Summary
Aqui um protocolo para a amostragem contínua do sangue durante a imagem latente de PET/CT dos ratos para medir a função de entrada arterial (AIF) é descrito. O cateterismo, a calibração e a configuração do sistema e a análise dos dados da radioatividade sanguínea são demonstrados. Os dados gerados fornecem parâmetros de entrada para a modelagem Biocinética subsequente.
Abstract
Para a análise quantitativa e a modelagem Biocinética dos dados de tomografia por emissão de pósitrons/tomografia computadorizada (PET/TC), a determinação da concentração temporal do tempo de atividade sanguínea também conhecida como função de entrada arterial (AIF) é um ponto-chave, especialmente para a caracterização de modelos de doenças animais e a introdução de radiotracers recém-desenvolvidos. O conhecimento da disponibilidade do radiotraçador no sangue ajuda a interpretar dados PET/CT-derivados da atividade tecidual. Para este efeito, a amostragem de sangue online durante a imagem PET/TC é aconselhável para medir o FIA. Em contraste com a amostragem manual de sangue e abordagens derivadas de imagem, a amostragem de sangue on-line contínua tem várias vantagens. Além da perda de sangue minimizada, há uma resolução melhorada e uma precisão superior para a medição da atividade sanguínea. No entanto, a principal desvantagem da amostragem de sangue on-line é a preparação dispendiosa e demorada para cateterizar os vasos femorais do animal. Aqui, nós descrevemos um fluxo de trabalho fácil e completo para o cateterismo e a amostragem contínua do sangue durante a imagem latente animal pequena de PET/CT e comparou-a à amostragem manual do sangue e a uma aproximação imagem-derivada. Usando este fluxo de trabalho altamente padronizado, a determinação do fluorodeoxyglucose ([18F] FDG) AIF é demonstrada. Além disso, este procedimento pode ser aplicado a qualquer radiotraçador em combinação com diferentes modelos animais para criar conhecimentos fundamentais de características cinéticas e modelo do traçador. Isso permite uma avaliação mais precisa do comportamento dos fármacos, tanto para abordagens diagnósticas como terapêuticas na pesquisa pré-clínica de doenças oncológicas, neurodegenerativas e miocárdicas.
Introduction
A tomografia por emissão de pósitrons/tomografia computadorizada (PET/TC) é uma tecnologia de imagem nuclear que possibilita a visualização de processos metabólicos no corpo após a injeção de um ligador radioativamente rotulado, também chamado de traçador. Enquanto o ligante é uma molécula que está envolvida em uma via metabólica ou atinge proteínas de superfície celular, o rótulo radioativo é um radionuclídeos emissores de positrão. Os raios gama são emitidos indiretamente pela deterioração do positrão e permitem a deteção de sua distribuição no organismo com os detectores extracorpórea do animal de estimação. Desta forma, diferentes moléculas celulares podem ser direcionadas: receptores de neurotransmissores e transportadores, processos metabólicos como a glicólise ou proteínas mitocondriais como a proteína de translocador 18 kDa (tspo) para detectar células de glia ativadas.
Na pesquisa pré-clínica, o PET/TC é um método atrativo para estudar processos bioquímicos de forma não invasiva in vivo, possibilitando estudos longitudinais. Os dados de PET/TC apoiam as análises dos mecanismos da doença, a avaliação das características e a farmacocinética de novos fármacos e a validação de ambos, atuais e novos radiofármacos para a pesquisa translacional.
Durante a análise de PET/TC, três Estados traçador podem ser definidos (exemplo do modelo do compartimento de 2 tecidos): primeiro, o traçador flui dentro do sangue após sua aplicação (estado 1; conc.[sangue]). Em segundo lugar, ele entra no tecido através do leito capilar e pode lá livremente mover-se dentro do espaço extracelular ou é vinculado de forma não específica a diversas estruturas celulares ou extracelulares (estado 2; conc.[unspec]). Em terceiro lugar, o traçador pode ser especificamente vinculado (com ou sem aprisionamento metabólico) à sua molécula alvo (estado 3, conc.[spec]). Todos esses processos dinâmicos entre os compartimentos são, em certa medida, bidirecionais e os processos de difusão são descritos por constantes de taxa (K1, K2, K3 e K4). Quando a concentração do Tracer no sangue (isto é, estado 1) for chamada "entrada", a concentração de Tracer unespecificamente e especificamente encadernado (isto é, estado 2 e estado 3) é chamada "output" e pode diretamente ser derivada da imagem do animal de estimação. Esta relação fisiológica pode ser indicada no modelo do compartimento de 2 tecidos (Figura 1).
