Summary
여기서 동맥 입력 기능(AIF)을 측정하는 쥐의 PET/CT 이미징 동안 연속 혈액 샘플링을 위한 프로토콜이 기재되어 있다. 카테터화, 시스템의 교정 및 설정 및 혈액 방사능의 데이터 분석이 입증됩니다. 생성된 데이터는 후속 생체 역학 모델링을 위한 입력 파라미터를 제공합니다.
Abstract
양전자 방출 단층 촬영 /컴퓨터 단층 촬영 (PET / CT) 데이터의 정량적 분석 및 생체 역학 모델링의 경우, 동맥 입력 함수 (AIF)로 알려진 측두혈 시간 활성 농도의 결정은 특히 핵심 포인트입니다. 동물 질병 모델의 특성화 및 새로 개발 된 방사성 추적기의 도입. 혈액에 있는 방사선 추적자 가용성의 지식은 조직 활동의 PET/CT 파생된 데이터를 해석하는 것을 돕습니다. 이를 위해 PET/CT 이미징 동안 온라인 혈액 샘플링은 AIF를 측정하는 것이 좋습니다. 수동 혈액 샘플링 및 이미지 파생 접근법과는 달리, 연속 적인 온라인 혈액 샘플링에는 몇 가지 장점이 있습니다. 최소화 된 혈액 손실 외에도 혈액 활동 측정을위한 향상된 해상도와 우수한 정확도가 있습니다. 그러나, 온라인 혈액 샘플링의 주요 단점은 동물의 대퇴 혈관을 카테터화하는 데 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 준비입니다. 여기서는 작은 동물 PET/CT 이미징 중에 카테터 화 및 지속적인 혈액 샘플링을 위한 쉽고 완전한 워크플로우를 설명하고 이를 수동 혈액 샘플링 및 이미지 파생 접근법과 비교했습니다. 이 고도로 표준화된 워크플로우를 사용하여 플루오로데옥시글루코스([18 F]FDG) AIF의 측정이 입증되었습니다. 또한, 이 절차는 트레이서 운동 및 모델 특성에 대한 기본 지식을 생성하기 위해 다른 동물 모델과 함께 모든 방사선 추적기에 적용 될 수있다. 이를 통해 종양학, 신경 퇴행성 및 심근 질환의 전임상 연구에서 진단 및 치료 접근법모두에 대한 의약품의 행동을 보다 정밀하게 평가할 수 있습니다.
Introduction
양전자 방출 단층 촬영 / 컴퓨터 단층 촬영 (PET / CT)은 추적이라고도 방사성 라벨 리간드의 주입 다음 신체의 대사 과정의 시각화를 가능하게하는 핵 이미징 기술입니다. 리간드는 대사 경로에 관여하거나 세포 표면 단백질을 표적으로 하는 분자인 반면, 방사성 라벨은 양전자 방출 방사성 핵종이다. 감마선은 양전자 붕괴에 의해 간접적으로 방출되고 체외 PET 검출기로 유기체에서 분포를 감지 할 수 있습니다. 이런 식으로, 다른 세포 분자는 표적으로 할 수 있습니다: 신경 전달 물질 수용체 및 수송기, translocator 단백질 18 kDa (TSPO)와 같은 glycolysis 또는 미토콘드리아 단백질 같이 신진 대사 프로세스는 활성화된 glia 세포를 검출하기 위하여.
전임상 연구에서 PET/CT는 생체 내에서 비침습적 방식으로 생화학 적 과정을 연구하는 매력적인 방법이므로 세로 연구를 허용합니다. PET/CT 데이터는 질병 메커니즘의 분석, 신약의 특성 및 약물 동태학 평가 및 번역 연구를 위한 현재 및 신규 방사성 추적기의 유효성 검사를 지원합니다.
PET/CT 분석 동안 3개의 트레이서 상태를 정의할 수 있다(2-조직 구획 모델의 예): 첫째, 트레이서는 적용 후 혈액 내에서 흐른다(상태 1; conc.[혈액]). 둘째, 모세관 침대를 통해 조직에 진입하고 세포외 공간 내에서 자유롭게 이동하거나 다양한 세포 또는 세포 외 구조에 비특이적으로 결합될 수 있다(상태 2; conc.[unspec]). 셋째, 트레이서가 표적 분자(상태 3, conc.[spec])에특이적으로 결합될 수 있다(대사 트래핑 유무에 관계없이). 구획 사이의 이러한 모든 동적 프로세스는 어느 정도 양방향이며 확산 프로세스는 속도 상수 (K1, k2, k3 및 k4)에 의해 설명됩니다. 혈액 내의 트레이서의 농도(즉, 상태 1)는 "입력"이라고 불리지만, 비특이적이고 구체적으로 결합된 트레이서(즉, 상태 2 및 상태 3)의 농도는 "출력"이라고 하며 PET 이미지로부터 직접 파생될 수 있다. 이러한 생리적 관계는 2-조직 구획 모델(도 1)에 표시될 수 있다.
