Summary
Her beskrives en protokol til kontinuerlig blodprøvetagning under PET/CT-scanning af rotter til måling af den arterielle indgangsfunktion (AIF). Kateteriseringen, kalibrering og opsætning af systemet og dataanalyse af blodets radioaktivitet er påvist. De genererede data giver inputparametre for efterfølgende bio-Kinetic modellering.
Abstract
For kvantitativ analyse og bio-kinetisk modellering af Positron emission tomografi/computertomografi (PET/CT) data, bestemmelse af den tidsmæssige blod tid-aktivitet koncentration også kendt som arteriel inputfunktion (AIF) er et centralt punkt, især til karakterisering af dyre sygdomsmodeller og indførelse af nyudviklede radiotracers. Kendskabet til radiotracer tilgængelighed i blodet hjælper med at fortolke PET/CT-afledte data for vævs aktivitet. Til dette formål er det tilrådeligt at måle AIF i forbindelse med blodprøvetagning på internettet under PET/CT-billeddannelse. I modsætning til manuelle blodprøvetagning og image-afledte tilgange, kontinuerlig online blodprøvetagning har flere fordele. Udover den minimerede blodtab, der er en forbedret opløsning og en overlegen nøjagtighed for blod aktivitet måling. Men den største ulempe ved online blodprøvetagning er den dyre og tidskrævende forberedelse til at kateterisere de femorale fartøjer af dyret. Her beskriver vi en nem og komplet arbejdsgang for kateterisering og kontinuerlig blodprøvetagning under små dyr PET/CT Imaging og sammenlignede det med manuel blodprøvetagning og en image-afledte tilgang. Ved hjælp af denne meget standardiserede arbejdsgang påvises bestemmelsen af responserne ([18F] FDG) AIF. Desuden kan denne procedure anvendes på enhver radiotracer i kombination med forskellige dyremodeller for at skabe grundlæggende viden om sporstof kinetiske og model karakteristika. Dette giver mulighed for en mere præcis evaluering af adfærden af lægemidler, både til diagnostiske og terapeutiske tilgange i den prækliniske forskning af onkologiske, neurodegenerative og Myokardie sygdomme.
Introduction
Positron emission tomografi/computertomografi (PET/CT) er en nuklear billedteknologi, der muliggør visualisering af metaboliske processer i kroppen efter injektion af et radioaktivt mærket ligand, også kaldet Tracer. Der henviser til, at ligand er et molekyle, der er involveret i en metabolisk vej eller mål celleoverflade proteiner, det radioaktive mærke er en positron-emitterende radionukleid. Gamma stråler udsendes indirekte af Positron forfald og tillader påvisning af dets fordeling i organismen med ekstrorporeal PET-detektorer. På denne måde kan forskellige cellulære molekyler målrettes: neurotransmitter receptorer og transportører, metaboliske processer som glykolyse eller mitokondrie proteiner som translocator protein 18 kDa (TSPO) at detektere aktiverede glia celler.
I præklinisk forskning er PET/CT en attraktiv metode til at studere biokemiske processer på en ikke-invasiv måde in vivo, hvilket giver mulighed for longitudinale undersøgelser. PET/CT-data understøtter analyser af sygdomsmekanismer, vurdering af nye lægemidler, karakteristika og farmakokinetik samt validering af både nuværende og nye aktive til Translationel forskning.
Under PET/CT-analyser kan der defineres tre Tracer-tilstande (eksempel på modellen med 2-vævs rum): for det første strømmer sporingen i blodet efter påføring (tilstand 1; Konc.[blod]). For det andet, det kommer ind i vævet via kapillær sengen og kan der enten frit bevæge sig inden for det ekstracellulære rum eller er uspecifikt bundet til forskellige cellulære eller ekstrellulære strukturer (tilstand 2; conc.[unspec]). For det tredje kan sporstoffet være specifikt bundet (med eller uden metabolisk diffusering) til dets målmole Kyle (tilstand 3, conc.[spec]). Alle disse dynamiske processer mellemrummene er til en vis grad tovejs, og diffusions processerne beskrives efter sats konstanter (K1, K2, K3 og K4). Mens koncentrationen af Tracer i blodet (dvs., tilstand 1) kaldes "input", er koncentrationen af uspecifikt og specifikt bundet Tracer (dvs. tilstand 2 og stat 3) kaldes "output" og kan direkte udledes af PET-billedet. Denne fysiologiske relation kan vises i 2-vævs rummets model (figur 1).
Figur 1 : Den tovævs opdelte model. De fysiologiske forhold for de tre forskellige Tracer stater og de dynamiske processer mellem dem vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
I det ideelle tilfælde er conc.[spec] proportional med koncentrationen af dets målmole Kyle. Men, produktionen af PET/CT måling er summen af conc.[spec] og conc.[unspec]. For at fastlægge conc.[spec] i den region af interesse, parallelt med conc.[unspec] af et referenceområde blottet for målet protein/pathway bestemmes. Ved hjælp af passende matematiske ligninger kan man nu beregne conc.[spec], oftest ved hjælp af rummet model (en bio-Kinetic modellering tilgang). I mange tilfælde findes der imidlertid ikke en sådan reference region uden for målproteinet1,2. I disse tilfælde kan conc.[Blood] anvendes til at bestemme conc.[spec]. Da conc.[blod] varierer på grund af forskellige lever-og nyre clearance, udskillelse, blodgennemstrømning, forskellige hjerne-blod barriere penetration og sygdomsrelaterede faktorer3, den nuværende guld standard er at måle conc.[ i blodet] parallelt med PET/CT-scanningen ved kontinuerlig blodprøvetagning. Dette giver den arterielle indgangsfunktion (AIF), som er defineret som conc.[Blood] over tid4. Bemærk, at udføre kontinuerlig blodprøvetagning anses teknisk meget udfordrende, især i små dyr som rotter eller mus5.