Figura 1 : O modelo compartimental de dois tecidos. As condições fisiológicas dos três diferentes Estados traçador e os processos dinâmicos entre eles são exibidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
No caso ideal, conc.[spec] é proporcional à concentração de sua molécula alvo. No entanto, a saída da medição PET/CT é a soma de conc.[spec] e conc.[unspec]. Para determinar conc.[spec] na região de interesse, em paralelo, o conc.[unspec] de uma região de referência desprovido da proteína/via de destino é determinado. Usando equações matemáticas apropriadas pode-se agora calcular conc.[spec], mais comumente usando o modelo de compartimento (uma abordagem de modelagem Biocinética). No entanto, em muitos casos, uma região de referência desprovida da proteína alvo não está disponível1,2. Nestes casos, o conc.[sangue] pode ser usado para determinar conc.[spec]. Desde que o conc.[sangue] está variando devido ao afastamento diferente do fígado e do rim, excreção, circulação sanguínea, penetração diferente da barreira do cérebro-sangue e fatores doença-relacionados3, o padrão de ouro atual é medir o conc.[ sangue] em paralelo à varredura Pet/TC por amostragem contínua de sangue. Isto dá a função de entrada arterial (AIF), que é definida como conc.[sangue] ao longo do tempo4. De notar, a realização de amostragem contínua de sangue é considerada tecnicamente altamente desafiadora, especialmente em pequenos animais como ratos ou camundongos5.
Aqui, nós fornecemos um protocolo fácil e prático para amostras contínuas de sangue de ratos através de um shunt arteriovenoso (a-v) entre a veia femoral e artéria. Acoplado a um sistema de bomba de detector disponível comercialmente, somos capazes de gerar um AIF contínuo em tempo real durante a dinâmica [18f] fluorodeoxyglucose ([18f] FDG)-Pet/TC em ratos e comparou-o com abordagens alternativas. A imagem latente de PET/CT foi executada nos ratos do Dawley do Sprague masculino em uma idade de 4 meses com um peso médio de 462 g ± 33 g (média ± desvio padrão) usando um varredor do animal de estimação/CT da multimodalidade.
Uma vez que uma grande variedade de dispositivos é utilizada durante a série de medições (Calibrador de dose, sampler de sangue on-line, PET/CT, e bem contador), um procedimento de controle de qualidade referido como calibração cruzada é necessário para verificar a precisão quantitativa de todos os sistemas e compensar as diferenças. A calibração cruzada no contexto da amostragem de sangue online significa que a taxa de contagem para uma determinada concentração de atividade medida em imagens de PET corrigidas pode ser convertida na concentração medida com o sistema de Twilite para a mesma concentração. Conseqüentemente, um procedimento transversal da calibração entre o animal de estimação/CT, o sistema da amostragem do sangue, e o contador bem foi estabelecido.
Esta metodologia altamente padronizada fornece uma abordagem poderosa para quantificar os processos metabólicos e celulares na pesquisa pré-clínica de pequenos animais e é uma maneira elegante de melhorar a confiabilidade e a reprodutibilidade do FIA. O AIF pode então ser usado para quantificar o traçador especificamente acoplado no tecido em dados pré-clínicos de PET/TC usando modelagem Biocinética.
Protocol
Todos os experimentos e manuseio de animais foram aprovados pelo Comitê Estadual de pesquisa animal de Mecklenburg-Pomerânia Ocidental (LALLF M-V/7221.3-1.1-004/18, aprovação: 03.04.2018). Os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes de chegada.
Nota: os animais foram mantidos em condições padrão (22 ± 2 ° c, 12 h ciclo diurno e noturno) com água e alimentos ad libitum. Todos os equipamentos necessários para a preparação do sistema shunt, o procedimento de operação e as medições reais estão listados na tabela de materiais.
1. preparação e procedimento cirúrgico para cateterismo do animal
- Jejue o animal para pelo menos 12 h com acesso livre à água. Para anestesia, coloque o rato numa câmara de indução e encha-o continuamente com mistura de oxigénio/isoflurano. Para o uso da iniciação 2.5-3.5% isoflurano e para a manutenção 1.5-3.0% (taxa de fluxo de 1.2-1.5 L/min).
Nota: o jejum é necessário para estudos que utilizam o traçador [18F] FDG, mas não para outros traçadores. É recomendável medir os níveis sanguíneos de glicose usando os draws de sangue manual descritos na seção 4 para garantir valores estáveis ou para corrigir em modelagem cinética. - Coloc o rato anestesiado na posição dorsal em uma esteira do aquecimento, o microscópio cirúrgico e adicione a pomada do veterinário em seus olhos. Monitore e mantenha a temperatura corporal do rato continuamente durante o experimento (37 ± 0,5 ° c) com uma sonda retal.
- Tape as pernas do rato para a superfície de trabalho para segurar as pernas em posição. Desinfete o local de funcionamento com um desinfetante mucoso e depile a perna e o virilha (lado de operação) do rato. Termine com uma limpeza final com o desinfetante.
- Faça uma incisão de cerca de 20 mm usando fórceps cirúrgico e tesouras na virilha do rato. Dissecar as camadas finas da pele e expor a veia femoral, artéria e nervo com o micro fórceps. Coloque dois filamentos finos cada veia femoral e artéria.
- Veia e artéria do selo com cada filamento longe do ponto de origem e preensão a tensão com uma braçadeira do buldogue.
