Summary
Her beskrives en protokoll for kontinuerlig blodprøve under PET/CT-avbildning av rotter for å måle arterie inngangs funksjonen (AIF). Catheterization, kalibrering og oppsett av systemet og dataanalyse av blod radioaktivitet er demonstrert. De genererte dataene gir inndataparametre for påfølgende bio-kinetisk modellering.
Abstract
For kvantitativ analyse og bio-kinetisk modellering av positron utslipp tomografi/beregnet tomografi (PET/CT) data, fastsettelse av Temporal blod tid-aktivitet konsentrasjon også kjent som arteriell input funksjon (AIF) er et sentralt punkt, spesielt for karakterisering av dyr sykdom modeller og innføring av nyutviklet radiotracers. Kunnskapen om radiotracer tilgjengelighet i blodet bidrar til å tolke PET/CT-avledede data av vevs aktivitet. For dette formålet, online blod prøvetaking under PET/CT Imaging er tilrådelig å måle AIF. I motsetning til manuell blod prøvetaking og bilde-avledet tilnærminger, kontinuerlig online blod prøvetaking har flere fordeler. I tillegg til den minimerte blodtapet, er det en forbedret oppløsning og en overlegen nøyaktighet for blod aktivitet måling. Imidlertid er den store ulempen med online blod prøvetaking den kostbare og tidkrevende forberedelsen til å catheterize lår skipene til dyret. Her beskriver vi en enkel og komplett arbeidsflyt for catheterization og kontinuerlig blodprøve under små dyr PET/CT Imaging og sammenlignet det til manuell blodprøve og en bilde-avledet tilnærming. Ved hjelp av denne svært standardiserte arbeidsflyten, er fastsettelse av fluorodeoxyglucose ([18F] FDG) AIF demonstrert. Videre kan denne prosedyren brukes på alle radiotracer i kombinasjon med ulike dyremodeller for å skape grunnleggende kunnskap om Tracer kinetisk og modellegenskaper. Dette gir en mer presis evaluering av atferden til legemidler, både for diagnostiske og terapeutiske tilnærminger i prekliniske forskning av onkologiske, nevrodegenerative og hjerteinfarkt sykdommer.
Introduction
Positron emisjon tomografi/beregnet tomografi (PET/CT) er en kjernefysisk tenkelig teknologi som muliggjør visualisering av metabolske prosesser i kroppen etter injeksjon av en radioaktivt merket ligand, også kalt Tracer. Mens ligand er et molekyl som er involvert i en metabolsk sti eller mål celleoverflaten proteiner, er den radioaktive etiketten en positron-emitting radionuklidet. Gamma stråler er indirekte slippes ut av positron forfall og tillate påvisning av distribusjonen i organismen med ekstrakorporal PET detektorer. På denne måten kan ulike cellulære molekyler være målrettet: signalstoff reseptorer og transportører, metabolske prosesser som Glykolysen eller mitokondrie proteiner som stedsforskyver protein 18 kDa (TSPO) for å oppdage aktiverte glia celler.
I prekliniske forskning, PET/CT er en attraktiv metode for å studere biokjemiske prosesser i en ikke-invasiv måte in vivo, og dermed tillater langsgående studier. PET/CT data støtte analysene av sykdoms mekanismer, vurdering av egenskaper og farmakokinetikken til nye legemidler og validering av både, nåværende og romanen radiotracers for translational forskning.
Under PET/CT-analyser kan tre sporings tilstander defineres (eksempel på modellen for 2-vevs kupé): for det første renner Tracer i blodet etter anvendelsen (tilstand 1; CONC.[blod]). For det andre går den inn i vevet via kapillær sengen og kan det enten fritt flytte innenfor ekstracellulære plass eller er uspesifikt bundet til ulike cellulære eller ekstracellulære strukturer (stat 2; CONC.[unspec]). For det tredje kan Tracer være spesielt bundet (med eller uten metabolsk fangst) til sin mål molekyl (stat 3, CONC.[spec]). Alle disse dynamiske prosessene mellom avdelingene er til en viss grad toveis og diffusjon prosessene er beskrevet av rate konstanter (K1, K2, K3 og K4). Mens konsentrasjonen av Tracer i blodet (dvs. stat 1) kalles "input", konsentrasjonen av uspesifikt og spesielt bundet Tracer (dvs. stat 2 og stat 3) kalles "output" og kan være direkte avledet fra PET image. Denne fysiologiske relasjonen kan vises i modellen med to vevs rom (figur 1).
Figur 1 : To-tissue avdelings modell. De fysiologiske forholdene til de tre forskjellige sporings tilstandene og de dynamiske prosessene mellom dem vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I det ideelle tilfellet, CONC.[spec] er proporsjonal med konsentrasjonen av sitt mål molekyl. Utdataene fra PET/CT-målingen er imidlertid summen av CONC.[spec] og CONC.[unspec]. For å bestemme CONC.[spec] i regionen av interesse, parallelt CONC.[unspec] av en referanse region blottet for mål proteinet/veien bestemmes. Ved å bruke egnede matematiske ligninger kan man nå beregne CONC.[spec], vanligvis bruker kupé modellen (en bio-kinetisk modellering tilnærming). I mange tilfeller er imidlertid en slik referanse region blottet for mål proteinet ikke tilgjengelig1,2. I disse tilfellene kan CONC.[blod] brukes til å avgjøre CONC.[spec]. Siden CONC.[blod] er varierende på grunn av ulike lever-og nyre klarering, utskillelse, blodstrøm, ulike hjerne-blod barriere penetrasjon og sykdoms relaterte faktorer3, den nåværende gullstandarden er å måle CONC.[ blod] parallelt med pet/CT-skanningen ved kontinuerlig blodprøve. Dette gir arteriell input-funksjonen (AIF), som er definert som CONC.[blod] over tid4. Av notatet, utføre kontinuerlig blod prøvetaking anses teknisk svært utfordrende, spesielt i små dyr som rotter eller mus5.
