (Figura 1a) consiste em 15 nucleotídeos (5 ' RGGCTAGCTACAACGA3 ') que formam um laço em torno do dinucleotídeo de Purina-PIRIMIDINA (Ry) de RNA direcionado e catalisam a clivagem entre esses dois nucleotídeos. O RNA Purina (R) não é base-emparelhado com o dnazyme e os 2 '-o-methylation presentes no dnazyme inibe a clivagem. Os braços de ligação de 10-23 dnazymes são geralmente 10-15 nucleotídeos longo. A segunda classe DNAzyme, 8-17 DNAzymes (Figura 1b) contém 14-nucleotídeo seqüência catalítica (5 ' TCCGAGCCGGACGA3 '). Nucleotides C2, c3 e g4 par com c9 g10 e g11 formando uma estrutura de loop de haste curta. 8-17 dnazymes Cleave RNA a montante de qualquer guanina que é imperfeitamente emparelhado com o primeiro timina da seqüência ativa dnazyme. O nucleotide do RNA a montante do guanina não é base-emparelhado com o dnazyme e seu 2 '-o-methylation prejudica o clivagem. 8-17 dnazymes exigem mais braços homologia de cerca de 20 nucleotídeos para direcionar dnazyme para sua seqüência específica.
Aqui, nós fornecemos um protocolo passo-a-passo para a análise de 2 '-O-methylation de rRNA em Saccharomyces cerevisiae usando 10-23 e 8-17 dnazyme-dependente aproximações12,13 (Figura 1C). Este protocolo pode facilmente ser adaptado para outros organismos e espécies do RNA e empregado para as análises rápidas, preliminares ou principais do RNA 2 '-O-methylation local-específico.
Protocol
1. cepas, mídia e receitas de buffer
- Prepare o fermento (S. cerevisiae) mídia como detalhado aqui: YP (1% w/v extrato de levedura, 2% w/v bacteriológico peptona), e glicose e galactose estoques em 20% w/v.
- Prepare o acetato de sódio (NaAc)-tampão EDTA (AE) conforme detalhado aqui: 50 mM NaAc pH 5,3 e 10 mM EDTA.
- Prepare 10-23 buffer de incubação DNAzyme 4x como detalhado aqui: 24 mM TRIS pH 8,0, 60 mM NaCl e 10-23 DNAzyme 4x buffer de reação: 200 mM TRIS pH 8,0 e 600 mM NaCl.
- Prepare 8-17 DNAzyme 2x reação tampão como detalhado aqui: 200 mM KCl, 800 mM NaCl, 100 mM HEPES pH 7,0, 15 mM MgCl2e 15 mm MNCL2.
- Prepare 10x MOPS buffer conforme detalhado aqui: 200 mM MOPS, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA; pH 7,0 e 1.5 x amostra Denaturing buffer: 50% v/v formamide, 20% v/v formaldeído, 1.5 x MOPS buffer.
- Obter cepas de S. cerevisiae , BY4741 (mata His3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0); GAL1:: SNR13 (como BY4741 mas GAL1:: SNR13: KANmX); GAL1:: SNR47 (como BY4741 mas GAL1:: SNR47: HIS3mX). Qualquer outra cepa de levedura pode ser usada para esta análise.
2. DNAzyme design
- Encontre a seqüência do RNA do local do metilação do interesse ou do putativo usando uma base de dados apropriada. Para alvos do snoRNA de S. cerevisiae , use a base de dados do snoRNA do fermento: http://People.Biochem.UMass.edu/fournierlab/snornadb/masterTable.php14
- Para encontrar o local do metilação do interesse, por exemplo, local snR13-dependent, seleto "snR13" e anote a posição do nucleotide modificado (por exemplo, snR13-guiado a2281 em 25s rRNA).