그림 1 : 2개의 티슈 구획 모델. 세 가지 다른 추적 자 상태의 생리 적 조건과 그들 사이의 동적 프로세스가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이상적인 경우에, conc.[사양]은 표적 분자의 농도에 비례한다. 그러나 PET/CT 측정의 출력은 conc.[사양] 및 conc.[unspec]의합계입니다. 관심 영역의 conc.[spec]을 결정하기 위해, 동시에 표적 단백질/경로가 없는 기준 영역의[unspec]이 결정된다. 적절한 수학 방정식을 사용하여 이제 conc.[사양]을 계산할 수 있으며, 구획 모델(생체 운동 모델링 접근 방식)을 가장 일반적으로 사용합니다. 그러나, 많은 경우에, 표적 단백질이 없는 이러한 기준영역은 1,2를사용할 수 없다. 이러한 경우, conc.[혈액]은 conc.[사양]을결정하는 데 사용할 수 있습니다. [혈액]은 상이한 간 및 신장 클리어런스, 배설, 혈류, 상이한 뇌-혈액 장벽 침투 및 질병 관련 인자3으로인해 다양하기 때문에, 현재 금본위제는 conc를 측정하는 것이다. [ 혈액] 연속 혈액 샘플링에 의해 PET / CT 스캔에 병렬로. 이것은 동맥 입력 기능을 제공합니다 (AIF), 이는 conc로 정의됩니다.[혈액] 시간이 지남에 따라4. 참고로, 연속 혈액 샘플링을 수행하는 것은 특히 쥐 또는 마우스5와같은 작은 동물에서 기술적으로 매우 도전적인 것으로 간주됩니다.
여기에서, 우리는 대퇴 정맥과 동맥 사이 동맥 (a-v) 션트를 통해 쥐에게서 혈액을 지속적으로 샘플링하는 쉽고 실용적인 프로토콜을 제공합니다. 시판되는 검출기 펌프 시스템에 결합하여, 우리는 동적[18F]플루오로데옥시글루코스([[18F]F]FDG)-PET/CT 스캔 동안 실시간, 연속 AIF를 생성할 수 있으며, 이를 다른 접근법과 비교할 수 있다. PET/CT 이미징은 다중 모달성 PET/CT 스캐너를 사용하여 평균 체중 462 g±33 g(평균 ± 표준 편차)의 나이로 4개월의 나이에 수컷 스프라그 dawley 래트에서 수행되었다.
일련의 측정(용량 교정기, 온라인 혈액 샘플러, PET/CT 및 웰 카운터)에서 다양한 장치가 사용되기 때문에 모든 시스템의 정량적 정확도를 확인하고 이를 위해 교차 교정이라고 하는 품질 관리 절차가 필요합니다. 차이를 보상합니다. 온라인 혈액 샘플링의 맥락에서 교차 캘리브레이션은 교정된 PET 이미지에서 측정된 주어진 활성 농도에 대한 카운트 레이트가 동일한 농도에 대해 트윌라이트 시스템으로 측정된 농도로 변환될 수 있음을 의미한다. 따라서 PET/CT, 혈액 샘플링 시스템 및 웰 카운터 간의 교차 교정 절차가 수립되었습니다.
이 고도로 표준화된 방법론은 전임상 소규모 동물 연구에서 대사 및 세포 과정을 정량화하는 강력한 접근법을 제공하며 AIF의 신뢰성과 재현성을 향상시키는 우아한 방법입니다. AIF는 바이오 운동 모델링을 사용하여 전임상 PET/CT 데이터에서 조직에서 구체적으로 결합된 트레이서를 정량화하는 데 사용될 수 있습니다.
Protocol
모든 동물 취급 및 실험은 메클렌부르크-웨스턴 포메라니아의 주 동물 연구 위원회에 의해 승인되었습니다 (LALLF M-V/7221.3-1.1-004/18, 승인: 03.04.2018). 실험은 도착 가이드라인에 따라 수행되었다.
참고: 동물은 물과 음식 광고 리비텀과 함께 표준 조건(22±2°C, 12시간 낮및 밤주기)에 따라 보관하였다. 션트 시스템의 준비, 작동 절차 및 실제 측정에 필요한 모든 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 동물의 카테터 화준비 및 외과 적 수술
- 물에 무료로 액세스 하여 적어도 12 시간 동안 동물을 빨리. 마취의 경우, 유도 챔버에 쥐를 배치하고 산소 / 이소플루란 믹스로 지속적으로 채웁니다. 개시용 2.5-3.5% 이소플루란 및 유지 보수 1.5-3.0% (유량 1.2-1.5 L/min).
참고: 금식은 트레이서[18F]FDG를 사용하는 연구에 필요하지만 다른 추적자는 그렇지 않습니다. 섹션 4에 설명된 수동 혈액 무승부를 사용하여 포도당 혈액 수치를 측정하는 것은 안정적인 값을 보장하거나 운동 모델링에서 교정하는 것이 좋습니다. - 마취 된 쥐를 가열 매트의 등축 위치에 놓고 외과 현미경 으로 검사소 연고를 눈에 추가하십시오. 직장 프로브로 실험(37±0.5°C)동안 쥐의 체온을 지속적으로 모니터링하고 유지한다.
- 쥐의 다리를 작업 표면에 테이프로 고정하여 다리를 제자리에 고정시다. 점막 소독제로 수술 부위를 소독하고 쥐의 다리와 사타구니 (수술 면)를 면도하십시오. 소독제로 마지막 클렌징을 마무리합니다.
- 쥐의 사타구니에 수술 집게와 가위를 사용하여 약 20mm의 절개를합니다. 미세 한 피부 층을 해부 하 고 대퇴 정맥, 동맥 및 신경을 마이크로 집게로 노출시다. 각 대퇴 정맥과 동맥 아래에 두 개의 미세 필라멘트를 놓습니다.
- 각 말단 필라멘트로 정맥과 동맥을 밀봉하고 불독 클램프로 장력 아래를 잡습니다.