Her gir vi en enkel og praktisk protokoll for å kontinuerlig prøve blod fra rotter via en arteriovenøse (a-v) shunt mellom lår venen og arterien. Koblet til et kommersielt tilgjengelig detektor pumpesystem, kan vi generere en sann tids kontinuerlig AIF under dynamisk [18f] fluorodeoxyglucose ([18f] FDG)-pet/CT skanner i rotter og sammenlignet den med alternative tilnærminger. PET/CT Imaging ble utført i mannlig Sprague dawley rotter i en alder av 4 måneder med en gjennomsnittlig vekt på 462 g ± 33 g (gjennomsnittlig ± standardavvik) ved hjelp av en multimodal PET/CT scanner.
Siden et bredt utvalg av enheter brukes under rekken av målinger (dose kalibrering, online blodprøve, PET/CT, og vel telleren), en kvalitetskontrollprosedyre referert som kryss kalibrering er nødvendig for å kontrollere den kvantitative nøyaktigheten av alle systemer og for å kompensere for forskjeller. Kryss kalibrering i sammenheng med online blodprøve betyr at telle raten for en gitt aktivitet konsentrasjon målt i korrigert PET bilder kan konverteres til konsentrasjonen målt med Twilite systemet for samme konsentrasjon. Derfor er det etablert en prosedyre for kryss kalibrering mellom PET/CT, blodprøve system og brønn teller.
Denne svært standardiserte metodikken gir en kraftig tilnærming for å kvantifisere metabolske og cellulære prosesser i prekliniske små dyr forskning og er en elegant måte å forbedre påliteligheten og reproduserbarheten til AIF. AIF kan deretter brukes til å kvantifisere den spesielt bundne Tracer i vev i prekliniske PET/CT data ved hjelp av bio-kinetisk modellering.
Protocol
Alle dyr håndtering og eksperimenter ble godkjent av staten Animal Research Committee of Mecklenburg-Vorpommern (LALLF M-V/7221.3-1.1-004/18, godkjenning: 03.04.2018). Eksperimentene ble utført i samsvar med retningslinjene for ankomst.
Merk: dyr ble holdt under standard forhold (22 ± 2 ° c, 12 h dag-og-natt syklus) med vann og mat ad lib. Alt nødvendig utstyr for utarbeidelse av shunt systemet, operasjonen prosedyren og de faktiske målingene er oppført i tabellen av materialer.
1. forberedelse og kirurgisk prosedyre for catheterization av dyret
- Raskt dyret i minst 12 timer med fri tilgang til vann. For anestesi, plassere rotte i en induksjon kammer og fylle den kontinuerlig med oksygen/isoflurane mix. For initiering bruk 2,5-3,5% isoflurane og for vedlikehold 1.5-3,0% (strømningshastighet på 1,2-1.5 L/min).
Merk: Fasting er nødvendig for studier som bruker Tracer [18F] FDG men ikke for andre Bevegelsesuskarphet. Måling av blodsukker nivåer ved bruk av manuelle blodprøver som er beskrevet i avsnitt 4, anbefales for å sikre stabile verdier eller for å korrigere for kinetisk modellering. - Plasser anesthetized rotte i rygg posisjon på en varmematte, under det kirurgiske mikroskopet og Legg til veterinær salve på øynene. Overvåk og oppretthold kroppstemperaturen til rotte kontinuerlig under eksperimentet (37 ± 0,5 ° c) med en rektal sonde.
- Tape bena på rotte til arbeidsflaten for å holde bena i posisjon. Desinfisere driftsområdet med en slimhinne desinfeksjonsmiddel og barbere benet og skrittet (drift side) av rotte. Avslutt med en endelig rensing med desinfeksjonsmiddel.
- Lag et snitt på ca 20 mm ved hjelp av kirurgisk tang og saks i lysken av rotte. Analysere den fine huden lag og eksponere lår venen, arterie og nerve med mikro tang. Plasser to fine filamenter under hver lår blodåre og arterien.
- Forsegle vene og arterie med hver enkelt glødetråd og hold under spenning med en Bulldog klemme.
Bruk proksimale Sutur filamenter til å stramme fartøyet ved hjelp av Bulldog klemmer (uten en knute). - Blokker venen med en proksimale, men 2-3 mm fra Sutur med Bulldog-klemmen. Bruk hornhinnen saks for å gjøre et lite snitt i venen (1/3 av diameter) og fjerne lekker blod med en steril bomull swap. Dilate venen med en sløv tang og hold den åpen. Sett skjerpet kateter (indre diameter [ID]: 0,58 mm, ytre diameter [OD]: 0,96 mm) inn i venen og skyv den i proksimale retning, opp til blødning klippet.
- Åpne blodomløpet klipp og skyv kateteret videre i proksimale retning (ca 2-3 cm), hvis kateteret er plassert riktig, vil blodet strømme inn i kateteret. Fest kateteret med proksimale Sutur ved å lage to knop; om nødvendig, Plasser en ekstra Sutur rundt venen og kateteret. Kontroller funksjonaliteten til kateteret ved å skylle og aspirating med en insulinsprøyte (30 G nål) fylt med 100 μL av heparinisert saltoppløsning (50 enheter/mL).