- Encontre sequências upstream e downstream do nucleotídeo modificado usando o banco de dados apropriado. Para S. cerevisiae, use o banco de dados do genoma Saccharomyces: https://www.yeastgenome.org/
- Procure o nome do gene alvo por exemplo, RDN25 (codificação 25S rRNA).
- Na guia "sequência", selecione 10-15 nucleotídeos upstream (5 ' ARM) e downstream (3 ' ARM) do local de metilação ao usar um ensaio de dnazyme 10-23 e 20 nucleotídeos upstream (5 ' ARM) e downstream (3 ' ARM) do local de metilação para um dnazyme 8-17.
- Criar sequências complementares de 5 ' e 3 ' braços.
- Flanco 10-23 ou 8-17 seqüência catalítica DNAzyme com sequências complementares de 5 ' e 3 ' braços.
- Ordem DNAzyme como um oligonucleotide normal do ADN do fornecedor.
3. S. cerevisiae condições de crescimento
Nota: Foram utilizados derivados de estirpe S. cerevisiae BY4741, nos quais a expressão de um snoRNA SNR13 ou SNR47 é conduzida do promotor GAL1 induzível. A fim induzir ou inibir sua síntese, cresça pilhas no meio que contem o galactose (transcriçãoGAL1-dependent sobre) ou a glicose (transcriçãoGAL1-dependente fora). Como um controle, use o tipo selvagem estirpe (BY4741) crescido no galactose ou na glicose.
- Cresça cepas de levedura em um meio apropriado e condições. Para analisar GAL1:: SNR13 e GAL1:: SNR47 cepas, bem como a estirpe de tipo selvagem isogênico, crescem células em 50 ml de mídia YP com glicose a 2% (YPD) ou galactose (ypgal) a 30 ° c para a fase exponencial média.
- Células centrífugas a 1.000 x g, por 3 min a 4 ° c.
- Descarte o sobrenadante e mantenha as pelotas.
- Congele pelotas da pilha no nitrogênio líquido e armazene-os em-80 ° c.
Atenção: O nitrogênio líquido pode causar queimaduras criogênicas graves. Sempre use roupas protetoras e precauções de segurança do exercício.
Nota: As pelotas da pilha podem ser armazenadas em-80 ° c até 1 mês. O protocolo pode ser pausado aqui, se necessário.
4. isolamento do RNA15
Nota: Use o método mais apropriado para isolar o RNA. Para o fermento S. cerevisiae, a extração do RNA do quente-fenol pode ser usada.
- Adicionar 1 mL de água gelada, ressuscita as pelotas e transferir células ressuscipended para 1,5 mL de microtubos.
- Centrifugue a 20.000 x g por 10 s a 4 ° c e retire o sobrenadante.
- Adicionar 400 μL de tampão AE e suspender as células.
Nota: Os passos 4.4-4.15 são realizados à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. - Adicionar 40 μL de SDS a 10% e 400 μL de fenol ácido (pH 4,5).
Atenção: O fenol é tóxico e deve ser manuseado uma capa de fumaça. Sempre use um jaleco, luvas protetoras e óculos ao trabalhar com fenol. Descarte os resíduos de acordo com os regulamentos institucionais. - Misture bem por vortexing para 20 s.
- Incubar a 65 ° c durante 10 min. A cada 2 min, gentilmente abrir e fechar o tubo para liberar a pressão e virar o tubo 2-3 vezes para misturar as fases.
- Transfira os tubos para-80 ° c e incubar durante 10 min.
- Descongelar os tubos no banco e centrifugar a 20.000 x g, durante 5 min à temperatura ambiente.
- Transfira a fase superior para um novo tubo contendo 400 μL de fenol ácido: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1). Não interrompa a interfase.
Atenção: Clorofórmio é tóxico e deve ser manuseado uma capa de fumaça. Sempre use um jaleco, luvas protetoras e óculos ao trabalhar com clorofórmio. Descarte os resíduos de acordo com as regulamentações institucionais. - Misture bem por vortexing para 30 s e Centrifugue a 20.000 x g por 10 min à temperatura ambiente.
