Summary
Hier wordt een protocol voor continue bloed bemonstering tijdens PET/CT-beeldvorming van ratten beschreven om de arteriële invoer functie (AIF) te meten. De catheterisatie, de kalibratie en opzet van het systeem en de gegevensanalyse van de bloed radioactiviteit worden aangetoond. De gegenereerde gegevens bieden invoerparameters voor daaropvolgende bio-kinetische modellering.
Abstract
Voor kwantitatieve analyse en bio-kinetische modellering van positron emissie tomografie/computertomografie (PET/CT) gegevens, is de bepaling van de temporele bloed tijd-activiteit concentratie ook bekend als arteriële input functie (AIF) een belangrijk punt, vooral voor de karakterisering van dierziekte modellen en de introductie van nieuw ontwikkelde radiotracers. De kennis van de beschikbaarheid van radio Tracer in het bloed helpt bij het interpreteren van PET/CT-afgeleide gegevens van weefsel activiteit. Voor dit doel is online bloed bemonstering tijdens de PET/CT-beeldvorming raadzaam om de ABI te meten. In tegenstelling tot handmatige bloedafname en beeld-afgeleide benaderingen, continue online bloed bemonstering heeft verschillende voordelen. Naast het geminimaliseerde bloedverlies is er een verbeterde resolutie en een superieure nauwkeurigheid voor de meting van de bloed activiteit. Het grote nadeel van online bloedafname is echter de kostbare en tijdrovende voorbereiding om de femorale vaten van het dier te CATHETERISEREN. Hier beschrijven we een eenvoudige en complete workflow voor katheterisatie en continue bloed bemonstering tijdens kleine dierlijke PET/CT-beeldvorming en vergeleken deze met handmatige bloed bemonstering en een beeld-afgeleide aanpak. Met behulp van deze zeer gestandaardiseerde workflow wordt de bepaling van de ABI fluorodeoxyglucose ([18F] FDG) aangetoond. Verder kan deze procedure worden toegepast op elke radio Tracer in combinatie met verschillende diermodellen om fundamentele kennis van de Tracer kinetische en model kenmerken te creëren. Dit maakt een nauwkeuriger evaluatie mogelijk van het gedrag van farmaceutische producten, zowel voor diagnostische als therapeutische benaderingen in het preklinisch onderzoek van oncologische, neurodegeneratieve en myocardiale ziekten.
Introduction
Positron emissie tomografie/computertomografie (PET/CT) is een nucleaire beeldvormingstechnologie die visualisatie van metabole processen in het lichaam mogelijk maakt na injectie van een radioactief gelabelde ligand, ook wel Tracer genoemd. Terwijl de ligand een molecuul is dat betrokken is bij een metabolische route of gericht is op celoppervlakte eiwitten, is het radioactieve label een positron-uitstralende radionuclide. Gamma stralen worden indirect uitgestoten door het positron verval en laten de detectie van de verdeling in het organisme met Extracorporale PET detectoren toe. Op deze manier, verschillende cellulaire moleculen kunnen worden gericht: neurotransmitter receptoren en vervoerders, metabole processen zoals glycolyse of mitochondriale eiwitten zoals de trans Locator eiwit 18 kDa (TSPO) om geactiveerde glia cellen te detecteren.
In preklinisch onderzoek is PET/CT een aantrekkelijke methode om biochemische processen in vivo op een niet-invasieve manier te bestuderen, waardoor longitudinale studies mogelijk zijn. PET/CT-gegevens ondersteunen de analyses van ziekte mechanismen, de beoordeling van de kenmerken en farmacokinetiek van nieuwe geneesmiddelen en de validering van zowel huidige als nieuwe radiotracers voor translationeel onderzoek.
Tijdens PET/CT analyses kunnen drie Tracer toestanden worden gedefinieerd (voorbeeld van het 2-weefsel compartiment model): ten eerste, de Tracer stroomt binnen het bloed na de toepassing ervan (toestand 1; conc.[bloed]). Ten tweede, het voert het weefsel via het capillaire bed en kan er ofwel vrij bewegen binnen de extracellulaire ruimte of is niet specifiek gebonden aan diverse cellulaire of extracellulaire structuren (staat 2; conc.[unspec]). Ten derde kan de Tracer specifiek (met of zonder metabole overvulling) worden gebonden aan zijn doel molecuul (staat 3, conc.[spec]). Al deze dynamische processen tussen de compartimenten zijn tot op zekere hoogte bidirectioneel en de diffusie processen worden beschreven door de frequentie constanten (K1, K2, K3 en K4). Terwijl de concentratie van de Tracer in het bloed (dat wil zeggen, staat 1) heet "input", de concentratie van onspecifiek en specifiek gebonden Tracer (dat wil zeggen, staat 2 en staat 3) heet "output" en kan direct worden afgeleid van het huisdier afbeelding. Deze fysiologische relatie kan worden weergegeven in het 2-weefsel compartiment model (Figuur 1).
Figuur 1 : Het twee-weefsel compartimentele model. De fysiologische omstandigheden van de drie verschillende Tracer toestanden en de dynamische processen daartussen worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
In het ideale geval is conc.[spec] evenredig aan de concentratie van het beoogde molecuul. De output van de PET/CT-meting is echter de som van conc.[spec] en conc.[unspec]. Om te bepalen conc.[spec] in het gebied van belang, parallel de conc.[unspec] van een referentiegebied verstoken van het doeleiwit/traject wordt bepaald. Door gebruik te maken van de juiste wiskundige vergelijkingen kan men nu conc.[spec] berekenen, meestal met behulp van het compartiment model (een bio-kinetische modellerings benadering). In veel gevallen is een dergelijk referentiegebied zonder het doeleiwit echter niet beschikbaar1,2. In deze gevallen kan de conc.[Blood] worden gebruikt om conc.[spec]te bepalen. Sinds de conc.[bloed] varieert als gevolg van verschillende lever-en nierklaring, uitscheiding, doorbloeding, verschillende hersen-bloed barrière penetratie en ziekte-gerelateerde factoren3, de huidige gouden standaard is het meten van de conc.[ bloed] parallel met de PET/CT-scan door continue bloed bemonstering. Dit geeft de arteriële input functie (AIF), die wordt gedefinieerd als conc.[bloed] na verloop van tijd4. Van nota, het uitvoeren van continue bloedafname wordt beschouwd als technisch zeer uitdagend, vooral bij kleine dieren zoals ratten of muizen5.