- Plasser kateteret i arterien ved å gjenta trinn 1,6 og 1,7.
- Når begge katetre er korrekt plassert, Lukk beinet med sting og bær dyret til PET/CT.
Merk: Vær så forsiktig som mulig med katetre under transport av dyret, ellers kan forskyvning av kateteret forekomme.
2. oppsett av shunt systemet
Figur 2 : Oppsett av målings oppsettet. (A) skjematisk tegning av målings oppsettet. (B) bilde av det tilkoblede shunt systemet med Twilite detektor, peristaltisk pumpe og forskjellige tilkoblingstyper. Tidsforløpet av radioaktivitet i blod av en rotte oppdages mens dyret (1) skannes i PET/CT (2). Derfor er arteriell (a) og venøs (b) kateter koblet til detektor pumpesystemet via adapter brikker (kontakt oransje, kontakt blå og kontakt grønn). Arteriell blod pumpes deretter fra arterie kateteret gjennom detektoren (3) til en peristaltisk pumpe (4) og tilbake i kroppen via venøs kateter. En 3-veis ventil (7) er integrert i rørsystemet for å utføre Tracer injeksjon, manuell blod trekker og skylling. En T-brikke (8) monteres for å injisere aktivitet. Detektoren er koblet til en datamaskin for å vise, kalibrere og korrigere kontinuerlig blod data. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Klipp av 6 deler av den fine bore polyeten slangen (FBPT) (ID: 0,58 mm, OD: 0,96 mm) med en lengde på c = 735 mm; e = 100 mm; f = 171 mm, g = 875 mm; h = 90 mm og i = 75 mm (figur 2). Klipp av 8 deler av silikon pumpe rør (svart/svart/svart, ID: 0,76 mm, OD: 2,48 mm) med en lengde på ca 20 mm.
- Plasser reduksjons kontakter (fra ID 2,5 mm til ID 1,5 mm) på begge ender av silikon pumpe røret d (gul/blå/gul, ID: 1,52 mm, OD: 3,20 mm). Sett en forberedt 20 mm del av silikon-rørene (svart/svart/svart) i den andre enden av de brukte reduksjons kontaktene (se kontakt blå i figur 2).
- Plasser den preparerte delen c av FBPT i den monterte kontakten blå på den ene enden av silikon pumpe røret d (gul/blå/gul) og den preparerte delen e av FBPT i den monterte kontakten blå på andre enden. Sett en forberedt 20 mm del av silikon rør (svart/svart/svart) på endene av to T-brikker 5 og 6 (tube T-kontakt ID: 1,5 mm; se kobling grønn i figur 2).
- Koble den frie enden av del e fra FBPT til venstre side av den monterte kontakten grønn (5) og plasser den TILBEREDTE delen f av FBPT på motsatt side av kontakten grønn (5). Plasser den frie enden av del f på FBPT i venstre side av den monterte kontakten grønn (6) og plasser den TILBEREDTE delen g av FBPT på motsatt side av kontakten grønn (6). Legg den preparerte del h av FBPT til den frie enden av den monterte kontakten grønn (5) og den PREPARERTE del i av FBPT til den frie enden av den monterte kontakten grønn (6).
- Koble en kombi propp til en sprøyte nål (G 23 x 1 1/4 ' '/ø 0,60 mm x 30 mm) og legg den til en treveis ventil. Plasser den tilberedte treveis ventilen med nålen i den frie enden av delen h på FBPT. Koble en kombi propp til en sprøyte nål og plasser nålen i den frie enden av delen i av FBPT .
Merk: før du starter blodprøver på nettet, se avsnitt 5. - Sett de frie endene av del c og g av FBPT i et 100 ml glass beger fylt med 20 ml heparinisert saltoppløsning (50 enheter/ml). Start den peristaltisk pumpen med en strømningshastighet på 1,52 mL/min slik at shunt systemet er fullstendig fylt med den fysiologiske saltvannsoppløsning. Etterpå satt tre saks klemmer i endene av del c og g og i midten av del i av FBPT .
- Løsne saks klemmene fra del c og g i FBPT. Koble arterie kateteret til den frie enden av del c på FBPT og koble vene kateteret b til den frie enden av del g i FBPT (se kontakt Orange i figur 2).
3. image oppkjøp og gjenoppbygging
- Plasser dyret i hode utsatt posisjon på Senge pallen (70 mm). Kontroll åndedrett av rotte og holde kroppstemperatur ved 37 ± 0,5 ° c ved hjelp av en oppvarming pad og en rektal sonde gjennom bildet oppkjøpet. Flytt shuttle seng til den utvidede sengen posisjon for injeksjon (pre-oppkjøpet) og koble den innsatte katetre til shunt systemet.
- Hold dyret under anestesi med isoflurane (2,5% isoflurane i oksygen, strømningshastighet 1.2-1.5 L/min) via en nese kjegle.
- Start peristaltisk pumpen med en strømningshastighet på 1,52 mL/min for å fylle shunt systemet med blod av dyret. Flytt shuttle sengen til midten av synsfeltet til PET deteksjon ringen og starte online blodprøve system (se avsnitt 5).
- Start arbeidsflyten PET/CT ved hjelp av parametere som er beskrevet i avsnitt 3,5 etter 60 s og deretter injisere en dose på ca. 22 MBq [18F] FDG i et volum på ca 0,5 ± 0,1 ml intravenøst via T-stykket. Skyll T-stykket med ca. 150 μL av heparinisert saltoppløsning etterpå.