- Transfira a fase superior (~ 400 μL) para um novo tubo contendo 400 μL de clorofórmio.
- Misture bem por vortexing para 30 s e Centrifugue a 20.000 x g por 5 min à temperatura ambiente.
- Transfira a fase superior (~ 300-350 μL) para um novo tubo contendo 1 mL de EtOH e 40 μL de acetato de amónio 7,5 M (NH4AC). Misture lançando o tubo algumas vezes.
- Incubar a-80 ° c durante 2 h ou durante a noite a-20 ° c.
Nota: O procedimento pode ser pausado aqui. - Centrifugador em 20.000 x g, para 10 minutos em 4 ° c. Uma pequena pelota de RNA branca se tornará visível na parte inferior do tubo.
- Retire o EtOH introduzindo pipetagem para evitar perturbar o pellet.
- Adicionar 1 mL de 70% de EtOH e centrifugar a 20.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Remover 70% EtOH por pipetagem.
- Centrifugue a 20.000 x g por 15 s e retire o EtOH remanescente com 2-20 μL de pipeta.
- Deixe o tubo aberto no banco por 5 min para secar a pelota do RNA.
Nota: A pelota do RNA muda sua cor do branco para transparente quando seco. - Ressuscitem a pelota do RNA em 30 μL de RNase/DNase-livre H2o, transfira o tubo imediatamente no gelo e meça a concentração do RNA no microespectrofotômetro.
- Congelar as amostras a-20 ° c.
Nota: O RNA pode ser armazenado em-20 ° c até 1 mês e em-80 ° c até 1 ano. O procedimento pode ser pausado aqui ou prosseguiu diretamente para a próxima etapa.
5. DNAzyme digestão
-
10-23 digestão de DNAzyme
- Em tubos de 1,5 mL Prepare uma mistura de incubação combinando 5 μg de RNA, 200 pmol de 10-23 DNAzyme (2 μL de solução de estoque de 100 mM) e 2,5 μL de tampão de incubação de 4x 10-23 em um volume total de 10 μL. Mantenha os tubos no gelo.
- Transfira os tubos para um bloco de calor seco fixado em 95 ° c e incubar durante 3 min.
- Transfira os tubos imediatamente no gelo e incubar por 5 min.
- Gire brevemente e coloque os tubos de volta no gelo.
- Adicionar 20 U de inibidor de RNase (por exemplo, 0,5 μL de inibidor de RiboLock RNase).
- Coloque os tubos em um bloco de calor seco definido para 25 ° c e incubar por 10 min.
- Enquanto isso, prepare uma mistura de reação em um tubo de 1,5 μL combinando 5 μL de tampão de reação 4x 10-23 com 4 μL de 300 mM MgCl2 e 1 μl H2o. Coloque o tubo em um bloco seco definido como 37 ° c.
- Transfira a mistura de incubação para um bloco de calor seco definido para 37 ° c e adicione 10 μL de mistura de reacção pré-aquecida.
- Incubar a reacção a 37 ° c durante 1 h.
- Transfira os tubos no gelo e avance para o passo 5.3.1.
-
8-17 digestão de DNAzyme
- Prepare um microtubo de 1,5 mL com 5 μg de RNA num volume total de 6 μL. Mantenha o tubo no gelo.
- Prepare um microtubo de 1,5 mL com 400 pmol de 8-17 DNAzyme (4 μL de uma bolsa de 100 mM). Mantenha o tubo no gelo.
- Transfira os tubos para um bloco de calor seco definido para 95 ° c e incubar durante 2 min.
- Mova a amostra de RNA no gelo.
- Gire o tubo com DNAzyme por 5 s e incubar a 25 ° c por 10 min.
- Ao mesmo tempo, prepare um tubo de 1,5 mL com 10 μL de 2x 8-17 amortecedor de reacção e incubar a 25 ° c.