근접 봉합사 필라멘트를 사용하여 불독 클램프를 사용하여 용기를 장력하십시오 (매듭없이). - 동맥류 클램프 근위로 정맥을 차단하지만 불독 클램프로 봉합사에서 2-3mm 말단을 제거하십시오. 각막 가위를 사용하여 정맥 (직경의 1/3)에 작은 절개를하고 멸균 면 스왑으로 누출 된 혈액을 제거하십시오. 둔한 집게로 정맥을 넓게 하고 열어 두는 다. 날카로운 카테터 (내경 [ID]: 0.58 mm, 외부 직경 [OD]: 0.96 mm)를 정맥에 삽입하고 동맥류 클립까지 근접 방향으로 밀어 넣습니다.
- 동맥류 클립을 열고 카테터를 근위 방향으로 (약 2-3cm)로 더 밀어 내고 카테터를 올바르게 놓으면 혈액이 카테터로 흘러 들어갑니다. 두 개의 매듭을 만들어 근위 봉합사로 카테터를 고정; 필요한 경우 정맥과 카테터 주위에 추가 봉합사를 놓습니다. 헤파린화된 식염수 100μL(50 단위/mL)으로 채워진 인슐린 주사기(30G 바늘)로 세척하고 흡입하여 카테터의 기능을 확인합니다.
- 1.6 단계와 1.7 단계를 반복하여 동맥에 카테터를 놓습니다.
- 두 카테터가 올바르게 배치되면 봉합사로 다리를 닫고 동물을 PET/CT로 운반합니다.
참고 : 동물의 운반 중에 카테터를 조심스럽게 사용하면 카테터의 이동이 발생할 수 있습니다.
2. 션트 시스템 설정
그림 2 : 측정 설정 방식. (A) 측정 설정의 개략도면. (B) 트윌라이트 검출기, 연동 펌프 및 다른 커넥터 유형으로 연결된 션트 시스템의 사진. 동물 (1)이 PET /CT (2)에서 스캔되는 동안 쥐의 혈액에서 방사능의 시간 과정이 감지됩니다. 따라서 동맥 (a) 및 정맥 (b) 카테터는 어댑터 조각 (커넥터 오렌지, 커넥터 파란색 및 커넥터 녹색)을 통해 검출기 펌프 시스템에 연결됩니다. 동맥 혈액은 검출기 (3)를 통해 동맥 카테터에서 연동 펌프 (4)로 펌핑되고 정맥 카테터를 통해 체내로 다시 펌핑됩니다. 3방향 밸브(7)는 튜브 시스템에 통합되어 트레이서 주입, 수동 혈액 무승부 및 헹구를 수행합니다. T-피스(8)는 활성을 주입하기 위해 조립된다. 검출기는 컴퓨터와 연결되어 연속 혈액 데이터를 보고, 보정하고, 교정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 미세 보어 폴리에틸렌 튜브 (FBPT)의 6 부분을 잘라 (ID : 0.58 mm, OD : 0.96 mm) c = 735 mm의 길이; e = 100 mm; f = 171 mm, g = 875 mm; h = 90mm 및 i = 75mm (그림 2). 약 20mm의 길이로 실리콘 펌프 튜브 (블랙 / 블랙 / 블랙, ID : 0.76mm, OD : 2.48mm)의 8 부분을 잘라냅니다.
- 실리콘 펌프 튜브 d의 양 단부(노란색/파란색/노란색, ID: 1.52mm, OD: 3.20mm)에 감소 커넥터(ID 2.5mm에서 ID 1.5mm)를 배치합니다. 사용된 환원 커넥터의 다른 쪽 끝에 준비된 20mm 부품(검은색/검은색/검은색)을 놓습니다(그림 2의 커넥터 파란색 참조).
- 준비된 FBPT 부품 c를 실리콘 펌프 튜브 d(노란색/파란색/노란색)의 한쪽 끝에 조립된 커넥터 파란색에 놓고, 준비된 부분 e를 조립된 커넥터 파란색에 놓고, 준비된 부분 e를 다른 쪽 끝. 준비된 20mm 실리콘 튜브(검은색/검은색/검은색)를 두 개의 T-피스 5와 6의 끝에 놓습니다(튜브 T 커넥터 ID: 1.5 mm; 그림2의 커넥터 녹색 참조).
- 조립된 커넥터 그린(5)의 왼쪽에 FBPT의 파트 e의 자유 단부와 연결하고 준비된 부분 f를 커넥터 그린(5)의반대쪽에 놓습니다. 조립된 커넥터 그린(6)의 왼쪽에 FBPT의 파트 f의 자유 단면을 놓고, 준비된 부분 g를 커넥터 그린(6)의반대쪽에 놓는다. 조립된 커넥터 그린(5)의 자유 단부에 FBPT의 준비된 부분 h를 추가하고, 제조된 부분 i를 조립된 커넥터 그린(6)의 자유 단부에 추가한다.
- 콤비 스토퍼를 피하 주사바늘(G 23 x 1 1/4'''/ø 0.60mm x 30mm)에 연결하고 3방향 밸브에 추가합니다. 준비된 3방향 밸브를 FBPT 의 부품 h의 자유 단부에 바늘로 놓습니다. 콤비 스토퍼를 피하 주사바늘에 연결하고 FBPT 의 부분 i의 자유 단부에 바늘을 놓습니다.
참고: 온라인 혈액 샘플링을 시작하기 전에 섹션 5를 참조하십시오. - 20mL의 헤파린식 식염수(50units/mL)로 채워진 100mL 비커에 FBPT의 파트 c와 g의 자유 단부들을 넣습니다. 1.52 mL/min의 유량으로 연동 펌프를 시작하여 션트 시스템이 생리식염수 용액으로 완전히 채워지게 합니다. 그 후 파트 C와 g의 끝과 FBPT의 파트 i의 중간에 세 개의 가위 클램프를 설정합니다.
