Summary
Här beskrivs ett protokoll för kontinuerlig blodprovstagning under PET/CT-avbildning av råttor för att mäta den arteriella inmatningsfunktionen (AIF). Kateterisering, kalibrering och inställning av systemet och dataanalys av blod radioaktivitet påvisas. De genererade data ger indataparametrar för efterföljande bio kinetisk modellering.
Abstract
För kvantitativ analys och bio kinetisk modellering av positron emissions tomografi/datortomografi (PET/CT) data, bestämning av temporal blod tid-aktivitetskoncentration även känd som arteriell input funktion (AIF) är en viktig punkt, särskilt för karakterisering av djur sjukdomsmodeller och införandet av nyutvecklade radiotracers. Kunskapen om tillgängligheten av radiotracer i blodet hjälper till att tolka PET/CT-härledda data av vävnads aktivitet. För detta ändamål är blodprovstagning online under PET/CT-avbildning tillrådligt att mäta AIF-fonden. Till skillnad från manuell blodprovstagning och bild-härledda metoder, kontinuerlig online blodprovstagning har flera fördelar. Förutom den minimerade blodförlusten, det finns en förbättrad upplösning och en överlägsen noggrannhet för blod aktivitet mätning. Men den stora nackdelen med online blodprovstagning är den kostsamma och tidskrävande förberedelse för att kateterisera femorala fartyg av djuret. Här, vi beskriver ett enkelt och komplett arbetsflöde för kateterisering och kontinuerlig blodprovstagning under små djur PET/CT Imaging och jämförde den med manuell blodprovstagning och en bild-derived metod. Genom att använda detta mycket standardiserade arbetsflöde demonstreras bestämning av fluordeoxyglukos ([18F] FDG) AIF. Vidare kan detta förfarande tillämpas på alla radiotracer i kombination med olika djurmodeller för att skapa grundläggande kunskaper om tracerkinetiska och modellegenskaper. Detta möjliggör en mer exakt utvärdering av läkemedels beteende, både för diagnostiska och terapeutiska metoder i den prekliniska forskningen av onkologiska, neurodegenerativa och myokardiella sjukdomar.
Introduction
Positron emissions tomografi/datortomografi (PET/CT) är en nukleär bildteknik som möjliggör visualisering av metaboliska processer i kroppen efter injektion av en radioaktiv märkt ligand, även kallad Tracer. Medan ligand är en molekyl som är involverad i en metabolisk väg eller riktar in sig på cellytan proteiner, är den radioaktiva etiketten en positron-Emitting radionuklid. Gamma strålar är indirekt avges av positron förfall och tillåta detektion av dess fördelning i organismen med extrakorporeal PET detektorer. På detta sätt kan olika cellulära molekyler riktas: signalsubstans receptorer och transportörer, metaboliska processer som glykolys eller mitokondriella proteiner som Translocator protein 18 kDa (TSPO) att upptäcka aktiverade glia celler.
I preklinisk forskning är PET/CT en attraktiv metod för att studera biokemiska processer på ett icke-invasiv sätt in vivo, vilket möjliggör longitudinella studier. PET/CT-data stöder analyser av sjukdomsmekanismer, bedömning av nya läkemedels egenskaper och farmakokinetik samt validering av både nuvarande och nya radiotracers för translationell forskning.
Under PET/CT-analyser kan tre spårämnen definieras (exempel på 2-vävnadens fack modell): för det första flödar spårämnet i blodet efter dess applicering (tillstånd 1; conc.[blod]). Andra, det kommer in i vävnaden via kapillär sängen och kan det antingen fritt röra sig inom extracellulära rymden eller är Ospecifikt bunden till olika cellulära eller extracellulära strukturer (stat 2; conc.[unspec]). För det tredje kan spårämne vara specifikt bundet (med eller utan metabolisk svällning) till sin målmolekyl (State 3, conc.[spec]). Alla dessa dynamiska processer mellan avdelningarna är till viss del dubbelriktad och diffusions processerna beskrivs av Hastighetskonstanter (K1, K2, K3 och K4). Medan koncentrationen av spårämne i blodet (dvs tillstånd 1) kallas "input", koncentrationen av ospecifikt och specifikt bunden Tracer (dvs tillstånd 2 och tillstånd 3) kallas "output" och kan direkt härledas från PET bilden. Denna fysiologiska relation kan visas i 2-vävnadens fack modell (figur 1).
Figur 1 : De två-vävnaderna compartmental modell. De fysiologiska förhållandena i de tre olika tracertillstånden och de dynamiska processerna mellan dem visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I det ideala fallet, conc.[spec] är proportionell mot koncentrationen av dess målmolekyl. Resultatet av PET/CT-mätningen är dock summan av conc.[spec] och conc.[unspec]. För att fastställa conc.[spec] i regionen av intresse, parallellt conc.[unspec] av en referens region saknar målprotein/väg bestäms. Genom att använda lämpliga matematiska ekvationer kan man nu beräkna conc.[spec], oftast med hjälp av kupé modellen (en bio-Kinetic modellering strategi). Men i många fall, en sådan referens region saknar målproteinet är inte tillgänglig1,2. I dessa fall kan conc.[Blood] användas för att bestämma conc.[spec]. Eftersom conc.[blod] är varierande på grund av olika lever-och njure clearance, utsöndring, blodflödet, olika hjärna-blod barriär penetration och sjukdomsrelaterade faktorer3, den nuvarande Guldstandarden är att mäta conc.[ blodet] parallellt med PET/datortomografi genom kontinuerlig blodprovstagning. Detta ger den arteriella inmatningsfunktionen (AIF), som definieras som conc.[blod] över tid4. Notera, utför kontinuerlig blodprovstagning anses tekniskt mycket utmanande, särskilt i små djur som råttor eller möss5.