- Erverve en drivkraft PET over 60 min og en CT avsøke på slutten av det PET tenkelig.
- For PET-utslipp oppkjøpet sette 3600 s (60 min) i erverve av tid alternativet. Velg F-18 som studie isotop og bruk 350-650 Kev som energi nivå og 3 438 NS som timing vindu.
- For CT-anskaffelse velger du dempings skanning i anskaffelses alternativet. I feltet for projeksjons innstillinger velger du 120 projeksjon for en halv Total rotasjon. For synsfelt (FOV) og oppløsning innstillinger, velger lav som forstørrelse og 4 x 4 som bindende med 275 mm aksial skanning lengde og 3328 px som transaxial CCD størrelse. I feltet eksponeringsinnstillinger setter du 500 μA for strøm, 80 KV for spenning og 180 MS for eksponeringstid.
- For PET-utslipp histogram, sett en serie på 20 bilder (6 x 10 s, 8 x 30 s, 5 x 300 s og 1 x 1800 s) som dynamisk innramming. Velg trekk fra som forsinkelser. Velg i den avanserte innstillings feltet 128 som sinogram bredde, 3 som span, 79 som Ring forskjell og død tid korreksjon.
- For PET rekonstruksjon, bruk to-dimensjonale organisert delsett forventning maksimering (2D-AEROPOSTALE) med en generere, søke og lagre scatter sinogram, 4 gjentakelse og Fourier for rebinning som rekonstruksjon algoritme. Velg 128 x 128 som matrise størrelse og bruk 1 som bilde zoom, alle som rammer og alle som segmenter.
4. prosedyre for manuell blodprøve
- Utfør manuell blodprøve 30 s, 60 s, 90 s, 600 s og 1800 s etter oppstart av bildeinnhenting.
Merk: økning av antall manuelle blodprøver, spesielt i løpet av det første minuttet etter at Tracer injeksjon er sterkt anbefalt hvis mulig. Derfor må blodprøve volumet reduseres til 20-30 μL per prøve6.- Åpne den første tre-veis ventil og samle 100 μL av arteriell blod i en kapillær blod samling EDTA tube 30 s etter Tracer injeksjon. Gjenta for de andre tids punktene. Bestem vekten av den tomme slangen og blod fylt tube.
- Målaktiviteten (teller/tidsenhet) av hele blodet for 180 s i en brønn teller, som senere krysser kalibrert for å innhente data i kBq/mL. Registrere starttidspunktet for brønn teller målingen. Beregn aktiviteten av hele blod for hvert tidspunkt av manuell blodprøve i kBq/mL, bruke forfall korreksjon og overføre data i en tids aktivitets kurven.
5. prosedyre av den elektroniske blodprøve
- Plasser røret i detektoren ved hjelp av rør føreren. Start blodprøve programvaren (f.eks. PSAMPLE), og åpne anskaffelses grensesnittet. Kontroller at datamaskinen til det elektroniske blodprøve oppsettet og av PET/CT er tidssynkronisert.
- Trykk på Start-knappen nøyaktig 60 s før Tracer injiseres for å skaffe nok data for bakgrunnen korreksjon. Lagre rådata via lagre-knappen i PMOD databasen etter målingen.
- For korrigering og kalibrering av de elektroniske blod dataene, Bytt til korrigerings grensesnittet. Aktiver forfall korreksjon og velg 18 F. Definer starttidspunktet for bilde anskaffelse og Aktiver gjennomsnittsknappen for å utføre bakgrunns korrigering. Aktiver kalibreringen og skriv inn den tidligere bestemte kalibreringsfaktoren (se avsnitt 7,1).
- Lagre korrigert og kalibrert blod data ved hjelp av lagre TAC-knappen og velg filen Blood. CRV. Denne filen kan deretter lastes som hele blod input kurve inn i kinetisk modellering verktøyet og kinetisk modellering kan utføres. Koble katetre fra det ekstrakorporal shunt systemet.
- Løsne dyret fra PET/CT-skanneren og euthanize med pentobarbital.
Merk: i dette eksperimentet ble dyrene euthanized etter målingene som hjerner ble brukt til in vitro-analyser i den eksperimentelle designen. Med dette oppsettet er gjentatte målinger i langsgående studier også iverksettes7. Bruk et helt nytt rørsystem for neste dyr.
6. bilde avledet input-funksjon
- Åpne sikrings verktøyet på PMOD. Legg PET-bildet som inn data og CT som referanse. Klikk allerede matchet.
- Åpne Voxel-verktøyet (VOI). Plasser markøren i stigende aorta i CT. Klikk på forhåndsdefinerte sfæriske VOI. Definer en radius på nøyaktig 0,7 mm. Pakk ut tids aktivitetsinformasjonen med VOI statistikk-knappen og kopier gjennomsnittsverdiene til utklippstavlen.
7. prosedyre for kryss kalibrering av Twilite systemet, PET/CT og brønn telleren
- Twilite-PET/CT-kalibrering
Merk: arbeidsflyten for kalibrering av Twilite er delvis basert på prosedyrene som er beskrevet i referanse manualen til PSAMPLE-modulen til PMOD.- Fyll en sprøyte med ca. 100 MBq [18F] FDG. Mål den nøyaktige aktiviteten a med en kalibrert dose-kalibratoren, og dokumenter den sammen med dato og klokkeslett for målingen og volumet på hele sprøyten. Den registrerte tiden er referanse tidspunktet punkt for alle forfall rettelser som skal utføres.