Use os filamentos de sutura proximal para tensionamento do vaso usando as braçadeiras de buldogue (sem nó). - Obstrua a veia com uma braçadeira do aneurysm proximal, mas 2-3 milímetros longe do ponto de origem da sutura com a braçadeira do buldogue. Use tesouras corneanas para fazer uma pequena incisão na veia (1/3 do diâmetro) e remover o vazamento de sangue com uma troca de algodão estéril. Dilate a veia com um fórceps maçante e segure-a aberta. Insira o cateter afiado (diâmetro interno [ID]: 0,58 mm, diâmetro externo [OD]: 0,96 mm) na veia e empurre-o na direção proximal, até o clipe do aneurisma.
- Abra o grampo do aneurysm e empurre o cateter mais mais na direção proximal (aproximadamente 2-3 cm), se o cateter é coloc para a direita, o sangue fluirá no cateter. Prenda o cateter com a sutura proximal fazendo dois nós; se necessário, coloque uma sutura adicional à volta da veia e do cateter. Verificar a funcionalidade do cateter por rubor e aspirar com uma seringa de insulina (agulha de 30 G) preenchida com 100 μL de solução salina heparinizada (50 unidades/mL).
- Coloque o cateter na artéria repetindo os passos 1,6 e 1,7.
- Quando ambos os cateteres são colocados corretamente, feche a perna com suturas e transportar o animal para o PET/CT.
Nota: seja o mais cuidadoso possível com os cateteres durante o transporte do animal, caso contrário o deslocamento do cateter pode ocorrer.
2. configuração do sistema shunt
Figura 2 : Esquema da configuração da medição. (A) desenho esquemático da configuração de medição. (B) foto do sistema conectado da derivação com o detector do Twilite, a bomba peristáltica e os tipos diferentes do conector. O tempo-curso da radioatividade no sangue de um rato é detectado quando o animal (1) for escaneado no animal de estimação/CT (2). Conseqüentemente o cateter arterial (a) e venoso (b) é conectado ao sistema da bomba do detetor através das partes do adaptador (laranja do conector, azul do conector e verde do conector). O sangue arterial é então bombeado a partir do cateter arterial através do detector (3) para uma bomba peristáltica (4) e de volta para o corpo através do cateter venoso. Uma válvula de 3 vias (7) é integrada no sistema de tubos para realizar injeção de traçador, empates manuais de sangue e enxaguamento. Uma peça em T (8) é montada para injetar atividade. O detector é conectado com um computador para ver, calibrar e corrigir os dados de sangue contínuos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Cortar 6 partes do tubo de polietileno de furo fino (FBPT) (ID: 0,58 mm, OD: 0,96 mm) com um comprimento de c = 735 mm; e = 100 mm; f = 171 mm, g = 875 mm; h = 90 mm e i = 75 mm (Figura 2). Corte 8 partes dos tubos da bomba do silicone (preto/preto/preto, identificação: 0,76 mm, OD: 2,48 mm) com um comprimento de aproximadamente 20 milímetros.
- Coloque os conectores de redução (de ID 2,5 mm a ID 1,5 mm) em ambas as extremidades do tubo da bomba de silicone d (amarelo/azul/amarelo, id: 1,52 mm, OD: 3,20 mm). Coloque uma parte preparada de 20 mm dos tubos de silicone (preto/preto/preto) na outra extremidade dos conectores de redução utilizados (ver conector azul na Figura 2).
- Coloque a parte preparada c do fbpt no conector azul montado na extremidade do tubo de silicone da bomba d (amarelo/azul/amarelo) e a parte preparada e do fbpt no conector azul montado no outra extremidade. Coloque uma parte preparada de 20 mm dos tubos de silicone (preto/preto/preto) nas extremidades de dois T-Pieces 5 e 6 (ID do conector t do tubo: 1,5 mm; consulte verde do conector na Figura 2).
- Ligue a extremidade livre da parte e do fbpt ao lado esquerdo do conector verde montado (5) e coloque a parte preparada f do fbpt no lado oposto do conector verde (5). Coloque a extremidade livre da parte f do fbpt no lado esquerdo do conector verde montado (6) e coloque a parte preparada g do fbpt no lado oposto do conector verde (6). Adicione a parte preparada h do fbpt à extremidade livre do verde montado do conector (5) e a parte preparada i do fbpt à extremidade livre do verde montado do conector (6).
- Ligue uma rolha combi a uma agulha hipodérmica (G 23 x 1 1/4 ' '/ø 0,60 mm x 30 mm) e adicione-a a uma válvula de três vias. Coloque a válvula de três vias preparada com a agulha na extremidade livre da parte h do fbpt. Ligue uma rolha combi a uma agulha hipodérmica e coloque a agulha na extremidade livre da parte i do fbpt.
Nota: antes de iniciar a amostragem de sangue online, ver secção 5. - Coloque as extremidades livres da parte c e g do fbpt em um copo de 100 mL preenchido com 20 ml de solução salina heparinizada (50 unidades/ml). Comece a bomba peristáltica com uma taxa de fluxo de 1,52 ml/min de modo que o sistema da derivação esteja enchido completamente com a solução salina fisiológica. Mais tarde, defina três braçadeiras de tesoura nas extremidades da parte c e g e no meio da parte i do fbpt.