Här, vi ger ett enkelt och praktiskt protokoll för att kontinuerligt prov blod från råttor via en arteriovenös (a-v) shunt mellan lår bens ven och artär. Kopplat till en kommersiellt tillgänglig detektor-pumpsystem, kan vi generera en realtid, kontinuerlig AIF under dynamisk [18f] fluorodeoxyglukos ([18f] FDG)-PET/CT skannar hos råttor och jämförde den med alternativa metoder. PET/CT Imaging utfördes i manliga Sprague Dawley råttor vid en ålder av 4 månader med en genomsnittlig vikt på 462 g ± 33 g (medelvärde ± standardavvikelse) med hjälp av en multimodalitet PET/CT scanner.
Eftersom en mängd olika enheter används under serien av mätningar (dos kalibrator, online Blood sampler, PET/CT, och väl Counter), en kvalitetskontroll procedur som kallas kors kalibrering behövs för att kontrollera den kvantitativa noggrannheten av alla system och att kompensera för olikheter. Kors kalibrering i samband med blodprovstagning på nätet innebär att räkna hastigheten för en given aktivitetskoncentration mätt i korrigerade PET-bilder kan omvandlas till den koncentration som mäts med Twilite-systemet för samma koncentration. Därför har man fastställt ett kors Kalibreringsförfarande mellan PET/CT, blod provs system och väl räknare.
Denna mycket standardiserade metodik ger en kraftfull metod för att kvantifiera metaboliska och cellulära processer i preklinisk smådjur forskning och är ett elegant sätt att förbättra tillförlitligheten och reproducerbarheten av AIF. AIF-fonden kan sedan användas för att kvantifiera den specifikt bundna spårämne i vävnad i prekliniska PET/CT-data med hjälp av bio kinetisk modellering.
Protocol
All djurhantering och alla experiment godkändes av den statliga djur forskningskommittén i Mecklenburg-Vorpommern (LALLF M-V/7221.3-1.1-004/18, godkännande: 03.04.2018). Experimenten utfördes i enlighet med riktlinjerna för ANLÄND.
Anmärkning: djur har hållits under standardbetingelser (22 ± 2 ° c, 12 h dag-och natt cykel) med vatten och mat AD libitum. All nödvändig utrustning för beredning av shuntsystemet, drift förfarandet och de faktiska mätningarna listas i tabellen av material.
1. förberedelse och kirurgiskt ingrepp för kateterisering av djuret
- Snabb djuret i minst 12 timmar med fri tillgång till vatten. För anestesi, placera råtta i en induktions kammare och fylla den kontinuerligt med syre/isofluran mix. Vid initiering Använd 2,5-3,5% isofluran och för underhåll 1,5-3,0% (flödeshastighet på 1,2-1,5 L/min).
Anmärkning: fastan är nödvändig för studier som använder Tracer [18F] FDG men inte för andra spårämnen. Mätning av glukos blodnivåer med hjälp av manuella blod dragningar som beskrivs i avsnitt 4 rekommenderas för att säkerställa stabila värden eller för att korrigera för i kinetisk modellering. - Placera anestetized råtta i rygg position på en Värmematta, under det kirurgiska mikroskopet och tillsätt vet salva på ögonen. Övervaka och bibehålla kroppstemperaturen hos råtta kontinuerligt under experimentet (37 ± 0,5 ° c) med en rektalsond.
- Tejpa benen på råtta till arbetsytan för att hålla benen i läge. Desinficera operationsstället med ett mukosaldesinfektions medel och raka benet och grenen (Operations sidan) av råtta. Avsluta med en slutlig rengöring med desinfektionsmedlet.
- Gör ett snitt på ca 20 mm med hjälp av kirurgiska tång och saxar vid ljuin av råtta. Dissekera de fina hudlagren och exponera lår bens ven, artär och nerv med Micro forceps. Placera två fina glödtrådar under varje lår bens ven och artär.
- Seal ven och artär med varje distala glödtråden och håll under spänning med en Bulldog klämma.
Använd de proximala sutur glödtrådarna för att spänna kärlet med Bulldog klämmor (utan Knut). - Blockera venen med ett aneurysm klämma proximalt, men 2-3 mm distala från suturen med Bulldog klämman. Använd hornhinnan sax för att göra ett litet snitt i venen (1/3 av diametern) och ta bort läckande blod med en steril bomull swap. Vidga venen med en tråkig pinps och hålla den öppen. Sätt den slipade katetern (innerdiameter [ID]: 0,58 mm, yttre diameter [OD]: 0,96 mm) i venen och skjut den i proximala riktning, upp till aneurysmet klippet.
- Öppna aneurysmet klippet och tryck katetern ytterligare i proximala riktning (ca 2-3 cm), om katetern är placerad rätt, blod kommer att flöda in i katetern. Säkra katetern med proximala suturen genom att göra två knop; om det behövs placerar du ytterligare en sutur runt venen och katetern. Kontrollera kateterns funktion genom att spola och aspirera med en insulinspruta (30 G nål) fylld med 100 μL hepariniserad saltlösning (50 enheter/mL).