- Fyll et beger med 500 mL vann fra springen. Nøyaktig volum bestemmes av veie metoden. Målvekten me i det tomme begeret med en bevilget og kalibrert presisjons skala (minst nøyaktighetsklasse II). Fyll begeret med vann fra springen og målvekten mf i hele begeret.
- Beregn volumet Vb av begeret ved hjelp av forskjellen på massen og tettheten av vann fra springen (r = 0,998 g/ml ved 20 ° c):
- Injiser [18F] FDG i det fylte begeret og fyll opp den tomme sprøyten til det opprinnelige volumet med inaktivt vann fra springen, og målaktiviteten enE av sprøyten med påfyll i dose kalibratoren. Aktiviteten konsentrasjon cb av løsningen i begeret er gitt av
, som bør være ca 200 kBq/ml. - Fyll et 50 mL konisk sentrifugerør med oppløsningen fra begeret (unngå store luftbobler) og plasser det sentralt i synsfeltet til PET/CT-skanneren. Fyll et kateter identisk med typen som brukes i PET/CT Imaging eksperiment og plassere den i røret guide av Twilite systemet. Fyll kateteret med Tracer løsningen fra begeret ved hjelp av peristaltisk pumpen.
- Start målingen av tids aktivitets kurven som beskrevet i del 5, med samme parameter for integrasjons tid, og rebinning som i eksperimentet, uten en kateter veiledning inne i måle hodet. Dette trinnet sikrer anskaffelse av nok data for passende bakgrunns korreksjon. Etter 2 min, uten å stoppe data oppkjøpet av Twilite systemet, plasserer kateteret guide med det fylte røret inn i målingen hodet, og fortsette data oppkjøpet i ca 5 min.
- Start en 10 min PET oppkjøpet av 50 mL konisk sentrifugerør parallelt etterfulgt av en standard CT oppkjøpet for demping korreksjon. Rekonstruere et statisk PET-bilde av 50 mL konisk sentrifugerør med samme PET rekonstruksjon algoritme og parametre beskrevet i avsnitt 3. Bruk en etterbehandling Imaging verktøy (f. eks, PVIEW) og plassere en sylindrisk VOI dekker ca 70% av volumet innsiden av rekonstruert PET bilder av 50 mL konisk sentrifugerør. Pakk gjennomsnittet aktivitet konsentrasjon ckjæledyr i KBQ/ml innenfor VOI.
- Gå tilbake til blodprøve programvaren og bruk kalibreringsmodus for å korrigere ervervet TAC for forfall, forgrening brøk og bakgrunn. Legg all nødvendig informasjon for Nuklide, aktivitet konsentrasjon og PET oppkjøpet starttid. Internt, trekker programvaren telle hastigheten målt med Twilite systemet (CRTwilite) og beregner kryss kalibreringsfaktoren for pet og Twilite system (CFpet/Twilite):
Merk: det er viktig at samme isotop brukes for både kalibrering og PET/CT eksperimenter, som forgrening brøkdel varierer mellom de ulike isotoper, som er korrigert for i PET rekonstruksjon prosessen. Denne prosedyren må gjentas regelmessig når det gjelder kvalitetskontroll, hvis viktige komponenter i systemet er endret (for eksempel rør, oppkjøp og gjenoppbygging parametere) og etter reparasjon fungerer.
- PET/CT-brønn mot kalibrering
- For å beregne kalibreringsfaktoren CFWell-telleren i brønn telleren, bruker du den samme aktivitets løsningen som er produsert i begeret for kalibrering av Twilite systemet. Vent ca 6 h for å tillate reduksjon av spesifikk aktivitet ved forfall for å minimere død tid effekter av scintillation detektor av brønnen telleren. Lokk begeret for å unngå fordamping.
- Beregn den nøyaktige tidsforskjellen til referanse tidspunktet, og Bestem den faktiske aktivitets konsentrasjonen cb(t+) til oppløsningen til begeret ved forfall for å korrigere den opprinnelige aktivitets konsentrasjonen. Forhåndsdefinerte volum (V-prøve) som er identiske med volumet i blodprøvene målt i eksperimentene (f.eks. 200 μL), fra begeret til fem sikre rør. Målaktiviteten til hver av de fem rørene med brønnen telleren for 180 s.
Merk: Hvis variasjonskoeffisienten for en enkelt måling er større enn 1%, bør målings tiden økes. Ta opp målt telle hastighet i antall per minutt [CPM] for hvert rør og målingen starttid. Utfør en forfall korreksjon. - Beregn kalibreringsfaktoren CFWell-Counter for hver måling ved å dele forfallet korrigert telle rate CRWell-Counter av brønnen telleren ved forfall korrigert aktivitet konsentrasjon av begeret cbeger (t +):
- Gjennomsnittlig de fem kalibrerings faktorene for å få gjennomsnittlig kalibrerings faktor.
, som bør være ca 200 kBq/ml.
Representative Results
Oppsettet av shunt systemet vises i figur 2. Representative resultater av kontinuerlige blodprøve data sammenlignet med manuelle blodprøve data i tre wildtype rotter over en tidsperiode på 30 min er presentert i Figur 3a, C. Ved begynnelsen av den kontinuerlige blodprøve, kan en første topp (maksimal radioaktivitet konsentrasjon) ses ved 5 s etter Tracer injeksjon. Etterpå avtar aktiviteten i blodet raskt og når et platå på ca 15 min. I manuell blodprøve data oppdaget Peak er mindre og platået er ikke lett å definere (Figur 3A, C). Sammenligningen av kontinuerlig blodprøve til bilde-avledet data vises i Figur 3B, D. I bildet avledet data, toppen og utgangspunktet for platået er godt synlig, likevel maksimalt toppen er mindre sammenlignet med kontinuerlig blodprøve data for alle dyr (Figur 3B, D).