- Prepare uma mistura de reacção adicionando 10 μL de tampão de reacção 2x pré-aquecido ao tubo com DNAzyme.
- Transfira 14 μL da mistura de reacção para o tubo com RNA e adicione 20 U de inibidor de RNase.
- Incubar a reacção a 25 ° c durante 2 h.
- Transfira o tubo no gelo e prossiga para a purificação do RNA (passo 5.3.1).
-
Purificação do RNA
- Adicionar 350 μL de água e 400 μL de clorofórmio ao tubo de reacção, misturar bem por vortexing por 30 s e centrifugar a 20.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Transfira a fase superior (~ 300-350 μL) para um novo tubo contendo 1 mL de EtOH, 40 μL de 7,5 M NH4AC e 1 μL de glicogênio (10 μg/μL). Misture lançando o tubo algumas vezes.
- Incubar a-80 ° c durante 2 h ou durante a noite a-20 ° c.
Nota: O procedimento pode ser pausado aqui. - Repita os passos de 4,15 para 4,21.
- Ressuscitem a pelota do RNA em 10 μL de RNase/DNase-livre H2o e transfira os tubos imediatamente no gelo.
- Congelar as amostras a-20 ° c.
Nota: O RNA pode ser armazenado em-20 ° c até um mês e em-80 ° c até 1 ano. O procedimento pode ser pausado aqui ou proceder à eletroforese de RNA.
6. electroforese do RNA
- Pulverize o equipamento da electroforese (tanque, bandeja, pente) com SDS de 1%, deixe por 15 minutos e enxague com abundância de ddH2O.
- Dissolver 1,5 g de agarose em 127,5 mL de ddH2o aquecendo-o no microondas.
- Adicione 15 mL de MOPS 10x e 7,5 mL de formaldeído 37% à solução de agarose (o volume total é de 150 mL).
Atenção: O formaldehyde é tóxico e deve ser segurado uma capa das emanações. Sempre use um jaleco, luvas protetoras e óculos ao trabalhar com formaldeído. Descarte os resíduos de acordo com as regulamentações institucionais. - Adicione uma quantidade apropriada de uma mancha do gel da escolha à solução do agarose (por exemplo, 15 μL da mancha segura do gel do ADN de SYBR). Misture bem e despeje o agarose para a bandeja.
- Insira um pente no gel imediatamente.
- Deixe-o por 45 min a capa das emanações. Cubra a bandeja com folha de alumínio ao usar uma mancha de gel sensível à luz.
- Prepare 600 mL de tampão de 1x MOPS.
-
Preparação da amostra de RNA
- Num tubo de 1,5 mL, combine 10 μL da amostra de RNA digerida e purificada, 5 μL de tampão de desnaturação de amostra e 0,5 μL de corante de carregamento de 6x.
Atenção: A formamida é tóxica e deve ser manuseada uma capa de fumaça. Sempre use um jaleco, luvas protetoras e óculos ao trabalhar com formamida. Descarte os resíduos de acordo com as regulamentações institucionais. - Incubar amostras de RNA a 70 ° c durante 5 min. Transfira as amostras no gelo. Incubar por 5 min.
- Gire brevemente antes de carregar o gel.
- Num tubo de 1,5 mL, combine 10 μL da amostra de RNA digerida e purificada, 5 μL de tampão de desnaturação de amostra e 0,5 μL de corante de carregamento de 6x.
- Põr o gel no tanque da electroforese e encha-o com o amortecedor de 1x MOPS. Carregue todo o volume de cada amostra (15 μL) no gel. Funcione em 80 V até que o azul do bromofenol alcangue 2/3 do comprimento do gel.
- Imagem o gel usando um Imager apropriado para detectar a mancha escolhida do gel (por exemplo, transilluminator UV).