- FBPT의 C 및 g 부품에서 가위 클램프를 놓습니다. 동맥 카테터를 FBPT의 부분 c의 자유 단부에 연결하고 정맥 카테터 b를 FBPT의 부분 g의 자유 단부에 연결합니다(그림 2의 커넥터 주황색 참조).
3. 이미지 획득 및 재구성
- 동물을 셔틀 침대 팔레트(70mm)에 머리가 취약한 위치에 놓습니다. 쥐의 호흡을 제어하고 이미지 수집 전반에 걸쳐 가열 패드 및 직장 프로브를 사용하여 체온을 37±0.5°C로 유지한다. 셔틀 침대를 주입(사전 수집)을 위해 확장된 침대 위치로 이동하고 삽입된 카테터를 션트 시스템에 연결합니다.
- 코 콘을 통해 이소플루란 (산소 2.5 % 이소플루란, 유량 1.2-1.5 L / 분)으로 마취하에 동물을 유지하십시오.
- 1.52 mL /min의 유량으로 연동 펌프를 시작하여 션트 시스템을 동물의 피로 채웁니다. 셔틀 침대를 PET 검출 링의 시야 중앙으로 이동하고 온라인 혈액 샘플링 시스템을 시작합니다(섹션 5 참조).
- 60s 후 섹션 3.5에 기재된 파라미터를 사용하여 PET/CT 워크플로우를시작하고 이어서 T-피스를 통해 약 0.5±0.1 mL의 부피에서 약 22 MBq[18 F]FDG의 투여량을 주입한다. 그 후 약 150 μL의 헤파린식 식염수로 T피스를 세척합니다.
- 60분 이상 동적 PET를 획득하고 PET 이미징이 끝날 때 CT 스캔을 합니다.
- PET 배출 량 획득의 경우 시간 옵션으로 획득시 3600초(60분)를 설정합니다. F-18을 스터디 동위원소로 선택하고 에너지 레벨로 350-650 keV를 사용하고 타이밍창으로 3,438ns를 사용합니다.
- CT 획득의 경우 수집 옵션에서 감쇠 스캔을 선택합니다. 투영 설정 필드에서 전체회전의 절반에 대해 120 투영을 선택합니다. 시야(FOV) 및 해상도 설정의 경우 배율이 낮고 4 x 4를 275mm 축 스캔 길이로 바인딩하고 3328px를 축축 CCD크기로 선택합니다. 노출 설정 필드에서 전류에대해 500 μA, 전압의 경우 80 kV, 노출 시간동안 180ms를 설정합니다.
- PET 방출 히스토그램의 경우 동적 프레임으로20프레임(6 x 10s, 8 x 30s, 5 x 300s 및 1 x 1800s)을 설정합니다. 지연으로 빼기 선택 합니다. 고급 설정 필드 (128)에서 sinogram 너비로, 3 을 범위로, 79를 링 차이 및 데드 타임보정으로 선택합니다.
- PET 재구성의 경우, 2차원 주문 서브셋 기대치 최대화(2D-OSEM)를 생성, 적용 및 저장하여 산란 시노그램,4반복 및 푸리에를 재구성 알고리즘으로리브닝합니다. 128 x 128을 매트릭스 크기로 선택하고 1을 이미지 확대/축소로사용하고 모두 프레임으로, 모두 세그먼트로사용합니다.
4. 수동 혈액 샘플링 절차
- 이미징 수집을 시작한 후 수동 혈액 샘플링을 30s, 60s, 90s, 600s 및 1800s 수행합니다.
참고 : 수동 혈액의 수를 증가 추적자 주입 후 첫 번째 분 이내에 특히 제거하는 것은 매우 좋습니다 가능하면. 따라서 혈액 샘플 부피는 샘플6당 20-30 μL로 감소되어야합니다.- 첫 번째 3방향 밸브를 열고 트레이서 주입 후 30s 의 모세관 혈액 수집 EDTA 튜브로 100 μL의 동맥 혈액을 수집합니다. 다른 시간 점에 대해 반복합니다. 빈 튜브와 혈액 충전 튜브의 무게를 결정합니다.
- 잘 카운터에서 180s에 대한 전혈의 활동 (카운트 / 시간 단위)을 측정하고 나중에 kBq / mL에서 데이터를 얻기 위해 교차 보정됩니다. 웰 카운터 측정의 시작 시간을 기록합니다. kBq/mL에서 수동 혈액 샘플링의 각 시점마다 전혈의 활성을 계산하고, 부패 교정을 적용하고, 시간 활동 곡선에서 데이터를 전송합니다.
5. 온라인 혈액 샘플링 절차
- 튜브 가이드를 사용하여 튜브를 검출기에 넣습니다. 혈액 샘플러 소프트웨어(예: PSAMPLE)를 시작하고 수집 인터페이스를 엽니다. 온라인 혈액 샘플링 설정 및 PET/CT의 컴퓨터가 시간 동기화되었는지 확인합니다.
- 추적자가 주입되기 전에 시작 버튼을 정확히 60초 누르면 배경 보정에 충분한 데이터가 수집됩니다. 측정 후 PMOD 데이터베이스의 저장 버튼을 통해 원시 데이터를 저장합니다.
- 온라인 혈액 데이터의 보정 및 교정을 위해 보정 인터페이스로 전환하십시오. 감쇠 보정을 활성화하고 18 F. 이미지 수집 시작 시간을 정의하고 평균 버튼을 사용하여 배경 보정을 수행할 수 있습니다. 이전에 결정된 교정 계수의 교정 및 유형을 활성화합니다(섹션 7.1 참조).