Hier bieden we een eenvoudig en praktisch protocol om continu bloed van ratten te proeven via een Arterioveneuze (a-v) shunt tussen de femorale ader en slagader. Gekoppeld aan een in de handel verkrijgbare detector-pompsysteem, zijn we in staat om een real-time, continue Abi te genereren tijdens Dynamic [18f] fluorodeoxyglucose ([18f] FDG)-PET/CT-scans bij ratten en vergeleken met alternatieve benaderingen. PET/CT beeldvorming werd uitgevoerd in mannelijke Sprague Dawley ratten op een leeftijd van 4 maanden met een gemiddeld gewicht van 462 g ± 33 g (gemiddelde ± standaarddeviatie) met behulp van een multimodaliteit PET/CT scanner.
Aangezien een breed scala aan apparaten wordt gebruikt tijdens de reeks metingen (dosis kalibrator, online bloed sampler, PET/CT en goed teller), is een kwaliteitscontroleprocedure bedoeld als kruis kalibratie nodig om de kwantitatieve nauwkeurigheid van alle systemen te controleren en compenseren voor verschillen. Kruis kalibratie in de context van online bloed bemonstering betekent dat het teltarief voor een bepaalde activiteitsconcentratie gemeten in gecorrigeerde PET-beelden kan worden omgezet in de concentratie gemeten met het twilite-systeem voor dezelfde concentratie. Daarom is een cross kalibratieprocedure tussen PET/CT, bloedbemonsterings systeem en goed teller vastgesteld.
Deze zeer gestandaardiseerde methodologie biedt een krachtige benadering voor het kwantificeren van metabole en cellulaire processen in preklinisch klein dierlijk onderzoek en is een elegante manier om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de ABI te verbeteren. De ABI kan vervolgens worden gebruikt om de specifiek afhankelijke Tracer in weefsel in preklinische PET/CT-gegevens te kwantificeren met behulp van bio-kinetische modellering.
Protocol
Alle dier hantering en experimenten werden goedgekeurd door de staats Dierenonderzoekscommissie van Mecklenburg-Vorpommern (LALLF M-V/7221.3-1.1-004/18, goedkeuring: 03.04.2018). De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor het aankomen.
Opmerking: dieren werden onder normale omstandigheden gehouden (22 ± 2 °C, 12 uur dag-en-nacht cyclus) met water en voedsel ad libitum. Alle benodigde apparatuur voor de bereiding van het shunt systeem, de bedieningsprocedure en de werkelijke metingen worden vermeld in de Inhoudsopgave.
1. voorbereiding en chirurgische procedure voor katheterisatie van het dier
- Snel het dier voor ten minste 12 uur met vrije toegang tot water. Voor anesthesie, plaats de rat in een inductie kamer en vul het continu met zuurstof/isoflurane mix. Voor initiatie gebruik 2.5-3.5% Isofluraan en voor onderhoud 1.5-3.0% (debiet van 1,2-1.5 L/min).
Let op: vasten is noodzakelijk voor studies met de Tracer [18F] FDG maar niet voor andere tracers. Het meten van glucose bloedspiegels met behulp van handmatige bloed trekkingen beschreven in rubriek 4 wordt aanbevolen om stabiele waarden te garanderen of om te corrigeren voor in kinetische modellering. - Plaats de verdoofd rat in rugligging op een verwarmingsmatje, onder de chirurgische Microscoop en voeg vet zalf toe op zijn ogen. Bewaak en onderhoud de lichaamstemperatuur van de rat continu tijdens het experiment (37 ± 0,5 °C) met een rectale sonde.
- Plak de benen van de rat op het werkoppervlak om de benen in positie te houden. Desinfecteer de operatieplaats met een mucosale ontsmettingsmiddel en Scheer het been en kruis (operatie zijde) van de rat. Eindig met een laatste reiniging met het ontsmettingsmiddel.
- Maak een incisie van ongeveer 20 mm met behulp van chirurgische Tang en schaar bij de lies van de rat. Ontleden de fijne huidlagen en stel de femorale ader, slagader en zenuw met de micro Tang bloot. Plaats twee fijne filamenten onder elke femorale ader en slagader.
- Afdichting ader en slagader met elk distale filament en houd onder spanning met een Bulldog Clamp.
Gebruik de proximale hechtdraden om het vat te spannen met behulp van de Bulldog klemmen (zonder knoop). - Blokkeer de ader met een aneurysma klem proximale, maar 2-3 mm distale van de hecht met de Bulldog Clamp. Gebruik corneale schaar om een kleine incisie in de ader te maken (1/3 van de diameter) en verwijder lekkende bloed met een steriele katoen swap. Laat de ader met een DOF Tang en houd hem open. Steek de geslepen katheter (inwendige diameter [ID]: 0,58 mm, buitendiameter [OD]: 0,96 mm) in de ader en duw deze in proximale richting, tot aan de aneurysma clip.
- Open de aneurysma clip en duw de katheter verder in proximale richting (ongeveer 2-3 cm), als de katheter rechts geplaatst, bloed zal stromen in de katheter. Beveilig de katheter met de proximale hechting door twee knopen te maken; plaats indien nodig een extra hechtdraad rond de ader en de katheter. Controleer de functionaliteit van de katheter doorspoelen en aspireren met een insulinespuit (30 G naald) gevuld met 100 μL gehepariniseerd zoutoplossing (50 eenheden/ml).