- Placera katetern i artären genom att upprepa steg 1,6 och 1,7.
- När båda katetrar är korrekt placerade, Stäng benet med suturer och bär djuret till PET/CT.
Anmärkning: var så noggrann som möjligt med katetrar under transporten av djuret, annars kan det uppstå en förskjutning av katetern.
2. inställning av shuntsystemet
Figur 2 : Schema för mätnings inställningen. (A) Schematisk ritning av mät inställningen. (B) foto av det anslutna shuntsystemet med Twilite-detektorn, Peristaltisk pump och olika anslutningstyper. Tiden för radioaktivitet i blodet hos en råtta upptäcks medan djuret (1) skannas i PET/CT (2). Därför är arteriell (a) och venös (b) kateter ansluten till detektor pumpsystemet via adapterdelar (kontakt orange, kontakt blå och kontakt grön). Arteriellt blod pumpas sedan från arteriell kateter genom detektorn (3) till en Peristaltisk pump (4) och tillbaka in i kroppen via den venösa katetern. En 3-vägsventil (7) är integrerad i rörsystemet för att utföra spår injektion, manuell blod dragning och sköljning. Ett T-stycke (8) monteras för att injicera aktivitet. Detektorn är ansluten med en dator för att visa, kalibrera och korrigera den kontinuerliga blod data. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Klipp av 6 delar av Fine Bore polyeten slangar (fbpt) (ID: 0,58 mm, OD: 0,96 mm) med en längd av c = 735 mm; e = 100 mm; f = 171 mm, g = 875 mm; h = 90 mm och i = 75 mm (figur 2). Klipp av 8 delar av silikon pump rören (svart/svart/svart, ID: 0,76 mm, OD: 2,48 mm) med en längd av ca 20 mm.
- Plats reducerings kontakter (från ID 2,5 mm till ID 1,5 mm) på båda ändarna av silikon pump röret d (gul/blå/gul, id: 1,52 mm, OD: 3,20 mm). Sätt en förberedd 20 mm del av silikon rören (svart/svart/svart) i andra änden av de använda reducerings kontakterna (se kontakt blått i figur 2).
- Placera den förberedda delen c av fbpt i den monterade kontakten blått på ena änden av silikon pump röret d (gul/blå/gul) och den förberedda del e av fbpt i den monterade kontakten blå på andra änden. Sätt en beredd 20 mm del av silikon rören (svart/svart/svart) på ändarna av två T-stycken 5 och 6 (rör T-kontakt-ID: 1,5 mm; se kontakt grön i figur 2).
- Anslut den fria änden av del e av fbpt till vänster sida av den monterade kontakten grön (5) och placera den förberedda delen f av fbpt på motsatt sida av kontakten grön (5). Placera den fria änden av del f av fbpt i vänster sida av monterad kontakt grön (6) och placera den förberedda delen g av fbpt på motsatt sida av kontakten grön (6). Tillsätt den förberedda delen h av fbpt till den fria änden av den monterade kopplingen grön (5) och den förberedda delen i av fbpt till den fria änden av den monterade kopplingen grön (6).
- Anslut en kombi propp till en hypodermisk nål (G 23 x 1 1/4 ' '/ø 0,60 mm x 30 mm) och Lägg den i en trevägsventil. Placera den förberedda Trevägsventilen med nålen i den fria änden av del h av fbpt. Anslut en kombi-propp till en Hypodermic nål och placera nålen i den fria änden av del i av fbpt.
Anmärkning: innan du påbörjar blodprovstagning online, se avsnitt 5. - Sätt de fria ändarna av del c och g av fbpt i en 100 ml bägare fylld med 20 ml hepariniserad saltlösning (50 enheter/ml). Starta den peristaltiska pumpen med en flödeshastighet på 1,52 mL/min så att shuntsystemet är helt fyllt med fysiologisk saltlösning. Därefter satte tre saxklämmor i ändarna av del c och g och i mitten av del i av fbpt.
- Lossa saxklämmorna från del c och g i fbpt. Anslut arteriell kateter a till den fria änden av del c av fbpt och Anslut den venösa katetern b till den fria änden av del g av fbpt (se kontakt orange i figur 2).
3. bild anskaffning och-rekonstruktion
- Placera djuret i huvud benäget läge på pallen för pendel sängen (70 mm). Kontrollera andningen av råtta och hålla kroppstemperaturen vid 37 ± 0,5 ° c med hjälp av en värmedyna och en rektal sond under hela bilden förvärvet. Flytta Shuttle sängen till den utökade sängen position för injektion (pre-förvärv) och Anslut de insatta katetrar till shuntsystemet.
- Håll djuret under anestesi med isofluran (2,5% isofluran i syre, flödeshastighet 1,2-1,5 L/min) via en näsa kon.
- Starta den peristaltiska pumpen med en flödeshastighet på 1,52 mL/min för att fylla shuntsystemet med djurets blod. Flytta Shuttle sängen till mitten av synfältet av PET Detection ring och starta online blodprovstagning system (se avsnitt 5).
- Starta PET/CT arbetsflöde med hjälp av parametrar som beskrivs i avsnitt 3,5 efter 60 s och därefter injicera en dos på cirka 22 MBq [18F] FDG i en volym av cirka 0,5 ± 0,1 ml intravenöst via T-stycket. Spola T-stycket med ca 150 μL hepariniserad saltlösning efteråt.