Her giver vi en nem og praktisk protokol til kontinuerligt at prøve blod fra rotter via en arteriovenøs (a-v) shunt mellem femoral vene og arterie. Koblet til et kommercielt tilgængeligt detektor pumpesystem kan vi generere en løbende AIF i realtid under Dynamic [18f] fluorodeoxyglucose ([18f] FDG)-PET/CT-scanninger i rotter og sammenlignede det med alternative tilgange. PET/CT Imaging blev udført i mandlige Sprague dawley rotter i en alder af 4 måneder med en gennemsnitlig vægt på 462 g ± 33 g (gennemsnitlig ± standardafvigelse) ved hjælp af en multimodalitet PET/CT scanner.
Da der anvendes en lang række anordninger i løbet af rækken af målinger (dosis kalibrator, online blod prøvetageren, PET/CT og Well Counter), er der behov for en kvalitetskontrolprocedure, der betegnes som kryds kalibrering, for at kontrollere den kvantitative nøjagtighed af alle systemer og for at kompensere for forskelle. Kryds kalibrering i forbindelse med online blodprøvetagning betyder, at tælle hastigheden for en given aktivitetskoncentration målt i korrigerede PET-billeder kan konverteres til den koncentration, der måles med twilite-systemet for den samme koncentration. Der er derfor fastlagt en kryds kalibreringsprocedure mellem PET/CT, blod prøvetagningssystem og brønd tæller.
Denne meget standardiserede metode giver en effektiv tilgang til kvantificering af metaboliske og cellulære processer i prækliniske smådyrs forskning og er en elegant måde at forbedre pålideligheden og reproducerbarhed af AIF. AIF kan derefter anvendes til at kvantificere den specifikt bundne Tracer i væv i prækliniske PET/CT-data ved hjælp af bio-kinetisk modellering.
Protocol
Alle dyreforsøg og-eksperimenter blev godkendt af det statslige udvalg for animalsk forskning i Mecklenburg-Vorpommern (LALLF M-V/7221.3-1.1-004/18, godkendelse: 03.04.2018). Eksperimenterne blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for ankomst.
Bemærk: dyrene blev holdt under standardbetingelser (22 ± 2 °C, 12 timer dag-og-nat-cyklus) med vand og fødevarer ad libitum. Alt nødvendigt udstyr til fremstilling af shunt-systemet, betjenings proceduren og de faktiske målinger er anført i tabellen over materialer.
1. klargøring og kirurgisk procedure for kateterisering af dyret
- Hurtigt dyret i mindst 12 h med fri adgang til vand. For anæstesi, Placer rotten i et induktions kammer og fyld det kontinuerligt med ilt/isoflurane mix. Ved initiering anvendes 2,5-3,5% isofluran og til vedligeholdelse 1,5-3,0% (strømningshastighed på 1,2-1,5 L/min).
Bemærk: faste er nødvendigt for undersøgelser, der anvender Tracer [18F] FDG, men ikke for andre røbestoffer. Måling af blodsukkerniveauet ved hjælp af manuelle blod trækninger som beskrevet i punkt 4 anbefales for at sikre stabile værdier eller for at korrigere for i kinetisk modellering. - Placer bedøvet rotte i dorsale position på en varmemåtte, under kirurgisk mikroskop og tilsæt dyrlæge salve på sine øjne. Overvåge og vedligeholde kropstemperaturen af rotter kontinuerligt under forsøget (37 ± 0,5 °C) med en rektal sonde.
- Tape benene på rotten til arbejdsoverfladen for at holde benene i position. Desinficer driftsstedet med et slimhinde desinfektionsmiddel og barberer benet og skridtet (Operations siden) af rotten. med en afsluttende rensning med desinfektionsmidlet.
- Lav en indsnit på ca. 20 mm ved hjælp af kirurgiske pincet og saks på Lysen af rotten. Dissekere de fine hudlag og udsætte femoral vene, arterie og nerve med mikro pincet. Placer to fine filamenter under hver femoral vene og arterie.
- Forsegl vene og arterie med hver distale glødetråd og hold under spænding med en bulldog clamp.
Brug de proksimale sutur filamenter til at spænde beholderen ved hjælp af bulldog klemmerne (uden knude). - Bloker venen med en aneurisme klemme proksimal, men 2-3 mm distale fra suturen med bulldog clamp. Brug cornea-saks til at lave et lille snit i venen (1/3 af diameteren) og fjern utætte blod med en steril bomulds swap. Dilate venen med en kedelig pincet og hold den åben. Indsæt det skarpe kateter (indvendig diameter [id]: 0,58 mm, udvendig diameter [OD]: 0,96 mm) i venen og skub den i proksimal retning op til aneurisme-clipsen.
- Åbn aneurisme clipsen og skub kateteret yderligere i proksimal retning (ca. 2-3 cm), hvis kateteret er placeret rigtigt, vil blodet flyde ind i kateteret. Fastgør kateteret med den proksimale sutur ved at lave to knob; om nødvendigt placeres en ekstra sutur rundt om venen og kateteret. Kontrollér katetrets funktion ved at skylle og aspirere med en insulin sprøjte (30 G nål) fyldt med 100 μL hepariniseret saltvandsopløsning (50 enheder/mL).
- Anbring kateteret i arterien ved at gentage trin 1,6 og 1,7.