- Solte as braçadeiras de tesoura da parte c e g do fbpt. Conecte o cateter arterial a à extremidade livre da parte c do fbpt e conecte o cateter venoso b à extremidade livre da parte g do fbpt (veja a laranja do conector na Figura 2).
3. aquisição e reconstrução de imagens
- Coloc o animal na posição cabeça-prone na pálete da cama da canela (70 milímetros). Controle a respiração do rato e mantenha a temperatura de corpo em 37 ± 0,5 ° c usando uma almofada de aquecimento e uma ponta de prova rectal durante todo a aquisição da imagem. Mova a cama da canela para a posição estendida da cama para a injeção (pre-Acquisition) e conecte os cateteres introduzidos ao sistema da derivação.
- Manter o animal anestesia com isoflurano (2,5% isoflurano em oxigénio, caudal 1,2-1,5 L/min) através de um cone nasal.
- Comece a bomba peristáltica com uma taxa de fluxo de 1,52 ml/min para encher o sistema da derivação com o sangue do animal. Mova o leito de transporte para o centro do campo de visão do anel de detecção de PET e inicie o sistema de amostragem de sangue on-line (consulte a seção 5).
- Inicie o fluxo de trabalho PET/CT utilizando parâmetros descritos na secção 3,5 após 60 s e, subsequentemente, injete uma dose de aproximadamente 22 MBq [18F] FDG num volume de cerca de 0,5 ± 0,1 ml por via intravenosa através do T-Piece. Lave o T-Piece com cerca de 150 μL de solução salina heparinizada depois.
- Adquira um animal de estimação dinâmico sobre 60 minutos e uma varredura do CT na extremidade da imagem latente do animal de estimação.
- Para aquisição de emissão de PET, defina 3600 s (60 min) na opção adquirir por hora . Selecione F-18 como isótopo de estudo e use 350 – 650 Kev como nível de energia e 3.438 NS como janela de temporização.
- Para a aquisição do CT, selecione a varredura da atenuação na opção da aquisição . No campo de configurações de projeção, escolha 120 projeção para uma meia rotação total. Para o campo de visão (FOV) e configurações de resolução, selecione baixa como ampliação e 4 x 4 como ligação com 275 mm de comprimento de digitalização axial e 3328 PX como o tamanho do CCD transaxial. No campo configurações de exposição, defina 500 μA para a corrente, 80 kV para tensão e 180 MS para o tempo de exposição.
- Para o histograma de emissão de PET, defina uma série de 20 quadros (6 x 10 s, 8 x 30 s, 5 x 300 s e 1 x 1800 s) como enquadramento dinâmico. Selecione subtrair como atrasos. Escolha no campo avançado das configurações 128 como a largura do tradicional , 3 como a extensão, 79 como a diferença do anel e a correção do tempo inoperante.
- Para a reconstrução PET, use a maximização de expectativa de subconjunto ordenado bidimensional (2D-OSEM) com uma geração, aplique e salve o sinograma Scatter, 4 iteração e Fourier para rebinning como algoritmo de reconstrução. Selecione 128 x 128 como tamanho da matriz e use 1 como zoom de imagem, tudo como quadros e todos como segmentos.
4. procedimento de amostragem manual do sangue
- Realizar amostragem manual de sangue 30 s, 60 s, 90 s, 600 s e 1800 s após o início da aquisição de imagem.
Nota: aumentar o número de sangue manual desenha especialmente dentro do primeiro minuto após a injeção de traçador é altamente recomendável, se possível. Portanto, o volume da amostra de sangue deve ser reduzido para 20-30 μL por amostra6.- Abra a primeira válvula de três vias e colete 100 μL de sangue arterial em um tubo de EDTA de coleta de sangue capilar 30 s após a injeção de traçador. Repita para os outros pontos temporais. Determine o peso do tubo vazio e do tubo preenchido com sangue.
- Meça a atividade (contagem/unidade de tempo) do sangue inteiro para 180 s em um contador do poço, que seja calibrado mais tarde para obter dados em kBq/mL. Registre a hora de início da medição do contador de poços. Calcule a atividade do sangue inteiro para cada ponto de tempo da amostragem manual do sangue em kBq/mL, aplique a correção da deterioração e transfira os dados em uma curva da atividade do tempo.
5. procedimento da amostragem de sangue online
- Coloque o tubo no detector utilizando a guia do tubo. Inicie o software de amostrador de sangue (por exemplo, PSAMPLE) e abra a interface de aquisição. Assegure-se de que o computador da instalação em linha da amostragem do sangue e do animal de estimação/CT esteja sincronizado tempo.
- Pressione o botão iniciar exatamente 60 s antes que o traçador seja injetado para adquirir dados suficientes para correção de fundo. Salve os dados brutos através do botão salvar no banco de dados PMOD após a medição.
- Para a correção e calibração dos dados de sangue on-line, mude para a interface de correção. Ative a correção de deterioração e selecione 18 F. defina a hora de início da aquisição da imagem e ative o botão médio para executar a correção de fundo. Ative a calibração e digite o fator de calibração previamente determinado (ver secção 7,1).