- 저장 TAC 버튼을 사용하여 수정 및 보정 된 혈액 데이터를 저장하고 파일 blood.crv를선택합니다. 그런 다음 이 파일은 전혈 입력 곡선을 운동 모델링 도구로 로드할 수 있으며 운동 모델링을 수행할 수 있습니다. 여분의 신체 션트 시스템에서 카테터를 분리합니다.
- PET/CT 스캐너에서 동물을 분리하고 펜토바르비탈로 안락사시.
참고: 본 실험에서, 실험 설계에서 시험관 내 분석에 뇌가 사용됨에 따라 측정 후 동물을 안락사시켰다. 이 설정으로, 세로 연구에서 반복 측정도 구현 할 수있습니다 7. 다음 동물을 위해 완전히 새로운 튜브 시스템을 사용하십시오.
6. 이미지 파생 입력 기능
- PMOD에서 퓨즈 툴을 엽니다. PET 이미지를 입력으로 로드하고 CT를 참조로 로드합니다. 이미 일치하는 것을 클릭합니다.
- 관심의 복셀 (VOI) 도구를 엽니 다. CT에서 오름차순 대류 내에 커서를 놓습니다. 정확히 0.7mm의 반지름을 정의합니다. VOI 통계 단추를 사용하여 시간 활동 정보를 추출하고 평균 값을 클립보드에 복사합니다.
7. 트웰라이트 시스템, PET/CT 및 웰 카운터의 교차 교정 절차
- 트윌라이트-PET/CT 교정
참고: 트위라이트 교정을 위한 제시된 워크플로우는 부분적으로 PMOD의 PSAMPLE 모듈의 참조 설명서에 설명된 절차에 따라 다릅니다.- 주사기를[18F]FDG의 약 100MBq로 채웁니다. 교정된 용량 교정기로 정확한 활동 AF를 측정하고 측정 날짜 및 시간 및 전체 주사기의 부피와 함께 문서화합니다. 기록된 시간은 모든 감쇠 보정이 수행될 참조 시간입니다.
- 비커에 500 mL의 수돗물을 채웁니다. 정확한 부피는 계량 방법에 의해 결정됩니다. 적절하고 보정된 정밀도 척도(최소한 정확도 클래스 II)로 빈 비커의 중량 me를 측정합니다. 비커를 수돗물로 채우고 전체 비커의 중량 mf를 측정합니다.
- 질량과 수돗물의 밀도의 차이를 사용하여 비커의 부피 Vb를 계산합니다(r = 20°C에서 0.998 g/mL):
- [18F]FDG를 충진비커에 주입하고 빈 주사기를 비활성 수돗물로 원래 부피로 리필하고 용량 교정기에서 리필된 주사기의 활성 A E를 측정한다. 비커 내의 용액의 활성 농도 c
b는 약 200 kBq/mL이어야 하는 에 의해 주어진다. - 비커의 용액으로 50mL 원추형 원심분리기 튜브를 채우고(큰 기포를 피하십시오) PET/CT 스캐너의 시야에 중앙에 놓습니다. PET/CT 이미징 실험에 사용된 유형과 동일한 카테터를 채우고 트윌라이트 시스템의 튜브 가이드에 놓습니다. 연동 펌프를 사용하여 비커의 트레이서 용액으로 카테터를 채웁니다.
- 섹션 5에 설명된 바와 같이 시간 활동 곡선의 측정을 시작하고, 적분 시간에 대해 동일한 파라미터를 사용하고, 측정 헤드 내부의 카테터 가이드 없이 실험에서와 같이 리비닝한다. 이 단계를 통해 적절한 백그라운드 보정에 충분한 데이터를 수집할 수 있습니다. 2분 후, 트위라이트 시스템의 데이터 수집을 멈추지 않고, 충전된 튜브와 함께 카테터 가이드를 측정 헤드에 넣고, 약 5분 동안 데이터 수집을 계속한다.
- 감쇠 보정을 위한 표준 CT 수집에 이어 병렬로 50mL 원추형 원심분리튜브의 10분 PET 획득을 시작합니다. 섹션 3에 설명된 동일한 PET 재구성 알고리즘 및 매개 변수를 사용하여 50 mL 원유 원심 분리기 튜브의 정적 PET 이미지를 재구성합니다. 후처리 이미징 도구(예: PVIEW)를 사용하여 50 mL 원엽 원심분리기 튜브의 재구성된 PET 이미지 내부에 약 70%의 볼륨을 포함하는 원통형 VOI를 배치합니다. VOI 내에서 kBq/mL에서 평균 활성 농도 cPET를 추출합니다.
- 혈액 샘플러 소프트웨어로 돌아가서 교정 모드를 사용하여 획득 한 TAC를 부패, 분기 분획 및 배경을 수정하십시오. 핵종, 활동 농도 및 PET 획득 시작 시간에 필요한 모든 정보를 추가합니다. 내부적으로, 소프트웨어는 트윌라이트 시스템(CR twilite)으로 측정된 카운트 레이트레이트(CRtwilite)를추출하고 PET 및 트윌라이트 시스템(CFPET/트위라이트)에대한 교차 교정 계수를 계산합니다.
참고: 분기 분율이 PET 재구성 프로세스에서 수정되는 다른 동위원소 간에 다르기 때문에 동일한 동위원소가 교정 및 PET/CT 실험모두에 사용되는 것이 중요합니다. 이 절차는 시스템의 중요한 구성 요소 (예 : 튜브, 수집 및 재건 매개 변수)가 변경되고 수리 작업 후 품질 관리 측면에서 정기적으로 반복되어야합니다.