- Når begge katetre er korrekt placeret, skal du lukke benet med suturer og bære dyret til PET/CT.
Bemærk: Vær så forsigtig som muligt med katetre under transporten af dyret, ellers kan der forekomme flytning af kateteret.
2. opsætning af shunt systemet
Figur 2 : Skema for opsætningen af målingen. (A) skematisk tegning af måle opsætningen. (B) foto af det tilsluttede shunt system med twilite detektor, peristaltisk pumpe og forskellige stiktyper. Tidsforløbet for radioaktivitet i blodet hos en rotte opdages, mens dyret (1) scannes i PET/CT (2). Derfor er det arterielle (a) og venøse (b) kateter forbundet til detektor pumpesystemet via adapter stykker (stik orange, stik blå og konnektor grøn). Det arterielle blod pumpes derefter fra det arterielle kateter gennem detektoren (3) til en peristaltisk pumpe (4) og tilbage i kroppen via det venøse kateter. En 3-vejs ventil (7) er integreret i rørsystemet for at udføre Tracer injektion, manuelle blod trækninger og skylning. Et T-stykke (8) samles for at injicere aktivitet. Detektoren er forbundet med en computer for at se, kalibrere og korrigere de kontinuerlige blod data. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Afskåret 6 dele af den fine bore polyethylen slange (fbpt) (id: 0,58 mm, OD: 0,96 mm) med en længde på c = 735 mm; e = 100 mm; f = 171 mm, g = 875 mm; h = 90 mm og i = 75 mm (figur 2). Afskårne 8 dele af silikone pumpe rørene (sort/sort/sort, ID: 0,76 mm, OD: 2,48 mm) med en længde på ca. 20 mm.
- Placer reduktions stik (fra ID 2,5 mm til ID 1,5 mm) på begge ender af silikone pumpe røret d (gul/blå/gul, id: 1,52 mm, OD: 3,20 mm). Læg en forberedt 20 mm del af silikone rørene (sort/sort/sort) på den anden ende af de brugte reduktions stik (Se stik blå i figur 2).
- Placer den forberedte del c af fbpt i den monterede konnektor blå på den ene ende af silikone pumpe røret d (gul/blå/gul) og den forberedte del e af fbpt i den monterede konnektor blå på anden ende. Sæt en forberedt 20 mm del af silikone rørene (sort/sort/sort) på enderne af to T-stykker 5 og 6 (tube T-stik ID: 1,5 mm; Se konnektor grøn i figur 2).
- den frie ende af del e af fbpt til venstre side af den samlede konnektor grøn (5) , og Placer den forberedte del f af fbpt på den modsatte side af konnektoren grøn (5). Placer den frie ende af del f af fbpt i venstre side af den samlede konnektor grøn (6) , og Placer den forberedte del g af fbpt på den modsatte side af konnektoren grøn (6). Tilsæt den forberedte del h af fbpt til den frie ende af den samlede konnektor grøn (5) og den forberedte del i af fbpt til den frie ende af den samlede konnektor grøn (6).
- Tilslut en Combi-prop til en hypodermic nål (G 23 x 1 1/4 ' '/ø 0,60 mm x 30 mm) og tilsæt den til en trevejs ventil. Placer den forberedte trevejs ventil med nålen i den frie ende af del h af FBPT. Tilslut en Combi-prop til en hypodermic nål og Placer nålen i den frie ende af del i af FBPT.
Bemærk: Se afsnit 5, før du starter blodprøvetagning på nettet. - Sæt de frie ender af del c og g af fbpt i et 100 ml bægerglas fyldt med 20 ml hepariniseret saltvandsopløsning (50 enheder/ml). Start den peristaltiske pumpe med en strømningshastighed på 1,52 mL/min, så shunt-systemet er helt fyldt med den fysiologiske saltvandsopløsning. Bagefter satte tre saks klemmer i enderne af del c og g og i midten af del i af fbpt.
- Slip Scissor klemmerne fra del c og g af fbpt. Tilslut det arterielle kateter a til den frie ende af del c af fbpt, og forbind det venøse kateter b til den frie ende af del g af Fbpt (Se stik orange i figur 2).
3. erhvervelse og genopbygning af billeder
- Anbring dyret i en hoved udsat position på shuttle-sengen (70 mm). Kontrollere respirationen af rotter og holde kropstemperaturen ved 37 ± 0,5 °C ved hjælp af en varmepude og en rektal sonde gennem hele billedet erhvervelse. Flyt shuttle-sengen til den forlængede senge position til injektion (før erhvervelse), og Forbind de indsatte katetre med shunt-systemet.
- Hold dyret under anæstesi med isofluran (2,5% isofluran i ilt, strømningshastighed 1,2-1,5 L/min) via en næse kegle.
- Start den peristaltiske pumpe med en strømningshastighed på 1,52 mL/min for at fylde shunt systemet med dyrets blod. Flyt shuttle-sengen til midten af synsfeltet på KÆLEDYRS detekterings ringen, og start det online blodprøve udtagningssystem (Se afsnit 5).
- Start PET/CT-arbejdsprocessen ved hjælp af parametrene beskrevet i afsnit 3,5 efter 60 s og Injicér derefter en dosis på ca. 22 MBq [18F] FDG i et volumen på ca. 0,5 ± 0,1 ml intravenøst via T-stykket. T-stykket skylles med ca. 150 μL hepariniseret saltvandsopløsning bagefter.
- Erhverve en dynamisk PET 60 min og en CT-scanning i slutningen af PET Imaging.