- Skaffa ett dynamiskt husdjur över 60 min och en datortomografi i slutet av PET Imaging.
- För PET emission förvärv, ange 3600 s (60 min) i förvärva av tid alternativet. Välj F-18 som studie isotop och Använd 350 – 650 keV som energinivå och 3 438 ns som timingfönster.
- För CT-förvärv väljer du dämpning Scan i anskaffnings alternativet. I fältet projektionsinställningar väljer du 120 projektion för en halv Total rotation. För synfält (FOV) och upplösning inställningar, Välj låg som förstoring och 4 x 4 som bindning med 275 mm axiell skanning längd och 3328 px som transaxial CCD storlek. I fältet exponeringsinställningar ställer du in 500 μA för ström, 80 kv för spänning och 180 ms för exponeringstid.
- För PET-utsläpp histogram, ställa in en serie av 20 bilder (6 x 10 s, 8 x 30 s, 5 x 300 s och 1 x 1800 s) som dynamisk inramning. Välj subtrahera som fördröjningar. Välj i avancerade inställningar fält 128 som sinogram bredd, 3 som span, 79 som Ring skillnad och död tidskorrigering.
- För husdjur rekonstruktion, använda tvådimensionell beställt delmängd förväntan maximering (2D-OSEM) med en generera, tillämpa och spara scatter sinogram, 4 iteration och Fourier för rebinning som rekonstruktion algoritm. Välj 128 x 128 som matrisstorlek och Använd 1 som bildzoom, alla som ramar och alla som segment.
4. förfarande för manuell blodprovstagning
- Utför manuell blodprovstagning 30 s, 60 s, 90 s, 600 s och 1800 s efter start av avbildnings förvärvet.
Obs: öka antalet manuella blod dragningar särskilt inom den första minuten efter spår injektion rekommenderas starkt om möjligt. Därför måste blod provs volymen reduceras till 20-30 μL per prov6.- Öppna den första Trevägsventilen och samla 100 μL arteriellt blod i ett kapillärblod samling EDTA-röret 30 s efter spår injektion. Upprepa för de andra tids punkterna. Bestäm vikten av det tomma röret och blodfyllda röret.
- Mät aktiviteten (antal/tidsenhet) för hela blodet för 180 s i en väl räknare, som senare är korskalibrerade för att få data i kBq/mL. Registrera starttiden för brunnen räknare mätning. Beräkna aktiviteten av helblod för varje tidspunkt i den manuella blodprovstagningen i kBq/mL, tillämpa sönderfalls korrigering och överföra data i en tids aktivitets kurva.
5. förfarande för blodprovstagning online
- Placera röret i detektorn med hjälp av rör skenan. Starta blod provs programvaran (t. ex. PSAMPLE) och öppna förvärvs gränssnittet. Se till att datorn av online blodprovstagning setup och av PET/CT är tid synkroniseras.
- Tryck på Start-knappen exakt 60 s innan spårämne injiceras för att hämta tillräckligt med data för bakgrundskorrigering. Spara rådata via knappen Spara i PMOD-databasen efter mätningen.
- För korrigering och kalibrering av online-bloddata, växla till korrigerings gränssnittet. Aktivera sönderfalls korrigeringen och välj 18 F. definiera starttiden för bild anskaffningen och aktivera knappen medel för att utföra bakgrundskorrigering. Aktivera kalibreringen och skriv in den tidigare fastställda kalibreringsfaktorn (se avsnitt 7,1).
- Spara den korrigerade och kalibrerade blod data med hjälp av Spara TAC knappen och välj filen Blood. CRV. Den här filen kan sedan läsas in som hela blod inmatnings kurvan i det kinetiska modellerings verktyget och kinetisk modellering kan utföras. Frikoppla katetrar från det extra korneal shuntsystemet.
- Ta bort djuret från PET/CT-skannern och euthanize med pentobarbital.
Anmärkning: i detta experiment var djuren euthanized efter mätningarna som hjärnor användes för in vitro-analyser i experimentell design. Med denna inställning, upprepade mätningar i longitudinella studier är också genomförbar7. Använd ett helt nytt rörsystem för nästa djur.
6. bild härledd inmatningsfunktion
- Öppna fuse IT -verktyget på PMOD. Ladda PET-bilden som indata och CT som referens. Klicka på redan matchade.
- Öppna verktyget Voxel av intresse (VOI). Placera markören i aorta ascendens i CT. Klicka på fördefinierade sfäriska VOI. Definiera en radie på exakt 0,7 mm. extrahera tids aktivitetsinformationen med knappen VOI-statistik och kopiera de genomsnittliga värdena till Urklipp.
7. förfarande för Cross kalibrering av Twilite systemet, PET/CT och väl Counter
- Twilite-PET/CT-kalibrering
Obs: det presenterade arbetsflödet för kalibrering av Twilite baseras delvis på de procedurer som beskrivs i referenshandboken för PSAMPLE-modulen i PMOD.- Fyll en spruta med cirka 100 MBq av [18F] FDG. Mät den exakta aktiviteten aF med en kalibrerad doskalibrator och dokumentera den tillsammans med datum och tid för mätningen och hela sprutans volym. Den inspelade tiden är referenstidpunkten för alla sönderfalls korrigeringar som ska utföras.
- Fyll en bägare med 500 mL kranvatten. Den exakta volymen bestäms av våg metoden. Mät den tomma bägaren vikt me med en disponerad och kalibrerad precisions skala (åtminstone noggrannhetsklass II). Fyll bägaren med kranvattnet och mät vikten mf på hela bägaren.