- Plaats de katheter in de slagader door de stappen 1,6 en 1,7 te herhalen.
- Wanneer beide katheters correct geplaatst zijn, sluit het been met hechtingen en draag het dier naar het huisdier/CT.
Opmerking: wees zo voorzichtig mogelijk met de katheters tijdens het transport van het dier, anders kan het verschuiven van de katheter optreden.
2. opstelling van het shunt systeem
Figuur 2 : Schema van de meetinstelling. A) Schematische tekening van de meetopstelling. B) foto van het aangesloten shunt-systeem met de twilite detector, peristaltische pomp en verschillende connectortypen. De tijd-verloop van radioactiviteit in bloed van een rat wordt gedetecteerd terwijl het dier (1) wordt gescand in het huisdier/CT (2). Daarom is de arteriële (a) en veneuze (b) katheter aangesloten op de detector pompsysteem via adapter stukken (connector oranje, connector blauw en connector groen). Het arteriële bloed wordt vervolgens van de arteriële katheter door de detector (3) naar een peristaltische pomp (4) en terug in het lichaam via de veneuze katheter gepompt. Een 3-weg ventiel (7) is geïntegreerd in het buis systeem om Tracer injectie, handmatige bloed trekkingen en spoelen uit te voeren. Een T-stuk (8) wordt geassembleerd om activiteit te injecteren. De detector is verbonden met een computer om de continue bloed gegevens te bekijken, te kalibreren en te corrigeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Afgesneden 6 delen van de fijne boring polytheen slang (fbpt) (id: 0,58 mm, od: 0,96 mm) met een lengte van c = 735 mm; e = 100 mm; f = 171 mm, g = 875 mm; h = 90 mm en i = 75 mm (Figuur 2). Afgesneden 8 delen van de siliconen pomp buizen (zwart/zwart/zwart, ID: 0,76 mm, OD: 2,48 mm) met een lengte van ongeveer 20 mm.
- Plaats reductie connectoren (van ID 2,5 mm tot ID 1,5 mm) aan beide uiteinden van de Silicone pompbuis d (geel/blauw/geel, id: 1,52 mm, OD: 3,20 mm). Zet een voorbereid 20 mm deel van de siliconen buizen (zwart/zwart/zwart) aan de andere kant van de gebruikte reductie connectoren (Zie connector blauw in Figuur 2).
- Plaats het bereide deel c van het fbpt in de geassembleerde connector blauw aan de ene kant van de Silicone pompbuis d (geel/blauw/geel) en het bereide deel e van het fbpt in de geassembleerde connector blauw op de andere kant. Zet een voorbereid 20 mm deel van de siliconen buizen (zwart/zwart/zwart) aan de uiteinden van twee T-stukken 5 en 6 (buis t-connector ID: 1,5 mm; Zie connector groen in Figuur 2).
- Sluit het vrije uiteinde van deel e van de fbpt aan de linkerzijde van de gemonteerde connector groen (5) en plaats het voorbereide deel f van het fbpt aan de andere kant van de connector groen (5). Plaats het vrije uiteinde van deel f van het fbpt links van de gemonteerde connector groen (6) en plaats het voorbereide deel g van het fbpt aan de andere kant van de connector groen (6). Voeg het voorbereide deel h van het fbpt toe aan het vrije uiteinde van de gemonteerde connector groen (5) en de voorbereide deel i van het fbpt tot het vrije uiteinde van de gemonteerde connector groen (6).
- Sluit een combi-stopper aan op een hypodermische naald (G 23 x 1 1/4 ' '/ø 0,60 mm x 30 mm) en voeg deze toe aan een drieweg ventiel. Plaats de bereide driewegklep met de naald in het vrije uiteinde van het deel h van het FBPT. Sluit een combi-stopper aan op een hypodermische naald en plaats de naald in het vrije uiteinde van de deel i van het FBPT.
Opmerking: voor aanvang van de online bloedafname, zie rubriek 5. - Zet de vrije uiteinden van deel c en g van het fbpt in een bekerglas van 100 ml gevuld met 20 ml gehepariniseerd zoutoplossing (50 eenheden/ml). Start de peristaltische pomp met een debiet van 1,52 mL/min zodat het shunt systeem volledig gevuld is met de fysiologische zoutoplossing. Zet daarna drie schaar klemmen aan de uiteinden van deel c en g en in het midden van deel i van het fbpt.
- Laat de schaar klemmen los van deel c en g van het fbpt. Sluit de arteriële katheter a aan op het vrije uiteinde van deel c van het fbpt en sluit de veneuze katheter b aan op het vrije uiteinde van deel g van het Fbpt (Zie connector oranje in Figuur 2).
3. beeld verwerving en wederopbouw
- Plaats het dier in hoofd gevoelige positie op de shuttle bed pallet (70 mm). Controle ademhaling van de rat en houd de lichaamstemperatuur bij 37 ± 0,5 °C met behulp van een verwarmingskussen en een rectale sonde tijdens beeld verwerving. Verplaats de shuttle bed naar de verlengde bedpositie voor injectie (pre-acquisitie) en verbind de geplaatste katheters met het shunt systeem.
- Houd het dier onder anesthesie met Isofluraan (2,5% Isofluraan in zuurstof, debiet 1,2-1.5 L/min) via een neuskegel.
- Start de peristaltische pomp met een debiet van 1,52 mL/min om het shunt systeem te vullen met het bloed van het dier. Verplaats de shuttle bed naar het midden van het gezichtsveld van de huisdieren detectie ring en start het online bloedbemonsterings systeem (zie rubriek 5).
- Start de PET/CT-workflow met parameters die worden beschreven in paragraaf 3,5 na 60 s en Injecteer vervolgens een dosis van ongeveer 22 MBq [18F] FDG in een volume van ongeveer 0,5 ± 0,1 ml intraveneus via het T-stuk. Spoel het T-stuk nadien met ongeveer 150 μL gehepariniseerd zoutoplossing.