- For erhvervelse af PET-emission indstilles 3600 s (60 min) i indstillingen Hent efter tid . Vælg F-18 som studie isotop og brug 350 – 650 Kev som energi niveau og 3.438 NS som timing vindue.
- For CT-anskaffelse skal du vælge dæmpnings scanning i anskaffelses muligheden. I feltet projektions indstillinger vælger du 120 projektion for en halv Total rotation. For indstillinger for synsfelt (FOV) og opløsning skal du vælge lav som forstørrelse og 4 x 4 som binding med 275 mm aksial scannings længde og 3328 px som retning CCD-størrelse. I feltet eksponeringsindstillinger indstilles 500 μA for strøm, 80 kV for spænding og 180 MS for eksponeringstid.
- For PET emission histogram, sæt en serie af 20 frames (6 x 10 s, 8 x 30 s, 5 x 300 s og 1 x 1800 s) som dynamisk indramning. Vælg fratræk som forsinkelser. Vælg i feltet avancerede indstillinger 128 som sinogram bredde, 3 som span, 79 som Ring forskel og Dead time korrektion.
- For PET rekonstruktion, bruge to-dimensionelle bestilt delmængde forventning maksimering (2D-OSEM) med en generere, anvende og gemme scatter sinogram, 4 iteration og Fourier for rebinning som rekonstruktion algoritme. Vælg 128 x 128 som matrix størrelse , og brug 1 som billedzoom, alle som rammer og alle som segmenter.
4. procedure for manuel blodprøvetagning
- Udfør manuel blodprøvetagning 30 s, 60 s, 90 s, 600 s og 1800 s efter start af Imaging erhvervelse.
Bemærk: det anbefales stærkt at øge antallet af manuelle blodprøver, især inden for det første minut efter injektion af Tracer, hvis det er muligt. Derfor skal blodprøve volumenet reduceres til 20-30 μL pr. prøve6.- Åbn den første trevejs ventil og saml 100 μL arteriel blod i en kapillar blod samling EDTA tube 30 s efter Tracer injektion. Gentag for de andre tidspunkter. Bestem vægten af det tomme rør og blod fyldte rør.
- Mål aktiviteten (tæller/tidsenhed) for hele blodet for 180 s i en brønd tæller, som senere er kryds kalibreret for at opnå data i kBq/mL. Optag starttidspunktet for brønd tæller målingen. Beregn hele blodets aktivitet for hvert tidspunkt i den manuelle blodprøvetagning i kBq/mL, Anvend henfalds korrektion, og Overfør dataene i en tids aktivitets kurve.
5. procedure for online blodprøvetagning
- Anbring røret i detektoren ved hjælp af rørføringen. Start blodsampler softwaren (f. eks. PSAMPLE), og Åbn anskaffelses grænsefladen. Sørg for, at computeren af online blodprøvetagning setup og PET/CT er tid synkroniseret.
- Tryk på Start-knappen præcis 60 s før Tracer injiceres for at erhverve nok data til baggrundskorrektion. Gem de rå data via Gem-knappen i PMOD-databasen efter målingen.
- For korrektion og kalibrering af online blod data, skifte til korrektion interface. Aktivér henfalds korrektion, og vælg 18 F. Definer starttidspunktet for billed anskaffelse, og aktivér knappen gennemsnit for at udføre baggrundskorrektion. Aktivér kalibreringen og typen i den tidligere fastsatte kalibreringsfaktor (Se afsnit 7,1).
- Gem de korrigerede og kalibrerede blod data ved hjælp af Save TAC-knappen og vælg filen Blood. CRV. Denne fil kan derefter indlæses som fuldblod indgangs kurve i kinetiske Modeling Tool og kinetiske modellering kan udføres. Afkoble katetre fra det ekstrakorporal shunt system.
- Fjern dyret fra PET/CT-scanneren og aflive med pentobarbital.
Bemærk: i dette eksperiment blev dyrene aflives efter målingerne som hjerner blev brugt til in vitro-analyser i det eksperimentelle design. Med dette setup, gentagne målinger i longitudinale undersøgelser er også gennemførlige7. Brug et helt nyt rørsystem til det næste dyr.
6. billede afledt input funktion
- Åbn Fuse it -værktøjet på PMod. Indlæs PET-billedet som input og CT som reference. Klik på allerede matchede.
- Åbn værktøjet voxel of Interest (VOI). Placer markøren i den stigende aorta i CT. Klik på foruddefineret sfærisk VOI. Definer en radius på præcis 0,7 mm. Udpak oplysninger om tids aktivitet med knappen VOI-statistik, og Kopiér de gennemsnitlige værdier til udklipsholderen.
7. procedure for kryds kalibrering af twilite-systemet, PET/CT og brønd tæller
- Twilite-PET/CT-kalibrering
Bemærk: den præsenterede arbejdsgang for kalibrering af twilite er delvist baseret på de procedurer, der er beskrevet i reference manualen for PSAMPLE-modulet i PMOD.- Fyld en sprøjte med ca. 100 MBq af [18F] FDG. Måle den nøjagtige aktivitet aF med en kalibreret dosis kalibrator og dokumentere det sammen med dato og tidspunkt for målingen og mængden af den fulde sprøjte. Den optagne tid er referencetidspunktet for alle henfalds korrektioner, der skal udføres.
- Fyld et bægerglas med 500 mL ledningsvand. Den nøjagtige lydstyrke bestemmes af veje metoden. Mål vægten me af det tomme bæger med en tilegnet og kalibreret præcisions skala (mindst nøjagtighedsklasse II). Fyld bægerglasset med vand fra hanen, og mål vægten mf på det fulde bægerglas.