- Beräkna bägarens volym Vb med hjälp av differensen mellan massan och kranvattnets täthet (r = 0,998 g/ml vid 20 ° c):
- Injicera [18F] FDG i den fyllda bägaren och fyll på den tomma sprutan till dess ursprungliga volym med inaktivt kranvatten och mät aktiviteten AE i den förfyllda sprutan i doskalibratorn. Aktivitetskoncentrationen cb av lösningen i bägaren ges av
, vilket bör vara ungefär 200 kBq/ml. - Fyll ett 50 mL koniskt centrifugeringsrör med lösningen från bägaren (Undvik stora luftbubblor) och placera den centralt inom synfältet för PET/CT-skannern. Fyll en kateter identisk med den typ som används i PET/CT Imaging experiment och placera den i röret guide av Twilite systemet. Fyll katetern med tracerlösningen från bägaren med hjälp av den peristaltiska pumpen.
- Starta mätningen av tids aktivitets kurvan enligt beskrivningen i avsnitt 5, med samma parameter för integrationstiden, och rebinning som i experimentet, utan en kateter guide inuti Mät huvudet. Det här steget säkerställer förvärvet av tillräckligt med data för lämplig bakgrundskorrigering. Efter 2 min, utan att stoppa datainhämtningen av Twilite-systemet, placera kateter ledaren med det fyllda röret i Mät huvudet och fortsätt datainhämtningen i ca 5 min.
- Starta en 10 min PET förvärvet av 50 mL koniskt centrifug röret parallellt följt av en standard CT förvärv för dämpning korrigering. Rekonstruera en statisk PET-bild av 50 mL koniskt centrifugerör med samma PET-rekonstruktion algoritm och parametrar som beskrivs i avsnitt 3. Använd ett verktyg för efter bearbetning av bilder (t. ex. PVIEW) och placera en cylindrisk VOI som täcker cirka 70% av volymen inuti de rekonstruerade PET-bilderna av 50 mL koniskt centrifugerör. Extrahera medelvärdet för aktivitetskoncentrationen cPET i kBq/ml inom voi.
- Gå tillbaka till blod provs programvaran och Använd kalibrerings läget för att korrigera den förvärvade TAC för förfall, förgrening fraktion och bakgrund. Lägg till all nödvändig information för Nuclide, aktivitetskoncentration och starttiden för PET-anskaffningen. Internt, programvaran extraherar räkna hastigheten mätt med Twilite systemet (CRTwilite) och beräknar korset kalibreringsfaktorn för PET och Twilite system (CFPET/Twilite):
Anmärkning: det är viktigt att samma isotop används för både kalibrering och PET/CT experiment, eftersom förgrenings fraktionen varierar mellan de olika isotoperna, som korrigeras i PET-återuppbyggnadsprocessen. Detta förfarande måste upprepas regelbundet när det gäller kvalitetskontroll, om viktiga komponenter i systemet ändras (t. ex. rör, anskaffnings-och återuppbyggnads parametrar) och efter reparationsarbeten.
- PET/CT-brunn räknaren kalibreringen
- För att beräkna kalibreringsfaktorn CFväl räknare av brunnen räknaren, Använd samma aktivitets lösning som har producerats i bägaren för kalibrering av Twilite systemet. Vänta ungefär 6 h för att minska den specifika aktiviteten genom att förfalla för att minimera död tids effekter av scintillationsentitorns av brunnen räknaren. Locket på bägaren för att undvika avdunstning.
- Beräkna den exakta tidsskillnaden till referenstidpunkten och Bestäm den faktiska aktivitetskoncentrationen cb(t+) av bägaren lösning genom sönderfalls korrigering av den ursprungliga aktivitetskoncentrationen. Pipettera fördefinierade volymer (V-prov) som är identiska med den volym av blodprov som mäts i experimenten (t. ex. 200 μl) från bägaren till fem säkra rör. Mät aktiviteten hos var och en av de fem rören med brunnen räknare för 180 s.
Anmärkning: om variationskoefficienten för en enda mätning är större än 1% bör Mät tiden ökas. Registrera den uppmätta räknings hastigheten i antal per minut [CPM] för varje rör och mätningens starttid. Utför en sönderfalls korrigering. - Beräkna räknaren för kalibreringsfaktorn CF för varje mätning genom att dividera räknarens korrigerade räknings frekvens CRwell-Counter av brunnen räkneverk vid den sönderfallet korrigerade aktivitetskoncentrationen av bägaren cbägare (t +):
- De fem kalibreringsfaktorerna för att erhålla den genomsnittliga kalibreringsfaktorn.
, vilket bör vara ungefär 200 kBq/ml.
Representative Results
Inställningen av shuntsystemet visas i figur 2. Representativa resultat av kontinuerlig blodprovstagning jämfört med manuella blod provs data i tre vildtyp råttor under en tidsperiod på 30 min presenteras i figur 3a, C. I början av den kontinuerliga blodprovstagningen kan en initial topp (maximum av radio aktivitetskoncentration) ses vid 5 s efter spår injektion. Efteråt, aktiviteten i blodet avtar snabbt och når en platå på ca 15 min. I den manuella blod provs data är den upptäckta toppen mindre och platån är inte lätt att definiera (figur 3A, C). Jämförelsen av den kontinuerliga blodprovstagningen till de avbildningshärledda uppgifterna visas i figur 3B, D. I de bildhärda uppgifterna är höjden och utgångspunkten för platån tydligt synliga, men maxhöjden är dock mindre jämfört med kontinuerliga blod provs data för alla djur (figur 3B, D).