En sub-optimale utfallet av kontinuerlig blod prøvetaking med vårt oppsett er vist i Figur 3E, F. I begynnelsen av den kontinuerlige blodprøve, ingen data oppkjøpet innen de første 3,5 min var mulig på grunn av blodpropp. Ved å koble rørsystemet på kontakten oransje og flyter med heparinisert saltoppløsning, ble flyten i rørsystemet startet på nytt, og målingen fortsatte. En topp kan sees på ca 4 min, som registrerer ikke maksimal radioaktivitet i blodet (Figur 3E, F). Manuell blodprøve (Figur 3E) og bilde-avledet analyser (Figur 3F) var fortsatt mulig og sammenlignbare med de riktige resultatene.
Figur 3 : Representative resultater av kontinuerlig blodprøve sammenlignet med manuell blodprøve. Typiske arteriell input funksjoner avledet fra kontinuerlig blodprøve sammenlignet med manuell blodprøve (venstre kolonne) og kontinuerlig blodprøve i forhold til bildet-avledet tilnærming (høyre kolonne) vises. Panel A-D demonstrere resultatene av riktig gjennomføring av protokollen i to forskjellige dyr. Paneler E og F illustrerer et sub-optimalt resultat av målingen. Alle viste data ble korrigert for kryss kalibreringsfaktoren og bakgrunnen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Resultatene trekkes ut fra et større prosjekt om neuronal aktivitet i en transgene dyremodell av Huntington sykdom sammenlignet med wildtype rotter. I alt 30 transgene og wildtype rotter ble kateteriseres og manuelle og online blodprøver parallelt med [18F] FDG-pet/CT ble utført. Tre AIFs av wildtype rotter er vist her over å demonstrere rekken av mulig resultater av protokollen. Resultatene av det fullstendige prosjektet om endringer av neuronal aktivitet i en dyremodell av Huntington sykdom vil bli publisert andre steder.
Den her beskrevne metoden muliggjør rask og nøyaktig kontinuerlig blodprøve i en stor kohort og gir en gapless AIF for kinetisk modellering av dynamisk PET/CT data i små dyr. En ekstern blodsirkulasjon er generert for å oppdage faktisk tid aktivitet i blodet av dyrene; Dermed unngås et blodtap. Den kirurgiske prosedyren er basert på Jespersen et al.8 og ble modifisert for å imøtekomme behovene for arteriell blodprøver under pet/CT-målingene. Shunt systemet ble validert av Weber et al.9. Med her brukt oppsett, er et eksternt blod volum på ca 1,1 mL kjører gjennom detektor-pumpesystemet. En rotte i alderen 4 mnd har et totalt blod volum på ca 30 mL. Diameteren av lår venen og arterien er ca 0.45-0,6 mm10 og må være litt stivet for å sette inn kateteret som brukes.
AIF kan også måles via sporadisk manuell blod samling eller bli rekonstruert fra tidlig tid poeng av KJÆLEDYRET bildene selv (bilde-avledet). Begge tilnærminger ble utført med her presenteres data og i forhold til kontinuerlig blod prøvetaking.
I forhold til manuell blodprøve, med online blod prøvetaking en merkbar høyere Temporal oppløsning (her: 1800 datapunkter per 30 min) blir mulig. Manuelle blodprøver (her: 5 datapunkter per 30 min) er begrenset til blod volumet som finnes i det lille dyret, da disse prøvene ikke pumpes tilbake i sirkulasjon av dyret. Dessuten, en maksimum intervall av 10-15 s er teknisk iverksettes og betydelig beskjed for kinetisk modellering er savnet. Dette kan også sees i de presenterte data, som en forskjell i den oppdagede maksimalt kontinuerlig og manuell blodprøve er åpenbar (Figur 3a, C, E). Med online blod prøvetaking oppdaget peak var høyere enn med bilde-avledet input funksjon av stigende aorta11 (Figur 3B, D, F). Den bilde-avledede inn data funksjonen er begrenset til den romlige oppløsningen til PET-skannere som resulterer i delvis volumeffekter12 og påvirkes av rekonstruert tidsrammer.
En generell fordel med denne kontinuerlige blodprøve prosedyren er at Tracer kan påføres via kateteret, som er mindre utsatt for forstyrrelse enn injeksjon via lateral hale vene. Husk at Tracer skal påføres i et moderat volum for å hindre at Tracer fra gjenværende i begynnelsen av røret systemet. For å sikre at ingen aktivitet er igjen i det døde volumet av T-stykket, skylles det med heparinisert saltoppløsning etterpå. Videre er bruken av en infusjon pumpe anbefales som det muliggjør justering av hastigheten på Tracer injeksjon og kan bidra til mer koordinert oppkjøpet av maksimal radioaktivitet topp med manuell blodprøve13.
Det er noen mulige problemer som kan oppstå under behandling av protokollen, og kan håndteres av følgende feilsøking. En sub-optimal posisjon av katetre kan føre til en ufullstendig gjennomføring av protokollen, derfor sørge for at de er nøyaktig festet med proksimale Sutur og at kateteret er skjøvet 2-3 cm proksimale inn i fartøyet. I tillegg kan fibrin lim brukes. Også dannelse av trombi kan tette katetre. Dette kan håndteres ved å øke heparin-konsentrasjonen og påfølgende spyling av katetre eller rørsystemet. En slik sub-optimale utfall på grunn av tilstopping av katetre vises i resultatene, er den maksimale toppen savnet (Figur 3E). Et annet kritisk punkt om dyr beskyttelse og trivsel er lengden på ekstrakorporal blodstrøm. Det foreslås derfor å redusere lengden på rørsystemet til et minimum.