- Bægerens volumen Vb beregnes ved hjælp af forskellen mellem massen og vand tætheden i ledningsvandet (r = 0,998 g/ml ved 20 °c):
- Injicer [18F] FDG i det fyldte bægerglas og Genfyld den tomme sprøjte med det oprindelige volumen med inaktiv ledningsvand, og mål aktiviteten AE af den genfyldte sprøjte i dosis kalibratoren. Aktivitetskoncentrationen cb af opløsningen i bægerglasset gives af
, som bør være ca. 200 kBq/ml. - Fyld et 50 mL konisk centrifugeglas med opløsningen fra bægerglasset (undgå store luftbobler), og Placer det centralt i synsfeltet for PET/CT-scanneren. Fyld et kateter identisk med den type, der anvendes i PET/CT Imaging eksperiment og Placer det i tube guide af twilite systemet. Fyld kateteret med Tracer-opløsningen fra bægerglasset ved hjælp af den peristaltiske pumpe.
- Start målingen af tidsaktivitets kurven som beskrevet i afsnit 5 ved hjælp af den samme parameter for integrationstid og rebinning som i eksperimentet uden en kateter guide inde i Målehovedet. Dette trin sikrer anskaffelse af tilstrækkelige data til passende baggrundskorrektion. Efter 2 min, uden at stoppe dataindsamlingen af twilite-systemet, Placer kateter styret med det fyldte rør i Målehovedet, og Fortsæt dataindsamlingen i ca. 5 minutter.
- Start en 10 min PET erhvervelse af 50 mL konisk centrifugeglas parallelt efterfulgt af en standard CT-erhvervelse for dæmpnings korrektion. Rekonstruere et statisk PET-billede af 50 mL konisk centrifugeglas ved hjælp af den samme algoritme og de parametre, der er beskrevet i punkt 3. Brug et billedbehandlings værktøj til efter behandling (f. eks. PVIEW), og Placer en cylindrisk VOI, der dækker ca. 70% af volumen indersiden af de rekonstruerede PET-billeder af det koniske centrifugeglas 50 mL. Det gennemsnitlige aktivitets koncentrations c-kæledyr i kBq/ml udtages inden for VOI.
- Gå tilbage til blodet sampler software og bruge kalibreringstilstand til at korrigere den erhvervede TAC for forfald, forgrenede fraktion og baggrund. Tilføj alle de nødvendige oplysninger for nuclide, aktivitetskoncentration og PET erhvervelse starttidspunkt. Internt udtrækker softwaren tælle hastigheden målt med twilite-systemet (CRtwilite) og beregner kryds kalibreringsfaktoren for PET-og Twilite-systemet (CFPet/twilite):
Bemærk: det er vigtigt, at den samme isotop anvendes til både kalibrerings-og PET/CT-eksperimenter, da forgrenings brøken varierer mellem de forskellige isotoper, som korrigeres i forbindelse med PET-genopbygningsprocessen. Denne procedure skal gentages regelmæssigt med hensyn til kvalitetskontrol, hvis vigtige komponenter i systemet ændres (f. eks. rør-, anskaffelses-og genopbygnings parametre) og efter reparationsarbejder.
- PET/CT-Well Counter kalibrering
- For at beregne kalibreringsfaktoren CF-brønd tælleren i brønd tælleren skal du bruge den samme aktivitets løsning, som er fremstillet i bægerglasset til kalibrering af twilite-systemet. Vent ca. 6 timer for at tillade reduktion af specifik aktivitet ved forfald for at minimere døde tids effekter af den scintillationdetektor af brønd tælleren. Låget bægerglasset for at undgå fordampning.
- Beregn den nøjagtige tidsforskel for referencetidspunktet, og Bestem den faktiske aktivitetskoncentration cb(t+) af opløsningen af bægerglasset ved forfald korrektion af den oprindelige aktivitetskoncentration. Pipette foruddefinerede volumener (V-prøve), som er identiske med mængden af de blodprøver, der måles i forsøgene (f. eks. 200 μl), fra bægerglasset til fem sikre rør. Mål aktiviteten af hver af de fem rør med brønd tælleren for 180 s.
Bemærk: Hvis variationskoefficienten for en enkelt måling er større end 1%, bør måle tiden øges. Registrer den målte tælle hastighed i antal pr. minut [CPM] for hvert rør og måle starttidspunktet. Udfør en henfalds korrektion. - Beregn kalibreringsfaktoren CF-brønd tælleren for hver måling ved at dividere henfalds korrigeret tælle hastighed CRbrønd tælleren af brønden med henfalds korrigeret aktivitetskoncentration af bægerglasset cbægerglas (t +):
- Gennemsnitlig de fem kalibrerings faktorer for at opnå den gennemsnitlige kalibreringsfaktor.
, som bør være ca. 200 kBq/ml.
Representative Results
Opsætningen af shunt-systemet vises i figur 2. Repræsentative resultater af de kontinuerlige blod prøvetagnings data sammenlignet med manuelle blod prøvetagnings data i tre dværg rotter over en tidshorisont på 30 min er præsenteret i figur 3a, C. Ved begyndelsen af den kontinuerlige blodprøvetagning kan en Initial Peak (maksimal koncentration af radioaktivitet) ses ved 5 s efter Tracer injektion. Bagefter, aktiviteten i blodet falder hurtigt og når et plateau på ca. 15 min. I de manuelle blodprøvetagning data den detekterede peak er mindre og plateauet er ikke let at definere (figur 3A, C). Sammenligningen af den kontinuerlige Blodprøvetagning med de billed afledte data vises i figur 3B, D. I de billed afledte data er toppen og udgangspunktet for plateauet klart synlige, ikke desto mindre er maksimum af toppen mindre i forhold til kontinuerlige blod prøvetagnings data for alle dyr (figur 3B, D).