Ett suboptimal resultat av kontinuerlig blodprovstagning med vår inställning visas i figur 3E, F. I början av den kontinuerliga blodprovstagningen var ingen datainsamling inom den första 3,5 min möjligt på grund av blodproppar. Genom att koppla loss rörsystemet vid kontakt orange och flytande med hepariniserad saltlösning, startades flödet i rörsystemet och mätningen fortsatte. En topp kan ses på ca 4 min, som inte registrerar maximalt av radioaktivitet i blod (figur 3E, F). Manuell blodprovstagning (figur 3E) och bild härledda analyser (figur 3F) var fortfarande möjliga och jämförbara med de korrekta resultaten.
Figur 3 : Representativa resultat av kontinuerlig blodprovstagning jämfört med manuell blodprovstagning. Typiska arteriella inmatningsfunktioner som härrör från kontinuerlig blodprovstagning jämfört med manuell blodprovstagning (vänster kolumn) och kontinuerlig blodprovstagning jämfört med den bild härledda metoden (höger kolumn) visas. Panelerna A-D visar resultaten av korrekt genomförande av protokollet på två olika djur. Panelerna E och F illustrerar ett suboptimal utfall av mätningen. Alla data som visas korrigerades för tvär kalibreringsfaktorn och bakgrunden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
De presenterade resultaten extraheras från ett större projekt om neuronala aktivitet i en transgen djurmodell av Huntingtons sjukdom jämfört med vild typs råttor. Totalt 30 transgena och vildtyp råttor var kateteriserad och manuell och online blodprovstagning parallellt med [18F] FDG-PET/CT utfördes. Tre AIF-fonder av vildtyp råttor visas här för att demonstrera utbudet av möjliga resultat av protokollet. Resultaten av det kompletta projektet om förändringar av neuronala aktivitet i en djurmodell av Huntingtons sjukdom kommer att publiceras på annat håll.
Den här beskrivna metoden möjliggör snabb och noggrann kontinuerlig blodprovstagning i en stor kohort och ger en oavbruten AIF för kinetisk modellering av dynamiska PET/CT-data i små djur. En extern blodcirkulation genereras för att upptäcka faktisk tid aktivitet i blodet hos djuren; Därför undviks en förlust av blod. Det kirurgiska ingreppet är baserat på Jespersen et al.8 och ändrades för att tillgodose behoven av arteriella blodprovstagning under PET/CT mätningar. Shuntsystemet validerades av Weber et al.9. Med här används setup, en extern blodvolym på ca 1,1 mL går genom detektor-pumpsystem. En råtta från 4 månaders ålder har en total blodvolym på ca 30 mL. Diametern på den femorala venen och artären är cirka 0,45-0.6 mm10 och måste vara lite stärkta för att sätta in katetern används.
AIF-fonden kan också mätas via sporadisk manuell blod insamling eller rekonstrueras från tidiga tidpunkter i själva PET-bilderna (bild-derived). Båda tillvägagångssätten utfördes med här presenterade data och jämfört med den kontinuerliga blodprovstagningen.
I jämförelse med manuell blodprovstagning, med online blodprovstagning en märkbar högre temporala upplösning (här: 1800 datapunkter per 30 min) blir möjligt. Manuella blod dragningar (här: 5 datapunkter per 30 min) är begränsade till den blodvolym som finns i det lilla djuret, eftersom dessa prover inte pumpas tillbaka in i cirkulationen av djuret. Dessutom är ett maximalt intervall på 10-15 s tekniskt genomförbar och viktig information för Kinetic modellering missas. Detta kan också ses i de presenterade data, som en skillnad i den upptäckta maximalt av kontinuerlig och manuell blodprovstagning är uppenbar (figur 3a, C, E). Med blodprovstagning på nätet var den upptäckta toppen högre än med den bild härledda inmatningsfunktionen i aorta ascendens11 (figur 3B, D, F). Den avbildade inmatningsfunktionen är begränsad till den rumsliga upplösningen hos PET-skannrar, vilket resulterar i partiella volymeffekter12 och påverkas av de rekonstruerade tidsramarna.
En generell fördel med detta kontinuerliga blod provs förfarande är att spårämne kan appliceras via katetern, vilket är mindre känsligt för störningar än injektion via den laterala svans venen. Tänk på att spårämne ska appliceras i en måttlig volym för att förhindra att spårämne blir kvar i början av rörsystemet. För att säkerställa att ingen aktivitet är kvar i den döda volymen av T-bit, är det spolas med hepariniserad saltlösning efteråt. Dessutom rekommenderas användning av en infusionspump eftersom den möjliggör justering av hastigheten på spår injektionen och kan bidra till ett mer samordnat förvärv av maximal radioaktivitet med manuell blodprovstagning13.
Det finns några möjliga problem som kan uppstå under protokoll bearbetningen och kan hanteras av följande felsökning. En suboptimal position av katetrar kan leda till en ofullständig exekvering av protokollet, därför se till att de är korrekt fixerade med den proximala suturen och att katetern skjuts 2-3 cm proximalt in i kärlet. Dessutom kan fibrin lim användas. Även bildandet av Trombi kan täppa till katetrar. Detta kan hanteras genom att öka heparin koncentrationen och efterföljande spolning av katetrar eller rörsystemet. Ett sådant suboptimala utfall på grund av igensättning av katetrar visas i resultaten, den maximala toppen missas (figur 3E). En annan kritisk punkt om djurskydd och välbefinnande är längden på extrakorporeal blodflödet. Det föreslås därför att minska längden på röret systemet till ett minimum.