Representative Results
A utilidade da clivagem dependente de DNAzyme na análise de modificações do rRNA foi mostrada recentemente no contexto da maturação13de snoRNAs. O ensaio DNAzyme-dependente foi utilizado para demonstrar que a falta de 5 '-End pre-snoRNA processamento afeta 2 '-O-metilação níveis de 25S e 18S rRNA em s. cerevisiae13.
Aqui, utilizamos um sistema de transcrição de snoRNA induzível para demonstrar a eficácia e a simplicidade da técnica. A caixa C/D snR13 guia a metilação em duas posições no rRNA 25S, incluindo a adenina 2281 (Figura 2a). Este nucleotide é seguido pelo uracil, que constitui o dinucleotídeo do consenso (Ry) ligante por um dnazyme 10-23. A caixa C/D snR47 também orienta a metilação de dois nucleotídeos em rRNA 25S (Figura 2b). A adenina na posição 2220 é seguida por um resíduo de guanina e este dinucleotídeo pode ser clivada por um DNAzyme 8-17. A fim induzir ou inibir a síntese de snR13 ou de snR47 snoRNA, nós inserimos o promotor GAL1 induzível a montante de genes de snR13 ou de snR47 e de pilhas cultivadas no meio que contem o galactose (GAL1-Dependent transcrição) ou glicose (GAL1-dependente transcrição off). Em seguida, o RNA isolado de GAL1:: SNR13 as pilhas foram incubadas com o dnazyme 10-23 projetado para Cleave 25s rRNA no local SNR13-dependent, entre nucleotídeos 2281 e 2282 (Figura 2C). O RNA da cepa GAL1:: SNR47 foi tratado com 8-17 DNAzyme visando o local SNR47-dependente entre os nucleotídeos 2220 e 2221 (Figura 2D). Como um controle, o RNA da estirpe do selvagem-tipo BY4741 que cresce no galactose ou na glicose foi incubado com ambos os DNAzymes. A electroforese do RNA DNAzyme-Tratado revelou que 25S rRNA extraído de GAL1:: SNR13 e GAL1:: as estirpes SNR47 que crescem na galactose (GAL) permaneceram intactas (Figura 3a,B; faixas 3). Ao contrário, o RNA isolado de GAL1:: SNR13 e GAL1:: SNR47 as células que crescem na glicose (GLC) foram digeridas pelos respectivos dnazymes (Figura 3a, B; pistas 4). Em ambos os casos, a faixa de 25s rRNA diminuiu e 5 ' e 3 ' cut-off clivagem produtos (a e B) foram observados. Isso indica que nas cepas GAL1:: SNR13 e GAL1:: SNR47 , O rRNA 25s foi 2 '-O-metilado em sítios SNR13 ou SNR47-guiados quando a galactose foi usada como fonte de carbono e estes snoRNA foram expressos. A falta do metilação do rRNA 25s quando a expressão de snR13 ou de snR47 foi desligada na glicose permitida para o clivagem dnazyme-dependente. Nenhuma digestão do RNA foi observada para o selvagem-tipo amostras (Figura 3a,B; pistas 1 e 2), porque a expressão de snR13 e de snR47 é galactose/glicose-independente nesta tensão. Conseqüentemente, o rRNA foi misturado normalmente e assim resistente à atividade de dnazymes.
No geral, nosso experimento mostra que a atividade de clivagem de 10-23 (Figura 3a) e 8-17 (Figura 3B) dnazymes correlacionou-se com a ausência de caixa C/D snR13 ou snR47, indicando claramente que esses snoRNA são responsáveis por 25s rRNA 2 '-O-methylation em locais particulares.