Et suboptimalt resultat af kontinuerlig Blodprøvetagning med vores setup er vist i figur 3E, F. Ved begyndelsen af den kontinuerlige blodprøvetagning var der ingen dataopsamling inden for den første 3,5 min. på grund af blodpropper. Ved frakobling af rørsystemet ved stik orange og flydende med hepariniseret saltvandsopløsning blev strømmen i rørsystemet genstartet, og målingen fortsatte. En top kan ses på ca 4 min, som ikke registrerer den maksimale radioaktivitet i blodet (figur 3E, F). Manuel blodprøvetagning (figur 3E) og billed afledte analyser (figur 3F) var stadig mulige og sammenlignelige med de korrekte resultater.
Figur 3 : Repræsentative resultater af kontinuerlig blodprøvetagning sammenlignet med manuel blodprøvetagning. Typiske arterielle inputfunktioner afledt af kontinuerlig blodprøvetagning sammenlignet med manuel blodprøvetagning (venstre kolonne) og kontinuerlig blodprøvetagning sammenlignet med den billede-afledte tilgang (højre kolonne) er vist. Paneler A-D viser resultaterne af korrekt gennemførelse af protokollen i to forskellige dyr. Paneler E og F illustrerer et suboptimalt resultat af målingen. Alle viste data blev korrigeret for kryds kalibreringsfaktoren og baggrunden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
De præsenterede resultater udvindes fra et større projekt om neuronal aktivitet i en transgene dyremodel af Huntingtons sygdom sammenlignet med dværg rotter. I alt 30 transgene og dværg rotter blev kateteriseret og manuel og online blodprøvetagning parallelt med [18F] FDG-PET/CT blev udført. Tre AIF'er af dværg rotter er vist her for at demonstrere rækken af mulige udfald af protokollen. Resultaterne af det komplette projekt om ændringer i neuronal aktivitet i en dyremodel af Huntingtons sygdom vil blive offentliggjort andetsteds.
Den her beskrevne metode muliggør hurtig og præcis kontinuerlig blodprøvetagning i en stor kohorte og giver en uden pauser AIF til kinetisk modellering af dynamiske PET/CT-data i små dyr. En ekstern blodcirkulation genereres for at detektere faktiske tids aktivitet i blodet af dyrene; derfor undgås et blodtab. Den kirurgiske procedure er baseret på Jespersen et al.8 og blev modificeret til at opfylde behovene for arteriel blodprøvetagning under PET/CT-målingerne. Shunt-systemet blev valideret af Weber et al.9. Med den her anvendte opsætning løber et eksternt blodvolumen på ca. 1,1 mL gennem detektor pumpesystemet. En rotte i alderen 4 måneder har et samlet blodvolumen på ca. 30 mL. Diameteren af femoral vene og arterie er ca. 0,45-0,6 mm10 og skal være lidt stivet at indsætte kateteret anvendes.
AIF'EN kan også måles via sporadisk manuel blodindsamling eller rekonstrueres fra tidlige tidspunkter af selve PET-billederne (billed afledt). Begge tilgange blev udført med her præsenterede data og sammenlignet med den kontinuerlige blodprøvetagning.
I forhold til manuel blodprøvetagning, med online blodprøvetagning en mærkbar højere tidsmæssig opløsning (her: 1800 datapunkter pr 30 min) bliver muligt. Manuelle blod trækninger (her: 5 datapunkter pr. 30 min) er begrænset til det blodvolumen, der er til stede i det lille dyr, da disse prøver ikke pumpes tilbage i dyrets cirkulation. Desuden er et maksimuminterval på 10-15 s teknisk gennemførlig, og vigtige oplysninger om kinetisk modellering glemmes. Dette kan også ses i de præsenterede data, som en forskel i den detekterede maksimale af kontinuerlig og manuel blodprøvetagning er indlysende (figur 3a, C, E). Med online blodprøvetagning den detekterede peak var højere end med den billed-afledte inputfunktion af opstigende aorta11 (figur 3B, D, F). Den Imaged-afledte inputfunktion er begrænset til den rumlige opløsning af PET-scannere, som resulterer i delvise volumen effekter12 og påvirkes af de rekonstruerede tidsrammer.
En generel fordel ved denne kontinuerlige blodprøve udtagnings procedure er, at traceren kan påføres via kateteret, som er mindre tilbøjelig til forstyrrelse end injektion via den laterale hale vene. Vær opmærksom på, at traceren skal påføres i moderat volumen for at forhindre, at sporstoffet forbliver i begyndelsen af rørsystemet. For at sikre, at der ikke er nogen aktivitet tilbage i T-stykkets Dead Volume, skylles den med hepariniseret saltvandsopløsning bagefter. Desuden tilrådes brug af en infusionspumpe, da det muliggør justering af hastigheden af Tracer injektion og kan bidrage til mere koordineret erhvervelse af den maksimale radioaktivitet peak med manuel blodprøvetagning13.