När blodprovstagning utförs måste tre korrigeringar av den resulterande AIF-fonden beaktas. Första, plasma korrigering. Tracers jämvikt mellan plasma och blodceller, främst erytrocyter. Beroende på hur snabbt dessa diffusionsprocesser är, är den tillgängliga spårämne huvudsakligen närvarande i plasma. För vissa spårämnen, förhållandet mellan plasma till helblod måste övervägas, såsom mer lipofila sådana. I dessa fall måste plasma aktiviteten bestämmas. Om [18f] FDG används, finns det ingen anledning att Centrifugera blodet för att bestämma plasma aktiviteten, eftersom det jämmer mycket snabbt mellan plasma och röda blodkroppar och tillgången på [18f] FDG i plasma är liknande den i hela blodet. För det andra, metabolit korrigering. Många spårämnen metaboliseras i helblod och några av dessa metaboliter är fortfarande radioaktivt märkta14. Denna fraktion förekommer i AIF-fonden men är inte tillgänglig för vävnadsupptag. För vissa spårämnen måste metaboliter bestämmas i helblod eller plasma och AIF-fonden måste korrigeras. För det tredje, dispersion korrigering. Spridningen orsakas av flera faktorer, bland annat (a) den systematiska tidsskillnaden mellan den spårbara ankomsttiden i vävnaden i förhållande till den perifera provtagningsplatsen (fördröjnings korrigering) och (b) och smeten för AIF-fondens form, eftersom spår transport inom rörsystemet påverkas av dess första order fördröjning (PT1) Kinetics. Flera korrigeringar baserade på deconvolution har föreslagits, huvudsakligen baserade på modellen av Iida et al.15, men de flesta av dem är mottagliga för buller. Munk et al.16har föreslagit en korrektions metod som kringgår avfaltning och därför är mindre utsatt för buller. De nödvändiga mätningarna för att uppskatta korrigerings parametrarna måste utföras för varje kombination av slangar och spårämne som används. Dispersion korrigering bör göras innan tidsfördröjning korrigering17. Men främst snabb vävnad perfusion processer påverkas av dispersion och det har också visats, att för modellering av [18F] FDG studier en dispersion korrigering är inte absolut nödvändigt18. I de presenterade exemplen har därför inte spridnings korrigeringen av AIF-fonden tillämpats.
En ordentlig kalibrering av dos kalibratorn på plats och dess regelbundna kvalitetskontroll är en förutsättning för den typ av tvär kalibrerings procedurer som presenteras här. Om den verksamhet som administreras till djuret mäts med samma doskalibrator kommer dock alla avvikelser i noggrannheten att annulleras, under förutsättning att avvikelsen är konstant och att det fullständiga kors kalibreringsförfarandet har följts, inklusive nuklidspecifika korrigeringar (t. ex. för varierande halveringstid eller olika förgrening ratio). Med hjälp av ett sådant Kalibreringsförfarande för harmonisering av PET/CT-system som används inom hälso-och sjukvård och forskning, kan en noggrannhet på minst 5-10% uppnås19,20.
De kalibrerade och korrigerade AIF-fonderna som genererats genom ett lyckat genomförande av detta protokoll möjliggör kvantifiering av PET/CT-data för karakterisering av djur sjukdomsmodeller, testning av nya behandlingsalternativ, etablering av nya spårämnen och överföring av befintliga spårämnen till en annan art. Till synes, kontinuerlig blodprovstagning i [18] FDG-PET/CT hos råttor ger den mest tillförlitliga informationen för beräkning av indata i bio kinetisk modellering. Genom att ta hänsyn till den individuella metabolismen, särskilt leverclearance, en mer exakt bedömning av de relevanta patologiska eller terapeutiska effekter är möjligt. Med detta genomförbara protokoll är en högre verkningsgrad för prekliniska PET/CT dataanalys lätt genomförbar.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt Susann Lehmann, Iloana Klamfuß och Petra Wolff för djur boende och omsorg och Matthias Wyss för stöd under inrättandet av online blod provs system. Det lilla djuret PET/CT finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (INST 2268/6-1 FUGG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sugery for arteriovenous shunt | |||
| anesthesia station | Groppler | ||
| aneurysm clips | Aesculap | FT190T | 5 mm, closing force 70 g |
| bulldog clamp | Aesculap | 35 mm | |
| dissectiong scissors BC165 | Aesculap | 490-866 | dull, for skin preparation |
| heating mat | |||
| insulin syringe | Braun | 30G | |
| needle holder | medicon | 11.62.18 | micro surgical |
| pliers for aneurysm clips | Aesculap | FT 470T | Yasargil |
| portex fine bore polythene tubing | Smith Medical | 800/100/200 | ID 0.58 mm, OD 0.96 mm; PE50 equivalent tubing |
| surgical microscope with camera | Leica | M50 + MC120 HD | |
| suture filaments 6.0 | 6.0, polypropylene | ||
| suture filaments 3.0 | 3.0, absorbable, braided | ||
| two anatomical forceps | Hammacher Soling | HSC601-11 | micro surgery, 45° |
| vascular or corneal scissors | Geuder | G19605 | micro surgery scissors |
| PET/CT imaging | |||
| dose calibrator ISOMED 2010 | nivia instruments GmbH | for tracer portioning | |
| Inveon PET/CT | Siemens | ||