- PET/CT 웰 카운터 교정
- 웰 카운터의 교정 계수 CF웰 카운터를 계산하려면 트위라이트 시스템의 교정을 위해 비커에서 생성된 것과 동일한 활성 솔루션을 사용하십시오. 약 6시간을 기다려 부패에 의한 특정 활성의 감소를 허용하여 웰 카운터의 진미 검출기의 죽은 시간 효과를 최소화한다. 증발을 피하기 위해 비커를 뚜껑을 닫습니다.
- 기준 시점까지의 정확한 시차를 계산하고 원래 활성 농도를 보정하여 비커의 용액의 실제 활성 농도 c(t+)를 결정한다. 실험 내에서 측정된 혈액 샘플의 부피와 동일한 파이펫 사전 정의된 부피(V 샘플)(예를 들어, 200 μL),비커로부터 5개의 안전 잠금 튜브로. 180s에 대한 웰 카운터와 다섯 튜브의 각각의 활동을 측정합니다.
참고: 단일 측정에 대한 변동 계수가 1%를 초과하는 경우 측정 시간을 늘려야 합니다. 각 튜브에 대한 분당 카운트[cpm]의 측정 된 개수 속도와 측정 시작 시간을 기록합니다. 감쇠 보정을 수행합니다. - 비커의 감쇄 보정 활성 농도에 의해 웰 카운터의 감각 보정 카운트 율 CR 웰 카운터를 나누어 각 측정에 대한 교정 계수 CF 웰 카운터를 계산합니다. c비커 (t +):
- 평균 교정 계수를 얻기 위해 5개의 교정 계수를 평균화합니다.
b는 약 200 kBq/mL이어야 하는 에 의해 주어진다.
Representative Results
션트 시스템의 설정은 그림2에 표시됩니다. 30분의 시간 동안 3마리의 야생형 쥐에서 수동 혈액 샘플링 데이터와 비교하여 연속 혈액 샘플링 데이터의 대표적인 결과는 도 3A,C에 제시된다. 연속 혈액 샘플링의 시작 부분에서, 초기 피크 (방사능 농도의 최대)는 트레이서 주입 후 5s에서 볼 수 있습니다. 그 후, 혈액의 활동이 급속히 감소하고 약 15 분만에 고원에 도달합니다. 수동 혈액 샘플링 데이터에서 검출된 피크는 작고 고원은 정의하기 쉽지 않다(도3A,C). 이미지 유래 데이터와 연속 혈액 샘플링의 비교는 도 3B,D에 표시됩니다. 이미지 유래 데이터에서, 고원의 피크와 시작점은 명확하게 볼 수 있으며, 그럼에도 불구하고 피크의 최대값은 모든 동물에 대한 연속 혈액 샘플링 데이터에 비해 작다(그림3B,D).
우리의 설정과 연속 혈액 샘플링의 하위 최적의 결과는 그림 3E,F에표시됩니다. 연속 혈액 샘플링의 시작 부분에서, 혈액 응고로 인해 처음 3.5 분 이내에 데이터 수집이 가능하지 않았습니다. 커넥터 오렌지에서 튜브 시스템을 분리하고 헤파린식 식염수로 부동함으로써 튜브 시스템의 흐름을 다시 시작하고 측정을 계속했습니다. 피크는 혈액에서 방사능의 최대를 기록하지 않는 약 4 분에서 볼 수 있습니다 (그림3E,F). 수동 혈액 샘플링(그림3E) 및 이미지 유래 분석(그림3F)은 여전히 가능하고 정확한 결과에 필적할 수 있었다.
그림 3 : 수동 혈액 샘플링에 비해 연속 혈액 샘플링의 대표적인 결과. 수동 혈액 샘플링(왼쪽 열)과 비교하여 연속 혈액 샘플링으로부터 유래된 전형적인 동맥 입력 함수(오른쪽 컬럼)와 비교하여 연속 혈액 샘플링이 도시됩니다. 패널 A-D는 두 개의 상이한 동물에서 프로토콜의 올바른 구현 결과를 보여 준다. 패널 E및 F는 측정의 최적이 아닌 결과를 보여줍니다. 표시된 모든 데이터는 교차 보정 계수및 배경에 대해 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
제시된 결과는 야생형 쥐에 비해 헌팅턴병의 형질전환 동물 모델에서 뉴런 활성에 대한 대규모 프로젝트에서 추출된다. 전부 30개의 형질전환 및 야생형 래트카테터화하고[18F]FDG-PET/CT와 병행하여 수동 및 온라인 혈액 샘플링을 수행하였다. 야생형 쥐의 3개의 AIFs는 프로토콜의 가능한 결과의 범위를 설명하기 위하여 여기에서 도시됩니다. 헌팅턴병의 동물 모델에서 뉴런 활동의 변화에 대한 전체 프로젝트의 결과는 다른 곳에서 발표될 예정이다.