Der er et par mulige problemer, der kan opstå under protokol behandling og kan håndteres ved følgende fejlfinding. En sub-optimal placering af katetre kan føre til en ufuldstændig udførelse af protokollen, derfor sikre, at de er nøjagtigt fastgjort med den proksimale sutur, og at kateteret skubbes 2-3 cm proksimalt ind i beholderen. Derudover kan fibrin lim anvendes. Dannelsen af trombi kan også tilstoppe katetre. Dette kan håndteres ved at øge heparin koncentrationen og efterfølgende rødmen af katetre eller rørsystemet. Et sådant suboptimalt udfald som følge af tilstopning af katetre er vist i resultaterne, den maksimale peak er savnet (figur 3E). Et andet kritisk punkt vedrørende dyrebeskyttelse og trivsel er længden af den ekstrudorporeale blodgennemstrømning. Det foreslås derfor at reducere rørsystemets længde til et minimum.
Når blodprøvetagning udføres, skal der tages hensyn til tre korrektioner af den resulterende AIF. For det første, plasma korrektion. Tracers ækvibrere mellem plasma og blodlegemer, hovedsageligt erythrocytter. Afhængigt af hvor hurtigt disse diffusions processer er, er den tilgængelige Tracer hovedsageligt til stede i plasma. For nogle røbestoffer, forholdet mellem plasma til fuldblod skal overvejes, såsom flere lipofile dem. I disse tilfælde skal plasma aktiviteten bestemmes. Hvis der anvendes [18f] FDG, er det ikke nødvendigt at centrifugeres i blodet for at bestemme plasma aktiviteten, da den er meget hurtig, når den er i balance mellem plasma og røde blodlegemer, og tilgængeligheden af [18f] FDG i plasma svarer til den i hele blodet. For det andet, metabolitten korrektion. Mange røbestoffer metaboliseres i fuldblod, og nogle af disse metabolitter er stadig radioaktivt mærket14. Denne fraktion er til stede i AIF, men er ikke tilgængelig for vævs optagelse. For nogle røbestoffer skal metabolitter bestemmes i fuldblod eller plasma, og AIF'EN skal korrigeres. For det tredje, spredning korrektion. Dispersion er forårsaget af flere faktorer, herunder (a) den systematiske tidsforskel mellem sporernes ankomsttider i vævet i forhold til det perifere prøvetagningssted (forsinkelse korrektion) og (b) og udtværing af formen af AIF, som sporstof transport inden for rørsystemet påvirkes af dets første ordre forsinkelse (PT1) kinetik. Der er foreslået flere korrektioner baseret på dekoncentrering, hovedsagelig baseret på modellen fra Iida et al.15, men de fleste af dem er modtagelige for støj. En korrektionsmetode, der omgår dekoncentrering og derfor er mindre tilbøjelig til støj, er blevet foreslået af munk et al.16. De nødvendige målinger til beregning af korrektions parametrene skal udføres for hver kombination af slanger og sporstof, der anvendes. Dispersion korrektion bør ske før tidsforskydning korrektion17. Men hovedsageligt hurtige vævs perfusions processer påvirkes af dispersion, og det er også blevet påvist, at for modellering af [18F] FDG-undersøgelser er en dispersions korrektion ikke absolut nødvendig18. I de præsenterede eksempler er dispersions korrektionen af AIF derfor ikke blevet anvendt.
En korrekt kalibrering af dosis kalibratoren på stedet og den regelmæssige kvalitetskontrol er en forudsætning for den type kryds kalibreringsprocedure, der præsenteres her. Hvis den aktivitet, der administreres til dyret, måles med samme dosis kalibrator, annulleres enhver afvigelse i nøjagtighed dog, forudsat at afvigelsen er konstant, og at den komplette kryds kalibreringsprocedure er fulgt, herunder nuclid-specifikke korrektioner (f. eks. for varierende halveringstider eller forskellige forgrenings forhold). Ved hjælp af en sådan kalibreringsprocedure til harmonisering af PET/CT-systemer, der anvendes til sundhedspleje og forskning, kan der opnås en nøjagtighed på mindst 5-10%19,20.
De kalibrerede og korrigerede AIF'er, der genereres ved en vellykket gennemførelse af denne protokol, muliggør kvantificering af PET/CT-data til karakterisering af dyre sygdomsmodeller, afprøvning af nye behandlingsmuligheder, etablering af nye røbestoffer og overførsel af eksisterende røbestoffer til en anden art. Tilsyneladende, kontinuerlig blodprøvetagning i [18] FDG-PET/CT i rotter leverer de mest pålidelige oplysninger til beregning af input i Bio-Kinetic modellering. Ved at tage hensyn til det individuelle stofskifte, især lever clearance, er det muligt at vurdere de relevante patologiske eller terapeutiske virkninger mere præcist. Med denne gennemførlige protokol er en højere effektivitet af prækliniske dataanalyse af PET/CT let gennemførlig.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender taknemmeligt Susann Lehmann, Iloana Klamfuß og Petra Wolff for husdyravl og pleje og Matthias Wyss for støtte under etableringen af online blodprøvetagning system. PET/CT for små dyr blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (INST 2268/6-1 FUGG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sugery for arteriovenous shunt | |||
| anesthesia station | Groppler | ||
| aneurysm clips | Aesculap | FT190T | 5 mm, closing force 70 g |
| bulldog clamp | Aesculap | 35 mm | |
| dissectiong scissors BC165 | Aesculap | 490-866 | dull, for skin preparation |
| heating mat | |||
| insulin syringe | Braun | 30G | |
| needle holder | medicon | 11.62.18 | micro surgical |
| pliers for aneurysm clips | Aesculap | FT 470T | Yasargil |
| portex fine bore polythene tubing | Smith Medical | 800/100/200 | ID 0.58 mm, OD 0.96 mm; PE50 equivalent tubing |
| surgical microscope with camera | Leica | M50 + MC120 HD | |