- Verkrijg een dynamisch huisdier over 60 min en een CT-scan aan het einde van de PET Imaging.
- Voor de aanschaf van PET-emissie, stelt u 3600 s (60 min) in de optie verwerven op tijd in. Selecteer F-18 als studie-isotoop en gebruik 350 – 650 Kev als energieniveau en 3.438 NS als timing venster.
- Voor CT-acquisitie, selecteer verzwakking scan in de acquisitie optie. Kies in het veld projectie-instellingen 120 projectie voor een halve totale rotatie. Voor gezichtsveld (FOV) en resolutie-instellingen, selecteer laag als vergroting en 4 x 4 als binding met 275 mm axiale Scanning lengte en 3328 PX als transaxiale CCD grootte. Stel in het veld belichtingsinstellingen 500 μA in voor stroom, 80 KV voor spanning en 180 MS voor belichtingstijd.
- Voor PET-emissie histogram, stel een reeks van 20 frames (6 x 10 s, 8 x 30 s, 5 x 300 s en 1 x 1800 s) als dynamische framing. Selecteer aftrekken als vertragingen. Kies in het veld geavanceerde instellingen 128 als sinogram breedte, 3 als span, 79 als ring verschil en dode tijdcorrectie.
- Voor huisdieren reconstructie, gebruik tweedimensionale geordende deelverzameling verwachting maximalisatie (2D-OSEM) met een genereren, toepassen en opslaan Scatter sinogram, 4 iteratie en Fourier voor rebinning als reconstructie-algoritme. Selecteer 128 x 128 als matrixgrootte en gebruik 1 als beeld zoom, alle als kaders en alle als segmenten.
4. procedure voorhand matige bloedafname
- Voer handmatige bloed bemonstering uit 30 s, 60 s, 90 s, 600 s en 1800 s na het starten van de Imaging Acquisition.
Opmerking: het verhogen van het aantal handmatige bloed trekkingen vooral binnen de eerste minuut na Tracer injectie wordt sterk aanbevolen indien mogelijk. Daarom moet het volume van het bloedmonster worden verlaagd tot 20-30 μL per monster6.- Open de eerste driewegklep en verzamel 100 μL arteriële bloed in een capillaire bloedafname EDTA Tube 30 s na Tracer injectie. Herhaal dit voor de andere tijdpunten. Bepaal het gewicht van de lege buis en bloed gevulde buis.
- Meet de activiteit (tellingen/tijdseenheid) van het hele bloed voor 180 s in een goed teller, die later cross gekalibreerd is om gegevens te verkrijgen in kBq/mL. Noteer de begintijd van de well Counter meting. Bereken de activiteit van volbloed voor elk tijdpunt van de handmatige bloedafname in kBq/mL, pas verval correctie toe en breng de gegevens over in een tijdactiviteitscurve.
5. procedure van de online bloedafname
- Plaats de buis in de detector met behulp van de buis geleider. Start de bloed sampler-software (bijv. PSAMPLE) en open de acquisitie-interface. Zorg ervoor dat de computer van de online bloed bemonstering Setup en van het huisdier/CT tijd gesynchroniseerd.
- Druk op de startknop exact 60 s voordat de Tracer wordt geïnjecteerd om voldoende gegevens te verkrijgen voor achtergrondcorrectie. Sla de onbewerkte gegevens op via de knop Opslaan in de PMOD-database na de meting.
- Voor correctie en kalibratie van de online bloed gegevens, overschakelen naar de correctie-interface. Schakel de verval correctie in en selecteer 18 F. Definieer de begintijd van het verzamelen van afbeeldingen en schakel de knop gemiddelde in om achtergrondcorrectie uit te voeren. Activeer de kalibratie en type in de eerder vastgestelde kalibratiefactor (zie paragraaf 7,1).
- Sla de gecorrigeerde en gekalibreerde bloed gegevens op met behulp van de knop TAC opslaan en kies het bestand Blood. CRV. Dit bestand kan vervolgens worden geladen als volbloed invoer curve in de Kinetic Modeling tool en kinetische modellering kan worden uitgevoerd. Ontkoppel de katheters van het Extracorporale shunt systeem.
- Maak het dier los van de PET/CT-scanner en euthanaseer met pentobarbital.
Opmerking: in dit experiment werden dieren na de metingen geëerd als hersenen werden gebruikt voor in vitro analyses in het experimentele ontwerp. Bij deze opstelling zijn herhaalde metingen in longitudinale studies ook uitvoerbaar7. Gebruik een volledig nieuw buis systeem voor het volgende dier.
6. afbeelding afgeleide invoer functie
- Open de fuse it tool op pmod. Laad de afbeelding van het huisdier als invoer en de CT als referentie. Klik op al gematcht.
- Open het hulpmiddel Voxel of Interest (VOI). Plaats de cursor binnen de oplopende aorta in de CT. Klik op vooraf gedefinieerde sferische VOI. Definieer een straal van exact 0,7 mm. Pak de informatie over de tijd activiteit uit met de toets VOI-statistiek en kopieer de gemiddelde waarden naar het Klembord.
7. procedure voor cross kalibratie van het twilite systeem, PET/CT en goed teller
- Twilite-PET/CT-kalibratie
Opmerking: de gepresenteerde workflow voor kalibratie van de twilite is deels gebaseerd op de procedures beschreven in de Referentiehandleiding van de PSAMPLE module van PMOD.- Vul een spuit met ongeveer 100 MBq van [18F] FDG. Meet de precieze activiteit aF met een gekalibreerde dosis kalibrator en documenteer deze samen met de datum en tijd van de meting en het volume van de volledige spuit. De vastgelegde tijd is het referentie tijdpunt voor alle verval correcties die moeten worden uitgevoerd.