여기에 설명된 방법은 큰 코호트에서 빠르고 정확한 연속 혈액 샘플링을 가능하게 하며 작은 동물의 동적 PET/CT 데이터의 역학 모델링을 위한 틈새 없는 AIF를 제공합니다. 외부 혈액 순환은 동물의 혈액에서 실제 시간 활동을 감지하기 위해 생성됩니다. 따라서 혈액의 손실을 피할 수 있습니다. 외과 적 절차는 Jespersen 등8을 기반으로하며 PET / CT 측정 중에 동맥 혈액 샘플링에 대한 요구를 충족시키기 위해 수정되었습니다. 션트 시스템은 웨버 외 9에의해 검증되었다 . 여기에서 사용되는 설정으로 약 1.1 mL의 외부 혈액 볼륨이 검출기 펌프 시스템을 통해 실행됩니다. 4개월 된 쥐는 총 혈액량이 약 30 mL입니다. 대퇴 정맥 및 동맥의 직경은 약 0.45-0.6 mm10이며 사용되는 카테터를 삽입하기 위해 약간 전분화될 필요가 있습니다.
AIF는 또한 산발적인 수동 혈액 수집을 통해 측정되거나 PET 이미지 자체의 초기 시점으로부터 재구성될 수 있다(이미지 유래). 두 접근법 모두 제시된 데이터와 함께 수행되었고 연속혈액 샘플링과 비교되었다.
수동 혈액 샘플링과 비교하여 온라인 혈액 샘플링으로 눈에 띄는 더 높은 시간 해상도 (여기 : 30 분당 1800 데이터 포인트)가 가능해집니다. 수동 혈액 무승부 (여기 : 30 분 당 5 데이터 포인트)는 이 견본이 동물의 순환으로 다시 펌핑되지 않기 때문에, 작은 동물에 존재하는 혈액 양으로 제한됩니다. 또한 최대 10-15초 간격은 기술적으로 구현 가능하며 운동 모델링을 위한 중요한 정보가 누락됩니다. 이는 또한 제시된 데이터에서 볼 수 있으며, 연속 및 수동 혈액 샘플링의 검출된 최대치의 차이는 명백하다(도3A, C,E). 온라인 혈액 샘플링을 통해 검출된 피크는 오름차순 대류11의 이미지 유래 입력 기능(도3B, D,F)보다높았다. 이미지 파생 입력 기능은 PET 스캐너의 공간 해상도로 제한되어 부분 볼륨 효과12를 발생시키고 재구성된 시간 프레임의 영향을 받습니다.
이 연속 혈액 샘플링 절차의 일반적인 장점은 트레이서가 카테터를 통해 적용 될 수 있다는 것입니다, 이는 측면 꼬리 정맥을 통해 주입보다 교란하는 경향이있다. 추적자가 튜브 시스템의 시작 부분에 남아 있는 것을 방지하기 위해 트레이서를 적당한 부피에 적용해야 합니다. T-피스의 죽은 부피에 활성이 남아 있지 않도록 하기 위해 나중에 헤파린화된 식염수 로 플러시됩니다. 더욱이, 주입 펌프의 사용은 트레이서 주입의 속도의 조정을 가능하게하고 수동 혈액 샘플링(13)을통해 최대 방사능 피크의 보다 조정 된 획득에 기여할 수 있기 때문에 권장된다.
프로토콜 처리 중에 발생할 수 있는 몇 가지 문제가 있으며 다음 문제 해결을 통해 처리할 수 있습니다. 카테터의 최적이 아닌 위치는 프로토콜의 불완전한 실행으로 이어질 수 있으므로 근위 봉합사로 정확하게 고정되고 카테터가 2-3cm 근위혈관으로 밀려나게 됩니다. 또한, 피브린 접착제를 사용할 수 있습니다. 또한 혈전형성은 카테터를 막을 수 있습니다. 이것은 카테터 또는 튜브 시스템의 헤파린 농도 및 후속 플러싱을 증가시킴으로써 처리 될 수있다. 카테터의 막힘에 의한 이러한 최적 이하의 결과는 결과에 도시되어, 최대 피크가 누락된다(도3E). 동물 보호 및 웰빙에 관한 또 다른 중요한 점은 체외 혈류의 길이입니다. 따라서 튜브 시스템의 길이를 최소한으로 줄이는 것이 좋습니다.
혈액 샘플링이 수행될 때, 결과 AIF의 3가지 수정을 고려해야 합니다. 첫째, 플라즈마 보정. 트레이서는 혈장과 혈액 세포, 주로 적혈구 사이의 균형을. 이러한 확산 공정의 속도에 따라 사용 가능한 추적자는 주로 플라즈마에 존재합니다. 일부 추적자에 대 한, 전혈에 플라즈마의 비율을 고려 될 필요가, 더 많은 친유성 것 들 등. 이러한 경우, 플라즈마 활성을 결정해야 한다. [18F]FDG가 사용되는 경우, 혈장 활성을 결정하기 위해 혈액을 원심분리할 필요가 없으며, 혈장과 적혈구 사이의 매우 빠른 평형및[18F]FDG의 가용성은 혈장 전체에서와 유사하다. 둘째, 대사 산물 보정. 많은 추적자는 전혈에서 대사되고 이 대사 산물의 일부는 아직도 방사성으로표지된14입니다. 이 분획은 AIF에서 존재하지만 조직 섭취에 사용할 수 없습니다. 몇몇 추적자를 위해 전혈 또는 혈장에서 결정될 필요가 있고 AIF는 정정될 필요가 있습니다. 셋째, 분산 보정. 분산은 (a) 트레이서 수송으로서 주변 샘플링 부위(지연 보정) 및 (b) 및 AIF 형상의 번짐에 상대적인 조직 내의 트레이서 도착 시간 사이의 체계적인 시간 차이를 포함하여 여러 가지 요인에 의해 발생합니다. 튜브 시스템 내에서 는 1 차 지연(PT 1) 역학에 의해 영향을받습니다. deconvolution에 근거한 몇몇 수정은 주로 Iida 등15에의하여 모형에 근거를 둔 제안되었습니다, 그러나 그들 대부분은 소음에 영향을 받기 쉽습니다. 16. Munk 등에서 소음에 대한 경향이 적고 따라서 소음을 덜 발생시키는보정 방법이 제안되었습니다. 교정 파라미터를 추정하는 데 필요한 측정은 사용되는 튜빙과 트레이서의 모든 조합에 대해 수행되어야 합니다. 분산 보정은 시간 지연 보정17전에 수행해야합니다. 그러나, 주로 빠른 조직 관류 과정은 분산에 의해 영향을 받고 또한,[18F]FDG의 모델링을 위해 분산 보정이절대적으로 필요하지 않다는 것을 18로 나타났다. 따라서 제시된 예에서 AIF의 분산 보정은 적용되지 않았다.