Figura 1: DNAzymes e seus substratos de RNA. (A) 10-23 DNAzymes Cleave um dinucleotide do RNA do purine-pyrimidine (Ry). R no RNA não é emparelhado com DNAzyme, enquanto Y é complementar à base de R no DNAzyme. A metilação da purina (R) no RNA suprime a clivagem dependente de DNAzyme. (B) 8-17 dnazymes Cleave RNA a montante da guanina que é imperfeitamente emparelhado com o primeiro timina na seqüência catalítica de dnazyme. O nucleotídeo que precede a guanina não é emparelhado e sua metilação protege da clivagem dependente de DNAzyme. O RNA é mostrado no cinza (aparte do local do metilação), dnazyme é mostrado no roxo. N = qualquer nucleotídeo, R = Purina: adenina ou guanina, Y = pirimidina: citosina ou uracil; CH3-denota metilação de RNA. O emparelhamento base dentro das sequências ativas do DNAzyme é marcado por linhas pontilhadas. Um raio azul marca o local da segmentação. (C) um fluxograma mostrando as etapas de uma análise dependente de DNAzyme. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: dnazymes segmentação snR13-e snR47-dependente metilação sites em 25s rRNA. (A, B) Capturas de tela do navegador mostrando snR13 dependentes (a) e snR47-dependentes (B) locais de metilação em 25s rRNA (C) 25s rRNA seqüência circundante snR13-dependente site de metilação (a2281) e 10-23 dnazyme (mostrado em roxo) projetado para Cleave RNA entre A2281 e U2282. Um2281 não é emparelhado com o dnazyme enquanto U2282 forma um par com o primeiro nucleotídeo da seqüência ativa dnazyme (marcada por uma linha azul). Um raio azul marca a clivagem. (D) seqüência do rRNA 25s que circunda o local snR47-dependent do metilação (a2220) e o 8-17 dnazyme (mostrado no roxo) projetados para Cleave o RNA entre uns2220 e G2221. A2220 não é hibridizada com o dnazyme enquanto G2221 é imperfeitamente emparelhado com timina (denotado com uma linha tracejadas). Um raio azul marca o local da segmentação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise de 2 '-O-methylation local-específico do rRNA 25S usando o ensaio 10-23 e 8-17 DNAzyme-dependente. (A) análise do metilação snR13-dependent do rRNA 25s usando o dnazyme 10-23. (B) análise do metilação snR47-dependent do rRNA 25s usando o dnazyme 8-17. O RNA foi visualizado manchando em um gel desnaturação do agarose. Os produtos de clivagem A e B são marcados por setas vermelhas. WT = estirpe do tipo selvagem; GAL = galactose, GLC = glicose. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
A digestão dependente de dnazyme pode ser usada como um método simples e rápido para analisar o RNA 2 '-O-methylation local-específico12,13. DNAzymes Cleave RNA se o nucleotídeo a montante do local de clivagem não é metilado. Em contraste com outras abordagens, incluindo a digestão dirigida por RNase H, degradação alcalina ou transcrição reversa em baixa concentração de nucleotídeos seguida de PCR quantitativo ou seqüenciamento8,10,11 ,16, a aproximação de dnazyme exige um oligonucleotide simples do ADN e uns reagentes básicos que estejam atuais em todo o laboratório molecular da biologia. Além disso, DNAzymes pode ser usado em uma maneira similar para analisar o pseudouridylation do RNA negociado pela caixa H/ACA snoRNA12, que os faz ferramentas versáteis em estudar alvos do snoRNA.
As abordagens dependentes de DNAzyme são limitadas apenas por sequências de consenso do site de clivagem17. 10-23 DNAzymes pode ser usado para analisar 2 '-O-metilação apenas na posição R do dinucleotídeo RY, enquanto 8-17 DNAzymes reconhecem a modificação do nucleotídeo localizado a montante da guanina. Como resultado, modificações como 2 '-o-metilação do primeiro nucleotídeo nos dinucleotídeos guanina-adenina (GA), adenina-adenina (AA), pirimidina-adenina (ya) e pirimidina-pirimidina (YY) não podem ser analisadas. Além disso, deve-se considerar a baixa eficiência da clivagem dependente de DNAzyme12 . Embora alguns DNAzymes cliquem RNA quase completamente (Figura 3B), muitos dnazymes apenas parcialmente digerem seus alvos (Figura 3B). A eficiência pode depender da seqüência em torno do site clivagem. Por exemplo, as regiões do RNA com trechos do mesmo nucleotide podem afetar o posicionamento correto da seqüência ativa de DNAzyme. Além disso, as regiões do RNA que formam a estrutura secundária forte podem re-hybridize e suprimir a ligação de DNAzyme à seqüência do alvo. Para superar essas questões, ciclos de aquecimento e resfriamento do 10-23 DNAzyme e seu substrato de RNA podem ser aplicados18.