- Vul een bekerglas met 500 mL kraanwater. Het precieze volume wordt bepaald door de weegmethode. Meet het gewicht me van het lege bekerglas met een toegewezen en gekalibreerde precisie schaal (ten minste nauwkeurigheid klasse II). Vul het bekerglas met het kraanwater en meet het gewicht mf van het volledige bekerglas.
- Bereken het volume Vb van het bekerglas door gebruik te maken van het verschil tussen de massa en de dichtheid van het kraanwater (r = 0,998 g/ml bij 20 °c):
- Injecteer de [18F] FDG in het gevulde bekerglas en vul de lege spuit met het inactieve kraanwater in op het oorspronkelijke volume en meet de activiteit eenE van de voorgevulde spuit in de dosis kalibrator. De activiteitsconcentratie cb van de oplossing in het bekerglas wordt gegeven door
, wat ongeveer 200 kbq/ml moet zijn. - Vul een conische centrifugebuis van 50 mL met de oplossing uit het bekerglas (Vermijd grote luchtbellen) en plaats deze centraal in het gezichtsveld van de PET/CT-scanner. Vul een katheter identiek aan het type dat wordt gebruikt in het PET/CT Imaging experiment en plaats het in de buis geleider van het twilite-systeem. Vul de katheter met de Tracer-oplossing uit het bekerglas met behulp van de peristaltische pomp.
- Start de meting van de tijd activiteit curve zoals beschreven in sectie 5, met behulp van dezelfde parameter voor de integratie tijd en rebinning zoals in het experiment, zonder een katheter gids in de meetkop. Deze stap zorgt voor de aanschaf van voldoende gegevens voor de juiste achtergrondcorrectie. Na 2 min, zonder het stoppen van de gegevensverwerving van het twilite systeem, plaats de katheter gids met de gevulde buis in de meetkop, en voortzetting van de data-acquisitie voor ongeveer 5 min.
- Start een 10 min huisdier overname van de conische centrifugebuis 50 mL parallel gevolgd door een standaard CT-overname voor demping correctie. Reconstrueer een statisch PET-beeld van de conische centrifugebuis van 50 mL met behulp van hetzelfde huisdier reconstructie algoritme en parameters beschreven in rubriek 3. Gebruik een beeldverwerkings hulpmiddel voor nabewerking (bijv. PVIEW) en plaats een cilindrische VOI die ongeveer 70% van het volume in de gereconstrueerde PET-beelden van de conische centrifugebuis van 50 mL beslaat. Extraheer de gemiddelde activiteitsconcentratie cPet in kbq/ml binnen de VOI.
- Ga terug naar de bloed sampler software en gebruik de kalibratiemodus om de verworven TAC voor verval, vertakkings Fractie en achtergrond te corrigeren. Voeg alle nodige informatie toe voor nuclide, activiteitsconcentratie en de begintijd van de aanschaf van het huisdier. Intern, de software haalt de tellings snelheid gemeten met het twilite systeem (CRtwilite) en berekent de cross kalibratiefactor voor Pet en Twilite systeem (CFPet/twilite):
Opmerking: het is belangrijk dat dezelfde isotoop wordt gebruikt voor zowel kalibratie en PET/CT experimenten, als de vertakkings fractie varieert tussen de verschillende isotopen, die is gecorrigeerd voor in het huisdier wederopbouwproces. Deze procedure moet regelmatig worden herhaald in termen van kwaliteitscontrole, als belangrijke onderdelen van het systeem worden gewijzigd (bijv. buizen, acquisitie-en reconstructie parameters) en na reparatiewerkzaamheden.
- HUISDIER/CT-goed teller kalibratie
- Voor het berekenen van de kalibratiefactor CF-goed teller van de goed teller, gebruikt u dezelfde activiteit oplossing die in het bekerglas is geproduceerd voor de kalibratie van het twilite-systeem. Wacht ongeveer 6 uur om reductie van specifieke activiteit door verval toe te staan om dode tijd effecten van de Scintillatie detector van de well Counter te minimaliseren. Deksel het bekerglas om verdamping te voorkomen.
- Bereken het exacte tijdsverschil met het referentie tijdpunt en bepaal de werkelijke activiteitsconcentratie cb(t+) van de oplossing van het bekerglas door verval, waarbij de oorspronkelijke activiteitsconcentratie wordt gecorrigeerd. Voorgedefinieerde pipet volumes (V-monster) die identiek zijn aan het volume van de bloedmonsters gemeten binnen de experimenten (bv. 200 μL), van het bekerglas tot vijf Safe-lock-buizen. Meet de activiteit van elk van de vijf buizen met de put teller voor 180 s.
Opmerking: als de variatiecoëfficiënt voor een enkele meting groter is dan 1%, moet de meet tijd worden verhoogd. Noteer de gemeten telsnelheid in aantallen per minuut [CPM] voor elke buis en de begintijd van de meting. Voer een verval correctie uit. - Bereken de ijkfactor CF-goed teller voor elke meting door de verval gecorrigeerde telsnelheid CR-teller van de put teller te delen door de verval gecorrigeerde activiteitsconcentratie van het bekerglas c beker(t +):
- Gemiddelde van de vijf kalibratie factoren om de gemiddelde kalibratiefactor te verkrijgen.
, wat ongeveer 200 kbq/ml moet zijn.
Representative Results
De installatie van het shunt systeem wordt weergegeven in Figuur 2. Representatieve resultaten van de continue bloedbemonsterings gegevens in vergelijking met handmatige bloedbemonsterings gegevens in drie wild type ratten over een tijdspanne van 30 min worden weergegeven in Figuur 3a, C. Aan het begin van de continue bloedafname, kan een initiële Piek (maximum van de radioactiviteitsconcentratie) worden gezien op 5 s na Tracer injectie. Daarna daalt de activiteit in het bloed snel en bereikt een plateau op ongeveer 15 min. In de handmatige bloedafname gegevens is de gedetecteerde piek kleiner en is het plateau niet gemakkelijk te definiëren (Figuur 3A, C). De vergelijking van de continue bloed bemonstering naar de afbeeldingsgerelateerde gegevens wordt weergegeven in Figuur 3B, D. In de afbeeldingsgerelateerde gegevens zijn de piek en het startpunt van het plateau duidelijk zichtbaar, niettemin is het maximum van de piek kleiner in vergelijking met continue bloedbemonsterings gegevens voor alle dieren (Figuur 3B, D).