- Excepto os dados de sangue corrigidos e calibrados usando o botão Save TAC e escolha o arquivo Blood. CRV. Este arquivo pode então ser carregado como a curva de entrada de sangue inteiro na ferramenta de modelagem cinética e a modelagem cinética pode ser realizada. Desacoplar os cateteres do sistema de derivação corporal extra.
- Retire o animal do scanner PET/CT e eutanizar com pentobarbital.
Nota: neste experimento, os animais foram eutanasiados após as medições como cérebros foram utilizados para análises in vitro no delineamento experimental. Com esta configuração, medidas repetidas em estudos longitudinais também são implementáveis7. Use um sistema completamente novo do tubo para o animal seguinte.
6. imagem derivada da função de entrada
- Abra a ferramenta Fuse it no pmod. Carregue a imagem do animal de estimação como a entrada e o CT como a referência. Clique já correspondido.
- Abra a ferramenta VOXEL de interesse (VOI). Posicione o cursor dentro da aorta ascendente na TC. clique em VOI esférico predefinido. Defina um raio de exatamente 0,7 mm. Extraia as informações de atividade de tempo com o botão de estatística VOI e copie os valores de média para a área de transferência.
7. procedimento de calibração cruzada do sistema Twilite, PET/CT e bem contador
- Twilite-PET/CT-calibração
Nota: o fluxo de trabalho apresentado para calibração do Twilite é parcialmente baseado nos procedimentos descritos no manual de referência do módulo PSAMPLE do PMOD.- Encha uma seringa com aproximadamente 100 MBq de [18F] FDG. Meça a atividade exata a F com um calibrador calibrado da dose e documente-o junto com a data e a hora da medida e o volume da seringa cheia. O tempo gravado é o ponto de tempo de referência para todas as correções de deterioração a serem executadas.
- Encha um copo com 500 mL de água da torneira. O volume exato é determinado pelo método de pesagem. Meça o peso me da taça vazia com uma balança de precisão apropriada e calibrada (pelo menos a classe de precisão II). Encha o copo com a água da torneira e meça o peso mf do copo cheio.
- Calcule o volume Vb da Taça utilizando a diferença da massa e a densidade da água da torneira (r = 0,998 g/ml a 20 ° c):
- Injete a FDG [18F] na Taça preenchida e encha a seringa vazia ao seu volume original com água da torneira inativa e meça a atividade a e da seringa reenchida no calibrador de dose. A concentração de atividade cb da solução no copo é dada por
, que deve ser aproximadamente 200 kBq/ml. - Encha um tubo de centrifugação cônico de 50 mL com a solução da taça (Evite grandes bolhas de ar) e coloque-a centralmente no campo de visão do scanner PET/CT. Encha um cateter idêntico ao tipo usado na experimentação da imagem latente de PET/CT e coloc o na guia do tubo do sistema do Twilite. Encha o cateter com a solução traçadora da Taça utilizando a bomba peristáltica.
- Inicie a medição da curva de atividade do tempo conforme descrito na seção 5, usando o mesmo parâmetro para o tempo de integração e rebinning como no experimento, sem um guia de cateter dentro da cabeça de medição. Esta etapa assegura a aquisição de dados suficientes para correção de plano de fundo apropriada. Após 2 min, sem parar a aquisição de dados do sistema Twilite, coloque a guia do cateter com o tubo preenchido na cabeça de medição e continue a aquisição de dados por cerca de 5 min.
- Comece uma aquisição do animal de estimação de 10 minutos do tubo de centrifugador cônico de 50 mL paralelamente seguido por uma aquisição padrão do CT para a correção da atenuação. Reconstruir uma imagem estática PET do tubo de centrífuga cônico 50 mL usando o mesmo algoritmo de reconstrução PET e parâmetros descritos na seção 3. Use uma ferramenta de imagem pós-processamento (por exemplo, PVIEW) e coloque um VOI cilíndrico cobrindo aproximadamente 70% do volume dentro das imagens de PET reconstruídas do tubo de centrífuga cônico 50 mL. Extraia a concentração de atividade média canimal de estimação em kBq/ml dentro do voi.
- Volte para o software de amostrador de sangue e use o modo de calibração para corrigir o TAC adquirido para decomposição, fração ramificando e fundo. Adicione todas as informações necessárias para nuclide, concentração de atividade e a hora de início da aquisição do PET. Internamente, o software extrai a taxa de contagem medida com o sistema Twilite (CRTwilite) e calcula o fator de calibração cruzada para o sistema PET e Twilite (CFPet/Twilite):
Nota: é importante que o mesmo isótopo seja utilizado tanto para a calibração como para experimentos de PET/TC, pois a fração de ramificação varia entre os diferentes isótopos, o que é corrigido no processo de reconstrução do PET. Este procedimento tem de ser repetido regularmente em termos de controlo de qualidade, se forem alterados componentes importantes do sistema (por exemplo, tubos, parâmetros de aquisição e reconstrução) e após trabalhos de reparação.