| tracer (e.g. 18F-FDG) | |||
| manuel bloodsampling | |||
| capillary blood collection EDTA tube | KABE Labortechnik GmbH | GK 150 EDTA 200 µl | |
| test tubes | SARSTEDT | 5 ml, 75 x 12 mm, PS | |
| well counter CAPTUS 700t | Capintec | manuel measurement of blood activity | |
| automatic blood sampling | |||
| BD Venflon TM pro safety shielded IV catheter; 18 G (1.3 mm x 32 mm) | BD | 3932269 | luer connections (to fit in t-connections) |
| bloodsampler twilite two | swisstrace GmbH | ||
| combi stopper | Braun | 4495101 | |
| heparin | 50U/ml for tube flushing before the experiment and aspiration during catheter surgery | ||
| hypodermic needle | G23 x 1 1/4" / 0.6 x 30 mm | ||
| microprocessor controlled tubing pump | Ismatec/Cole-Parmer | ISM596 | 12 rollers, 2 channels |
| PSAMPLE modul of PMOD | PMOD | ||
| reduction connectors | Ismatec/Cole-Parmer | ISM569A | from ID 2.5 mm to ID 1.5 mm |
| silicone pump tubes | Ismatec/Cole-Parmer | 070535-17-ND /SC0065N | for roller pump (yellow/blue/yellow ID 1.52 mm, WT 0.84 mm, OD 3.2 mm) |
| silicone pump tubes - adapter tubing | Ismatec/Cole-Parmer | SC 0107 | black/black/black ID 0.76 mm, WT 0.86 mm, OD: 2.48 mm |
| t-piece or t-connections | Ismatec/Cole-Parmer | ISM 693A | ID 2.5 mm |
References
- Schain, M., et al. Arterial input function derived from pairwise correlations between PET-image voxels. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33 (7), 1058-1065 (2013).
- Schain, M., Zanderigo, F., Mann, J. J., Ogden, R. T. Estimation of the binding potential BPND without a reference region or blood samples for brain PET studies. NeuroImage. 146, 121-131 (2017).
- Bentourkia, M. Determination of the Input Function at the Entry of the Tissue of Interest and Its Impact on PET Kinetic Modeling Parameters. Molecular Imaging and Biology. 17 (6), 748-756 (2015).
- Phelps, M. E. PET. , Springer New York. New York, NY. (2004).
- Laforest, R., et al. Measurement of input functions in rodents: challenges and solutions. Nuclear Medicine and Biology. 32 (7), 679-685 (2005).
- Napieczynska, H., et al. Impact of the Arterial Input Function Recording Method on Kinetic Parameters in Small-Animal PET. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 59 (7), 1159-1164 (2018).
- Sijbesma, J. W. A., et al. Novel Approach to Repeated Arterial Blood Sampling in Small Animal PET: Application in a Test-Retest Study with the Adenosine A1 Receptor Ligand [(11)C]MPDX. Molecular Imaging and Biology: MIB: the Official Publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (5), 715-723 (2016).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), e3496 (2012).
- Weber, B., Burger, C., Biro, P., Buck, A. A femoral arteriovenous shunt facilitates arterial whole blood sampling in animals. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 29 (3), 319-323 (2002).
- Liu, H. -L. Microvascular anastomosis of submillimeter vessels-a training model in rats. Journal of Hand and Microsurgery. 5 (1), 14-17 (2013).
- van der Weerdt, A. P., et al. Image-derived input functions for determination of MRGlu in cardiac (18)F-FDG PET scans. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 42 (18), 1622-1629 (2001).
- Alf, M. F., et al. Quantification of brain glucose metabolism by 18F-FDG PET with real-time arterial and image-derived input function in mice. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 54 (1), 132-138 (2013).
- Eriksson, O., et al. A computerized infusion pump for control of tissue tracer concentration during positron emission tomography in vivo pharmacokinetic/pharmacodynamic measurements. BMC Medical Physics. 8, 2 (2008).
- Burger, C., Buck, A. Tracer kinetic modelling of receptor data with mathematical metabolite correction. European Journal of Nuclear Medicine. 23 (5), 539-545 (1996).
- Iida, H., et al. Error analysis of a quantitative cerebral blood flow measurement using H2(15)O autoradiography and positron emission tomography, with respect to the dispersion of the input function. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 6 (5), 536-545 (1986).
- Munk, O. L., Keiding, S., Bass, L. A method to estimate dispersion in sampling catheters and to calculate dispersion-free blood time-activity curves. Medical Physics. 35 (8), 3471-3481 (2008).
- Meyer, E. Simultaneous correction for tracer arrival delay and dispersion in CBF measurements by the H215O autoradiographic method and dynamic PET. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 30 (6), 1069-1078 (1989).
- Lanz, B., Poitry-Yamate, C., Gruetter, R. Image-derived input function from the vena cava for 18F-FDG PET studies in rats and mice. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 55 (8), 1380-1388 (2014).
- Geworski, L., et al. Multicenter comparison of calibration and cross calibration of PET scanners. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 43 (5), 635-639 (2002).
- Boellaard, R. Standards for PET image acquisition and quantitative data analysis. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 50, Suppl 1 11-20 (2009).