Een suboptimaal resultaat van continue bloedafname met onze installatie wordt weergegeven in Figuur 3E, F. Aan het begin van de continue bloedafname was geen data-acquisitie binnen de eerste 3,5 min mogelijk als gevolg van bloedstolling. Door het buis systeem los te koppelen aan de connector Orange en te zweven met een gehepariniseerd zoutoplossing, werd de stroom in het buis systeem opnieuw gestart en werd de meting voortgezet. Een piek kan worden gezien op ongeveer 4 minuten, die niet het maximum van radioactiviteit in het bloed registreert (Figuur 3E, F). Handmatige bloedafname (Figuur 3E) en beeld-afgeleide analyses (Figuur 3F) waren nog steeds mogelijk en vergelijkbaar met de juiste uitkomsten.
Figuur 3 : Representatieve resultaten van continue bloedafname in vergelijking met handmatige bloedafname. Typische arteriële ingangsfuncties afgeleid van continue bloedafname in vergelijking met handmatige bloedafname (linker kolom) en continue bloedafname in vergelijking met de beeld-afgeleide benadering (rechterkolom) worden weergegeven. Deelvensters A-D tonen de resultaten van een correcte uitvoering van het protocol in twee verschillende dieren. De panelen E en F illustreren een suboptimaal resultaat van de meting. Alle getoonde gegevens werden gecorrigeerd voor de cross-Calibration factor en de achtergrond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
De gepresenteerde resultaten worden geëxtraheerd uit een grootschalig project over Neuronale activiteit in een transgene diermodel van de ziekte van Huntington in vergelijking met wild type ratten. Totaal 30 transgene en wild type ratten waren katheterized en handmatige en online bloed bemonstering parallel aan [18F] FDG-PET/CT werd uitgevoerd. Drie Abi's van wild type ratten worden hier getoond om het bereik van mogelijke uitkomsten van het protocol aan te tonen. De resultaten van het volledige project over veranderingen van neuronale activiteit in een diermodel van de ziekte van Huntington zullen elders worden gepubliceerd.
De hier beschreven methode maakt snelle en nauwkeurige continue bloedafname in een grote cohort mogelijk en biedt een gapless ABI voor kinetische modellering van dynamische PET/CT-gegevens in kleine dieren. Er wordt een externe bloedcirculatie gegenereerd om de werkelijke tijd activiteit in het bloed van de dieren te detecteren; Hierdoor wordt een verlies van bloed vermeden. De chirurgische ingreep is gebaseerd op Jespersen et al.8 en werd aangepast om te voldoen aan de behoeften voor arteriële bloed bemonstering tijdens de PET/CT-metingen. Het shunt systeem werd gevalideerd door Weber et al.9. Met de hier gebruikte Setup, een externe bloed volume van ongeveer 1,1 mL loopt door de detector-pompsysteem. Een rat in de leeftijd van 4 maanden heeft een totaal bloed volume van ongeveer 30 mL. De diameter van de dijbeenader en slagader is ongeveer 0.45-0,6 mm10 en moet een beetje gesteven worden om de gebruikte katheter in te voegen.
De ABI kan ook worden gemeten via sporadische handmatige bloedafname of worden gereconstrueerd vanaf vroege tijdpunten van de PET-afbeeldingen zelf (afbeelding-afgeleid). Beide benaderingen werden uitgevoerd met de hier gepresenteerde gegevens en vergeleken met de continue bloedafname.
In vergelijking met handmatige bloedafname, met online bloed bemonstering een merkbare hogere temporele resolutie (hier: 1800 gegevenspunten per 30 min) wordt mogelijk. Handmatige bloed trekkingen (hier: 5 gegevenspunten per 30 min) zijn beperkt tot het bloed volume aanwezig in het kleine dier, omdat deze monsters niet terug in de circulatie van het dier worden gepompt. Bovendien is een maximum interval van 10-15 s technisch uitvoerbaar en wordt belangrijke informatie voor kinetische modellering gemist. Dit kan ook worden gezien in de gepresenteerde gegevens, als een verschil in het gedetecteerde maximum van continue en handmatige bloedafname is duidelijk (Figuur 3a, C, E). Bij online bloed bemonstering was de gedetecteerde piek hoger dan bij de input functie van de afbeelding van de oplopende aorta11 (Figuur 3B, D, F). De imaged input-functie is beperkt tot de ruimtelijke resolutie van PET-scanners, wat resulteert in gedeeltelijke volume-effecten12 en wordt beïnvloed door de gereconstrueerde tijdframes.
Een algemeen voordeel van deze continue bloedbemonsterings procedure is dat de Tracer kan worden aangebracht via de katheter, die minder vatbaar is voor verstoring dan injectie via de laterale staart ader. Houd er rekening mee dat de Tracer in een gematigd volume moet worden aangebracht om te voorkomen dat de Tracer in het begin van het buis systeem blijft. Om ervoor te zorgen dat er geen activiteit overblijft in het dode volume van het T-stuk, wordt het daarna gespoeld met een gehepariniseerde zoutoplossing. Bovendien wordt het gebruik van een infusiepomp geadviseerd omdat hiermee de snelheid van de Tracer injectie kan worden aangepast en kunnen bijdragen tot een meer gecoördineerde verwerving van de maximale radioactiviteitspiek met handmatige bloedafname13.