- PET/CT-poço de calibração do contador
- Para calcular o fator de calibração CFbem-contador do poço, use a mesma solução de atividade que foi produzida na taça para a calibração do sistema Twilite. Aguarde aproximadamente 6 h para permitir a redução da atividade específica por deterioração para minimizar os efeitos do tempo morto do detector de cintilação do contador de poços. Tampa da taça para evitar a evaporação.
- Calcule a diferença de tempo exata ao ponto de tempo de referência e determine a concentração de atividade real cb(t+) da solução do béquer pela deterioração que corrige a concentração original da atividade. Pipetar volumes predefinidos (VSample) que são idênticos ao volume das amostras de sangue medidos dentro dos experimentos (por exemplo, 200 μL), da Taça em cinco tubos de bloqueio seguro. Meça a atividade de cada um dos cinco tubos com o contador de poço para 180 s.
Nota: se o coeficiente de variação para uma única medição for superior a 1%, o tempo de medição deve ser aumentado. Registre a taxa de contagem medida em contagens por minuto [CPM] para cada tubo e a hora de início da medição. Realize uma correção de deterioração. - Calcule o fator de calibração CFbem-contador para cada medida dividindo a taxa de contagem corrigida da deterioração CRpoço-contador do poço contador pela concentração corrigida da atividade da deterioração da Taça cBeaker (t +):
- Média dos cinco fatores de calibração para obtenção do fator de calibração médio.
, que deve ser aproximadamente 200 kBq/ml.
Representative Results
A configuração do sistema shunt é exibida na Figura 2. Os resultados representativos dos dados contínuos da amostragem do sangue comparados aos dados manuais da amostragem do sangue em três ratos do tipo selvagem durante um período de tempo de 30 minutos são apresentados em Figura 3a, C. No início da amostragem contínua de sangue, um pico inicial (máximo de concentração de radioatividade) pode ser observado a 5 s após a injeção do traçador. Depois, a atividade no sangue diminui rapidamente e atinge um planalto em cerca de 15 min. Nos dados de amostragem manual do sangue, o pico detectado é menor e o planalto não é facilmente definido (Figura 3a, C). A comparação da amostragem contínua de sangue aos dados derivados da imagem é apresentada na Figura 3B, D. Nos dados derivados da imagem, o pico e o ponto de partida do planalto são claramente visíveis, no entanto, o máximo do pico é menor em comparação com os dados contínuos de amostragem de sangue para todos os animais (Figura 3B, D).
Um resultado secundário-optimal da amostragem contínua do sangue com nossa instalação é mostrado na Figura 3E, F. No início da amostragem contínua do sangue, nenhuma aquisição de dados dentro dos primeiros 3,5 minutos era possível devido à coagulação de sangue. Ao desconectar o sistema de tubos no conector laranja e flutuante com solução salina heparinizada, o fluxo no sistema de tubos foi reiniciado e a medição continuou. Um pico pode ser observado em cerca de 4 min, o que não registra o máximo de radioatividade no sangue (Figura 3E, F). A amostragem manual do sangue (Figura 3e) eas análises imagem-derivadas (Figura 3F) eram ainda possíveis e comparáveis aos resultados corretos.
Figura 3 : Resultados representativos da amostragem contínua de sangue em comparação com a amostragem manual de sangue. As funções de entrada arterial típicas derivadas da amostragem contínua do sangue comparadas à amostragem manual do sangue (coluna esquerda) e à amostragem contínua do sangue comparadas à aproximação imagem-derivada (coluna direita) são mostradas. Os painéis a-D demonstram os resultados da correta implementação do protocolo em dois animais diferentes. Os painéis e e F ilustram um resultado sub-optimal da medida. Todos os dados mostrados foram corrigidos para o fator de calibração cruzada e o plano de fundo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Os resultados apresentados são extraídos de um projeto de maior escala sobre a atividade neuronal em um modelo animal transgênico da doença de Huntington em comparação com ratos tipo selvagem. Completamente 30 ratos transgênicas e tipo selvagem foram cateterizados e a amostragem manual e em linha do sangue em paralelo a [18F] FDG-PET/CT foi executada. Três aifs de ratos tipo selvagem são mostrados aqui para demonstrar a escala de resultados possíveis do protocolo. Os resultados do projecto completo sobre as alterações da actividade neuronal num modelo animal da doença de Huntington serão publicados noutro local.
O método descrito aqui permite a amostragem contínua rápida e exata do sangue em uma coorte grande e fornece um AIF gapless para a modelagem cinética de dados dinâmicos do animal de estimação/CT em animais pequenos. Uma circulação sanguínea externa é gerada para detectar a atividade de tempo real no sangue dos animais; conseqüentemente uma perda de sangue é evitada. O procedimento cirúrgico é baseado em Jespersen et al.8 e foi modificado para atender às necessidades de amostragem de sangue arterial durante as medições de PET/TC. O sistema shunt foi validado por Weber et al.9. Com a configuração aqui usada, um volume de sangue externo de cerca de 1,1 mL está funcionando através do sistema de bomba de detector. Um rato com idade entre 4 meses tem um volume total de sangue de cerca de 30 mL. O diâmetro da veia femoral e da artéria é de aproximadamente 0,45-0,6 mm10 e precisa ser um pouco encarado para inserir o cateter utilizado.