Når blodprøver utføres, må det tas hensyn til tre korrigeringer av det resulterende AIF. Først plasma korreksjon. Bevegelsesuskarphet likevekt mellom plasma og blodceller, hovedsakelig erytrocytter. Avhengig av hvor fort disse diffusjon prosessene er, er tilgjengelig Tracer hovedsakelig til stede i plasma. For noe bevegelsesuskarphet, forholdet av plasma å hele blod nødvendig å bli betraktet som, som flere lipofile seg. I disse tilfellene, plasma aktivitet må fastsettes. Hvis [18f] FDG brukes, er det ikke nødvendig å sentrifuger blodet å bestemme plasma aktivitet, som det equilibrates veldig fort mellom plasma og røde blodlegemer og tilgjengeligheten av [18f] FDG i plasma er lik som i hele blodet. For det andre, metabolitten korreksjon. Mange Bevegelsesuskarphet metaboliseres i hele blod og noen av disse metabolitter er fortsatt radioaktivt merket14. Denne fraksjonen er til stede i AIF, men er ikke tilgjengelig for opptak av vev. For noen Bevegelsesuskarphet metabolitter må fastsettes i hele blod eller plasma og AIF må korrigeres. For det tredje, dispersjon korreksjon. Dispersjon skyldes flere faktorer, inkludert (a) systematisk tidsforskjellen mellom Tracer ankomst ganger i vevet i forhold til perifere prøvetaking området (forsinkelse korreksjon) og (b) og smøre av formen på AIF, som Tracer Transport innenfor rørsystemet er påvirket av sin første ordre lag (PT1) Kinetics. Flere rettelser basert på deconvolution har blitt foreslått, hovedsakelig basert på modellen av Iida et al.15, men de fleste av dem er utsatt for støy. En korreksjon metode som omgår deconvolution og er derfor mindre utsatt for støy har blitt foreslått av munk et al.16. De nødvendige målinger for å anslå korreksjon parametrene må utføres for hver kombinasjon av rør og Tracer brukes. Dispersjon korreksjon bør gjøres før tidsforsinkelse korreksjon17. Men i hovedsak er raske vevs prosesser påvirket av dispersjon og det har også blitt vist, at for modellering av [18F] FDG studier en dispersjon korreksjon er ikke absolutt nødvendig18. I de presenterte eksemplene har derfor ikke sprednings korrigeringen i AIF blitt brukt.
En riktig kalibrering av dose kalibratoren på stedet og den vanlige kvalitetskontrollen er en forutsetning for den typen kryss kalibreringsprosedyrer som presenteres her. Men hvis aktiviteten som administreres til dyret måles med samme dose kalibratoren, vil eventuelle avvik i nøyaktigheten bli kansellert, forutsatt at avviket er konstant og at den komplette tverr kalibreringsprosedyren er fulgt, inkludert Nuklide-spesifikke korrigeringer (f.eks. for varierende halveringstid eller forskjellig forgrenings forhold). Ved hjelp av en slik kalibrering prosedyre for harmonisering pet/CT systemer som brukes i helsevesenet og forskning, en nøyaktighet på minst 5-10% kan oppnås19,20.
Den kalibrert og korrigert AIFs generert av vellykket implementering av denne protokollen muliggjør kvantifisering av PET/CT data for karakterisering av dyr sykdom modeller, testing av nye behandlingsalternativer, etablering av nye bevegelsesuskarphet, og overføring av eksisterende Bevegelsesuskarphet til en annen art. Tilsynelatende, kontinuerlig blodprøve i [18] FDG-pet/CT i rotter leverer den mest pålitelige informasjonen for beregning av innspill i bio-kinetisk modellering. Ved å ta hensyn til individuelle metabolisme, spesielt leveren klaring, en mer presis vurdering av relevante patologiske eller terapeutiske effekter er mulig. Med dette praktisk protokoll, en høyere effektivitet av prekliniske PET/CT dataanalyse er lett iverksettes.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takknemlig erkjenner Susann Lehmann, Iloana Klamfuß og Petra Wolff for dyr bolig og omsorg og Matthias Wyss for støtte under etablering av online blod prøvetaking systemet. Den lille dyret PET/CT ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (INST 2268/6-1 FUGG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sugery for arteriovenous shunt | |||
| anesthesia station | Groppler | ||
| aneurysm clips | Aesculap | FT190T | 5 mm, closing force 70 g |
| bulldog clamp | Aesculap | 35 mm | |
| dissectiong scissors BC165 | Aesculap | 490-866 | dull, for skin preparation |
| heating mat | |||
| insulin syringe | Braun | 30G | |
| needle holder | medicon | 11.62.18 | micro surgical |
| pliers for aneurysm clips | Aesculap | FT 470T | Yasargil |
| portex fine bore polythene tubing | Smith Medical | 800/100/200 | ID 0.58 mm, OD 0.96 mm; PE50 equivalent tubing |
| surgical microscope with camera | Leica | M50 + MC120 HD | |
| suture filaments 6.0 | 6.0, polypropylene | ||
| suture filaments 3.0 | 3.0, absorbable, braided | ||
| two anatomical forceps | Hammacher Soling | HSC601-11 | micro surgery, 45° |
| vascular or corneal scissors | Geuder | G19605 | micro surgery scissors |
| PET/CT imaging | |||
| dose calibrator ISOMED 2010 | nivia instruments GmbH | for tracer portioning | |
| Inveon PET/CT | Siemens | ||
| tracer (e.g. 18F-FDG) | |||
| manuel bloodsampling | |||