Er zijn een aantal mogelijke problemen die kunnen optreden tijdens het verwerken van het protocol en kunnen worden afgehandeld door de volgende probleemoplossing. Een suboptimale positie van de katheters kan leiden tot een onvolledige uitvoering van het Protocol, dus zorg ervoor dat ze nauwkeurig zijn bevestigd met de proximale hechting en dat de katheter 2-3 cm proximale in het vat wordt geduwd. Daarnaast kan fibrinelijm worden gebruikt. Ook de vorming van trombi kan de katheters verstoppen. Dit kan worden aangepakt door het verhogen van de heparine concentratie en daaropvolgende Flushing van de katheters of het buis systeem. Een dergelijke suboptimale uitkomst als gevolg van verstopping van de katheters wordt getoond in de resultaten, de maximale piek wordt gemist (Figuur 3E). Een ander kritisch punt met betrekking tot de bescherming van dieren en welzijn is de lengte van de Extracorporale bloedstroom. Daarom wordt voorgesteld om de lengte van het buis systeem tot een minimum te beperken.
Wanneer bloed bemonstering wordt uitgevoerd, moet rekening worden gehouden met drie correcties van de resulterende Abi. Eerste, plasma correctie. Tracers equilibreren tussen plasma en bloedcellen, voornamelijk erytrocyten. Afhankelijk van hoe snel deze diffusie processen zijn, is de beschikbare Tracer voornamelijk aanwezig in plasma. Voor sommige tracers, de verhouding van plasma tot volbloed moet worden overwogen, zoals meer lipofiele degenen. In deze gevallen moet de plasma activiteit worden bepaald. Als [18f] FDG wordt gebruikt, is het niet nodig om het bloed te centrifugeren om de plasma activiteit te bepalen, omdat het zeer snel tussen plasma en rode bloedcellen en de beschikbaarheid van [18f] FDG in plasma is vergelijkbaar met die in het hele bloed. Ten tweede, metaboliet correctie. Veel tracers worden gemetaboliseerd in volbloed en sommige van deze metabolieten zijn nog steeds radioactief gelabeld14. Deze breuk is aanwezig in de ABI, maar is niet beschikbaar voor weefsel opname. Voor sommige tracers moeten metabolieten in volbloed of plasma worden bepaald en moet de ABI worden gecorrigeerd. Ten derde, dispersie correctie. Dispersie wordt veroorzaakt door verschillende factoren, waaronder (a) het systematische tijdsverschil tussen de indicatoraankomst tijden in het weefsel ten opzichte van de perifere bemonsteringsplaats (delay-correctie) en (b) en het uitsmeren van de vorm van de ABI, aangezien het Tracer transport binnen het buis systeem wordt beïnvloed door de eerste orde lag (PT1) kinetiek. Er zijn verschillende correcties op basis van deconvolutie voorgesteld, voornamelijk gebaseerd op het model van iida et al.15, maar de meesten zijn vatbaar voor lawaai. Een correctiemethode die deconvolutie omzeilt en daardoor minder vatbaar is voor lawaai, is voorgesteld door Munk et al.16. De noodzakelijke metingen om de correctie parameters te schatten moeten worden uitgevoerd voor elke combinatie van slang en Tracer gebruikt. Dispersie correctie moet worden uitgevoerd voordat de correctie van de tijdvertraging17. Echter, voornamelijk snelle weefsel perfusie processen worden beïnvloed door dispersie en het is ook aangetoond, dat voor modellering van [18F] FDG studies een dispersie correctie is niet absoluut noodzakelijk18. Daarom is in de gepresenteerde voorbeelden de dispersie correctie van de ABI niet toegepast.
Een juiste kalibratie van de dosis kalibrator op locatie en de regelmatige kwaliteitscontrole is een voorwaarde voor het type cross kalibratieprocedures dat hier wordt gepresenteerd. Als de activiteit die aan het dier wordt toegediend echter met dezelfde dosis kalibrator wordt gemeten, wordt elke afwijking in nauwkeurigheid geannuleerd, op voorwaarde dat de afwijking constant is en de volledige procedure voor cross kalibratie is gevolgd, inclusief nuclide-specifieke correcties (bijvoorbeeld voor wisselende halfwaardetijd of verschillende vertakkings ratio). Met behulp van een dergelijke kalibratieprocedure voor het harmoniseren van PET/CT-systemen die worden gebruikt in de menselijke gezondheidszorg en het onderzoek, kan een nauwkeurigheid van ten minste 5-10% worden bereikt19,20.