O AIF pode igualmente ser medido através da coleção manual esporádica do sangue ou ser reconstruído dos pontos do tempo adiantado das imagens do animal de estimação própria (imagem-derivado). Ambas as abordagens foram realizadas com os dados aqui apresentados e comparados com a amostragem contínua de sangue.
Em comparação à amostragem manual do sangue, com amostragem de sangue em linha uma definição temporal mais elevada perceptível (aqui: 1800 pontos de dados por 30 minutos) tornam-se possíveis. O sangue manual extrai (aqui: 5 pontos de dados por 30 minutos) são limitados ao volume de sangue atual no animal pequeno, porque estas amostras não são bombeado de volta na circulação do animal. Além disso, um intervalo máximo de 10-15 s é tecnicamente implementável e informações importantes para a modelagem cinética é perdida. Isso também pode ser observado nos dados apresentados, pois a diferença no máximo detectado de amostragem sanguínea contínua e manual é óbvia (Figura 3a, C, E). Com a amostragem de sangue on-line o pico detectado foi maior do que com a função de entrada de imagem derivada da aorta ascendente11 (Figura 3B, D, F). A função de entrada derivada de imaged é restrita à resolução espacial de scanners PET que resulta em efeitos de volume parcial12 e é afetada pelos períodos de tempo reconstruído.
Uma vantagem geral deste procedimento contínuo da amostragem do sangue é que o Tracer pode ser aplicado através do cateter, que é menos propenso ao distúrbio do que a injeção através da veia de cauda lateral. Tenha em mente que o traçador deve ser aplicado em um volume moderado para evitar que o rastreador fique no início do sistema de tubos. Para assegurar-se de que nenhuma atividade esteja permanecendo no volume inoperante do T-Piece, é lavada com a solução salina heparinizado mais tarde. Além disso, o uso de uma bomba de infusão é aconselhado, pois permite o ajuste da velocidade da injeção do traçador e pode contribuir para a aquisição mais coordenada do pico máximo de radioatividade com amostragem manual de sangue13.
Há algumas dificuldades possíveis que podem ocorrer durante o processamento do protocolo e podem ser tratadas pela seguinte solução de problemas. Uma posição suboptimal dos cateteres pôde conduzir a uma execução incompleta do protocolo, assegura assim que são fixadas exatamente com a sutura proximal e que o cateter está empurrado 2-3 cm proximal na embarcação. Além disso, adesivo de fibrina pode ser usado. Também a formação de trombos pode entupir os cateteres. Isto pode ser segurado aumentando a concentração da heparina e o nivelamento subseqüente dos cateteres ou do sistema do tubo. Tal resultado sub-optimal devido ao entupimento dos cateteres é mostrado nos resultados, o pico máximo é desperdiçada (Figura 3E). Outro ponto crítico sobre a proteção e o bem-estar dos animais é o comprimento do fluxo sanguíneo extracorpóreo. Sugere-se conseqüentemente para reduzir o comprimento do sistema do tubo a um mínimo.
Quando a amostragem sanguínea é efectuada, devem ser tidas em conta três correcções do FIA resultante. Primeiro, correção de plasma. Os Tracers equilibram entre o plasma e as pilhas de sangue, principalmente erythrocytes. Dependendo de quão rápido esses processos de difusão são, o traçador disponível está principalmente presente no plasma. Para alguns traçadores, a proporção de plasma para sangue total precisa ser considerada, como as mais lipofílicas. Nestes casos, a atividade plasmática tem de ser determinada. Se [18f] FDG é usado, não há necessidade de centrifugar o sangue para determinar a atividade plasmática, como ele se equipara muito rápido entre o plasma e glóbulos vermelhos e a disponibilidade de [18f] FDG no plasma é semelhante ao que em todo o sangue. Em segundo lugar, a correção do metabolito. Muitos traçadores são metabolizados no sangue total e alguns destes metabolitos ainda são rotulados radioativamente14. Esta fração está presente no FIA, mas não está disponível para captação de tecidos. Para alguns traçadores os metabolitos precisam de ser determinados no sangue ou no plasma inteiros e o AIF precisa de ser corrigido. Em terceiro lugar, correção de dispersão. A dispersão é causada por vários fatores, incluindo (a) a diferença de tempo sistemática entre os tempos de chegada do traçador no tecido em relação ao local de amostragem periférica (correção de atraso) e (b) e a mancha da forma do FIA, como o transporte de traçador dentro do sistema de tubos é influenciada pela sua cinética de retardo de primeira ordem (PT1). Várias correções baseadas na desvolução têm sido propostas, principalmente com base no modelo de Iida et al.15, mas a maioria deles é suscetível ao ruído. Um método de correção que contorna a desvolução e, portanto, é menos propenso a ruído tem sido proposto por Munk et al.16. As medições necessárias para estimar os parâmetros de correção devem ser realizadas para cada combinação de tubulação e traçador usado. A correção da dispersão deve ser feita antes da correção do retardo de tempo17. No entanto, principalmente processos rápidos de perfusão tecidual são afetados pela dispersão e também tem sido demonstrado, que para a modelagem de [18F] estudos de FDG uma correção de dispersão não é absolutamente necessário18. Portanto, nos exemplos apresentados, a correção da dispersão do FIA não foi aplicada.