| capillary blood collection EDTA tube | KABE Labortechnik GmbH | GK 150 EDTA 200 µl | |
| test tubes | SARSTEDT | 5 ml, 75 x 12 mm, PS | |
| well counter CAPTUS 700t | Capintec | manuel measurement of blood activity | |
| automatic blood sampling | |||
| BD Venflon TM pro safety shielded IV catheter; 18 G (1.3 mm x 32 mm) | BD | 3932269 | luer connections (to fit in t-connections) |
| bloodsampler twilite two | swisstrace GmbH | ||
| combi stopper | Braun | 4495101 | |
| heparin | 50U/ml for tube flushing before the experiment and aspiration during catheter surgery | ||
| hypodermic needle | G23 x 1 1/4" / 0.6 x 30 mm | ||
| microprocessor controlled tubing pump | Ismatec/Cole-Parmer | ISM596 | 12 rollers, 2 channels |
| PSAMPLE modul of PMOD | PMOD | ||
| reduction connectors | Ismatec/Cole-Parmer | ISM569A | from ID 2.5 mm to ID 1.5 mm |
| silicone pump tubes | Ismatec/Cole-Parmer | 070535-17-ND /SC0065N | for roller pump (yellow/blue/yellow ID 1.52 mm, WT 0.84 mm, OD 3.2 mm) |
| silicone pump tubes - adapter tubing | Ismatec/Cole-Parmer | SC 0107 | black/black/black ID 0.76 mm, WT 0.86 mm, OD: 2.48 mm |
| t-piece or t-connections | Ismatec/Cole-Parmer | ISM 693A | ID 2.5 mm |
References
- Schain, M., et al. Arterial input function derived from pairwise correlations between PET-image voxels. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33 (7), 1058-1065 (2013).
- Schain, M., Zanderigo, F., Mann, J. J., Ogden, R. T. Estimation of the binding potential BPND without a reference region or blood samples for brain PET studies. NeuroImage. 146, 121-131 (2017).
- Bentourkia, M. Determination of the Input Function at the Entry of the Tissue of Interest and Its Impact on PET Kinetic Modeling Parameters. Molecular Imaging and Biology. 17 (6), 748-756 (2015).
- Phelps, M. E. PET. , Springer New York. New York, NY. (2004).
- Laforest, R., et al. Measurement of input functions in rodents: challenges and solutions. Nuclear Medicine and Biology. 32 (7), 679-685 (2005).
- Napieczynska, H., et al. Impact of the Arterial Input Function Recording Method on Kinetic Parameters in Small-Animal PET. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 59 (7), 1159-1164 (2018).
- Sijbesma, J. W. A., et al. Novel Approach to Repeated Arterial Blood Sampling in Small Animal PET: Application in a Test-Retest Study with the Adenosine A1 Receptor Ligand [(11)C]MPDX. Molecular Imaging and Biology: MIB: the Official Publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (5), 715-723 (2016).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), e3496 (2012).
- Weber, B., Burger, C., Biro, P., Buck, A. A femoral arteriovenous shunt facilitates arterial whole blood sampling in animals. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 29 (3), 319-323 (2002).
- Liu, H. -L. Microvascular anastomosis of submillimeter vessels-a training model in rats. Journal of Hand and Microsurgery. 5 (1), 14-17 (2013).
- van der Weerdt, A. P., et al. Image-derived input functions for determination of MRGlu in cardiac (18)F-FDG PET scans. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 42 (18), 1622-1629 (2001).
- Alf, M. F., et al. Quantification of brain glucose metabolism by 18F-FDG PET with real-time arterial and image-derived input function in mice. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 54 (1), 132-138 (2013).
- Eriksson, O., et al. A computerized infusion pump for control of tissue tracer concentration during positron emission tomography in vivo pharmacokinetic/pharmacodynamic measurements. BMC Medical Physics. 8, 2 (2008).
- Burger, C., Buck, A. Tracer kinetic modelling of receptor data with mathematical metabolite correction. European Journal of Nuclear Medicine. 23 (5), 539-545 (1996).
- Iida, H., et al. Error analysis of a quantitative cerebral blood flow measurement using H2(15)O autoradiography and positron emission tomography, with respect to the dispersion of the input function. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 6 (5), 536-545 (1986).
- Munk, O. L., Keiding, S., Bass, L. A method to estimate dispersion in sampling catheters and to calculate dispersion-free blood time-activity curves. Medical Physics. 35 (8), 3471-3481 (2008).
- Meyer, E. Simultaneous correction for tracer arrival delay and dispersion in CBF measurements by the H215O autoradiographic method and dynamic PET. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 30 (6), 1069-1078 (1989).
- Lanz, B., Poitry-Yamate, C., Gruetter, R. Image-derived input function from the vena cava for 18F-FDG PET studies in rats and mice. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 55 (8), 1380-1388 (2014).
- Geworski, L., et al. Multicenter comparison of calibration and cross calibration of PET scanners. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 43 (5), 635-639 (2002).
- Boellaard, R. Standards for PET image acquisition and quantitative data analysis. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 50, Suppl 1 11-20 (2009).