De geijkte en gecorrigeerde Abi's die door de succesvolle uitvoering van dit protocol worden gegenereerd, maken het mogelijk PET/CT-gegevens te kwantificeren voor de karakterisering van dierziekte modellen, het testen van nieuwe behandelingsopties, de oprichting van nieuwe tracers en het overdragen van bestaande tracers in een andere soort. Schijnbaar, continue bloedafname in [18] FDG-PET/CT bij ratten levert de meest betrouwbare informatie voor de berekening van de input in bio-kinetische modellering. Door rekening te houden met de individuele stofwisseling, met name de klaring van de lever, is een nauwkeuriger beoordeling van de relevante pathologische of therapeutische effecten mogelijk. Met dit haalbare protocol is een hogere efficiëntie van preklinische PET/CT-gegevensanalyse eenvoudig uitvoerbaar.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen met name Susann Lehmann, Iloana Klamfuß en Petra Wolff voor dieren huis en verzorging en Matthias Wyss voor ondersteuning bij het opzetten van het online bloedbemonsterings systeem. De kleine dieren PET/CT werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (INST 2268/6-1 FUGG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sugery for arteriovenous shunt | |||
| anesthesia station | Groppler | ||
| aneurysm clips | Aesculap | FT190T | 5 mm, closing force 70 g |
| bulldog clamp | Aesculap | 35 mm | |
| dissectiong scissors BC165 | Aesculap | 490-866 | dull, for skin preparation |
| heating mat | |||
| insulin syringe | Braun | 30G | |
| needle holder | medicon | 11.62.18 | micro surgical |
| pliers for aneurysm clips | Aesculap | FT 470T | Yasargil |
| portex fine bore polythene tubing | Smith Medical | 800/100/200 | ID 0.58 mm, OD 0.96 mm; PE50 equivalent tubing |
| surgical microscope with camera | Leica | M50 + MC120 HD | |
| suture filaments 6.0 | 6.0, polypropylene | ||
| suture filaments 3.0 | 3.0, absorbable, braided | ||
| two anatomical forceps | Hammacher Soling | HSC601-11 | micro surgery, 45° |
| vascular or corneal scissors | Geuder | G19605 | micro surgery scissors |
| PET/CT imaging | |||
| dose calibrator ISOMED 2010 | nivia instruments GmbH | for tracer portioning | |
| Inveon PET/CT | Siemens | ||
| tracer (e.g. 18F-FDG) | |||
| manuel bloodsampling | |||
| capillary blood collection EDTA tube | KABE Labortechnik GmbH | GK 150 EDTA 200 µl | |
| test tubes | SARSTEDT | 5 ml, 75 x 12 mm, PS | |
| well counter CAPTUS 700t | Capintec | manuel measurement of blood activity | |
| automatic blood sampling | |||
| BD Venflon TM pro safety shielded IV catheter; 18 G (1.3 mm x 32 mm) | BD | 3932269 | luer connections (to fit in t-connections) |
| bloodsampler twilite two | swisstrace GmbH | ||
| combi stopper | Braun | 4495101 | |
| heparin | 50U/ml for tube flushing before the experiment and aspiration during catheter surgery | ||
| hypodermic needle | G23 x 1 1/4" / 0.6 x 30 mm | ||
| microprocessor controlled tubing pump | Ismatec/Cole-Parmer | ISM596 | 12 rollers, 2 channels |
| PSAMPLE modul of PMOD | PMOD | ||
| reduction connectors | Ismatec/Cole-Parmer | ISM569A | from ID 2.5 mm to ID 1.5 mm |
| silicone pump tubes | Ismatec/Cole-Parmer | 070535-17-ND /SC0065N | for roller pump (yellow/blue/yellow ID 1.52 mm, WT 0.84 mm, OD 3.2 mm) |
| silicone pump tubes - adapter tubing | Ismatec/Cole-Parmer | SC 0107 | black/black/black ID 0.76 mm, WT 0.86 mm, OD: 2.48 mm |
| t-piece or t-connections | Ismatec/Cole-Parmer | ISM 693A | ID 2.5 mm |
References
- Schain, M., et al. Arterial input function derived from pairwise correlations between PET-image voxels. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33 (7), 1058-1065 (2013).
- Schain, M., Zanderigo, F., Mann, J. J., Ogden, R. T. Estimation of the binding potential BPND without a reference region or blood samples for brain PET studies. NeuroImage. 146, 121-131 (2017).
- Bentourkia, M. Determination of the Input Function at the Entry of the Tissue of Interest and Its Impact on PET Kinetic Modeling Parameters. Molecular Imaging and Biology. 17 (6), 748-756 (2015).
- Phelps, M. E. PET. , Springer New York. New York, NY. (2004).
- Laforest, R., et al. Measurement of input functions in rodents: challenges and solutions. Nuclear Medicine and Biology. 32 (7), 679-685 (2005).
- Napieczynska, H., et al. Impact of the Arterial Input Function Recording Method on Kinetic Parameters in Small-Animal PET. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 59 (7), 1159-1164 (2018).
- Sijbesma, J. W. A., et al. Novel Approach to Repeated Arterial Blood Sampling in Small Animal PET: Application in a Test-Retest Study with the Adenosine A1 Receptor Ligand [(11)C]MPDX. Molecular Imaging and Biology: MIB: the Official Publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (5), 715-723 (2016).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), e3496 (2012).
- Weber, B., Burger, C., Biro, P., Buck, A. A femoral arteriovenous shunt facilitates arterial whole blood sampling in animals. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 29 (3), 319-323 (2002).
- Liu, H. -L. Microvascular anastomosis of submillimeter vessels-a training model in rats. Journal of Hand and Microsurgery. 5 (1), 14-17 (2013).
- van der Weerdt, A. P., et al. Image-derived input functions for determination of MRGlu in cardiac (18)F-FDG PET scans. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 42 (18), 1622-1629 (2001).
- Alf, M. F., et al. Quantification of brain glucose metabolism by 18F-FDG PET with real-time arterial and image-derived input function in mice. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 54 (1), 132-138 (2013).
- Eriksson, O., et al. A computerized infusion pump for control of tissue tracer concentration during positron emission tomography in vivo pharmacokinetic/pharmacodynamic measurements. BMC Medical Physics. 8, 2 (2008).
- Burger, C., Buck, A. Tracer kinetic modelling of receptor data with mathematical metabolite correction. European Journal of Nuclear Medicine. 23 (5), 539-545 (1996).
- Iida, H., et al. Error analysis of a quantitative cerebral blood flow measurement using H2(15)O autoradiography and positron emission tomography, with respect to the dispersion of the input function. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 6 (5), 536-545 (1986).
- Munk, O. L., Keiding, S., Bass, L. A method to estimate dispersion in sampling catheters and to calculate dispersion-free blood time-activity curves. Medical Physics. 35 (8), 3471-3481 (2008).
- Meyer, E. Simultaneous correction for tracer arrival delay and dispersion in CBF measurements by the H215O autoradiographic method and dynamic PET. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 30 (6), 1069-1078 (1989).
- Lanz, B., Poitry-Yamate, C., Gruetter, R. Image-derived input function from the vena cava for 18F-FDG PET studies in rats and mice. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 55 (8), 1380-1388 (2014).
- Geworski, L., et al. Multicenter comparison of calibration and cross calibration of PET scanners. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 43 (5), 635-639 (2002).
- Boellaard, R. Standards for PET image acquisition and quantitative data analysis. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 50, Suppl 1 11-20 (2009).