Nós usamos a aproximação de DNAzyme para investigar 2 '-O-methylation do rRNA. Um pode igualmente usar esta técnica para analisar outras modificações do RNA, tais como N6methyladenosine19. O RNA ribossomal, devido a sua abundância, pode ser analisado pela electroforese e os produtos do clivagem podem ser visualizados a luz UV. Entretanto, isto não é aplicável para RNAs menos abundantes como RNAs da codificação do RNA polymerase II-generated (mRNA) e RNAs não-codificando (ncRNA). Estes RNAs não podem geralmente ser detectados diretamente pelo RNA que mancha em géis do Agarose ou do poliacrilamida. Em tais casos, a segmentação DNAzyme-dependente pode ser visualizada pela mancha do Norte, detectada indiretamente pelo PCR/PCR quantitativo ou ser analisada pelo PCR quantitativo com polymerases (por exemplo, ADN polymerase de KlenTaq) capaz de discriminar O RNA 2 ′-O-methylated de RNA unmethylated20,21.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Maya Wilson e a Aneika leney pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um Sir Henry Dale Fellowship financiado conjuntamente pelo Wellcome Trust e da sociedade real (200473/Z/16/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Acid phenol | SIGMA | P4682 | |
| Agarose | VWR | A2114 | |
| Ammonium acetate | SIGMA | A1542 | |
| Chlorophorm | Fisher scientific | 10293850 | |
| DNase/RNase free water | Fischer Scientific | 10526945 | |
| DNAzyme | Integrated DNA Technology | Custom oligo DNA | |
| EDTA | SIGMA | E9884 | |
| Ethanol Absolute | Fisher scientific | 10437341 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Formamide | sigma | F9037 | |
| Galactose | SIGMA | G0750 | |
| Gel Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Glucose | SIGMA | G7021 | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | R0561 | |
| HEPES | SIGMA | H3375 | |
| Isoamyl | SIGMA | W205702 | |
| KCl | SIGMA | P9333 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| MnCl2 | SIGMA | 244589 | |
| MOPS | SIGMA | M1254 | |
| NaCl | SIGMA | S7653 | |
| Oxoid Peptone Bacteriological | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| Oxoid Yeast Extract Powder | Thermo Fisher Scientific | LP0021 | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
| SDS | SIGMA | 74255 | |
| Sodium acetate trihydrate | SIGMA | S8625 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| Tris base | SIGMA | TRIS-RO | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microtubes | Sarstedt | ||
| 152VR5C01M -80°C freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 250 mL Erlenmeyer flasks | Cole-Parmer | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Combicup VX200 vortex | Appleton Woods | ||
| DS-11 microspectrophotometer | Denovix | ||
| Electrophoresis chamber (20 cm tray) | SIGMA | ||
| FiveEasy F20 pH meter | Appleton Woods | ||
| Gel documentation system | Syngene | ||
| Heraeus Fresco 21 micro centrifuge | Fisher Scientific | ||
| Megafuge 8R centrifuge with rotator suitable for 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | ||
| Mini Fuge Plus mini centrifuge | Starlab | ||
| Mixer HC thermal block | Starlab | ||
| OLS26 Shaking Water Bath | Grant | ||
| PowerPac power supplier | BioRad |
References
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