현장 용량 교정기와 정기적인 품질 관리의 적절한 교정은 여기에 제시된 교차 교정 절차유형에 대한 전제 조건입니다. 그러나 동물에게 투여된 활성이 동일한 용량 교정기로 측정되는 경우, 편차가 일정하고 완전한 교차 교정 절차가 수행된 경우 정확도의 편차가 취소됩니다. 핵종 별 교정(예: 다양한 반감기 또는 다른 분기 비율). 인간의 건강 관리 및 연구에 사용되는 PET / CT 시스템을 조화시키기위한 이러한 교정 절차를 사용하여 적어도 5-10 %의 정확도를 달성 할 수19,20.
이 프로토콜의 성공적인 구현에 의해 생성된 교정 및 수정된 AIF를 통해 동물 질병 모델의 특성화, 새로운 치료 옵션 테스트, 새로운 추적기 의 확립 및 전송을 위한 PET/CT 데이터의 정량화 다른 종으로 기존 추적기. 겉보기에, 쥐에서[18]FDG-PET/CT에서 연속 혈액 샘플링은 생체 운동 모델링에서 입력의 계산을 위한 가장 신뢰할 수 있는 정보를 제공한다. 개별 신진 대사, 특히 간 정리를 고려하면 관련 병리학 적 또는 치료 적 효과에 대한 보다 정확한 평가가 가능합니다. 이 실용적인 프로토콜을 통해 전임상 PET/CT 데이터 분석의 높은 효율을 쉽게 구현할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 온라인 혈액 샘플링 시스템의 설립 기간 동안 지원을 위해 동물 주택 및 관리와 마티아스 Wyss에 대한 수잔 레만, 일로아나 클램푸스와 페트라 울프를 감사하게 인정합니다. 작은 동물 PET /CT는 도이치 포르충스게마인샤프트 (INST 2268/6-1 FUGG)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sugery for arteriovenous shunt | |||
| anesthesia station | Groppler | ||
| aneurysm clips | Aesculap | FT190T | 5 mm, closing force 70 g |
| bulldog clamp | Aesculap | 35 mm | |
| dissectiong scissors BC165 | Aesculap | 490-866 | dull, for skin preparation |
| heating mat | |||
| insulin syringe | Braun | 30G | |
| needle holder | medicon | 11.62.18 | micro surgical |
| pliers for aneurysm clips | Aesculap | FT 470T | Yasargil |
| portex fine bore polythene tubing | Smith Medical | 800/100/200 | ID 0.58 mm, OD 0.96 mm; PE50 equivalent tubing |
| surgical microscope with camera | Leica | M50 + MC120 HD | |
| suture filaments 6.0 | 6.0, polypropylene | ||
| suture filaments 3.0 | 3.0, absorbable, braided | ||
| two anatomical forceps | Hammacher Soling | HSC601-11 | micro surgery, 45° |
| vascular or corneal scissors | Geuder | G19605 | micro surgery scissors |
| PET/CT imaging | |||
| dose calibrator ISOMED 2010 | nivia instruments GmbH | for tracer portioning | |
| Inveon PET/CT | Siemens | ||
| tracer (e.g. 18F-FDG) | |||
| manuel bloodsampling | |||
| capillary blood collection EDTA tube | KABE Labortechnik GmbH | GK 150 EDTA 200 µl | |
| test tubes | SARSTEDT | 5 ml, 75 x 12 mm, PS | |
| well counter CAPTUS 700t | Capintec | manuel measurement of blood activity | |
| automatic blood sampling | |||
| BD Venflon TM pro safety shielded IV catheter; 18 G (1.3 mm x 32 mm) | BD | 3932269 | luer connections (to fit in t-connections) |
| bloodsampler twilite two | swisstrace GmbH | ||
| combi stopper | Braun | 4495101 | |
| heparin | 50U/ml for tube flushing before the experiment and aspiration during catheter surgery | ||
| hypodermic needle | G23 x 1 1/4" / 0.6 x 30 mm | ||
| microprocessor controlled tubing pump | Ismatec/Cole-Parmer | ISM596 | 12 rollers, 2 channels |
| PSAMPLE modul of PMOD | PMOD | ||
| reduction connectors | Ismatec/Cole-Parmer | ISM569A | from ID 2.5 mm to ID 1.5 mm |
| silicone pump tubes | Ismatec/Cole-Parmer | 070535-17-ND /SC0065N | for roller pump (yellow/blue/yellow ID 1.52 mm, WT 0.84 mm, OD 3.2 mm) |
| silicone pump tubes - adapter tubing | Ismatec/Cole-Parmer | SC 0107 | black/black/black ID 0.76 mm, WT 0.86 mm, OD: 2.48 mm |
| t-piece or t-connections | Ismatec/Cole-Parmer | ISM 693A | ID 2.5 mm |
References
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