Uma calibração adequada do calibrador de dose no local e seu controle de qualidade regular é um pré-requisito para o tipo de procedimentos de calibração cruzada apresentados aqui. No entanto, se a atividade administrada ao animal for medida com o mesmo calibrador de dose, qualquer desvio de precisão será cancelado, desde que o desvio seja constante e o procedimento completo de calibração cruzada tenha sido seguido, incluindo correções específicas do nuclide (por exemplo, para a meia-vida variando ou a relação de ramificação diferente). Utilizando um procedimento de calibração para a harmonização dos sistemas Pet/TC utilizados na assistência e na pesquisa em saúde humana, uma acurácia de pelo menos 5-10% poderia ser alcançada19,20.
Os AIFs calibrados e corrigidos gerados pela implementação bem-sucedida deste protocolo possibilitam a quantificação dos dados de PET/TC para a caracterização de modelos de doenças animais, testes de novas opções de terapia, estabelecimento de novos traçadores e transferência de Traçadores existentes em outra espécie. Aparentemente, a amostragem contínua do sangue em [18] FDG-PET/CT nos ratos fornece a informação a mais de confiança para o cálculo da entrada na modelagem bio-cinética. Ao tomar em consideração o metabolismo individual, especialmente a depuração hepática, é possível uma avaliação mais precisa dos efeitos patológicos ou terapêuticos relevantes. Com este protocolo praticável, uma eficiência mais elevada da análise de dados pré-clínica de PET/CT é facilmente implementável.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem com gratidão Susann Lehmann, Iloana Klamfuß e Petra Wolff para habitação animal e cuidados e Matthias Wyss para apoio durante o estabelecimento do sistema de amostragem de sangue on-line. O animal de estimação/CT pequeno foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (INST 2268/6-1 FUGG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sugery for arteriovenous shunt | |||
| anesthesia station | Groppler | ||
| aneurysm clips | Aesculap | FT190T | 5 mm, closing force 70 g |
| bulldog clamp | Aesculap | 35 mm | |
| dissectiong scissors BC165 | Aesculap | 490-866 | dull, for skin preparation |
| heating mat | |||
| insulin syringe | Braun | 30G | |
| needle holder | medicon | 11.62.18 | micro surgical |
| pliers for aneurysm clips | Aesculap | FT 470T | Yasargil |
| portex fine bore polythene tubing | Smith Medical | 800/100/200 | ID 0.58 mm, OD 0.96 mm; PE50 equivalent tubing |
| surgical microscope with camera | Leica | M50 + MC120 HD | |
| suture filaments 6.0 | 6.0, polypropylene | ||
| suture filaments 3.0 | 3.0, absorbable, braided | ||
| two anatomical forceps | Hammacher Soling | HSC601-11 | micro surgery, 45° |
| vascular or corneal scissors | Geuder | G19605 | micro surgery scissors |
| PET/CT imaging | |||
| dose calibrator ISOMED 2010 | nivia instruments GmbH | for tracer portioning | |
| Inveon PET/CT | Siemens | ||
| tracer (e.g. 18F-FDG) | |||
| manuel bloodsampling | |||
| capillary blood collection EDTA tube | KABE Labortechnik GmbH | GK 150 EDTA 200 µl | |
| test tubes | SARSTEDT | 5 ml, 75 x 12 mm, PS | |
| well counter CAPTUS 700t | Capintec | manuel measurement of blood activity | |
| automatic blood sampling | |||
| BD Venflon TM pro safety shielded IV catheter; 18 G (1.3 mm x 32 mm) | BD | 3932269 | luer connections (to fit in t-connections) |
| bloodsampler twilite two | swisstrace GmbH | ||
| combi stopper | Braun | 4495101 | |
| heparin | 50U/ml for tube flushing before the experiment and aspiration during catheter surgery | ||
| hypodermic needle | G23 x 1 1/4" / 0.6 x 30 mm | ||
| microprocessor controlled tubing pump | Ismatec/Cole-Parmer | ISM596 | 12 rollers, 2 channels |
| PSAMPLE modul of PMOD | PMOD | ||
| reduction connectors | Ismatec/Cole-Parmer | ISM569A | from ID 2.5 mm to ID 1.5 mm |
| silicone pump tubes | Ismatec/Cole-Parmer | 070535-17-ND /SC0065N | for roller pump (yellow/blue/yellow ID 1.52 mm, WT 0.84 mm, OD 3.2 mm) |
| silicone pump tubes - adapter tubing | Ismatec/Cole-Parmer | SC 0107 | black/black/black ID 0.76 mm, WT 0.86 mm, OD: 2.48 mm |
| t-piece or t-connections | Ismatec/Cole-Parmer | ISM 693A | ID 2.5 mm |
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