| suture filaments 6.0 | 6.0, polypropylene | ||
| suture filaments 3.0 | 3.0, absorbable, braided | ||
| two anatomical forceps | Hammacher Soling | HSC601-11 | micro surgery, 45° |
| vascular or corneal scissors | Geuder | G19605 | micro surgery scissors |
| PET/CT imaging | |||
| dose calibrator ISOMED 2010 | nivia instruments GmbH | for tracer portioning | |
| Inveon PET/CT | Siemens | ||
| tracer (e.g. 18F-FDG) | |||
| manuel bloodsampling | |||
| capillary blood collection EDTA tube | KABE Labortechnik GmbH | GK 150 EDTA 200 µl | |
| test tubes | SARSTEDT | 5 ml, 75 x 12 mm, PS | |
| well counter CAPTUS 700t | Capintec | manuel measurement of blood activity | |
| automatic blood sampling | |||
| BD Venflon TM pro safety shielded IV catheter; 18 G (1.3 mm x 32 mm) | BD | 3932269 | luer connections (to fit in t-connections) |
| bloodsampler twilite two | swisstrace GmbH | ||
| combi stopper | Braun | 4495101 | |
| heparin | 50U/ml for tube flushing before the experiment and aspiration during catheter surgery | ||
| hypodermic needle | G23 x 1 1/4" / 0.6 x 30 mm | ||
| microprocessor controlled tubing pump | Ismatec/Cole-Parmer | ISM596 | 12 rollers, 2 channels |
| PSAMPLE modul of PMOD | PMOD | ||
| reduction connectors | Ismatec/Cole-Parmer | ISM569A | from ID 2.5 mm to ID 1.5 mm |
| silicone pump tubes | Ismatec/Cole-Parmer | 070535-17-ND /SC0065N | for roller pump (yellow/blue/yellow ID 1.52 mm, WT 0.84 mm, OD 3.2 mm) |
| silicone pump tubes - adapter tubing | Ismatec/Cole-Parmer | SC 0107 | black/black/black ID 0.76 mm, WT 0.86 mm, OD: 2.48 mm |
| t-piece or t-connections | Ismatec/Cole-Parmer | ISM 693A | ID 2.5 mm |
References
- Schain, M., et al. Arterial input function derived from pairwise correlations between PET-image voxels. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33 (7), 1058-1065 (2013).
- Schain, M., Zanderigo, F., Mann, J. J., Ogden, R. T. Estimation of the binding potential BPND without a reference region or blood samples for brain PET studies. NeuroImage. 146, 121-131 (2017).
- Bentourkia, M. Determination of the Input Function at the Entry of the Tissue of Interest and Its Impact on PET Kinetic Modeling Parameters. Molecular Imaging and Biology. 17 (6), 748-756 (2015).
- Phelps, M. E. PET. , Springer New York. New York, NY. (2004).
- Laforest, R., et al. Measurement of input functions in rodents: challenges and solutions. Nuclear Medicine and Biology. 32 (7), 679-685 (2005).
- Napieczynska, H., et al. Impact of the Arterial Input Function Recording Method on Kinetic Parameters in Small-Animal PET. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 59 (7), 1159-1164 (2018).
- Sijbesma, J. W. A., et al. Novel Approach to Repeated Arterial Blood Sampling in Small Animal PET: Application in a Test-Retest Study with the Adenosine A1 Receptor Ligand [(11)C]MPDX. Molecular Imaging and Biology: MIB: the Official Publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (5), 715-723 (2016).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), e3496 (2012).
- Weber, B., Burger, C., Biro, P., Buck, A. A femoral arteriovenous shunt facilitates arterial whole blood sampling in animals. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 29 (3), 319-323 (2002).
- Liu, H. -L. Microvascular anastomosis of submillimeter vessels-a training model in rats. Journal of Hand and Microsurgery. 5 (1), 14-17 (2013).
- van der Weerdt, A. P., et al. Image-derived input functions for determination of MRGlu in cardiac (18)F-FDG PET scans. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 42 (18), 1622-1629 (2001).
- Alf, M. F., et al. Quantification of brain glucose metabolism by 18F-FDG PET with real-time arterial and image-derived input function in mice. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 54 (1), 132-138 (2013).
- Eriksson, O., et al. A computerized infusion pump for control of tissue tracer concentration during positron emission tomography in vivo pharmacokinetic/pharmacodynamic measurements. BMC Medical Physics. 8, 2 (2008).
- Burger, C., Buck, A. Tracer kinetic modelling of receptor data with mathematical metabolite correction. European Journal of Nuclear Medicine. 23 (5), 539-545 (1996).
- Iida, H., et al. Error analysis of a quantitative cerebral blood flow measurement using H2(15)O autoradiography and positron emission tomography, with respect to the dispersion of the input function. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 6 (5), 536-545 (1986).
- Munk, O. L., Keiding, S., Bass, L. A method to estimate dispersion in sampling catheters and to calculate dispersion-free blood time-activity curves. Medical Physics. 35 (8), 3471-3481 (2008).
- Meyer, E. Simultaneous correction for tracer arrival delay and dispersion in CBF measurements by the H215O autoradiographic method and dynamic PET. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 30 (6), 1069-1078 (1989).
- Lanz, B., Poitry-Yamate, C., Gruetter, R. Image-derived input function from the vena cava for 18F-FDG PET studies in rats and mice. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 55 (8), 1380-1388 (2014).
- Geworski, L., et al. Multicenter comparison of calibration and cross calibration of PET scanners. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 43 (5), 635-639 (2002).
- Boellaard, R. Standards for PET image acquisition and quantitative data analysis. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 50, Suppl 1 11-20 (2009).
